KR20240012963A - 고정화 효소로 Lipozyme TL IM을 이용한 감마리놀렌산 고함유 트리글리세라이드 제조방법 - Google Patents
고정화 효소로 Lipozyme TL IM을 이용한 감마리놀렌산 고함유 트리글리세라이드 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 상업적으로 판매하는 고정화 효소인 Lipozyme TL IM을 이용하여 감마리놀렌산을 풍부하게 함유하는 트리글리세라이드의 제조방법 및 상기 방법을 통해 제조된 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법은 기질로 감마리놀렌산 함유 글리세라이드 분획물 및 감마리놀렌산 함유 지방산을 이용함으로써 상업적으로 널리 사용하고 있는 저렴한 효소 중 하나인 Lipozyme TL IM(기존에 가장 많이 사용되는 효소인 Novozym 435 에 비하여 20배 정도 저렴함)을 통해 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드를 효과적으로 합성할 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법은 효소량, 온도 및 진공도와 같은 다양한 반응 조건을 최적화함으로써 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드의 높은 수율을 달성하였다.
Description
본 발명은 상업적으로 판매하는 고정화 효소인 Lipozyme TL IM을 이용하여 감마리놀렌산을 풍부하게 함유하는 트리글리세라이드의 제조방법 및 상기 방법을 통해 제조된 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드에 관한 것이다.
인간의 영양과 건강에 있어서 중요하게 여겨지는 다중불포화지방산에 대한 많은 연구들이 존재한다. 그 중에서도 오메가 3와 오메가 6 지방산에 대한 생리학적 활성 연구가 많이 진행되었다.
감마리놀렌산(γ-Linolenic acid, GLA, C18:3n6)은 탄소수가 18개이고 3개의 이중 결합을 가진 오메가 6 지방산 중 하나이다. 이 지방산은 체내에서 많은 생리학적 기능을 가지고 있어 중요하게 여겨진다. 감마리놀렌산은 혈중 콜레스테롤 개선 및 혈행개선에 도움을 주며 아토피성 습진, 월경 전 증후군, 류마티스 관절염 등 다양한 질환 개선에 많은 효과가 있다고 보고되었다. 감마리놀렌산은 사람의 모유에서 소량 발견되고 대부분 식물성 공급원을 이용하여 섭취 할 수 있다. 식물성 공급원에는 보리지 오일, 달맞이꽃 오일, 블랙 커런트 오일 등이 있다.
다중불포화지방산을 농축하기 위한 방법으로 효소(리파아제) 촉매 가수분해 방법이 있다. 효소를 촉매로 사용하면 선택적으로 원하는 지방산을 농축 할 수 있어 효율적이고 환경친화적인 방법으로 실험을 진행할 수 있다는 장점이 있다.
지질은 자연계와 인체 내에서 주로 트리글리세라이드 형태로 존재한다. 그래서 트리글리세라이드 형태가 지방산이나 에틸에스터 형태 보다 우수한 체내 흡수성을 가지고 있고 더 높은 산화안정성을 갖고 있다. 이러한 이유 때문에 트리글리세라이드 형태로의 재합성을 진행하는 연구들이 활발히 이루어지고 있다.
현재 트리글리세라이드로의 합성에는 글리세롤과 지방산을 기질로 한 효소를 이용한 에스테르 반응이 많이 사용된다. 이 반응에는 상업적으로 고정화된 형태인 Novozym 435라는 값비싼 효소가 널리 사용되고 있다.
한편, Lipozyme TL IM은 가격이 매우 저렴한(기존에 가장 많이 사용되는 효소인 Novozym 435 에 비하여 20배 정도 저렴함) 효소 중 하나이며 많은 반응에 널리 사용되고 있다. 그러나 Lipozyme TL IM을 이용하여 지방산과 글리세롤을 기질로 사용할 경우 반응이 전혀 일어나지 않는다. 그 이유는 Lipozyme TL IM에 사용된 담체가 실리카겔(silica gel)이라 기질로 사용된 글리세롤과 뭉치는 현상이 일어나기 때문이다.
따라서 Lipozyme TL IM을 단독으로 사용하여 다중불포화지방산을 포함하는 트리글리세라이드를 효과적으로 합성하는 연구는 전무한 실정이다.
