CN113583998B - 米糠脂肪酶的提取和保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了米糠脂肪酶的提取和保存方法，该方法包括以下步骤：将天然低共熔溶剂作为提取溶剂，加入米糠，加热提取，然后离心取上清液，该上清液中含有米糠脂肪酶；米糠脂肪酶保存在含有天然低共熔溶剂的该上清液中；所述天然低共熔溶剂的氢键受体化合物为氯化胆碱或脯氨酸；所述天然低共熔溶剂的氢键供体化合物为苹果酸、乳酸、甘油、乙酰胺、木糖醇、尿素或山梨醇中的一种。本发明利用植物源组分的天然低共熔溶剂作为提取溶剂和稳定助剂提取米糠脂肪酶，天然低共熔溶剂组分的弱酸/碱性破坏米糠的组织结构，利于脂肪酶的释放，提高了提取效率。同时本发明利用天然低共熔溶剂与米糠脂肪酶存在的氢键相互作用可提高米糠脂肪酶稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及米糠脂肪酶的提取和保存方法。
背景技术
米糠是一种典型的量大面广的农副产品资源，也是一种未充分利用的原料。
脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)，即三酰基甘油水解酶，是一类能够将长链脂肪酸甘油酯水解成甘二酯、单甘酯、甘油和脂肪酸的酶，除此，脂肪酶同样可以水解短链脂肪酸甘油酯。脂肪酶除了可以水解脂肪外，脂肪酶还具有催化酯化反应、酯交换反应、酸解反应、醇解反应以及氨解等反应的性质。此外，脂肪酶还具有催化底物特异性强、催化效率高、反应条件温和、副产物少等特点。
目前工业用脂肪酶主要依靠微生物发酵获得，微生物发酵法的生产工艺和下游提纯工艺复杂，对生产设备和运输储存也有严格的要求，以确保提升脂肪酶产能和维持酶的稳定性，生产规模扩张难度大，因此脂肪酶生产成本高，产能有限。
尽管现已报道的新型溶剂有离子液体等，因其成本或安全性问题难以满足规模化生产的要求，且提取脂肪酶效率低，因其高盐组分导致脂肪酶容易丧失活力，稳定性差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种米糠脂肪酶的提取和保存方法，将天然低共熔溶剂作为稳定助剂用于提取米糠脂肪酶，提高了米糠脂肪酶的提取效率、酶活和稳定性。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
米糠脂肪酶的提取和保存方法，包括以下步骤：
将天然低共熔溶剂作为提取溶剂，加入米糠，30～60℃下加热提取0.5～2.0h，然后离心取上清液，该上清液中含有米糠脂肪酶；米糠脂肪酶保存在含有天然低共熔溶剂的该上清液中，稳定剂大大提高。
所述的保存优选在4℃以下保存；
所述的米糠优选粉碎过40目使用，以提高提取效率；
所述的离心优选在10000rpm/min离心5min。
所述的天然低共熔溶剂由以下方法合成：
将氢键供体化合物和氢键受体化合物混合，水浴加热直至形成透明液体状溶剂，即为天然低共熔溶剂；
所述的氢键受体化合物为氯化胆碱或脯氨酸；
所述的氢键供体化合物为苹果酸、乳酸、甘油、乙酰胺、木糖醇、尿素或山梨醇中的一种；
所述氢键受体化合物与氢键供体化合物的摩尔比为2:1～1:2；
优选地，所述氢键受体化合物和氢键供体化合物为以下组合中的一种：氯化胆碱/苹果酸、氯化胆碱/乳酸、氯化胆碱/甘油、氯化胆碱/乙酰胺、氯化胆碱/木糖醇、氯化胆碱/尿素、氯化胆碱/山梨醇、脯氨酸/乳酸、脯氨酸/甘油；
所述的水浴加热优选80～100℃。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明利用植物源组分的天然低共熔溶剂作为提取溶剂和稳定助剂提取米糠脂肪酶，天然低共熔溶剂组分的弱酸/碱性破坏米糠的组织结构，利于脂肪酶的释放，提高了提取效率。同时本发明利用天然低共熔溶剂与米糠脂肪酶存在的氢键相互作用可提高米糠脂肪酶稳定性，这是现有技术不存在的技术启示。
2、天然低共熔溶剂具有可生物降解性、无毒性、环境友好、难挥发性和不易燃等特点，将天然低共熔溶剂用于提取米糠脂肪酶既具备提取溶剂功能又可作为其稳定剂，为脂肪酶在工业生产中的应用提供新策略。
3、本发明方法的提供工艺过程简单，具有更好的经济性和环保性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所涉及的米糠(丝苗米水稻)购于广东海纳农业有限公司。
实施例1
一种米糠脂肪酶的提取和保存方法，包括以下步骤：
(1)将氯化胆碱和苹果酸按摩尔比2:1混合，80℃水浴加热直至形成透明液体状溶剂，即为天然低共熔溶剂；
