JPH08302384A - 高度不飽和脂肪酸の酵素分画方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 高度不飽和脂肪酸の豊富な油から３以上の不
飽和度を有する高度不飽和脂肪酸の豊富な画分を得る。 【解決手段】 高度不飽和脂肪酸の豊富な油をＣａｎｄ
ｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａの非立体特異性リパー
ゼにより加水分解し、次に混合物はメタノールの存在で
酵素反応によりエステル化し、反応混合物は調整條件下
で鹸化し、得た水性相および有機相を分離し、非エステ
ル化脂肪酸を非−極性溶媒により水性相から抽出し、溶
媒を除去する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は本質的に酵素による
高度不飽和脂肪酸の分画方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ｎ−６およびｎ−３系脂肪酸は、特にプ
ロスタグランジンの生合成における前駆体として栄養価
を有する。各種栄養品および化粧品適用に対しこれらの
脂肪酸の豊富化画分を利用しうることは有利である。こ
れらの脂肪酸は主としてトリグリセリドとして天然に見
出される。遊離脂肪酸は高温および高圧下でトリグリセ
リドを加水分解して工業的に得られる。次いでこれらの
脂肪酸を分画するために、いくつかの方法、例えば結晶
化、蒸留、含有複合体の形成またはクロマトグラフ技術
が開発された。これらの方法の適用では高度不飽和脂肪
酸の場合分解を生じ、または工業的に適用するには費用
がかかり過ぎることが分かった。

【０００３】酵素方法は先行方法に対する別法を表わ
し、ほとんどエネルギーを使用せず、応力の少ない設備
を使用して温和な條件下で反応を行うことができる。

【０００４】例えば、魚油および月見草油脂肪酸を分画
する酵素方法は、ＭａｔｔｈｅｗＪ．ＨｉｌｌｓらのＪ
ＡＯＣＳ，６７巻、９号、５６１〜５６３頁から既知で
あり、これは菜種リパーゼおよびＭｕｃｏｒ ｍｉｅｈ
ｅｉにより触媒され、ブタノールによるエステル化はエ
ステル化される酸の飽和度の関数であることに基づく。
高飽和度を有する脂肪酸のエステル化後、エステルは薄
層クロマトグラフィにより未反応脂肪酸から分離する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は酵素に
よエステル化により高度不飽和脂肪酸の豊富な油から脂
肪酸を分画する方法を供することで、これはクロマトグ
ラフ分離を避け、工業的に適用できる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は高度不飽和脂肪
酸を本質的に酵素により分画する方法に関し、この方法
は酵素触媒作用により脂肪酸混合物のエステル化を行な
い、形成エステルは未反応脂肪酸から分離し、所望の高
度不飽和脂肪酸が豊富化した画分を得るもので、脂肪酸
エステルは脂肪酸を調整鹸化し、形成石鹸を水で抽出
し、水性相を酸性化し、形成酸を非極性溶媒で抽出する
ことにより分離することを特徴とする。

【０００７】本発明方法を実施するために、好ましく
は、高度不飽和脂肪酸の豊富な油のトリグリセリドの全
酵素加水分解由来の出発脂肪酸混合物を使用する。この
加水分解は好ましくは、Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄ
ｒａｃｅａの非領域−特異性リパーゼにより好ましく
は、室温で、中性ｐＨまたは中性に近いｐＨで、および
大気圧で乳化媒体で行う。

【０００８】出発油として、任意の天然油は高度不飽和
脂肪酸、特に３以上の不飽和度を有する動物または植物
または合成起源のもの、例えばガンマ−リノレン酸（Ｇ
ＬＡ）の豊富な黒スグリ種子油、ルリヂサ油、月見草油
またはアラキドン酸の豊富な「ＴＧＡ」油を挙げること
ができる。

【０００９】エステル化はメタノールおよび溶媒、例え
ばヘキサンまたは少量の水の存在で行う。反応は５〜７
０時間、好ましくは１０〜４０時間、好ましくは室温で
継続する。使用酵素は固定化しても、またはしなくても
よい。再使用できるように固定化することが好ましい。
領域−特異性でも、またはなくてもよい。