본 발명은 이러한 종래 기술의 한계점을 극복하기 위하여 안출된 것으로, 상업적으로 널리 사용하고 있는 저렴한 효소 중 하나인 Lipozyme TL IM을 트리글리세라이드의 합성에 사용할 수 있는 방법을 도출하고자 하였으며, 그 결과 기질로 글리세롤이 아닌 글리세라이드 분획을 사용하는 경우 기존에 글리세롤의 존재 하에 응집하는 문제점을 극복하고 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드 합성이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 또한, 효소량, 온도 및 진공도와 같은 다양한 반응 조건을 조사하여 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드의 최대 수율을 달성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 상업적으로 널리 사용하고 있는 저렴한 효소 중 하나인 Lipozyme TL IM을 이용하여(기존에 가장 많이 사용되는 효소인 Novozym 435 에 비하여 20배 정도 저렴함), 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 통해 제조되는 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드를 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 a) 감마리놀렌산 함유 글리세라이드 분획물 및 감마리놀렌산 함유 지방산을 기질로 준비하는 단계; 및 b) 상기 기질에 고정화 효소로 Lipozyme TL IM를 혼합하여 반응시키는 단계를 포함하는, 감마리놀렌산 함유 트리글리세라이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 감마리놀렌산 함유 글리세라이드 분획물은 오메가 3 또는 오메가 6를 함유하는 오일에 칸디다 루고사(Candida rugose) 유래 효소를 가하여 가수분해하는 단계; 가수분해물에 헥산을 넣고 분별깔때기를 이용하여 효소 및 물을 제거하는 단계; 및 효소가 제거된 반응 혼합물을 증류 분리하는 단계를 통해 제조될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 오메가 3 또는 오메가 6를 함유하는 오일은 아마씨 오일, 청어 오일, 정어리 오일, 멸치 오일, 참치 오일, 미세조류 오일, 아히플라워 오일(ahiflower oil), 에키움 오일(echium oil), 달맞이꽃 오일, 블랙커런트 오일 및 보리지 오일(borage oil)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 감마리놀렌산 함유 지방산은 감마리놀렌산 함유 글리세라이드 분획물을 비누화 반응을 통해 제조될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계는 45℃ 내지 55℃의 온도조건에서 반응시키는 단계일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계에서 고정화 효소는 기질의 무게 기준으로 5 내지 10 중량%로 혼합할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계는 15 내지 20 mmHg의 진공 조건에서 반응시키는 단계일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 감마리놀렌산 함유 트리글리세라이드를 제공한다.
본 발명의 제조방법은 기질로 감마리놀렌산 함유 글리세라이드 분획물 및 감마리놀렌산 함유 지방산을 이용함으로써 상업적으로 널리 사용하고 있는 저렴한 효소 중 하나인 Lipozyme TL IM(기존에 가장 많이 사용되는 효소인 Novozym 435 에 비하여 20배 정도 저렴함)을 통해 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드를 효과적으로 합성할 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법은 효소량, 온도 및 진공도와 같은 다양한 반응 조건을 최적화함으로써 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드의 높은 수율을 달성하였다.
도 1은 보리지 오일에서 칸디다 루고사(Candida rugosa) 유래 효소 촉매 가수분해를 통한 감마리놀렌산 농축 반응에 있어서, 온도 조건에 따른 가수분해도(A), 감마리놀렌산 함량(B), 감마리놀렌산 회수율(C)를 나타낸 것이다. 반응은 1:1의 무게비(보리지 오일 대 인산 나트륨 완충액), 효소량은 0.05%(오일 중량 기준)으로 6시간 동안 300rpm의 교반 속도에서 수행되었다.
도 2는 효소의 종류에 따른 반응시간별 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드 전환율을 나타낸 것이다. 반응은 50℃ 온도, 1:1의 몰비율 (지방산 대 글리세라이드내 히드록시그룹), 효소량 5%(총 기질 중량 기준), 진공도 5mmHg 에서 250 rpm의 교반속도로 12시간 동안 수행되었다.
도 3은 온도 조건에 따른 반응시간별 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드 전환율을 나타낸 것이다. 반응은 1:1의 몰비율 (지방산 대 글리세라이드내 히드록시그룹), 효소량 5%(총 기질 중량 기준), 진공도 5mmHg 에서 250 rpm의 교반속도로 12시간 동안 수행되었다.
도 4는 효소량에 따른 반응시간별 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드 전환율을 나타낸 것이다. 반응은 50℃ 온도, 1:1의 몰비율 (지방산 대 글리세라이드내 히드록시그룹), 진공도 5mmHg 에서 250 rpm의 교반속도로 12시간 동안 수행되었다.
도 5는 진공 조건에 따른 반응시간별 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드 전환율을 나타낸 것이다. 반응은 50℃ 온도, 1:1의 몰비율 (지방산 대 글리세라이드내 히드록시그룹), 효소량 10% (총 기질 중량 기준)에서 250 rpm의 교반속도로 12시간 동안 수행되었다.
도 2는 효소의 종류에 따른 반응시간별 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드 전환율을 나타낸 것이다. 반응은 50℃ 온도, 1:1의 몰비율 (지방산 대 글리세라이드내 히드록시그룹), 효소량 5%(총 기질 중량 기준), 진공도 5mmHg 에서 250 rpm의 교반속도로 12시간 동안 수행되었다.
도 3은 온도 조건에 따른 반응시간별 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드 전환율을 나타낸 것이다. 반응은 1:1의 몰비율 (지방산 대 글리세라이드내 히드록시그룹), 효소량 5%(총 기질 중량 기준), 진공도 5mmHg 에서 250 rpm의 교반속도로 12시간 동안 수행되었다.
도 4는 효소량에 따른 반응시간별 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드 전환율을 나타낸 것이다. 반응은 50℃ 온도, 1:1의 몰비율 (지방산 대 글리세라이드내 히드록시그룹), 진공도 5mmHg 에서 250 rpm의 교반속도로 12시간 동안 수행되었다.
