KR20230085877A - 에이코사펜타엔산(epa)이 고 함량으로 함유된, 고 순도의 트리글리세라이드 유도체의 제조방법 - Google Patents

에이코사펜타엔산(epa)이 고 함량으로 함유된, 고 순도의 트리글리세라이드 유도체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오메가-3 지방산 에틸에스테르 와 글리세롤 및 효소를 사용하여 진공 조건하에서 합성함을 포함한 고 함량 및 고 순도의 오메가-3 트리글리세라이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법은 1세대 오메가-3의 유효성분의 저 농도 문제와 2세대 오메가-3의 안정성 및 생체 이용률 문제를 개선한 3세대 오메가-3 트리글리세라이드의 효율적인 대량생산 제조방법이다. 구체적으로, 본 발명의 제조 방법은 반응성 향상을 위하여 기존 선행 실험들과 차별화한 가공된 효소를 사용하고, 기존 선행 실험들과 차별화된 조건으로 반응 효율을 극대화 하여 단일 오메가-3 지방산 트리글리세라이드의 순도가 70% 이상이며 단일 오메가-3의 함량이 80% 이상인 오메가-3 트리글리세라이드를 제공할 수 있는 가공 공정을 최소화한 대량생산 합성법이다.
본 발명에 따른 고 함량 및 고 순도의 오메가-3 트리글리세라이드는 의약품, 식품, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

에이코사펜타엔산(EPA)이 고 함량으로 함유된, 고 순도의 트리글리세라이드 유도체의 제조방법{Method for producing high-purity triglyceride derivatives containing high content of eicosapentaenoic acid (EPA)}
본 발명은 오메가-3 지방산 에틸에스테르와 글리세롤 및 효소를 사용하여 진공 조건하에서 단일 오메가-3 지방산을 80% 이상 함유하며 단일 오메가-3 성분의 트리글리세라이드를 70% 이상 함유하는 오메가-3 트리글리세라이드(rTG 오메가-3, Re-Triglyceride form)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
현대인들은 식습관 변화(육류 및 식용유 과다 섭취)로 인해 오메가-6를 과다섭취하고 있으며 상대적으로 오메가-3 섭취가 부족하다. ‘World Rev. Nutr. Diet. 102: 92-97 (2011)’문헌에 따르면 서양의 경우 오메가-6/오메가-3의 섭취 비는 약 15.0-16.7 정도이며, 국민건강영양조사에 의하면 우리나라의 오메가-6/오메가-3 섭취 비는 6.7-14.2로 권장 섭취비율(오메가-3 : 오메가-6 = 1 : 1~4)에 비해 오메가-3가 부족하다. 오메가-3과 오메가-6의 섭취 비율이 중요한 이유는 두 지방산이 대사되면서 혈압 조절, 혈전 형성과 억제, 염증반응, 면역반응, 수면 주기 등 인체의 다양한 조절 기능에 영향을 주기 때문이다. 따라서 인체의 기능을 잘 유지하려면 어느 한 쪽에 치우치지 않고 적절한 비율로 섭취해야 한다. 이러한 배경으로 인하여 현재 많은 오메가-3 관련 의약품, 식품 및 건강기능식품들이 판매되고 있다.
1세대의 오메가-3의 경우 천연 형태로 존재하는 트리글리세라이드 형태(Triglyceride Form: TG Form)이다. 이 경우 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)과 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA)이 저 농도로 함유되어 있기 때문에 EPA와 DHA를 보충하기 위해서는 다른 지방산들도 같이 더 섭취하게 되는 문제가 있다. 2세대 오메가-3의 경우 천연 유래의 트리글리세라이드 유지를 에탄올과 반응시켜 수득한 지방산 에틸에스테르 형태(Ethyl-ester form: EE form)이다. 이 경우 EPA와 DHA 오메가-3를 선택적으로 고농도로 섭취가 가능하지만 트리글리세라이드 유지에 비해 안정성이 낮고 ‘Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 83 (2010) 137-141’문헌에 따르면 생체 이용률이 3세대 오메가-3에 비해 1.76배 낮다. 3세대 오메가-3의 경우 2세대인 오메가-3 에틸 에스터 혹은 오메가-3 지방산을 사용하여 합성한 트리글리세라이드 형태(Re-esterified triglyceride form: rTG form)이다. 이 경우 1세대 오메가-3의 유효성분의 저 농도 문제와 2세대 오메가-3의 안정성 및 생체 이용률 문제를 개선할 수 있다.
3세대 오메가-3를 합성하는 일반적인 유기합성 제법의 경우 반응성이 우수하지만 합성 시약 및 용매를 사용하여 식품 원료 등으로의 사용이 제한되며, 고가의 시약 및 정제공정이 추가로 필요하여 가공비 증가로 대량생산에 어려움이 있다. 효소를 사용한 3세대 오메가-3 합성법의 경우는 합성시약 및 용매 등의 사용을 배제하여 오메가-3 트리글리세라이드를 합성할 수 있다. 하지만 일반적으로 알려진 반응의 경우 반응성이 낮기 때문에 고 함량 및 고 순도의 오메가-3 트리글리세라이드를 합성하기 위해선 정제공정이 필요하게 되어 가공비 증가로 대량생산에 어려운 문제가 있다. 이러한 사유 때문인지 현재 유통되는 3세대 오메가-3 트리글리세라이드 원료의 함량 및 순도는 다소 낮은 수준이다.
KR20110069421A KR20180082207A JP1994-072959A JP1986-043143A
World Rev. Nutr. Diet. 102: 92-97 (2011) Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 83 (2010) 137-141
본 발명은 오메가-3 지방산 에틸에스테르와 글리세롤 및 효소를 사용하여 진공 조건하에서 고 함량 및 고 순도의 오메가-3 트리글리세라이드를 합성하는 것을 특징으로 하는 것으로, 보다 구체적으로 단일 오메가-3 지방산을 80% 이상 함유하고, 단일 오메가-3 성분의 트리글리세라이드로 70%이상의 고 순도를 나타내는 오메가-3 트리글리세라이드의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 반응성 향상을 위하여 기존 선행 실험들과 차별화한 가공된 효소를 사용하였으며, 기존 선행 실험들과 차별화된 반응 조건에서 반응 효율을 극대화 하였다. 이를 통해 가공공정을 최소화한 방법으로 고 함량 및 고 순도의 오메가-3 트리글리세라이드를 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 단일 오메가-3 지방산을 80% 이상 함유하고, 단일 오메가-3 지방산 트리글리세라이드로 70% 이상의 고순도를 나타내는 오메가-3 트리글리세라이드의 대량생산 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법은 (i) 오메가-3 지방산 에틸에스테르를 글리세롤과 효소의 존재 하에 반응시키는 단계를 포함한다.
