CN111394345A - 一种定向催化酯化反应的固载酶及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物化工技术领域，具体公开了一种定向催化酯化反应的固载酶及其制备方法与应用。所述方法包括如下步骤：将南极假丝酵母脂肪酶与HEPES缓冲液混合，配制得到HEPES‑脂肪酶液；然后将所得HEPES‑脂肪酶液与GMP或AMP母液混合得到混合溶液，再加入金属离子混合均匀，过滤后冷冻干燥，得到固载酶。本发明固载酶制备方法简单，所得固载酶其酶活性高，能高效催化酯化反应，并且重复利用性好，但是它不能催化醇解反应，具有定向催化性质，即能催化酯化反应而不能催化醇解反应，因此本发明具有非常好的应用前景。

Description

一种定向催化酯化反应的固载酶及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一种定向催化酯化反应的固载酶及其制备方法与应用。
背景技术
脂肪酶(lipase,E.C.3.1.1.3)即三酰基甘油酯水解酶，其功能是催化水解天然油脂，生成甘油二酯、甘油一酯、游离脂肪酸以及甘油，彻底水解油脂得到的是游离脂肪酸和甘油。脂肪酶除了催化水解反应之外，还可以催化其他反应，包括酯化反应、酯交换反应以及醇解反应。脂肪酶的这些性质，使其广泛应用于食品、化工、制药等行业。但是，游离态的脂肪酶存在较多的问题，包括稳定性差、易失活、无法回收重复利用、反应后混入产品中造成分离困难等，因此，脂肪酶在工业化的应用仍存在较大的困难。脂肪酶的固定化可实现其重复利用，采用适宜的载体以及固定化工艺，可得到酶学性质优良(酶活高、稳定性好等)的固定化酶。
脂肪酶的固定化，目前研究较多的是侧重于提高酶活、热稳定性、重复利用性、耐pH能力等基本酶学性质方面。对于酶的选择性催化(定向催化)的研究相对较少。脂肪酶除了可以催化水解反应，同时还可以催化酯化、酯交换、醇解等反应。但是，在实际过程中，并不希望它同时催化较多的反应以避免副产物的生成。比如，在高酸价油脂的酶促脱酸工艺或者在一些特定甘油三酯酯化制备过程中，采用脂肪酶催化酯化反应可将游离脂肪酸转化为甘油三酯；但是，由于脂肪酶同时也能催化醇解反应，醇解反应的进行使得(生成的)甘油三酯与甘油反应，生成了甘油一酯和甘油二酯，降低了目标产物甘油三酯的含量。因此，定向催化性质的固定化酶具有尤其重要的应用前景。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种定向催化酯化反应的固载酶的制备方法。
本发明另一目的在于提供一种上述方法制备得到的定向催化酯化反应的固载酶。
本发明再一目的在于提供上述定向催化酯化反应的固载酶在生物酶催化剂中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种定向催化酯化反应的固载酶的制备方法，包括如下步骤：
将南极假丝酵母脂肪酶与HEPES缓冲液混合，配制得到HEPES-脂肪酶液；然后将所得HEPES-脂肪酶液与核苷酸二钠盐母液混合得到混合溶液，再加入金属离子混合均匀，过滤后冷冻干燥，得到固载酶。
所述HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)缓冲液的浓度为0.07-0.35g/ml，pH为5.8-8.3；
所述HEPES-脂肪酶液中南极假丝酵母脂肪酶的浓度(蛋白浓度)为0.36～12.3mg/ml；
所述核苷酸二钠盐为GMP(鸟苷酸-5’-单磷酸二钠盐)和AMP(5’-腺嘌呤核苷酸二钠盐)中的至少一种。
所述核苷酸二钠盐母液的浓度为0.014-0.08g/ml。
所述HEPES-脂肪酶液与核苷酸二钠盐母液的体积比为0.2～1:1，优选为0.4～0.6:1。