도 5는 진공 조건에 따른 반응시간별 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드 전환율을 나타낸 것이다. 반응은 50℃ 온도, 1:1의 몰비율 (지방산 대 글리세라이드내 히드록시그룹), 효소량 10% (총 기질 중량 기준)에서 250 rpm의 교반속도로 12시간 동안 수행되었다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 a) 감마리놀렌산 함유 글리세라이드 분획물 및 감마리놀렌산 함유 지방산을 기질로 준비하는 단계; 및 b) 상기 기질에 고정화 효소로 Lipozyme TL IM를 혼합하여 반응시키는 단계를 포함하는, 감마리놀렌산 고함유 트리글리세라이드의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 상기 a) 단계는 기질을 준비하는 단계로서, 자세하게는 감마리놀렌산 함유 글리세라이드 분획물 및 감마리놀렌산 함유 지방산을 준비하는 단계이다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 감마리놀렌산 함유 글리세라이드 분획물은 오메가 3 또는 오메가 6를 함유하는 오일에 칸디다 루고사(Candida rugose) 유래 효소를 가하여 가수분해하는 단계; 가수분해물에 헥산을 넣고 분별깔때기를 이용하여 효소 및 물을 제거하는 단계; 및 효소가 제거된 반응 혼합물을 증류 분리하는 단계를 통해 제조될 수 있다.
상기 과정을 통해 제조된 감마리놀렌산 함유 글리세라이드 분획물은 지방산 2 ~ 3중량%, 모노아실글리세롤 1 ~ 2중량%, 다이아실글리세롤 17 ~ 18중량%, 트리글리세라이드 77 ~ 80 중량%를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 오메가 3 또는 오메가 6를 함유하는 오일은 아마씨 오일, 청어 오일, 정어리 오일, 멸치 오일, 참치 오일, 미세조류 오일, 아히플라워 오일(ahiflower oil), 에키움 오일(echium oil), 달맞이꽃 오일, 블랙커런트 오일 및 보리지 오일(borage oil)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 오일일 수 있다.
본 발명의 상기 b) 단계는 기질을 촉매 하에서 반응시키는 단계로서, 자세하게는 고정화 효소인 Lipozyme TL IM 하에서 기질인 감마리놀렌산 함유 글리세라이드 분획물 및 감마리놀렌산 함유 지방산을 화학 양론적 비율로 반응시키는 단계이다.
본 발명에서 ‘고정화 효소’란 소수성 담체에 리파아제를 물리적으로 흡착시킨 효소를 의미하는 것으로, 리파아제와 담체가 결합된 형태를 의미한다.
본 발명에서 사용하고 있는 고정화 효소 Lipozyme TL IM은 상업적으로 널리 사용하고 있는 저렴한 효소 중 하나로, Novozym 435에 비하여 20배 정도 저렴하다.
현재 트리글리세라이드의 합성에는 글리세롤과 지방산을 기질로 한 효소를 이용한 에스테르 반응이 많이 사용되며, 상기 반응에는 상업적으로 고정화된 형태인 Novozym 435라는 값비싼 효소가 널리 사용되고 있다. 반면에, Lipozyme TL IM은 가격이 매우 저렴한 이점이 있으나, 이 효소는 담체가 실리카겔(silica gel) 소재로 글리세롤을 기질로 사용할 경우 글리세롤과 뭉치는 현상이 일어나 반응이 전혀 일어나지 않기 때문에, 트리글리세라이드의 합성에 이용할 수 없는 문제점이 있다.
본 발명에서는 상기와 같은 문제점을 극복하기 위하여 기질로 글리세롤 대신 보리지 오일에 효소를 이용 부분적 가수분해를 통하여 생산된 감마리놀렌산 고함유 글리세라이드 분획을 사용하였으며, 그 결과 Lipozyme TL IM 효소를 이용하여 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드 합성이 가능함을 확인하였다.
본 발명의 하기 실시예에서, 효소의 종류(Novozym 435, Lipozyme RM IM, Lipozyme TL IM)에 따른 반응시간별 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드 전환율을 측정한 결과, 본 발명의 고정화 효소로 Lipozyme TL IM을 이용하는 경우 Novozym 435와 유사하게 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드를 합성할 수 있음을 확인하였다(도 2 참조).
이에, 본 발명의 방법은 매우 저렴한 상업적 효소인 Lipozyme TL IM을 이용하여(기존에 가장 많이 사용되는 효소인 Novozym 435 에 비하여 20배 정도 저렴함), 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드를 제조할 수 있는 이점을 갖는다.
본 발명의 상기 고정화 효소는 기질의 무게 기준으로 5 내지 10 중량%로 혼합할 수 있으며, 바람직하게는 10중량%를 사용할 수 있다.
본 발명의 하기 실시예에서, 효소양에 따른 반응시간별 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드 전환율을 측정한 결과, 효소량이 2.5%에서 10%로 증가함에 따라 전체 반응 시간 동안 전환률이 현저하게 증가하였으며, 효소량 15%와 20%를 사용하였을 때, 4시간 미만의 반응 시간에서는 10%의 효소량 보다 약간 더 높았지만 그 이후 시간에는 세 효소량의 전환률 사이에 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 따라서, 비용 효율성과 제품 수율을 고려하는 경우 최적의 효소량은 10%로 결정되었다(도 4 참조).
