JPH08205879A

JPH08205879A - 高度不飽和脂肪酸の酵素的製造方法

Info

Publication number: JPH08205879A
Application number: JP7307018A
Authority: JP
Inventors: Hans-Juergen Wille; − ユエルゲンヴィリハンス
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1994-11-28
Filing date: 1995-11-27
Publication date: 1996-08-13
Also published as: BR9505529A; EP0713917A1; CN1131697A; AU3776595A; CA2163815A1

Abstract

(57)【要約】【課題】トリグリセリド油を酵素により加水分解して
高脂肪酸を得る。【解決手段】高度不飽和脂肪酸の豊富な油をレシチン
の存在で乳化した油／水媒体で、好ましくは室温の操作
條件下でおよび中性に近いｐＨに緩衝した水性媒体でＣ
ａｎｄｉｄａＣｙｌｉｎｄｒａｃｅａからの非立体特
異性リパーゼにより加水分解して品質の良い高度不飽和
脂肪酸の混合物を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は高度不飽和脂肪酸の
豊富な油の全酵素加水分解に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ｎ−
６およびｎ−３系の脂肪酸は特にプロスタグランジンの
生合成における前駆体として栄養価値を有する。各種栄
養的および香粧的に適用するために、これらの脂肪酸に
富む画分を利用することは有利である。これらの脂肪酸
は天然には主としてトリグリセリド形で見出される。

【０００３】遊離脂肪酸は高温および高圧でトリグリセ
リドを加水分解して工業的に得られる。トリグリセリド
を強塩基により鹸化し、次いで強酸により石鹸を中和し
て脂肪酸を遊離させ、最後に非極性溶媒、例えばヘキサ
ンにより媒体から脂肪酸を抽出して、遊離脂肪酸を化学
的に得ることもできる。

【０００４】これらの方法を適用すると、高度不飽和脂
肪酸の場合分解を生じうる。

【０００５】酵素方法はほとんどエネルギーを使用せ
ず、応力の少ない系を使用し温和な條件下で反応を行な
うことができるので、上記方法の別法と言うことができ
る。

【０００６】水性相および有機相間の最善の可能な接触
を確保するため、有効な攪拌を維持しながら、加水分解
は通常２相媒体で行なう。

【０００７】本発明者は、トリグリセリド油を全加水分
解する簡単な酵素方法を見出した。この方法は２相媒体
で酵素方法により得られる度合いより大きい脂肪酸への
転換度を得る一方で、予期されない方法で加水分解を改
良できる。これはほとんど分解を生じない條件下であ
り、化学的方法と比較して高度不飽和脂肪酸の品質およ
び安定性を改良することができる。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明はこれらの高度不
飽和脂肪酸の豊富な油から高度不飽和脂肪酸を製造する
酵素方法に関し、乳化剤としてレシチンの存在で乳化し
た媒体でＣａｎｄｉｄａＣｙｌｉｎｄｒａｃｅａから
の非立体特異性リパーゼにより上記油を加水分解するこ
とに特徴がある。

【０００９】本発明方法はｎ−３およびｎ−６系の脂肪
酸、特にガンマ−リノレン酸の豊富な油、特に黒スグ
リ、ルリヂサおよび月見草種子由来の油の加水分解に特
に適用できる。

【００１０】本方法を実施する場合、完全な酵素分解は
２０〜４５℃の温度、好ましくは室温で、大気圧で、ｐ
Ｈ６〜８で乳化媒体で高度不飽和脂肪酸の豊富なトリグ
リセリド油により行なう。これらは品質的および経済的
に有利な調整條件である。

【００１１】酵素反応は有機相および酵素および中性に
近いｐＨ６〜８の緩衝水溶液を含有する水性相間の界面
で行なう。油／水型エマルジョンは、水性相および乳化
剤の存在で油を激しく攪拌して、例えば、水性相に分散
し、かつ乳化剤のレシチンにより安定化した約４５０ｎ
ｍの平均直径を有する微小滴形の油エマルジョンを製造
する。

【００１２】本発明方法により使用できるレシチンは好
ましくは次のホスホリピドから選択できる。 −６０重量％以上のアセトン不溶性物質（以下ＡＩＭ）
を含有するレシチン、 −９０％以上のＡＩＭを含有する油を含まないレシチ
ン、 −６０重量％以上のＡＩＭを含有し、ホスファチジルコ
リン（ＰＣ）に富むアルコール可溶性レシチン画分、 −９０重量％以上のＡＩＭを含有するアルコール可溶
性、油を含まないレシチン、 −５０重量％以上のＰＣを含有するレシチン画分、およ
び −膵臓または微生物起源（１０〜９０重量％のＰＣがラ
イソＰＣ（ＬＰＣ）に転換される）のホスホリピダーゼ
Ａ₂により修飾されたレシチンまたはその前駆画分。