상기 단계 (i)에서 오메가-3 지방산 에틸에스테르는 오메가-3 지방산으로 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA), α-리놀렌산(α-linolenic acid: ALA), 도코사펜타에노산(docosapentaenoic acid: DAP), 스테아리돈산(stearidonic acid: SDA) 등을 포함하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예들에서, 상기 단계 (i)에서 오메가-3 지방산 에틸에스테르는 오메가-3 지방산으로 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA), α-리놀렌산(α-linolenic acid: ALA), 도코사펜타에노산(docosapentaenoic acid: DAP), 및 스테아리돈산(stearidonic acid: SDA) 중 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있다. 본 발명의 실시예들에서, 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA) 및 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA) 중 선택된 적어도 하나를 포함하는 것이 바람직하며, 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 효소로는 리조푸스속(Rhizopus sp.) 미생물, 아스퍼질러스속(Aspergillus sp.) 미생물 및 뮤커속(Mucorsp.) 미생물과 같은 미생물 유래의 리파아제, 또는 비위치 특이성 리파아제인 칸디다 실린드라세아(Candida cylindracea) 또는 칸디다 안타르티카(Candida antarctica)에서 유래한 리파아제 등이 사용될 수 있다. 특히 칸디다 안타르티카(Candida antarctica)에서 유래한 리포자임(Lipozyme) 435가 바람직하다.
상기 효소는 효율을 극대화하기 위해 분쇄 및 가공하여 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예들에서, 상기 효소는 분쇄 효소일 수 있다. 본 발명의 실시예들에서 상기 효소는 특히 입자 크기가 300㎛ 이하인 효소를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 단계 (i)에서, 상기 효소의 투입량은 오메가-3 지방산 에틸에스테르에 대해 10 중량% 이하이다. 이중에서 5 중량% 이하가 바람직하며, 0.25 내지 5 중량%, 구체적으로, 0.25 초과 5 중량% 미만이 더욱 바람직하다. 0.25 중량% 보다 적을 경우에는 반응성이 낮고, 5 중량% 보다 많을 경우에는 반응성이 저하될 수 있거나 더 이상 반응성이 향상되지 않아 경제성이 저하될 수 있다. 본 발명의 실시예들에서, 상기 효소의 투입량은 오메가-3 지방산 에틸에스테르에 대해 0.25 중량% 초과, 5 중량% 미만일 수 있다.
상기 단계 (i)에서, 반응 온도는 40 내지 130℃가 바람직하다. 본 발명의 실시예들에서, 상기 단계 (i)에서 반응 온도는 70℃ 이상, 80℃ 이상, 또는 90℃ 이상일 수 있고, 130℃ 이하, 120℃ 이하, 또는 110℃ 이하일 수 있다. 예를 들어, 상기 반응 온도는 70 내지 130℃, 또는 80 내지 120℃의 반응온도가 가장 바람직할 수 있다.
본 발명의 실시예들에서, 본 발명의 제조 방법에서 효소가 칸디다 안타르티카(Candida antarctica)에서 유래한 리파아제(예를 들어 리포자임(Lipozyme) 435)를 포함하는 경우, 상기 단계 (i)에서 반응 온도는 70℃ 이상 130℃ 이하, 구체적으로 80℃ 이상 120℃ 이하일 수 있다. 효소의 종류에 따라 다양한 최적 온도가 존재하는데, 리포자임(Lipozyme) 435 효소의 경우 제조사인 노보자임사에 따르면 높은 온도에서 반응 시 불활성화 될 수 있으니 최적의 생산성을 위하여 40-60℃에서 사용하길 권장된다. 그러나, 본 발명의 발명자들은 리포자임 435를 사용한 본 발명에 따른 오메가-3 트리글리세라이드 합성 시 예상치 못하게 본 발명의 반응 온도에서, 특히, 80~120℃에서 높은 활성을 보임을 발견하였고, 본 발명에 따르면, 종래와는 차별화된 본 발명의 반응 온도 등의 반응 조건 및 효소를 사용함으로써 상대적으로 적은 양의 효소를 사용하여도 종래 보다 경제적이고 우수한 효율로 오메가-3 지방산을 고함량 포함하는 오메가-3 지방산 트리글리세라이드를 제조할 수 있다.
상기 반응 중 생성되는 에탄올은 에스테르 교환반응에 지속적으로 참여한다. 따라서 신속한 제거를 위해 반응은 진공 하에서 수행하는 것이 바람직하다. 이때 진공도는 5 내지 0.05 mbar가 바람직하다.
상기 오메가-3 지방산 에틸에스테르의 사용량은 글리세롤에 대해 2.0 내지 3.5 당량이 바람직하며, 2.5 내지 3.0 당량이 보다 바람직하다. 오메가-3 지방산 에틸에스테르의 투입량에 글리세롤에 지방산이 3개 결합된 트리글리세라이드의 순도가 달라질 수 있기 때문에 오메가-3 지방산 에틸에스테르의 함량에 따라 적절한 양의 조절이 필요하다. 본 발명에 따르면, 상기와 같은 당량으로 효소와 함께 반응시킴으로써 고 함량 및 고 순도의 오메가-3 트리글리세라이드를 제공할 수 있다.
상기 단계 (i)에서 고 함량 및 고 순도의 오메가-3 트리글리세라이드를 포함하는 트리글리세리드 유지(오일)이 제조되고, 이때, 상기 단계 (i)에서 합성된 오메가-3 트리글리세라이드의 함량은 65% 이상, 70% 이상, 75 이상, 80% 이상, 85% 이상, 또는 90% 이상일 수 있다. 본 발명의 실시예들에서, 상기 단계 (i)에서 합성된 오메가-3 트리글리세라이드의 함량은 80% 이상, 85% 이상, 또는 90% 이상일 수 있다.
상기 단계 (i)에서 합성된 오메가-3 트리글리세라이드에서, 단일 오메가-3 성분의 함량이 80% 이상, 85% 이상, 또는 90% 이상일 수 있다.
또한, 상기 단계 (i)에서 합성된 오메가-3 트리글리세라이드에서, 단일 오메가-3 지방산의 트리글리세라이드 순도는 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 또는 85% 이상일 수 있다.