한편, 반응 온도는 반응속도 및 효소의 잔존 활성에도 영향을 미치므로 효소 반응에서 중요한 요소이다.
본 발명의 상기 b) 단계에서 반응 온도는 40 ~ 60℃일 수 있으며, 바람직하게는 45 ~ 55℃이며, 더욱 바람직하게는 50℃일 수 있다.
본 발명의 하기 실시예에서, 온도에 따른 반응시간별 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드 전환율을 측정한 결과, 30℃에서 50℃로 증가함에 따라 전체 반응 시간 동안 전환율이 현저하게 증가했으며, 50℃와 60℃에서는 6시간 후에 거의 평형상태에 도달하여 전환률이 거의 유사하게 나타났다. 따라서 에너지 비용과 효소 안정성을 고려할 때 50℃를 최적 온도로 선택하였다(도 3 참조).
참고로, Novozym 435를 이용한 트리글리세라이드 합성의 최적 온도는 60℃이다. 이에, Lipozyme TL IM을 사용한 본 발명에서는 50℃가 최적 온도에 해당하는바, Lipozyme TL IM을 사용하는 것이 비용적인 면에서 더 좋을 뿐 아니라 에너지 절약 부분에서도 더 효율적인 이점을 갖는다.
본 발명의 상기 b) 단계는 15 내지 20 mmHg의 진공 조건에서 진행될 수 있으며, 바람직하게는 20 mmHg 압력에서 진행할 수 있다.
일반적으로 효소를 이용한 에스테르화 반응에서 수분은 반응에 매우 큰 영향을 주는 요인으로 알려져 있다. 감마리놀렌산 함유 글리세라이드 분획물 및 감마리놀렌산 함유 지방산이 반응하여 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드가 합성될 때 물이 생성되는데, 과량의 물이 생성되면 에스테르 반응의 역반응인 가수분해 반응을 촉진하여 에스테르 반응에 바람직하지 못한 영향을 준다.
따라서 본 발명에서는 반응 중 생성되는 수분을 진공을 이용하여 효과적으로 제거하였다. 그러나 너무 높은 진공은 효소 활성에 필수적인 수분까지 제거하게 되어 오히려 효소 활성을 감소시킨다. 따라서 적절한 진공은 부적절한 가수분해 반응을 막을 뿐만 아니라 효소 내 최적의 효소 활성을 유지할 수 있는 수분을 조절하는데 필수적이다.
본 발명의 하기 실시예에서, 진공도에 따른 반응시간별 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드 전환율을 측정한 결과, 모든 진공도에서 초기 4시간 동안 전환률이 급증한 반면, 8시간 이후 1mmHg와 20mmHg 진공도 사이의 전환률에는 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 에너지 효율 및 비용적인 측면을 고려했을 때, 20mmHg가 최적 진공도로 판단되었다. 최적 조건 하에서 약 91.7%의 최대 전환률을 보였다(도 5 참조).
일반적으로, 효소를 이용한 트리글리세라이드 합성은 5mmHg 이상의 고진공 상태에서 많이 수행되고 있다. 이에 비해, 본 발명의 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드의 합성 방법에서는, Lipozyme TL IM을 사용했을 때 최적의 진공도가 20mmHg로 확인되어 상대적으로 낮은 진공도를 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 감마리놀렌산 고함유 트리글리세라이드를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 재료 및 방법
재료
보리지 오일은 대한캠텍(Seoul, Republic of Korea)에서 지원받았다. 선택적 가수분해시 사용한 칸디다 루고사(Candida rugosa) 기원 효소(상품명; Lipase OF)는 Meito Sangyo Co.,Ltd.(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 분자증류 시스템은 UIC GmbH(Alzenau-Horstein, Germany)에서 구입하였다. 에스테르 반응에서 효소별 활성비교에 사용된 효소인 Novozym 435(Candida antarctica에서 유래된 고정화 효소), Lipozyme RM IM(Rhizomucor miehei에서 유래된 고정화 효소), Lipozyme TL IM(Thermomyces lanuginosus에서 유래된 고정화 효소)은 Novozymes(Seoul, Republic of Korea)으로부터 구입하였다. 분석에 사용된 TLC plate는 silica gel 60 F254 TLC plate(Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하였다. 이 연구에 사용된 다른 모든 시약은 달리 명시되지 않는 한 등급은 특급 이상이었다.
효소 촉매 선택적 가수분해
본 실험의 효소 촉매에 의한 선택적 가수분해는 평평한 바닥의 유리 워터 재킷 용기(내경, 3.5cm; 높이, 8cm)에서 진행하였다. 보리지 오일 4g과 인산 나트륨 완충액(50mM, pH 7.0)을 1:1의 중량비로 혼합하여 용기에 넣고 순환식 항온수조를 이용해 원하는 온도로 맞춘 뒤 300rpm으로 교반하였다. 교반하면서 기질 혼합물에 칸디다 루고사(Candida rugosa) 유래 효소(Meito Sangyo Co.,Ltd, Tokyo, Japan, 상품명; Lipase OF)를 첨가함으로써 반응을 시작하였다. 반응시간에 따라 반응물을 회수하여 원심분리 후 상층부(200 μL)만을 회수하여 클로로포름에 용해시켰다. 이후 나일론 마이크로 필터(Pall Corporation, Port Washington, NY, USA)를 통해 여과하여 효소를 완전히 제거한 후 분석에 사용하였다.