(2)取100g步骤(1)所得天然低共熔溶剂，称取过筛40目的米糠50g加入至上述溶剂中，在30℃水浴提取1h，提取后将混合物在10000rpm/min离心5min，取上层清液进行检测分析，测得提取液中蛋白质浓度70.5mg/g，提取率90.6％，米糠脂肪酶活力1234.7U。
将上层清液分别置于4℃、25℃、40℃贮存，定期检测上述米糠脂肪酶活力。
实施例2
一种米糠脂肪酶的提取和保存方法，包括以下步骤：
(1)将氯化胆碱和乳酸按摩尔比1:1混合，90℃水浴加热直至形成透明液体状溶剂，即为天然低共熔溶剂；
(2)取100g步骤(1)所得天然低共熔溶剂，称取过筛40目的米糠100g加入至上述溶剂中，在40℃水浴提取2h，提取后将混合物在10000rpm/min离心5min，取上层清液进行检测分析，测得提取液中蛋白质浓度86.3mg/g，提取率84.9％，米糠脂肪酶活力1857.6U。
将上层清液分别置于4℃、25℃、40℃贮存，定期检测上述米糠脂肪酶活力。
实施例3
一种米糠脂肪酶的提取和保存方法，包括以下步骤：
(1)将氯化胆碱和甘油按摩尔比1:2混合，80℃水浴加热直至形成透明液体状溶剂，即为天然低共熔溶剂；
(2)取100g步骤(1)所得天然低共熔溶剂，称取过筛40目的米糠50g加入至上述溶剂中，在40℃水浴提取1h，提取后将混合物在10000rpm/min离心5min，取上层清液进行检测分析，测得提取液中蛋白质浓度80.4mg/g，提取率95.6％，米糠脂肪酶活力2456.4U。
将上层清液分别置于4℃、25℃、40℃贮存，定期检测上述米糠脂肪酶活力。
实施例4
一种米糠脂肪酶的提取和保存方法，包括以下步骤：
(1)将氯化胆碱和木糖醇按摩尔比1.5:1混合，100℃水浴加热直至形成透明液体状溶剂，即为天然低共熔溶剂；
(2)取100g步骤(1)所得天然低共熔溶剂，，称取过筛40目的米糠50g加入至上述溶剂中，在50℃水浴提取0.5h，提取后将混合物在10000rpm/min离心5min，取上层清液进行检测分析，测得提取液中蛋白质浓度75.58mg/g，提取率90.6％，米糠脂肪酶活力2046.8U。
将上层清液分别置于4℃、25℃、40℃贮存，定期检测上述米糠脂肪酶活力。
实施例5
一种米糠脂肪酶的提取和保存方法，包括以下步骤：
(1)将氯化胆碱和尿素按摩尔比1:1.5混合，80℃水浴加热直至形成透明液体状溶剂，即为天然低共熔溶剂；
(2)取100g步骤(1)所得天然低共熔溶剂，称取过筛40目的米糠100g加入至上述溶剂中，在60℃水浴提取1h，提取后将混合物在10000rpm/min离心5min，取上层清液进行检测分析，测得提取液中蛋白质浓度75.53mg/g，提取率87.56％，米糠脂肪酶活力1653.8U。
将上层清液分别置于4℃、25℃、40℃贮存，定期检测上述米糠脂肪酶活力。
实施例6
一种米糠脂肪酶的提取和保存方法，包括以下步骤：
(1)将氯化胆碱和山梨醇按摩尔比2:1混合，100℃水浴加热直至形成透明液体状溶剂，即为天然低共熔溶剂；
(2)取50g步骤(1)所得天然低共熔溶剂，称取过筛40目的米糠100g加入至上述溶剂中，在50℃水浴提取1h，提取后将混合物在10000rpm/min离心5min，取上层清液进行检测分析，测得提取液中蛋白质浓度78.3mg/g，提取率92.6％，米糠脂肪酶活力2013.5U。
将上层清液分别置于4℃、25℃、40℃贮存，定期检测上述米糠脂肪酶活力。
实施例7
一种米糠脂肪酶的提取和保存方法，包括以下步骤：
(1)将氯化胆碱和乙酰胺按摩尔比1:2混合，80℃水浴加热直至形成透明液体状溶剂，即为天然低共熔溶剂；
(2)取100g步骤(1)所得天然低共熔溶剂，称取过筛40目的米糠50g加入至上述溶剂中，在40℃水浴提取1.5h，提取后将混合物在10000rpm/min离心5min，取上层清液进行检测分析，测得提取液中蛋白质浓度50.2mg/g，提取率81.1％，米糠脂肪酶活力635.1U。
将上层清液分别置于4℃、25℃、40℃贮存，定期检测上述米糠脂肪酶活力。
实施例8
一种米糠脂肪酶的提取和保存方法，包括以下步骤：
(1)将脯氨酸和乳酸按摩尔比1:1混合，80℃水浴加热直至形成透明液体状溶剂，即为天然低共熔溶剂；
(2)取50g步骤(1)所得天然低共熔溶剂，称取过筛40目的米糠100g加入至上述溶剂中，在40℃水浴提取1h，提取后将混合物在10000rpm/min离心5min，取上层清液进行检测分析，测得提取液中蛋白质浓度135.6mg/g，提取率92.8％，米糠脂肪酶活力3458.9U。
将上层清液分别置于4℃、25℃、40℃贮存，定期检测上述米糠脂肪酶活力。
实施例9
一种米糠脂肪酶的提取和保存方法，包括以下步骤：