所述金属离子为镧(La3+)、铈(Ce3+)、镨(Pr3+)、钕(Nd3+)、钐(Sm3+)、铕(Eu3+)、钆(Gd3+)、铽(Tb3+)、镝(Dy3+)、钬(Ho3+)、铒(Er3+)、铥(Tm3+)、镱(Yb3+)、镥(Lu3+)、钪(Sc3+)、钇(Y3+)、锌(Zn2+)、铜(Cu2+)、铁(Fe3+)、镉(Cd2+)和锆(Zr4+)中的至少一种。
所述金属离子的用量满足其在混合溶液中的浓度为0.03-0.31mol/l。
一种定向催化酯化反应的固载酶，通过上述方法制备得到。
所述定向催化酯化反应的固载酶作为生物酶催化剂的应用。
所述的定向催化酯化反应固载酶，其“定向”专门指能高效催化酯化反应、但是不能催化醇解反应；
所述的醇解反应包括(1)甘油与甘油三酯反应，(2)甘油一酯与甘油三酯的反应，(3)以及其他如甲醇、乙醇、丁醇等脂肪醇与甘油三酯的反应。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
本发明固载酶制备方法简单，所得固载酶其酶活性高，能高效催化酯化反应，并且重复利用性好，但是它不能催化醇解反应，具有定向催化性质，即能催化酯化反应而不能催化醇解反应，因此本发明具有非常好的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。实施例中所用南极假丝酵母脂肪酶B购买于北京诺维信(Novozyme,Beijing，China)
实施例1
(1)HEPES缓冲液制备：称取2.0g HEPES溶解在水中，调节pH 6.5，定容至25ml，低温保存；
(2)HEPES-脂肪酶溶液制备：取100mg南极假丝酵母脂肪酶B溶解在上述(1)缓冲液中，低温保存；
(3)AMP母液制备：称取0.2g AMP溶解在水中，定容至10ml，低温保存；
(4)Cu2+母液制备：称取0.16g无水氯化铜溶解定容在10ml，低温保存；
(5)固载酶制备：取0.4ml HEPES-脂肪酶溶液与1.0ml AMP溶液混合，然后加入1.2ml Cu2+母液混合。静置，离心，弃上清液后，冷冻干燥，得到固载酶。
(6)将所得的固载酶应用于甘油与油酸酯化反应，反应条件为：甘油0.4605g，油酸4.2369g，固载酶0.20g于三口反应瓶，70℃油浴搅拌反应24h(200rpm)；反应后的产物组成采用HPLC-ELSD检测，结果为：油酸5.05％，油酸甘油一酯0.83％，油酸甘油二酯6.08％，油酸甘油三酯88.04％。
(7)将所得的固载酶应用与甘油与大豆油的醇解反应，反应条件为：甘油0.184g，大豆油3.52g，固载酶0.15g于单口反应瓶，60℃油浴搅拌反应12h(200rpm)；反应后的产物组成采用HPLC-ELSD检测，结果为：大豆油转化率几乎为零，即甘油解反应没有进行。
实施例2
(1)HEPES缓冲液制备：称取3.0g HEPES溶解在水中，调节pH 7.3，定容至40ml，低温保存；
(2)HEPES-脂肪酶溶液制备：取200mg南极假丝酵母脂肪酶B溶解在上述(1)缓冲液中，低温保存；
(3)GMP母液制备：称取0.3g GMP溶解在水中，定容至10ml，低温保存；
(4)Tb3+母液制备：称取0.37g六水合氯化铽溶解定容在10ml，低温保存；
(5)固载酶制备：取0.6ml HEPES-脂肪酶溶液与1.0ml GMP溶液混合，然后加入1.0ml Tb3+母液混合。静置，离心，弃上清液后，冷冻干燥，得到固载酶。
(6)将所得的固载酶应用于甘油与油酸酯化反应，反应条件为：甘油0.4605g，棕榈酸3.846g，固载酶0.20g于三口反应瓶，70℃油浴搅拌反应24h(200rpm)；反应后的产物组成采用HPLC-ELSD检测，结果为：棕榈酸0.9％，棕榈酸甘油一酯0.63％，棕榈酸甘油二酯5.14％，棕榈酸甘油三酯93.33％。