【００１３】エマルジョンは予め次の用途を予想して製
造し、例えば滅菌容器に入れることができる。

【００１４】エマルジョンの組成は安定性が持続するよ
うに決定される。油の割合がある限度、例えば約２０重
量％を越えて増加すると、エマルジョンはもはや均質で
はなく、得た加水分解度は低減する。約１重量％未満の
レシチン含量を加水分解度の減少となる。好ましくはレ
シチン含量は組成物重量で０．１〜５重量％、有利には
０．３〜０．８重量％、特に約０．５重量％である。好
ましくは、レシチン含量はエマルジョンの油含量基準で
１．５〜４重量％、特に約２．５重量％の純ＰＣに相当
するように決定される。

【００１５】非立体特異性リパーゼは、Ｃａｎｄｉｄａ
ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ由来のものである。最適反応
條件は加水分解する基質の性質および各種リパーゼの固
有の性質による。

【００１６】反応は加水分解ができるだけ完了するよう
に２０〜４５℃で、好ましくは最低温度、例えば約２０
℃で行なう。この温度で温度の増加につれて特に酸化分
解に敏感である、特に高度不飽和脂肪酸を処理できる。

【００１７】ｐＨは６〜８の値では加水分解度に影響し
ない。例えば６．８８のｐＨを有するリン酸塩のような
中性緩衝塩溶液を使用して、一定かつ再現可能な結果を
導く反応條件を保持することが好ましい。上記の最適條
件下では、完全な加水分解は２〜２０時間で得ることが
できる。

【００１８】加水分解度は上記操作條件下では酵素の使
用濃度によるが、ある濃度を越えると、このパラメータ
はもはや関係がなくなる。これは酵素反応は油および水
媒体間の界面で行われ、利用しうる界面の表面積により
酵素の必要量は必要最高量を越えるからである。１０〜
１００ｍｇ／ｇの油濃度を使用することが好ましい。

【００１９】反応が終了すると、リパーゼは再循環およ
び再使用することができる。これを行うためには、エマ
ルジョンは高速で遠心分離して破壊する。次に脂質相は
溶媒で抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、
溶媒を蒸発して回収する。脂肪酸は光を避けて、不活性
雰囲気下で、マイナス温度（℃で）、好ましくは約−２
５℃で貯蔵することが好ましい。加水分解中形成するグ
リセロールを含む水性相の溶液リパーゼは濃縮して、例
えば限外濾過により回収する。次にリパーゼは再循環で
きる。

【００２０】得た脂肪酸混合物は特定高度不飽和脂肪酸
を豊富化する方法で、または脂肪酸およびグリセロール
分子のその位置が特異的である構造化トリグリセリドの
製造方法で原料として使用できる。得た生成物はそれぞ
れ栄養、香粧および医薬組成物に使用できる。

【００２１】

【実施例】次例により本発明を説明する。例中、％およ
び部は特記しない限り重量による。例１〜７ｐＨ６．８８の０．０２５Ｍリン酸塩緩衝水溶液７８．
８％に溶解した２０％の黒スグリ種子油および１．２％
の大豆レシチン（Ａｓｏｌ１００（商標）、ルーカス
・メイヤー）を含有する油／水型エマルジョンを調製
し、５回ミクロ流動化装置（１１０Ｔ、ミクロフルイデ
ィクス社、ニュートン）を通して約４５０ｎｍの油滴平
均直径とした。リパーゼはリン酸塩緩衝液に溶解し、次
に４０００ｇで２０分遠心分離して不溶性残渣を除去し
た。上澄液を試験に使用した。１０ｍｌの上記エマルジ
ョン（２ｇの黒スグリ種子油）を選択温度にサーモスタ
ットで維持し２５０ｒｐｍで電磁的に攪拌する浴で、栓
付き２５ｍｌエルレンマイヤーフラスコに入れ、０．２
ｇのリパーゼに相当する酵素溶液を添加した。反応後、
４０００ｇで遠心分離してエマルジョンを破壊し、脂質
相はエーテルで抽出して回収した。水で洗浄し、硫酸ナ
トリウムで乾燥し、次いで溶媒は蒸発除去した。得た脂
肪酸は光を避けて窒素下で−２５℃で貯蔵した。水性相
の溶解リパーゼおよび形成グリセロールは限外濾過（Ｙ
Ｍ１０モジュール、カットオフ限界１０，０００、アミ
コシ社、米国）により回収し、再使用できるリパーゼ濃
厚溶液を得た。反応中に遊離した遊離脂肪酸％に相当す
る加水分解度はＭｅｔｒｏｈｍ６９２チトロプロセッサ
ーを使用して酸−塩基滴定により測定した。分析試料は
エタノールおよびエチルエーテルの等容量混合物２５ｍ
ｌに溶解し、０．１Ｎ濃度のＫＯＨ／アルコール溶液で
滴定した。加水分解條件は表１に示す。