가수분해 반응이 끝나면 기질에 헥산을 넣고 분별깔때기를 이용해 효소 및 물을 제거하였다. 물과 효소가 완전히 제거된 효소 촉매 가수분해에 의해 얻은 반응 혼합물로부터 분자 증류 시스템을 사용하여 ‘감마리놀렌산이 풍부한 글리세라이드’를 분리하였다. 이때 분자 증류 조건은 다음과 같다. 증류 본체의 온도는 180 ℃, 진공도는 1 x 10-4 mmHg, 기질이 떨어지는 속도는 3초당 1방울로 진행하였다.
한편, ‘감마리놀렌산이 풍부한 지방산’은 감마리놀렌산이 풍부한 글리세라이드의 일부를 비누화하여 준비하였다. 자세하게는, 감마리놀렌산이 풍부한 글리세라이드 20g, NaOH 용액 (8g NaOH + 20ml 증류수) 및 99% 에탄올 60ml를 둥근플라스크에 넣고 환류냉각장치에 연결한 후 30분 동안 핫플레이트를 이용해 열을 가하였다. 이후 500ml 분별깔떼기(separate funnel)에 넣고 증류수 40ml와 n-헥산 60ml를 넣고 흔들어 섞어주었다. 층이 분리되면 하층을 다른 분별깔떼기(separate funnel)로 받은 후, 여기에 25ml 염산, 60ml n-헥산, 20ml 증류수를 넣고 흔들어서 섞어주었다. 층이 분리되면 하층은 버리고, 상층을 20ml 증류수로 중성 상태가 될 때까지 워싱하였다. 소듐 설페이트(sodium sulfate)를 필터페이퍼가 담긴 펀넬에 담고 아래엔 둥근 플라스크로 받쳐주었다. 중성이 된 상층을 이전 단계에 만든 셋팅에 받아준 다음, 둥근 플라스크로 받은 상층을 evaporation을 통해 남은 용매와 물을 제거함으로써 최종적으로 감마리놀렌산이 풍부한 지방산을 제조하였다.
효소 촉매 에스테르화
본 실험에서 효소 촉매 에스테르 반응은 50mL의 워터 재킷 용기를 이용하여 반응을 진행하였다. 분자 증류를 통해 얻은 감마리놀렌산이 풍부한 글리세라이드의 조성(wt%)은 지방산 2.8%, 모노아실글리세롤 1.2%, 다이아실글리세롤 17.4%, 트리글리세라이드 78.5% 였다. 글리세라이드 내 하이드록시기의 몰수는 아래과 같은 함수식으로 부터 계산하였다.
글리세라이드 내 하이드록시기의 몰 수 = (A + 2B) - C
상기 식에서 A는 글리세라이드 내의 다이아실글리세롤의 몰 수, B는 글리세라이드 내의 모노아실글리세롤의 몰 수, C는 글리세라이드 내의 지방산의 몰 수이다.
본 실험에서는 감마리놀렌산이 풍부한 글리세라이드(2.8g, 0.71mmol)와 감마리놀렌산이 풍부한 지방산(0.2g, 0.71mmol)을 용기에 넣고 순환식 항온수조를 이용해 원하는 온도로 맞춰준 뒤 250rpm의 속도로 교반하며 실험을 진행하였다. 교반하면서 기질 혼합물에 효소(Novozym 435, Lipozyme RM IM 또는 Lipozyme TL IM)를 첨가함으로써 반응을 시작하였다. 진공은 마이크로미터링 밸브(Swagelok, Solon, OH, USA)를 사용하여 조절하였고 디지털 진공게이지(Teledyne, Thousand Oaks, CA, USA)를 사용하여 모니터링하였다. 적절한 시간 간격으로 반응 혼합물에서 샘플(100 μL)을 회수하고 클로로포름에 용해시켰다. 이후 나일론 마이크로 필터를 통해 여과하여 효소를 완전히 제거하였다.