(7)将所得的固载酶应用与甘油与大豆油的醇解反应，反应条件为：甘油0.184g，棕榈油3.20g，固载酶0.20g于单口反应瓶，60℃油浴搅拌反应12h(200rpm)；反应后的产物组成采用HPLC-ELSD检测，结果为：棕榈油转化率几乎为零，即甘油解反应没有进行。
实施例3
(1)HEPES缓冲液制备：称取5.0g HEPES溶解在水中，调节pH 8.0，定容至50ml，低温保存；
(2)HEPES-脂肪酶溶液制备：取300mg南极假丝酵母脂肪酶A溶解在上述(1)缓冲液中，低温保存；
(3)GMP母液制备：称取0.3g AMP溶解在水中，定容至10ml，低温保存；
(4)Zn2+母液制备：称取0.15g无水氯化锌溶解定容在10ml，低温保存；
(5)固载酶制备：取0.5ml HEPES-脂肪酶溶液与1.0ml GMP溶液混合，然后加入1.2ml Zn2+母液混合。静置，离心，弃上清液后，冷冻干燥，得到固载酶。
(6)将所得的固载酶应用于甘油与油酸酯化反应，反应条件为：甘油0.4605g，月桂酸3.0045g，固载酶0.18g于三口反应瓶，70℃油浴搅拌反应24h(200rpm)；反应后的产物组成采用HPLC-ELSD检测，结果为：月桂酸4.65％，月桂酸甘油一酯0.92％，月桂酸甘油二酯7.21％，月桂酸甘油三酯87.22％。
(7)将所得的固载酶应用与甘油与大豆油的醇解反应，反应条件为：甘油0.184g，玉米油3.52g，固载酶0.20g于单口反应瓶，60℃油浴搅拌反应12h(200rpm)；反应后的产物组成采用HPLC-ELSD检测，结果为：玉米油转化率几乎为0，即甘油解反应没有进行。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种定向催化酯化反应的固载酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
将南极假丝酵母脂肪酶与HEPES缓冲液混合，配制得到HEPES-脂肪酶液；然后将所得HEPES-脂肪酶液与核苷酸二钠盐母液混合得到混合溶液，再加入金属离子混合均匀，过滤后冷冻干燥，得到固载酶。
2.根据权利要求1所述的定向催化酯化反应的固载酶的制备方法，其特征在于：所述HEPES-脂肪酶液中南极假丝酵母脂肪酶的浓度为0.36～12.3mg/ml。
3.根据权利要求1所述的定向催化酯化反应的固载酶的制备方法，其特征在于：所述HEPES缓冲液的浓度为0.07-0.35g/ml，pH为5.8-8.3。
4.根据权利要求1所述的定向催化酯化反应的固载酶的制备方法，其特征在于：
所述核苷酸二钠盐为GMP和AMP中的至少一种；
所述核苷酸二钠盐母液的浓度为0.014-0.08g/ml。
5.根据权利要求1所述的定向催化酯化反应的固载酶的制备方法，其特征在于：所述HEPES-脂肪酶液与核苷酸二钠盐母液的体积比为0.2～1:1。
6.根据权利要求1所述的定向催化酯化反应的固载酶的制备方法，其特征在于：所述金属离子为La3+、Ce3+、Pr3+、钕Nd3+、Sm3+、Eu3+、Gd3+、Tb3+、Dy3+、Ho3+、Er3+、Tm3+、Yb3+、Lu3+、Sc3+、Y3 +、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Cd2+和Zr4+中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的定向催化酯化反应的固载酶的制备方法，其特征在于：所述金属离子的用量满足其在混合溶液中的浓度为0.03-0.31mol/l。
8.一种定向催化酯化反应的固载酶，通过权利要求1-7所述任一项方法制备得到。
9.根据权利要求8所述定向催化酯化反应的固载酶作为生物酶催化剂的应用。
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