【００１０】反応後、遊離脂肪酸および脂肪酸メチルエ
ステルの混合物を得る。エステル化画分は高不飽和度を
有する脂肪酸、例えば黒スグリ種子油の場合特にＧＬＡ
およびステアリドン酸（ＳＡ）が少なくなる。これはこ
れらの酸がほとんどエステル化されず、従って遊離脂肪
酸画分に豊富化されることを示す。

【００１１】本発明によれば、エステルから遊離脂肪酸
の分離は温和な條件下で脂肪酸の鹸化により行う。これ
らの條件は水性媒体中で弱塩基、例えばナトリウム、カ
リウムまたはアンモニウムの炭酸塩、リン酸塩、クエン
酸塩またはその混合物、好ましくは炭酸ナトリウムと、
室温からの出発温度、例えば２０℃〜約８０℃までの温
度で撹拌、好ましくは次第に強く撹拌しながら、徐々に
温度を４５℃から約７５℃まで上げて反応させることを
特徴とする。次に水性相と有機相間に分離が認められ、
この分離は例えば飽和食塩溶液の添加により強化でき
る。

【００１２】この方法により石鹸形で水溶性になる脂肪
酸のみを反応させることができる。得た水性相は、例え
ば遠心分離によりデカンテーション後脂溶性エステルを
含有する有機相から容易に分離できる。遊離脂肪酸は
酸、例えば濃塩酸により水性相を酸性化して回収し、溶
媒、例えばヘキサンにより抽出することができ、次に溶
媒は例えば蒸発により除去できる。

【００１３】次例は本発明を説明する。例中、％および
部は特記しない限り重量による。遊離脂肪酸の定量分析
は塩化アセチルによるメチレーション後気相クロマトグ
ラフィ（ＧＰＣ）により行ない、従ってメチルエステル
基準である。