본 발명의 실시예들에서, 상기 단계 (i)에서 상기 오메가-3 지방산 에틸에스테르는 상업적으로 이용 가능한 것일 수 있고, 예를 들어, 오메가-3 지방산 에틸에스테르의 함량이 70% 이상인 것일 수 있다. 구체적으로, 오메가-3 지방산 에틸에스테르의 함량이 80% 이상인 것이 바람직하며, 함량이 90% 이상인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 실시예들에서, 상기 단계（i) 이후에, (ii) 효소를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계 (ii)는 단계 (i)에서 합성된 유지에서 효소를 제거하는 단계이다. 불포화 지방산의 경우 산소와 접촉 시 산패물이 발생될 수 있으므로 산소차단 혹은 질소 및 아르곤 분위기 하에 수행해야 한다. 수득한 유지의 보관 또한 산소를 차단해야 한다.
본 발명의 실시예들에서, 본 발명의 제조 방법은
(1) 오메가 3 지방산 에틸에스테르와 글리세롤 및 효소를 진공 조건에서 반응시키는 단계를 포함하는 고 함량 및 고 순도의 오메가-3 트리글리세라이드의 제조방법이다.
(2) 상기 (1)에 있어서, 효소가 리조푸스속(Rhizopus sp.) 미생물, 아스퍼질러스속(Aspergillus sp.) 미생물 또는 뮤커속(Mucorsp.) 미생물에서 유래한 리파아제 또는 비위치 특이성 리파아제인 칸디다 실린드라세아(Candida cylindracea) 또는 칸디다 안타르티카(Candida antarctica)에서 유래한 리파아제인 제조방법이다.
(3) 상기 (1) 또는 (2)에 있어서, 효소가 칸디다 안타르티카(Candida antarctica)에서 유래한 리포자임(Lipozyme 435)인 제조방법이다.
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 효소가 분쇄 효소인 제조방법이다.
(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 효소의 입자 크기가 300㎛ 이하인 제조방법이다.
(6) 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 효소의 투입량은 오메가-3 지방산 에틸에스테르에 대해 10 중량% 이하인 제조방법이다.
(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 효소의 투입량은 오메가-3 지방산 에틸에스테르에 대해 5 중량% 미만인 제조방법이다.
(8) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 효소의 투입량은 오메가-3 지방산 에틸에스테르에 대해 0.25 중량% 초과인 제조방법이다.
(9) 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 반응 온도가 40 내지 130℃인 제조방법이다.
(10) 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 반응 온도가 70 내지 130℃인 제조방법이다.
(11) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, 반응 온도가 80 내지 120℃인 제조방법이다.
(12) 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, 오메가-3 지방산 에틸에스테르가 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA), α-리놀렌산(α-linolenic acid: ALA), 도코사펜타에노산(docosapentaenoic acid: DAP), 및 스테아리돈산(stearidonic acid: SDA) 중 선택된 적어도 하나를 포함하는 것인 제조방법이다.
(13) 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 있어서, 오메가-3 지방산 에틸에스테르가 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA) 및 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA) 중 선택된 적어도 하나를 포함하는 것인 제조방법이다.
(14) 상기 (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 있어서, 오메가-3 지방산 에틸에스테르가 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)을 포함하는 것인 제조방법이다.
(15) 상기 (1) 내지 (14) 중 어느 하나에 있어서, 오메가-3 지방산 에틸에스테르은 글리세롤에 대해 2.0 내지 3.5 당량인 제조방법이다.
(16) 상기 (1) 내지 (15) 중 어느 하나에 있어서, 오메가-3 지방산 에틸에스테르은 글리세롤에 대해 2.5 내지 3.0 당량인 제조방법이다.
(17) 상기 (1) 내지 (16) 중 어느 하나에 있어서, 진공도가 0.05 내지 5 mbar인 것을 특징으로 하는 제조방법이다.
(18) 상기 (1) 내지 (17) 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응시키는 단계에서 시작물질인 오메가-3 지방산 에틸에스테르의 함량이 70% 이상인 제조방법이다.
(19) 상기 (1) 내지 (18) 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응시키는 단계에서 시작물질인 오메가-3 지방산 에틸에스테르의 함량이 80% 이상인 제조방법이다.
(20) 상기 (1) 내지 (19) 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응시키는 단계에서 시작물질인 오메가-3 지방산 에틸에스테르의 함량이 90% 이상인 제조방법이다.
(21) 상기 (1) 내지 (20) 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응시키는 단계에서 합성된 오메가-3 트리글리세라이드 중에 단일 오메가-3 성분의 트리글리세라이드 순도가 70% 이상인 제조방법이다.
(22) 상기 (1) 내지 (21) 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응시키는 단계에서 합성된 오메가-3 트리글리세라이드 중에 단일 오메가-3 성분의 트리글리세라이드 순도가 80% 이상인 제조방법이다.
(23) 상기 (1) 내지 (22) 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응시키는 단계에서 합성된 오메가-3 트리글리세라이드 중에 단일 오메가-3 성분의 트리글리세라이드 순도가 85% 이상인 제조방법이다.
(24) 상기 (1) 내지 (23) 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응시키는 단계에서 합성된 오메가-3 트리글리세라이드 중에 단일 오메가-3 성분의 함량이 80% 이상인 제조방법이다.
(25) 상기 (1) 내지 (24) 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응시키는 단계에서 합성된 오메가-3 트리글리세라이드 중에 단일 오메가-3 성분의 함량이 85% 이상인 제조방법이다.
(26) 상기 (1) 내지 (25) 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응시키는 단계에서 합성된 오메가-3 트리글리세라이드 중에 단일 오메가-3 성분의 함량이 90% 이상인 제조방법이다.
또한, 본 발명의 오메가-3 트리글리세라이드는 상기 (1) 내지 (26) 중 어느 하나에 따라 제조된 오메가-3 트리글리세라이드이다.
본 발명에 따르면, 고가의 시약 및 정제 공정 없이, 가공 공정을 최소화한 경제적이고 효율적인 방법으로 높은 반응성으로 고 함량 및 고 순도의 오메가-3 트리글리세라이드를 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 고 함량 및 고 순도의 오메가-3 트리글리세라이드는 안정하고 우수한 생체이용률을 나타낼 수 있다.
본 발명은 또한 상기 본 발명의 제조 방법에 따라 제조된 오메가-3 트리글리세라이드를 제공한다.
본 발명에서 오메가-3 트리글리세라이드는 오메가-3 지방산 트리글리세라이드로도 지칭될 수 있고, 오메가-3는 오메가-3 지방산으로도 지칭될 수 있다.
본 발명에 따른 오메가-3 지방산 트리글리세라이드는 고 함량 및 고 순도의 오메가-3 트리글리세라이드이다.