가스 크로마토그래피를 이용한 생성물 분석
[감마리놀렌산 함량 분석]
지방산과 글리세라이드 분획들은 박층 크로마토그래피(TLC)를 이용하여 분리하였다. 이때 사용한 전개용매는 석유 에테르 : 디에틸에테르 : 아세트산(petroleum ether : diethyl ether : acetic acid) (80:20:0.5, 부피비)가 혼합된 용매를 사용하였다. 전개 후 2,7-디클로로플루오레세인 용액(0.2% in 95% methanol)을 분무하여 자외선을 통하여 확인하였다. 지방산과 글리세라이드 분획에 해당하는 밴드를 TLC판에서 회수하고 각 분리된 분획은 BF3(Borontrifluoride) 메탄올을 촉매로 한 유도체화 반응을 통하여 지방산 메틸 에스터로 유도체화 시킨 후 n-헥산(1mL)으로 추출하였다. 분석을 위해 Supelcowax10 컬럼(30m x 0.25mm 내경.; Supelco, Bellefonte, PA, USA)과 화염 이온화 검출기 (FID)가 장착된 가스 크로마토그래피(model 3800; Varian, Palo Alto, CA, USA)가 사용되었으며 분석 조건은 다음과 같았다. 컬럼을 초기 180℃에서 1 분 동안 유지하고 2℃/min의 속도로 230 ℃까지 상승한 후 20분 동안 유지하였다. 캐리어가스는 헬륨이었고 컬럼 유속은 1.0 mL/min이다. Split ratio는 1:50 였으며, Injector 및 detector 온도는 각각 240℃ 및 250℃로 설정되었다. 내부표준물질로는 헵타데칸산(1mg/mL)을 사용하였다.
[보리지 오일의 위치별 지방산 조성]
보리지 오일의 지방산 위치분포를 확인하였으며 과정은 다음과 같다. 보리지 오일(5mg)에 1M Tris-HCl 완충액(pH 7.3) 2mL, 0.05%의 담즙산염 0.5mL, 2.2%의 염화칼슘 용액 0.2mL을 넣고 혼합한 후 약 20mg의 폴신시약(sigma, MO, USA)을 첨가하였다. 충분히 섞어준 후 37℃에서 2분동안 반응 후 즉시 6N 염산 5mL를 넣어 효소반응을 정지시켰다. 여기에 다이에틸 에테르(diethyl ether)를 15mL넣고 혼합 후 상층액(diethyl ether층)을 취하는 과정을 2회 반복하고 무수황산나트륨(anhydrous sodium sulfate)을 사용하여 잔존 수분 및 불순물을 제거하였다. TLC를 이용하여 각 지방산 분획들을 분리하였다. 이때 사용한 전개용매는 n-헥산 : 디에틸에테르 : 아세트산(n-hexane: diethyl ether : acetic acid) (50:50:1, 부피비)이 혼합된 용매를 사용하였다. 전개가 완료 된 후 2-모노아실글리세롤 분획을 회수하고 메틸화하여 가스크로마토그래피로 분석하였다. 보리지 오일에서 sn-1,3 위치의 지방산 조성은 sn-2위치의 지방산과 총 지방산 조성으로부터 계산하였다.
[가수분해도 측정 및 트리글리세라이드 전환률]
반응물 내 트리글리세라이드, 다이아실글리세롤, 모노아실글리세롤, 지방산 분포 분석을 위해 DB-1ht 컬럼 (15m x 0.25mm Id; J & W Scientific, Folsom, CA, USA)과 화염 이온화 검출기(flame ionization detector, FID)가 장착된 가스크로마토그래피(model 3800; Varian, Palo Alto, CA, USA)가 사용되었으며 분석 조건은 다음과 같았다. 컬럼을 초기 120℃에서 3분 동안 유지하고 25℃/min의 속도로 370℃까지 상승한 후 3분 동안 유지하였다. 캐리어가스는 헬륨이었고 컬럼 유속은 1.5mL/min이다. Split ratio는 1:50 였으며, Injector 및 detector 온도는 370℃로 설정되었다. 가스크로마토그래피 분석 결과로부터 얻은 가수분해도 및 전환율 (%)은 지방산(FA), 모노아실글리세롤(MAG), 다이아실글리세롤(DAG), 트리글리세라이드(TAG)의 면적으로부터 아래과 같은 함수식으로 부터 계산하였다.
가수분해도 = FA/(FA+MAG+DAG+TAG) x 100
트리글리세라이드 전환률 (%) = TAG/(FA+MAG+DAG+TAG) x 100
2. 결과
효소를 이용한 선택적 가수분해를 통한 감마리놀렌산 농축에 있어서 반응 온도 차이에 따른 효과
보리지 오일에서 칸디다 루고사(Candida rugosa) 유래 효소(Meito Sangyo Co.,Ltd, Tokyo, Japan, 상품명; Lipase OF)가 촉매하는 가수분해에 의한 감마리놀렌산 농축반응의 온도에 대한 결과를 가수분해도, 감마리놀렌산 함량, 감마리놀렌산 회수율 순으로 도 1에서 나타내었다. 30 ~ 50℃의 온도 범위에서 수행되었으며 보리지 오일과 인산 나트륨 완충액의 무게비, 효소량은 각각 1:1, 0.05% (오일 중량 기준)였다.