【００１４】

【実施例】

例１ １．１ 脂肪酸出発混合物の製造Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａの非特異性リ
パーゼにより黒スグリ種子油の酵素加水分解由来の脂肪
酸混合物を出発材料として使用した。脂肪酸混合物は次
の方法で得た。２０％の黒スグリ種子油を含有し、１．
２％の大豆レシチン（Ａｓｏｌ １００（商標）ルーカ
スマイヤー）を７８．８％の０．０２５Ｍリン酸塩緩衝
水溶液（ｐＨ６．８８）に溶解し、ミクロ流動化装置
（１１０Ｔ，ミクロフルイディスク社，ニュートン）を
５回通して油滴の平均直径を約４５０ｎｍにした油／水
エマルジョンを製造した。Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎ
ｄｒａｃｅａタイプＢのリパーゼ（バイオカタリスツ
社，カーディフ，英国）をリン酸塩緩衝液に溶解し、次
に４０００ｇで２０分遠心分離して不溶性残留物を除去
した。上澄を試験に使用した。１０mlの上記エマルジョ
ン（２ｇの黒スグリ種子油含有）は２５mlの栓付エルレ
ンマイヤーフラスコに入れ、３７℃の温度にサーモスタ
ット制御された浴で２５０ｒｐｍで電磁撹拌しながら、
そこに０．２ｇのリパーゼに相当する酵素溶液を添加し
た。４時間反応後、媒体は４０００ｇで遠心分離してエ
マルジョンを破壊し、油相はエーテルで抽出して回収し
た。抽出物は水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、
次いで溶媒を蒸発除去した。得た脂肪酸は光から保護
し、窒素下で−２５℃で貯蔵した。水性相のリパーゼ溶
液および形成グリセロールは限外濾過（モジュール Ｙ
Ｍ１０、カットオフ限界１０，０００、アミコン，デン
バー，米国）により回収し、再使用できるリパーゼ濃溶
液を得た。反応中遊離した脂肪酸％に相当する加水分解
度はＭｅｔｒｏｈｍ ｔｉｔｒｏｐｒｏｃｅｓｓｏｒ
６９２により酸−塩基滴定により測定して９９．９％に
相当した。エタノールおよびエチルエーテルの２５mlの
等量混合物に溶解した分析試料は、０．１Ｎ濃度のＫＯ
Ｈアルコール溶液により滴定した。脂肪酸混合物はメチ
ルエステル形でＧＰＣにより測定して次の組成を有し
た。 脂肪酸 ％ Ｃ １６：０ ７．１ Ｃ １８：０ １．７ Ｃ １８：１ １３．３ Ｃ １８：２ ４５．６ Ｃ １８：３ ガンマ １５．５ Ｃ １８：３ アルファ １２．２ Ｃ １８：４ ２．９ Ｃ ２０：１ ０．８ Ｃ ２０：２ ０．２ その他 ０．８ １．２ エステル化 脂肪酸は１１mlのヘキサンおよび１mlのメタノール混液
中の９００mgの脂肪酸混合物および１２００mgの固定化
リパーゼ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉからのＬｉｐｏｚ
ｙｍｅ ＴＭ２０，ノボノルディスク社，デンマーク）
を使用してメタノールによりエステル化した。この酵素
は位置２と比較してトリグリセリドのグリセロール骨格
の位置１および３で強い特異性を有する。反応は電磁バ
ーを供したガラスフラスコで、機械撹拌機上に置いて２
０時間室温で行った。反応後、酵素は濾別し、すすぎ、
１０容量％の水で再水和後再使用できる。遊離脂肪酸お
よび脂肪酸メチルエステルの混合物を得た。 １．３ 脂肪酸およびメチルエステルの分離 ２０ｇの脂肪酸および脂肪酸メチルエステルの上記混合
物を４０℃に加熱し、次に水に溶解した１．１ｇの炭酸
ナトリウムを撹拌しながら添加した。次いで撹拌速度を
上げ、温度を７５℃に高めた。この温度に達すると、加
熱を中止し、２０mlの飽和塩溶液を添加した。それによ
り有機相および水性相の形成が認められた。次に全体を
３０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、２相を分離し、次
いで石鹸を含有する水性相は塩酸溶液により固化した。
次に形成脂肪酸はヘキサンにより抽出し、次いでヘキサ
ンは蒸発除去した。こうしてＧＬＡおよびＳＡが豊富化
した、次の組成（メチルエステルのＧＰＣ）を有する
１．５ｇの脂肪酸を回収した。 脂肪酸 ％ Ｃ １６：０ １．３ Ｃ １８：１ ２ Ｃ １８：２ ６．５ Ｃ １８：３ ガンマ ７３．４ Ｃ １８：３ アルファ ２．４ Ｃ １８：４ １３．６ その他 ０．８

【００１５】例２ エステル化工程（例１の１．２に相当）において、９ml
のメタノールおよび１mlの水から成る溶媒混合物を使用
したことを除いて、手順は例１に従った。こうして６
４．６％のＧＬＡおよび１１．８％のＳＡの豊富化相
（石鹸から得た非エステル化部分から成る）を得た。

【００１６】例３〜７ エステル化工程（例１の１．２に相当）において、酵素
反応時間は表示のように変え、豊富化相のＧＬＡ％およ
びＳＡ％の結果は表示のように得たこと以外、手順は例
１と同じであった（ＧＰＣによりメチルエステルを測
定）。

【表１】

【００１７】例８〜１５ 黒スグリ種子油脂肪酸混合物のエステル化を各種起源お
よび区域−特異性の酵素により室温で２０時間反応させ
て例１（１．２の項）のように行った。得た結果はエス
テル化画分の脂肪酸組成を測定して評価した（ＧＰＣに
よりメチルエステルで）。

【表２】 上記結果は、すべての場合エステル化画分はＧＬＡおよ
びＳＡが減少したことを示す。これはこれら２つの酸が
ほとんどエステル化されず、従って遊離脂肪酸画分にこ
れらの酸が豊富化することを示す。