본 발명에서 오메가-3 지방산 트리글리세라이드는 본 발명의 제조 방법에서 사용한 오메가-3 지방산 에틸에스테르에 따라 달라진다. 본 발명에서 오메가-3 지방산 트리글리세라이드 및 오메가-3 지방산 에틸에스테르는 오메가-3 지방산으로 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA) 및/또는 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA)를 포함하는 것이 바람직하며, 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따라 합성된 오메가-3 지방산 트리글리세라이드 중에 단일 오메가-3 성분의 함량이 80% 이상이다. 이중에서 함량이 85% 이상인 것이 바람직하며, 함량이 90% 이상인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따라 합성된 오메가-3 지방산 트리글리세라이드 중에 단일 오메가-3 성분의 트리글리세라이드 순도가 70% 이상이다. 이중에서 순도가 80% 이상인 것이 바람직하며, 순도가 85% 이상인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따른 오메가-3 지방산 트리글리세라이드는 의약품, 식품, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하고 유용하게 활용할 수 있다.
본 발명에 따라 합성된 오메가-3 지방산 트리글리세라이드는 용도에 따라 토코페롤과 같은 항산화제 등의 첨가제/부형제와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따르면 1세대 오메가-3의 유효성분의 저 농도 문제와 2세대 오메가-3의 안정성 및 생체 이용률 문제를 개선한 고 함량 및 고 순도의 오메가-3 지방산 트리글리세라이드를 가공공정을 최소화한 효율적인 방법으로 제조할 수 있다. 또한 본 발명으로 제조된 오메가-3 지방산 트리글리세라이드는 의약품, 식품, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하고 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 실험예 1의 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)의 체내 흡수율 양상을 보여주는 도면이다.
도 1에서 G3: 2세대 오메가-3 시제품, G4: 3세대 오메가-3 시제품, G5: 식물성 오메가-3 시제품, G6: CKD EPA rTG Omega-3 Low(경구 용량 51.7 mg/kg), G7: CKD EPA rTG Omega-3 High(경구 용량 103.4 mg/kg)이다.
도 2는 실험예 1의 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)의 체내 반감기 양상을 보여주는 도면이다.
도 2에서 G3: 2세대 오메가-3 시제품, G4: 3세대 오메가-3 시제품, G5: 식물성 오메가-3 시제품, G6: CKD EPA rTG Omega-3 Low(경구 용량 51.7 mg/kg), G7: CKD EPA rTG Omega-3 High(경구 용량 103.4 mg/kg)이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예에서 사용되는 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(eicosapentaenoic acid ethyl ester: EPA EE)는 KinOmega사 및 기타 업체로부터 구매한 것을 사용하였고, Lipozyme 435는 Novozyme사의 것을 사용하였다. 글리세롤(Glycerol)은 Aldrich사 또는 LG H&H사의 것을 사용하였다.
실시예 1. 분쇄 Lipozyme 435를 사용한 트리글리세라이드 오일의 제조(Lipozyme 435: 1%, 반응 온도: 90℃)
반응부에 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(EPA EE, 100g)오일, 글리세롤(Glycerol, 9.11g) 및 효소(Lipozyme 435, 300㎛이하, 1g)를 투입하고 감압(2.5mbar 이하) 조건 하에서 교반하였다. 반응 온도를 90℃까지 승온 교반하였다. 반응시간 24시간 후에 반응을 종결하고 실온으로 냉각한 후 여과하여 트리글리세라이드 오일을 제조하였다. 제조한 오일은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하여 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(eicosapentaenoic acid ethyl ester: EPA EE), 에이코사펜타엔산 다이글리세라이드(Dieicosapentaenoyl glycerol: DG-EPA) 및 에이코사펜타엔산 트리글리세라이드(1,2,3-Trieicosapentaenoyl Glycerol: rTG-EPA)를 확인하였다(표 1).
실시예 2. 분쇄 Lipozyme 435를 사용한 트리글리세라이드 오일의 제조(Lipozyme 435: 3%, 반응 온도: 50℃)
반응부에 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(EPA EE, 100g)오일, 글리세롤(Glycerol, 9.11g) 및 효소(Lipozyme 435, 300㎛이하, 3g)를 투입하고 감압(2.5mbar 이하) 조건 하에서 교반하였다. 반응 온도를 50℃까지 승온 교반하였다. 반응시간 24시간 후에 반응을 종결하고 실온으로 냉각한 후 여과하여 트리글리세라이드 오일을 제조하였다. 제조한 오일은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하여 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(eicosapentaenoic acid ethyl ester: EPA EE), 에이코사펜타엔산 다이글리세라이드(Dieicosapentaenoyl glycerol: DG-EPA) 및 에이코사펜타엔산 트리글리세라이드(1,2,3-Trieicosapentaenoyl Glycerol: rTG-EPA)를 확인하였다(표 1).
실시예 3. 분쇄 Lipozyme 435를 사용한 트리글리세라이드 오일의 제조(Lipozyme 435: 1%, 반응 온도: 70℃)
반응부에 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(EPA EE, 100g)오일, 글리세롤(Glycerol, 9.11g) 및 효소(Lipozyme 435, 300㎛이하, 1g)를 투입하고 감압(2.5mbar 이하) 조건 하에서 교반하였다. 반응 온도를 70℃까지 승온 교반하였다. 반응시간 24시간 후에 반응을 종결하고 실온으로 냉각한 후 여과하여 트리글리세라이드 오일을 제조하였다. 제조한 오일은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하여 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(eicosapentaenoic acid ethyl ester: EPA EE), 에이코사펜타엔산 다이글리세라이드(Dieicosapentaenoyl glycerol: DG-EPA) 및 에이코사펜타엔산 트리글리세라이드(1,2,3-Trieicosapentaenoyl Glycerol: rTG-EPA)를 확인하였다(표 1).
실시예 4. 분쇄 Lipozyme 435를 사용한 트리글리세라이드 오일의 제조(Lipozyme 435: 0.25%, 반응 온도: 110℃)
반응부에 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(EPA EE, 100g)오일, 글리세롤(Glycerol, 9.12g) 및 효소(Lipozyme 435, 300㎛이하, 0.25g)를 투입하고 감압(2.5mbar 이하) 조건 하에서 교반하였다. 반응 온도를 110℃까지 승온 교반하였다. 반응시간 24시간 후에 반응을 종결하고 실온으로 냉각한 후 여과하여 트리글리세라이드 오일을 제조하였다. 제조한 오일은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하여 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(eicosapentaenoic acid ethyl ester: EPA EE), 에이코사펜타엔산 다이글리세라이드(Dieicosapentaenoyl glycerol: DG-EPA) 및 에이코사펜타엔산 트리글리세라이드(1,2,3-Trieicosapentaenoyl Glycerol: rTG-EPA)를 확인하였다(표 1).