그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, 전체 반응 기간 중 50℃에서 상당히 낮은 가수분해도와 감마리놀렌산 함량이 관찰되었다. 30℃와 40℃ 두 온도 모두 4시간 까지는 꾸준히 증가하다가 그 이후엔 평형 상태에 도달했고, 최종적으로 비슷한 가수분해도 및 감마리놀렌산함량이 관찰되었다. 그리고 회수율은 30℃에서 약간 더 높았다. 따라서 에너지 효율과 감마리놀렌산 함량을 고려하여 30℃를 가수분해에 가장 적합한 온도로 설정하였다.
| 가수분해도 | |||
| 시간(h) | 30℃ | 40℃ | 50℃ |
| 0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 1 | 47.0 ± 0.6 | 45.5 ± 2.9 | 9.4 ± 0.4 |
| 2 | 55.1 ± 1.6 | 55.6 ± 1.9 | 13.7 ± 0.4 |
| 3 | 58.8 ± 0.4 | 58.9 ± 0.9 | 15.5 ± 1.6 |
| 4 | 61.8 ± 0.4 | 62.2 ± 1.1 | 16.4 ± 1.5 |
| 6 | 64.4 ± 0.4 | 65.1 ± 0.7 | 19.0 ± 1.8 |
| 감마리놀렌산 함량 | |||
| 시간(h) | 30℃ | 40℃ | 50℃ |
| 0 | 20.6 | 20.6 | 20.6 |
| 1 | 36.3 ± 0.3 | 37.3 ± 2.9 | 22.4 ± 0.4 |
| 2 | 41.8 ± 0.5 | 42.9 ± 1.9 | 23.7 ± 0.7 |
| 3 | 43.9 ± 0.7 | 44.4 ± 0.9 | 23.8 ± 0.5 |
| 4 | 45.3 ± 0.3 | 45.9 ± 1.1 | 25.3 ± 1.8 |
| 6 | 46.7 ± 0.1 | 47.1 ± 0.7 | 25.4 ± 1.0 |
| 회수율 | |||
| 시간(h) | 30℃ | 40℃ | 50℃ |
| 0 | 100 | 100 | 100 |
| 1 | 94.8 ± 0.1 | 95.2 ± 0.7 | 99.2 ± 0.0 |
| 2 | 91.1 ± 0.6 | 90.9 ± 0.9 | 98.8 ± 0.2 |
| 3 | 87.6 ± 0.2 | 87.3 ± 1.1 | 98.6 ± 0.3 |
| 4 | 84.4 ± 0.9 | 84.3 ± 1.1 | 98.7 ± 0.1 |
| 6 | 80.6 ± 0.6 | 79.4 ± 0.8 | 98.5 ± 0.3 |
보리지 오일의 Sn-1,3 및 Sn-2위치의 지방산 조성과 칸디다 루고사(Candida rugosa) 유래 효소 촉매 가수분해 후 얻어진 글리세라이드 분획의 지방산 조성을 하기 표 2에 나타내었다. Sn-2 위치의 감마리놀렌산 함량이 Sn-1,3 위치의 감마리놀렌산 함량보다 높았다. 그리고 효소 촉매 가수분해 후 글리세라이드 분획에서의 감마리놀렌산 함량이 현저히 증가했고 올레산과 리놀레산 함량은 감소함을 볼 수 있었다. 이로써 본 실험에 사용한 칸디다 루고사(Candida rugosa) 유래 효소는 Δ-9 지방산에 특이성이 있음을 확인할 수 있었다.
| 지방산 | 트리아실글리세롤b) | 위치 | 감마-리놀렌산 풍부 글리세라이드c) | |
| sn-1 | sn-2 | |||
| C16:0 | 11.8 ± 0.4a) | 15.7 ± 0.1 | 1.2 ± 0.2 | 7.4 ± 0.2 |
| C18:0 | 4.9 ± 0.2 | 7.0 ± 0.1 | 0.5 ± 0.1 | 5.4 ± 0.5 |
| C18:1 (Δ9) | 18.7 ± 0.3 | 19.3 ± 0.5 | 17.4 ± 1.0 | 11.4 ± 0.2 |
| C18:1 (Δ11) | 0.5 ± 0.0 | 0.7 ± 0.0 | 0.0 ± 0.0 | 0.4 ± 0.0 |
| C18:2 (Δ9,12) | 36.9 ± 0.2 | 34.9 ± 0.2 | 41.3 ± 0.3 | 20.6 ± 0.1 |
| C18:3 (Δ6,9,12) | 20.6 ± 0.6 | 12.0 ± 0.6 | 37.6 ± 1.2 | 45.9 ± 0.6 |
| C20:0 | 0.3 ± 0.0 | 0.2 ± 0.0 | 1.2 ± 0.4 | 0.4 ± 0.0 |
| C20:1 (Δ11) | 4.0 ± 0.3 | 6.2 ± 0.0 | 0.4 ± 0.0 | 5.3 ± 0.1 |
| C22:1 (Δ13) | 2.4 ± 0.3 | 4.1 ± 0.0 | 0.1 ± 0.1 | 3.3 ± 0.1 |
| a) 결과는 3회 측정된 값의 평균 b) 보리지 오일의 트라이아실글리세롤 c) 칸디다 루고사 유래 리파아제 촉매 가수분해 후 글리세라이드 |
||||
효소 종류에 따른 효과
글리세롤과 지방산을 이용한 트리글리세라이드 합성에 있어서 Lipozyme TL IM을 효소로 이용하는 경우 응집이 일어나 반응이 발생하지 않는다. 그 이유는 Lipozyme TL IM에 사용된 담체가 실리카겔(silica gel)에 해당하는바, 기질로 사용된 글리세롤과 뭉치는 현상이 일어나기 때문이다. 본 발명에서는 상기와 같은 문제점을 극복하기 위하여 기질로 글리세롤 대신 보리지 오일에 효소를 이용 부분적 가수분해를 통하여 생산된 감마리놀렌산 고함유 글리세라이드 분획과 감마리놀렌산이 풍부한 지방산을 사용하여 Lipozyme TL IM과 반응을 시도하였으며, 그 결과 응집반응 없이 트리글리세라이드를 효과적으로 합성할 수 있음을 확인하였다.