【００１８】例１６ 原料として、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｆｕｎｇｕｓか
ら抽出し、アラキドン酸が非常に豊富な、サントリー会
社、東京、日本からの合成ＴＧＡ油の全加水分解物を使
用した。トリグリセリドの加水分解後、遊離脂肪酸混合
物はＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＭ２０により室温で２０時間
例１（１．２の項）のようにエステル化した。次に遊離
脂肪酸メチルエステルは薄層クロマトグラフィにより分
離し、遊離脂肪酸混合物の組成を分析した。脂肪酸出発
混合物およびエステル化後得た遊離脂肪酸混合物の組成
は下記する（ＧＰＣによりメチルエステルを測定）。 脂肪酸組成 ＴＧＡ油組成 エステル化画分 ％ ％ 組成 ％ Ｃ １４：０ ０．７ − Ｃ １６：０ １７．２ ５．６ Ｃ １６：１ ０．２ − Ｃ １７：０ ０．３ ０．２ Ｃ １８：０ ９．２ ５．５ Ｃ １８：１ ２２．３ ７．７ Ｃ １８：２ ８．３ ２．４ Ｃ １８：３ ガンマ １．７ ６．５ Ｃ １８：３ アルファ １ − Ｃ ２０：０ ０．９ ０．９ Ｃ ２０：１ １ ０．７ Ｃ ２０：２ ０．７ ０．５ Ｃ ２０：３ ３．９ １３．１ Ｃ ２０：４ ２０．２ ４０．２ Ｃ ２２：０ ３．５ ４．２ Ｃ ２２：６ ８．２ １１．２ その他 ０．７ １．５ （注） −：定量し得ず 上記結果は黒スグリ種子油の場合と同様に、遊離脂肪酸
画分に一層豊富化した、特にトリ不飽和脂肪酸であった
ことを示す。ＴＧＡ中の％が低いに拘らず、ＧＬＡはア
ルファリノレン酸（ＡＬＡ）に比し選択的に豊富化され
たことも注目される。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵素触媒作用により脂肪酸混合物をエス
   テル化し、形成エステルを未反応脂肪酸から分離し、目
   的の高度不飽和脂肪酸を豊富化した画分を得る、高度不
   飽和脂肪酸の本質的酵素分画方法において、脂肪酸を調
   整鹸化して形成石鹸を水により抽出し、水性相を酸性化
   し、形成酸を非−極性溶媒により抽出して脂肪酸エステ
   ルを分離することを特徴とする，上記高度不飽和脂肪酸
   の本質的酵素分画方法。
2. 【請求項２】 出発脂肪酸混合物は高度不飽和酸の豊富
   な油のトリグリセリドの全酵素加水分解由来のものを使
   用する、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 使用油はｎ−３およびｎ−６系脂肪酸、
   特にガンマリノレン酸が豊富で、特に黒スグリ種子油、
   ルリヂサ油および月見草油から選択した油である、請求
   項２記載の方法。
4. 【請求項４】 鹸化は水性媒体で弱塩基、特にナトリウ
   ム、カリウムまたはアンモニウムの炭酸塩、リン酸塩、
   クエン酸塩またはその混合物と反応させて行ない、反応
   媒体は水性相および有機相に分離する、請求項１記載の
   方法。
5. 【請求項５】 鹸化は炭酸ナトリウム水溶液と反応させ
   て行う、請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 反応は２０°〜８０℃の温度で撹拌しな
   がら行う、請求項４記載の方法。
7. 【請求項７】 反応は撹拌速度を高め、温度を徐々に約
   ４５°〜約７５℃に上げて行う、請求項４記載の方法。
8. 【請求項８】 相の分離は塩化ナトリウム飽和溶液を添
   加して強化する、請求項４記載の方法。
9. 【請求項９】 水溶性脂肪酸含有水性相は脂溶性エステ
   ル含有有機相から遠心分離により分離する、請求項４記
   載の方法。
10. 【請求項１０】 遊離脂肪酸は水性相を酸、特に濃塩酸
    により酸性化後、非−極性溶媒、特にヘキサンにより抽
    出し、次いで溶媒を特に蒸発により除去して回収する、
    請求項４記載の方法。