실시예 5. 분쇄 Lipozyme 435를 사용한 트리글리세라이드 오일의 제조(Lipozyme 435: 0.5%, 반응 온도: 110℃)
반응부에 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(EPA EE, 100g)오일, 글리세롤(Glycerol, 9.12g) 및 효소(Lipozyme 435, 300㎛이하, 0.5g)를 투입하고 감압(2.5mbar 이하)조건 하에서 교반하였다. 반응 온도를 110℃까지 승온 교반하였다. 반응시간 24시간 후에 반응을 종결하고 실온으로 냉각한 후 여과하여 트리글리세라이드 오일을 제조하였다. 제조한 오일은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하여 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(eicosapentaenoic acid ethyl ester: EPA EE), 에이코사펜타엔산 다이글리세라이드(Dieicosapentaenoyl glycerol: DG-EPA) 및 에이코사펜타엔산 트리글리세라이드(1,2,3-Trieicosapentaenoyl Glycerol: rTG-EPA)를 확인하였다(표 1).
실시예 6. 분쇄 Lipozyme 435를 사용한 트리글리세라이드 오일의 제조(Lipozyme 435: 1%, 반응 온도: 110℃)
반응부에 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(EPA EE,27.88g)오일, 글리세롤(Glycerol, 2.54g) 및 효소(Lipozyme 435, 300㎛이하, 0.279g)를 투입하고 감압(2.5mbar 이하) 조건 하에서 교반하였다. 반응 온도를 110℃까지 승온 교반하였다. 반응시간 24시간 후에 반응을 종결하고 실온으로 냉각한 후 여과하여 트리글리세라이드 오일을 제조하였다. 제조한 오일은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하여 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(eicosapentaenoic acid ethyl ester: EPA EE), 에이코사펜타엔산 다이글리세라이드(Dieicosapentaenoyl glycerol: DG-EPA) 및 에이코사펜타엔산 트리글리세라이드(1,2,3-Trieicosapentaenoyl Glycerol: rTG-EPA)를 확인하였다(표 1).
실시예 7. 분쇄 Lipozyme 435를 사용한 트리글리세라이드 오일의 제조(Lipozyme 435: 1.5%, 반응 온도: 110℃)
반응부에 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(EPA EE, 100g)오일, 글리세롤(Glycerol, 9.15g) 및 효소(Lipozyme 435, 300㎛이하, 1.5g)를 투입하고 감압(2.5mbar 이하) 조건 하에서 교반하였다. 반응 온도를 110℃까지 승온 교반하였다. 반응시간 24시간 후에 반응을 종결하고 실온으로 냉각한 후 여과하여 트리글리세라이드 오일을 제조하였다. 제조한 오일은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하여 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(eicosapentaenoic acid ethyl ester: EPA EE), 에이코사펜타엔산 다이글리세라이드(Dieicosapentaenoyl glycerol: DG-EPA) 및 에이코사펜타엔산 트리글리세라이드(1,2,3-Trieicosapentaenoyl Glycerol: rTG-EPA)를 확인하였다(표 1).
실시예 8. 분쇄 Lipozyme 435를 사용한 트리글리세라이드 오일의 제조(Lipozyme 435: 1.5%, 반응 온도: 130℃)
반응부에 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(EPA EE, 100g)오일, 글리세롤(Glycerol, 9.15g) 및 효소(Lipozyme 435, 300㎛이하, 1.5g)를 투입하고 감압(2.5mbar 이하) 조건 하에서 교반하였다. 반응 온도를 130℃까지 승온 교반하였다. 반응시간 24시간 후에 반응을 종결하고 실온으로 냉각한 후 여과하여 트리글리세라이드 오일을 제조하였다. 제조한 오일은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하여 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(eicosapentaenoic acid ethyl ester: EPA EE), 에이코사펜타엔산 다이글리세라이드(Dieicosapentaenoyl glycerol: DG-EPA) 및 에이코사펜타엔산 트리글리세라이드(1,2,3-Trieicosapentaenoyl Glycerol: rTG-EPA)를 확인하였다(표 1).
상기 실시예 1 내지 8에 따른 HPLC 분석 결과를 하기 표 1로 나타낸다.
[표 1] Lipozyme 435 투입량 및 반응 온도에 따른 반응성 분석
Figure pat00001
상기 표에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따라 고함량의 오메가-3 트리글리세라이드를 제조할 수 있다.
실시예 9. 대량 생산 가능성 확인실험
반응부에 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(EPA EE, 2kg)오일, 글리세롤(Glycerol, 183.4g) 및 효소(Lipozyme 435, 300㎛이하, 30g)를 투입하고 감압(2.5mbar) 조건 하에서 교반하였다. 110℃ 까지 승온 교반하였다. 반응시간 48시간 후에 반응을 종결하고 실온으로 냉각한 후 토코페롤 10g을 첨가하고 30분 동안 교반한 후 여과하여 트리글리세라이드 오일(1.8kg)을 제조하였다. 제조한 오일은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하여 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(eicosapentaenoic acid ethyl ester: EPA EE), 에이코사펜타엔산 다이글리세라이드(Dieicosapentaenoyl glycerol: DG-EPA) 및 에이코사펜타엔산 트리글리세라이드(1,2,3-Trieicosapentaenoyl Glycerol: rTG-EPA)를 확인하였다(표 2).
[표 2] 대량생산 조건 및 반응성 분석
Figure pat00002
비교예 1. 비교 트리글리세라이드 오일의 제조
반응부에 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(EPA EE, 96.4%, 100g)오일, 글리세롤(Glycerol, 9.12g)을 혼합한 후 45℃에서 30분간 탈기하였다. 효소(Lipozyme 435, 5g)를 투입하여 혼합한 후 60℃, 감압(2.5mbar) 조건 하에서 교반하였다. 반응시간 48시간 후에 반응을 종결하고 실온으로 냉각한 후 여과하여 트리글리세라이드 오일을 제조하였다. 제조한 오일은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하여 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(eicosapentaenoic acid ethyl ester: EPA EE), 에이코사펜타엔산 다이글리세라이드(Dieicosapentaenoyl glycerol: DG-EPA) 및 에이코사펜타엔산 트리글리세라이드(1,2,3-Trieicosapentaenoyl Glycerol: rTG-EPA)를 확인하였다(표 3).