【表１】表１例 Candida cylindracea 温度時間％リパーゼ ℃ ｈ加水分解１タイプＢ、バイオキャタリスツ社、英国３７４９９．９２タイプVII 、シグマ化学、米国２０２０９１．６３ロット189 、バイオジェンジアレマニア社、スイス３７２０９６４タイプＯＦ、明糖産業、日本２０８９９．２５タイプＯＦ、明糖産業３０８９６．３６タイプＭＹ、明糖産業３７２０９１．１７タイプＦ５、エンザイマティックス、英国３７２０９７．６比較として、例１〜４の酵素、温度條件および期間を使
用して２相系の加水分解により次の結果を得た。例のリパーゼ２相系の加水分解％１７９４８１．１

【００２２】例８〜１３例４と同じ條件を使用する一方で、酵素濃度、油および
レシチンの割合、および再循環リパーゼによる連続サイ
クル数を変えることにより、表２に示す加水分解度を得
た。

【表２】表２例エマルジョンの組成酵素濃度 20時間の加水分解％加水分解（％） mg/g 油サイクル数８油、３０ − − ７８レシチン、１．２緩衝液、６８．８９油、２０ − − ８９レシチン、１緩衝液、７９ 10 − ２０ − ８８．６ 11 − ５０ − ９２．７ 12 − − ２９６ 13 − − ３９４．６ −：例４と同じ條件。

【００２３】例１４酵素方法により得た脂肪酸の品質および安定性は次の條
件下で黒スグリ種子油を化学的に鹸化して得たものと比
較して評価した。１００ｇの黒スグリ種子油を４７．７
％の水、１４．３％の水酸化ナトリウム、３７．８％の
エタノールおよび０．１５％のエチレンジアミンテトラ
酢酸ジナトリウムから成る２１３ｇのアルカリ溶液と混
合し、混合物は８０〜８５℃で１２０分還流した。４０
ｇの水、次いで８０ｍｌの発煙塩酸の添加後、混合物は
６０分間烈しく攪拌した。形成脂肪酸はヘキサンで抽出
し、有機相は水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶
媒は蒸発除去した。メチルエステル形の２つの加水分解
物の脂肪酸のガスクロマトグラフィ分析によりその組成
と完全に一致することが分かり、これにより大豆レシチ
ンは加水分解されないことを確認することができた。脂
肪酸のイソオクタン溶液のＵＶ分光分析により、酵素加
水分解により得た脂肪酸の最大吸収値は化学的に得た脂
肪酸のものより低いことが分かった。さらに、いくつか
の波長および脂肪酸の２つの型で計算した分子吸光係数
値は酵素的に得た脂肪酸の場合より化学的に得た脂肪酸
の場合高かった。最後に、脂肪酸の過酸化物指数の測定
により２つの加水分解方法および得た脂肪酸の特性を比
較することができた。第２鉄イオンを赤色を有するチオ
シアン酸第２鉄に転換することにより５１０ｎｍの波長
でＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ８４５Ａ分光計に
より測定して得た値によりＯ₂／ｋｇのｍｇ当量で表わ
して過酸化物指数を測定することができた。結果は次の
通りであった。鹸化により得た脂肪酸７．９酵素的に得た脂肪酸１．４上記分析結果により生体触媒加水分解反応は化学的加水
分解より多少高い品質を有する脂肪酸混合物を生成する
ことが確証された。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】乳化剤としてのレシチンの存在下で乳化
した媒体で、Ｃａｎｄｉｄａｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ
由来の非立体特異性リパーゼにより多価不飽和脂肪酸に
富む油を加水分解することを特徴とする、高度不飽和脂
肪酸の豊富な油から高度不飽和脂肪酸を酵素的に製造す
る方法。
【請求項２】エマルジョンは油／水型のものであり、
３０重量％までの油および０．１〜５％、特に０．３〜
０．８重量％のレシチンを含有する、請求項１記載の方
法。
【請求項３】反応は室温で行なう、請求項１記載の方
法。
【請求項４】水性相は畧畧中性にｐＨを維持する緩衝
塩を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項５】酵素使用量は１０〜１００ｍｇ／ｇ油に
相当する、請求項１記載の方法。
【請求項６】反応は２〜２０時間行なう、請求項１記
載の方法。
【請求項７】反応が完了すると、エマルジョンは高速
で遠心分離してこれを破壊し、次いで脂質相は溶媒で抽
出して回収し、水で洗浄し、乾燥し、溶媒を蒸発し、得
た脂肪酸は使用するまで光を避けて、不活性雰囲気下
で、マイナス温度で貯蔵する、請求項１記載の方法。
【請求項８】加水分解中形成したグリセロールを含む
水性相中の溶液リパーゼは限外濾過して回収し、新しい
加水分解に再使用するため再循環する、請求項１記載の
方法。
【請求項９】使用油はｎ−３およびｎ−６系の脂肪
酸、特にガンマ−リノレン酸が豊富な、特に黒スグリ、
ルリヂサおよび月見草種子油から選択した油である、請
求項１記載の方法。
【請求項１０】請求項１から９のいずれか１項記載の
方法により得た脂肪酸混合物。