(1)将脯氨酸和甘油按摩尔比1.5:1混合，80℃水浴加热直至形成透明液体状溶剂，即为天然低共熔溶剂；
(2)取100g步骤(1)所得天然低共熔溶剂，称取过筛40目的米糠50g加入至上述溶剂中，在30℃水浴提取2h，提取后将混合物在10000rpm/min离心5min，取上层清液进行检测分析，测得提取液中蛋白质浓度82.9mg/g，提取率97.5％，米糠脂肪酶活力2751.5U。
将上层清液分别置于4℃、25℃、40℃贮存，定期检测上述米糠脂肪酶活力。
对比例1
一种米糠脂肪酶的提取和保存方法，包括以下步骤：
称去离子水质量为100g，称取过筛40目的米糠50g加入至上述溶剂中，在40℃水浴提取1h，提取后将混合物在10000rpm/min离心5min，取上层清液进行检测分析，测得提取液中蛋白质浓度60.2mg/g，提取率76.5％，米糠脂肪酶活力568.9U。
将上层清液分别置于4℃、25℃、40℃贮存，定期检测上述米糠脂肪酶活力。
对比例2
一种米糠脂肪酶的提取和保存方法，包括以下步骤：
称50mM PBS缓冲液质量为100g，称取过筛40目的米糠50g加入至上述溶剂中，在50℃水浴提取1h，提取后将混合物在10000rpm/min离心5min，取上层清液进行检测分析，测得提取液中蛋白质浓度52.4mg/g，提取率75.6％，米糠脂肪酶活力525.9U。
将上层清液分别置于4℃、25℃、40℃贮存，定期检测上述米糠脂肪酶活力。
对比例3
一种米糠脂肪酶的提取和保存方法，包括以下步骤：
称甘油质量为100g，称取过筛40目的米糠50g加入至上述溶剂中，在60℃水浴提取1h，提取后将混合物在10000rpm/min离心5min，取上层清液进行检测分析，测得提取液中蛋白质浓度55.58mg/g，提取率77.5％，米糠脂肪酶活力654.8U。
将上层清液分别置于4℃、25℃、40℃贮存，定期检测上述米糠脂肪酶活力。
对比例4
一种米糠脂肪酶的提取和保存方法，包括以下步骤：
称乳酸质量为100g，称取过筛40目的米糠100g加入至上述溶剂中，在30℃水浴提取1h，提取后将混合物在10000rpm/min离心5min，取上层清液进行检测分析，测得提取液中蛋白质浓度68.9mg/g，提取率80.6％，米糠脂肪酶活力1045.8U。
将上层清液分别置于4℃、25℃、40℃贮存，定期检测上述米糠脂肪酶活力。
各实施例和对比例所得米糠脂肪酶的稳定性检测结果如表1所示。
表1所述的半衰期是指米糠脂肪酶的活力损失一半所需要的时间。
表1不同温度下米糠脂肪酶的保存半衰期(天)
由表1可知，含有醇羟基的天然低共熔溶剂可明显提高米糠脂肪酶的稳定性，尤其是含有甘油、山梨醇和木糖醇组分(实施例3、4、6和9)具有明显优势，相对于纯水体系(对比例1)、缓冲液体系(对比例2)、甘油单组分体系(对比例3)和乳酸单组分体系(对比例4)中米糠脂肪酶半衰期均具延长的效果。同时，低温环境对延长米糠脂肪酶的稳定性具有保护作用。
可见，含有醇羟基的天然低共熔溶剂应用于脂肪酶提取具有较好稳定性，而且含有醇羟基较多的山梨醇体系比较其余体系在脂肪酶提取稳定性方面具有明显优势。
在米糠脂肪酶提取效率方面，实施例较对比例均具有较好的优势，主要是实施例中溶剂组分偏弱碱性或酸性促进破坏米糠结构，有利于米糠脂肪酶的释放。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.米糠脂肪酶的提取和保存方法，其特征在于包括以下步骤：
将天然低共熔溶剂作为提取溶剂，加入米糠，30～60℃下加热提取0.5～2.0 h，然后离心取上清液，该上清液中含有米糠脂肪酶；米糠脂肪酶保存在含有天然低共熔溶剂的该上清液中；
所述天然低共熔溶剂的氢键受体化合物和氢键供体化合物为以下组合中的一种：氯化胆碱/甘油、氯化胆碱/木糖醇、氯化胆碱/山梨醇、脯氨酸/甘油；
所述的天然低共熔溶剂由以下方法合成：
将氢键供体化合物和氢键受体化合物混合，水浴加热直至形成透明液体状溶剂，即为天然低共熔溶剂；
所述氢键受体化合物与氢键供体化合物的摩尔比为1～2:1；
所述的水浴加热为80～100℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的保存是在4℃以下保存。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的米糠粉碎过40目使用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的离心是在10000 rpm/min离心5min。
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