[표 3] 반응성 비교
Figure pat00003
실험예 1. 오메가 3 지방산 함량
실시예 9에서 제조한 에이코사펜타엔산 트리글리세라이드(1,2,3- Trieicosapentaenoyl Glycerol: rTG-EPA) 원료의 오메가-3 지방산 함량을 분석하였다. 오메가-3 지방산 함량은 미국 약전(USP)의 <401> FATS AND FIXED OILS에 기재된 내용으로 진행하였다.
[표 4] 대량 생산 시료의 함량 분석
Figure pat00004
상기 표에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 오메가-3 트리글리세라이드에서 높은 오메가-3 지방산의 함량을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
실험예 2. 트리글리세라이드의 순도 분석
실시예 9에서 제조한 에이코사펜타엔산 트리글리세라이드(rTG-EPA, 1,2,3- Trieicosapentaenoyl Glycerol)의 트리글리세라이드 순도를 분석하였다. 트리글리세라이드 순도는 미국 약전(USP)의 <401> FATS AND FIXED OILS에 기재된 HPLC-RID 분석법과 Naohiro Gotoh et al.[Quantification Method for Triglyceride Molecular Species in Fish Oil with High Performance Liquid chromatography-Ultraviolet Detector-Evaporative Light Scattering Detector, Journal of Oleo Science, 55(9), 457-463, 2006]에 기재된 내용을 참고하여 수정한 HPLC-UV 분석법으로 진행하였다. HPLC-UV 분석법의 경우 에이코사펜타엔산 에틸에스테르(eicosapentaenoic acid ethyl ester: EPA EE), 도코사헥사엔산 에틸에스테르(docosahexaenoic acid ethyl ester: DHA EE), 에이코사펜타엔산 다이글리세라이드(Dieicosapentaenoyl glycerol: DG-EPA), 도코사헥사엔산 다이글리세라이드(Didocosahexaenoyl glycerol: DG-DHA), 에이코사펜타엔산 트리글리세라이드(1,2,3- Trieicosapentaenoyl Glycerol: rTG-EPA) 및 도코사헥사엔산 트리글리세라이드(1,2,3- Tridocosahexaenoyl Glycerol: rTG-DHA)를 분리 분석 가능하며, HPLC-RID 분석법의 경우 다이글리세라이드(Omega-3 acid diglycerides: DG-Omega-3) 및 트리글리세라이드(Omega-3 acid triglycerides: rTG-Omega-3)를 분석 가능하다.
본 발명에서 사용된 HPLC-UV 분석 조건은 다음과 같다
검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 : 210nm)
칼럼 : Kromasil C18 (250 × 4.6mm, 5㎛)
칼럼온도 : 25℃
주입량 : 5.0㎕
유량 : 0.8mL/min
이동상A : 이소프로필알코올
이동상B : 아세토니트릴
[표 5]
Figure pat00005
[표 6] 순도 분석(HPLC, UV)
Figure pat00006
[표 7] 순도 분석(HPLC, RID)
Figure pat00007
상기 표에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 오메가-3 트리글리세라이드는 높은 트리글리세라이드 순도를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
실험예 3. 시료의 산패도 측정
실시예 9에서 제조한 트리글리세라이드(TG) 오일의 산패도를 측정하였다.
산가(Acid Value) 측정
제조한 오일（실시예 9)의 산가(Acid Value)는 미국 약전(USP)의 <401> FATS AND FIXED OILS에 기재된 내용으로 진행하였다. 오일 10g에 에탄올과 에테르를 1:1의 비율로 만든 용액 50mL를 넣고 혼합한 후 페놀프탈레인 지시약을 1mL 넣어 혼합액을 제조하였다. 0.1N 수산화칼륨 수용액으로 미홍색이 30초 이상 유지될 때까지 적정하여 다음과 같은 방법으로 계산하였다.
산가(mg KOH/g) = (M × V) × (N/W)
(여기서 M은 수산화칼륨의 분자량 56.11, V는 수산화칼륨의 적정량, N은 수산화칼륨의 노르말농도, W는 오일의 양이다.)
과산화물가(Peroxide Value) 측정
제조한 오일(실시예 9)의 과산화물가(Peroxide Value)는 미국 약전(USP)의 <401> FATS AND FIXED OILS에 기재된 내용으로 진행하였다. 오일 5g에 아세트산과 클로로포름을 3:2의 비율로 혼합한 용액 30mL를 넣고 혼합시킨 후 포화 요오드화칼륨 용액 0.5mL를 넣고 1분간 교반하였다. 정제수 30mL를 넣은 후 0.01N 티오황산나트륨으로 노란색이 사라질 때까지 적정하였다. 추가로 전분시액 5mL를 넣은 후 0.01N 티오황산나트륨으로 청색이 사라질 때까지 적정하여 다음과 같은 방법으로 계산하였다.
과산화물가(meq/g) = [1000(VT - VB) × N]/W
(여기서 VT는 실시험액의 티오황산나트륨 적정량, VB는 공시험액의 티오황산나트륨 적정량, N은 티오황산나트륨의 노르말농도, W는 오일의 양이다.)
아니시딘가(Anisidine Value) 측정
제조한 오일(실시예 9)의 아니시딘가(Anisidine Value)는 미국 약전(USP)의 <401> FATS AND FIXED OILS에 기재된 내용으로 진행하였다. 오일 0.5g에 아이소옥테인 25mL를 넣고 혼합시킨 후(Test solution A) 아이소옥테인을 공시험액으로 350nm에서 흡광도(AB)를 측정하였다. Test solution A 1mL와 p-아니시딘 용액(p-아니시딘 25g/아세트산 1L) 5mL를 혼합시킨 후(Test solution B) 10분간 방치하고 p-아니시딘 용액을 표준용액으로 350nm에서 흡광도(AS)를 측정하여 다음과 같은 방법으로 계산하였다.
아니시딘가 = [25 × (1.2AS - AB)]/W
(여기서 AS는 Test solution B의 흡광도, AB는 Test solution A의 흡광도, W는 오일의 양이다.)
총산화가(Total Oxidation Value)
제조한 오일(실시예 9)의 총산화가(Total Oxidation Value)는 미국 약전(USP)의 <401> FATS AND FIXED OILS에 기재된 내용으로 진행하였다. 상기 방법으로 과산화물가, 아니시딘가를 측정한 후 다음과 같은 방법으로 계산하였다.
총산화가 = 2PV + AV
[여기서 PV는 과산화물가(Peroxide Value), AV는 아니시딘가(Anisidine Value)이다.]
[표 8] 산패물 분석
Figure pat00008
상기 표에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 따른 오메가-3 트리글리세라이드는 우수한 안정성을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
시험예 1. 체내 흡수율 및 반감기 확인 실험
1. 실험 방법
1.1 실험동물 및 시험군의 구성
실험동물은 5주령 (150-200 g)의 Sprague-Dawley (SD) 수컷 랫트(male Rat) 25마리를 구입하여 사용하였다. 처음 1주일은 pellet 형태의 chow 식이로 적응시킨 후 난괴법(randomized complete block design)에 의해 아래 표와 같이 5군으로 나누었다. 모든 실험동물은 개개의 케이지(cage)에 사육하였으며 사육실 환경은 항온 (24℃), 항습 55%를 유지시키고 12시간 간격의 light cycle을 유지하였다. 시료 흡수율 실험은 6주령 (200-250 g)의 SD 수컷 랫트(male rat)를 사용하였으며, 전날 사료를 제거하여 17시간 절식을 시키고 시료 경구투여 시점부터 시간별 (0.5, 1, 2, 3, 6 h)로 경정맥 채혈하고 혈액분석을 진행하였다.
[표 9] 실험군의 구성
Figure pat00009
시험 물질인 CKD EPA rTG omega-3는 실시예 9에 따라 제조된 오메가-3 트리글리세라이드이다.
1.2 지질 추출
혈액(Whole blood) (1 mL)을 0.9% NaCl(5 mL)로 2번 세척하고 매번 상등액은 버렸다. 지질을 50 mg/L 뷰틸레이트하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene) (BHT)이 항산화제로 함유된 클로로포름/메탄올(chloroform/methanol) (2:1 v/v; 5mL)로 추출하였다. 사전에 디에틸 에테르(diethyl ether)로 세척된 황산나트륨 컬럼(sodium sulphate column)을 통해 디에틸 에테르 (2 mL)로 지질 추출물을 세척하고 건조한 후 클로로포름 (1 mL)으로 재용해하였다. 지질 추출물을 아미노프로필실리카 컬럼(aminopropylsilica column)에 넣은 후 클로로포름을 사용하여 트리아실클리세롤(triacylglycerol)과 콜레스테롤 에스테르 분획(cholesteryl ester fraction)을 추출하였다.
1.3 인지질 분리 및 비누화
지질 추출물에 클로로포름/메탄올(chloroform/methanol) (60:40 v/v) 2 mL를 추가하여 인지질을 추출하고 건조하였다. 2 M 수산화나트륨(sodium hydroxide)으로 메탄올 1 mL에서 1시간 동안 80℃로 비누화하였다.
1.4 FAME (fatty acid methyl ester)형성
FAME을 메탄올 1 mL에서 25% BF3로 80℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 형성시켰다. FAME을 식힌 다음 헥산(hexane)으로 추출하고, 이때, 내부 표준품 10 μg/mL를 포함한 60 μL 헥산으로 재용해하고 이를 GC-MS 시료로 사용하였다.
1.5 EPA 정량
내부표준물질의 양을 일정하게 하고 표준물질의 기지량을 각각 단계적 농도가 되도록 첨가하여 표준액을 만들었다. 각 표준액을 가지고 각 원소의 분석선파장에서 표준물질에 의한 흡광도 및 내부표준물질에 의한 흡광도를 같은 조건으로 측정하여 표준물질에 의한 흡광도와 내부표준물질에 의한 흡광도와의 비를 구하였다. 표준물질의 양(농도)을 가로축으로 하고 흡광도비를 세로축으로 하여 검량선을 작성하였다. 검액을 만들 때에는 미리 표준액의 경우와 같은 양의 내부표준물질을 넣었다. 다음에 검량선을 작성할 때와 같은 조건으로 얻은 목적성분에 의한 흡광도와 내부표준물질에 의한 흡광도와의 비를 구하여 검량선에서 목적성분의 양(농도)을 구하였다.
본 발명에서 사용된 GC-MS 분석 조건은 다음과 같다.
GC parameter
Column : Agilent DB23 capillary column (60 m X 0.25 mm X 0.25 μm)
Carrier Gas : Helium
Carrier Gas Flow Rate : 1.0 mL/min
Inlet Temperature : 250℃
Oven Temperature : 50℃(1 min)→25℃/min→175℃→4℃/min→235℃(9 min)
MS parameter
MS Transfer line temperature : 240℃
Retention Time : 22.943
m/z : 79.1 and 91.1
2. 실험 결과
2.1 체내 흡수율
체내 흡수율 결과를 도 1 및 하기 표 10에 나타낸다.
[표 10] 체내 흡수율 분석 결과
Figure pat00010
체내 흡수율 확인 결과, CKD EPA rTG 오메가-3는 2세대 오메가-3 시제품(G3 투여군)과 비교하여 51.7 mg/kg 용량(G6 투여군)의 6시간(p<0.05) 샘플과 103.4 mg/kg 용량(G7 투여군)의 2시간(p<0.01), 3시간(p<0.05) 샘플에서 통계적으로 유의한 혈중 EPA 농도의 증가를 보였다.
CKD EPA rTG 오메가-3는 3세대 오메가-3 시제품(G4 투여군)과 비교하여 51.7 mg/kg 용량(G6 투여군)의 6시간(p<0.01) 샘플과 103.4 mg/kg 용량(G7 투여군)의 6시간(p<0.05) 샘플에서 통계적으로 유의한 혈중 EPA 농도의 증가를 보였다.
CKD EPA rTG 오메가-3는 식물성 오메가-3 시제품(G5 투여군)과 비교하여 51.7 mg/kg 용량(G6 투여군)의 6시간(p<0.01) 샘플과 103.4 mg/kg 용량(G7 투여군)의 2, 3 및 6시간(p<0.05) 샘플에서 통계적으로 유의한 혈중 EPA 농도의 증가를 보였다.
2.2 체내 반감기
체내 반감기 결과를 도 2및 하기 표 11에 나타낸다.
[표 11] 체내 반감기 분석 결과
Figure pat00011
체내 반감기 확인 결과, CKD EPA rTG 오메가-3는 AUC가 0.527 h*mg/L인 2세대 오메가-3 시제품(G3 투여군)과 비교하여, 51.7 mg/kg 용량(G6 투여군)에서 3.889 h*mg/L(p<0.05), 103.4 mg/kg 용량(G7 투여군)에서 5.183 h*mg/L(p<0.01)로 통계적으로 유의한 증가를 보였다.
CKD EPA rTG 오메가-3는 AUC가 1.838 h*mg/L인 3세대 오메가-3 시제품(G4 투여군)과 비교하여, 103.4 mg/kg 용량(G7 투여군)에서 5.183 h*mg/L(p<0.05)로 통계적으로 유의한 증가를 보였다.
CKD EPA rTG 오메가-3는 AUC가 1.409 h*mg/L인 식물성 오메가-3 시제품(G5 투여군)과 비교하여, 103.4 mg/kg 용량(G7 투여군)에서 5.183 h*mg/L(p<0.05)로 통계적으로 유의한 증가를 보였다.
따라서, 본 발명에 따라 제조된 오메가-3 트리글리세라이드는 우수한 체내 흡수율을 나타낼 수 있고 체내 반감기가 증가될 수 있으며, 우수한 생체이용률을 나타낼 수 있음을 확인할 수 있다.

Claims (24)

  1. 오메가 3 지방산 에틸에스테르와 글리세롤 및 효소를 진공 조건에서 반응시키는 단계를 포함하는 고 함량 및 고 순도의 오메가-3 트리글리세라이드의 제조방법.
  2. 제1항 있어서, 효소가 리조푸스속(Rhizopus sp.) 미생물, 아스퍼질러스속(Aspergillus sp.) 미생물 또는 뮤커속(Mucorsp.) 미생물에서 유래한 리파아제 또는 비위치 특이성 리파아제인 칸디다 실린드라세아(Candida cylindracea) 또는 칸디다 안타르티카(Candida antarctica)에서 유래한 리파아제인 제조방법.
  3. 제2항에 있어서 효소가 칸디다 안타르티카(Candida antarctica)에서 유래한 리포자임(Lipozyme 435)인 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 효소가 분쇄 효소인 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 효소의 입자 크기가 300㎛ 이하인 제조방법.
  6. 제1항 있어서, 효소의 투입량은 오메가-3 지방산 에틸에스테르에 대해 10 중량% 이하인 제조방법.
  7. 제6항 있어서, 효소의 투입량은 오메가-3 지방산 에틸에스테르에 대해 5 중량% 미만인 제조방법.
  8. 제1항 있어서, 효소의 투입량은 오메가-3 지방산 에틸에스테르에 대해 0.25 중량% 초과인 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 반응 온도가 40 내지 130℃인 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 반응 온도가 70 내지 130℃인 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 반응 온도가 80 내지 120℃인 제조방법.
  12. 제1항에 있어서, 오메가-3 지방산 에틸에스테르가 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA), α-리놀렌산(α-linolenic acid: ALA), 도코사펜타에노산(docosapentaenoic acid: DAP), 및 스테아리돈산(stearidonic acid: SDA) 중 선택된 적어도 하나를 포함하는 것인 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 오메가-3 지방산 에틸에스테르가 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA) 및 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA) 중 선택된 적어도 하나를 포함하는 것인 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 오메가-3 지방산 에틸에스테르가 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)을 포함하는 것인 제조방법
  15. 제1항에 있어서, 오메가-3 지방산 에틸에스테르는 글리세롤에 대해 2.0 내지 3.5 당량인 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 오메가-3 지방산 에틸에스테르는 글리세롤에 대해 2.5 내지 3.0 당량인 제조방법.
  17. 제1항에 있어서, 진공도가 0.05 내지 5 mbar인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 반응시키는 단계에서 합성된 오메가-3 트리글리세라이드 중에 단일 오메가-3 성분의 트리글리세라이드 순도가 70% 이상인 제조방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 반응시키는 단계에서 합성된 오메가-3 트리글리세라이드 중에 단일 오메가-3 성분의 트리글리세라이드 순도가 80% 이상인 제조방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 반응시키는 단계에서 합성된 오메가-3 트리글리세라이드 중에 단일 오메가-3 성분의 트리글리세라이드 순도가 85% 이상인 제조방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 반응시키는 단계에서 합성된 오메가-3 트리글리세라이드 중에 단일 오메가-3 성분의 함량이 80% 이상인 제조방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 반응시키는 단계에서 합성된 오메가-3 트리글리세라이드 중에 단일 오메가-3 성분의 함량이 85% 이상인 제조방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 반응시키는 단계에서 합성된 오메가-3 트리글리세라이드 중에 단일 오메가-3 성분의 함량이 90% 이상인 제조방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따라 제조된 오메가-3 트리글리세라이드.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6143143A (ja) 1984-08-03 1986-03-01 Nisshin Flour Milling Co Ltd エイコサペンタエン酸のグリセリンエステルおよびその製法
JPH0672959A (ja) 1991-03-28 1994-03-15 Agency Of Ind Science & Technol エイコサペンタエン酸トリグリセリド及びその製造法
KR20110069421A (ko) 2009-12-17 2011-06-23 (주) 켐포트 고도 불포화 지방산을 고농도로 함유하는 트리글리세라이드 유지의 제조방법
KR20180082207A (ko) 2017-01-10 2018-07-18 부경대학교 산학협력단 rTG 오메가 3 지방산을 함유하는 오일의 제조 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2731015B1 (fr) * 1995-02-24 1997-05-30 Sci Sartone Procede d'enrichissement enzymatique d'huiles d'origine marine et les triglycerides d'acides gras polyinsatures ainsi obtenus
JP4530311B2 (ja) * 2000-07-13 2010-08-25 日本水産株式会社 リパーゼを用いたグリセライドの製造方法
JP4394598B2 (ja) * 2004-08-24 2010-01-06 日清オイリオグループ株式会社 リパーゼ粉末組成物及びそれを用いたエステル化物の製造方法
CN101348807B (zh) * 2008-08-26 2011-07-27 江南大学 一种从鱼油中富集n-3多不饱和脂肪酸甘油酯的方法
CN110325637B (zh) * 2016-12-19 2023-07-18 转换生物柴油有限公司 甘油酯形式的n-3脂肪酸的酶促富集

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6143143A (ja) 1984-08-03 1986-03-01 Nisshin Flour Milling Co Ltd エイコサペンタエン酸のグリセリンエステルおよびその製法
JPH0672959A (ja) 1991-03-28 1994-03-15 Agency Of Ind Science & Technol エイコサペンタエン酸トリグリセリド及びその製造法
KR20110069421A (ko) 2009-12-17 2011-06-23 (주) 켐포트 고도 불포화 지방산을 고농도로 함유하는 트리글리세라이드 유지의 제조방법
KR20180082207A (ko) 2017-01-10 2018-07-18 부경대학교 산학협력단 rTG 오메가 3 지방산을 함유하는 오일의 제조 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 83 (2010) 137-141
World Rev. Nutr. Diet. 102: 92-97 (2011)

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