본 실험에서 Lipozyme TL IM의 활용 가능성을 제시하기 위해 현재 에스터 반응용으로 가장 널리 사용되고 있는 효소인 Novozym 435, Lipozyme RM IM을 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드합성에 사용하여 활성을 비교하였다. 효소의 활성은 트리글리세라이드 합성 전환률(%)로 정의하였다. 이 실험에서 온도, 효소량, 지방산과 글리세라이드내 히드록시그룹의 몰비율 그리고 진공도는 각각 50℃, 5% (총 기질 중량 기준), 1:1, 5 mmHg였다.
그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, Lipozyme RM IM은 전체 반응에 걸쳐 낮은 활성을 나타낸 반면, Lipozyme TL IM과 Novozym 435 두 효소는 유사한 활성을 나타내었다(Lipozyme TL IM : 약 89.6%, Novozym 435 : 약 90.5%). 초기 반응 시간에서는 Lipozyme TL IM의 활성이 높았으며, 6시간 이후에는 Novozym 435의 활성이 조금 더 높았으나, 결과적으로는 두 효소의 활성이 비슷하였다.
따라서 글리세롤 대신 보리지 오일에 효소를 이용 부분적 가수분해를 통하여 생산된 감마리놀렌산 고함유 글리세라이드 분획을 사용하는 본 연구의 새로운 전략이 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드를 합성하는데 Lipozyme TL IM을 사용할 수 있음을 입증하였다.
| 시간(h) | Lipozyme TL IM | Lipozyme RM IM | Novozym 435 |
| 0 | 70.7 ± 0.5 | 71.4 ± 0.9 | 71.4 ± 0.3 |
| 2 | 79.7 ± 0.2 | 75.8 ± 0.7 | 77.4 ± 0.5 |
| 4 | 84.4 ± 0.6 | 77.8 ± 0.9 | 81.0 ± 0.3 |
| 6 | 86.2 ± 0.1 | 79.7 ± 1.1 | 84.4 ± 0.8 |
| 8 | 86.8 ± 0.1 | 82.5 ± 1.1 | 86.6 ± 0.1 |
| 12 | 89.6 ± 0.4 | 84.3 ± 0.8 | 90.5 ± 0.3 |
온도 조건에 따른 효과
상기 실험을 통해 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드를 합성하는데 Lipozyme TL IM을 사용하는 것이 효과적임을 입증하였는바, 본 실험에서는 상기 효소를 이용한 최적의 반응 온도를 확인하기 위하여 다양한 온도 조건에서 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드의 합성 효율을 평가하였다.
반응 온도에 대한 결과는 도 3에 나타내었다. 30 ~ 60℃의 온도 범위에서 수행되었으며 이 실험에서 효소량, 지방산과 글리세라이드내 히드록시그룹의 몰비율 그리고 진공도는 각각 5% (총 기질 중량 기준), 1:1, 5 mmHg였다.
반응 온도가 30℃에서 50℃로 증가함에 따라 전체 반응 시간 동안 전환률이 현저하게 증가하였다. 50℃와 60℃ 두 온도는 6시간 후에 거의 평형상태에 도달했으며, 트리글리세라이드로의 전환률도 거의 유사하였다. 따라서 에너지 효율과 효소의 잔존 활성을 고려하여, 50℃를 트리글리세라이드 합성에 가장 적합한 온도로 선정하였다.
참고로, Novozym 435를 이용한 트리글리세라이드 합성의 최적온도는 60℃인것과 비교했을 때, Lipozyme TL IM을 사용한 본 실험에서는 50℃가 최적 온도였다. 따라서 Lipozyme TL IM을 사용하는 것은 비용적인 면에서 더 좋을 뿐 아니라 에너지 절약 부분에서도 더 효율적임을 확인할 수 있었다.
| 시간(h) | 30℃ | 40℃ | 50℃ | 60℃ |
| 0 | 71.2 ± 0.9 | 70.7 ± 1.7 | 71.3 ± 0.9 | 70.5 ± 0.8 |
| 2 | 73.0 ± 0.7 | 76.3 ± 0.9 | 81.5 ± 1.9 | 80.3 ± 0.9 |
| 4 | 77.3 ± 0.0 | 82.6 ± 1.3 | 85.6 ± 1.1 | 85.4 ± 0.7 |
| 6 | 81.4 ± 1.1 | 85.5 ± 0.8 | 87.6 ± 0.6 | 87.9 ± 1.1 |
| 8 | 84.2 ± 1.3 | 86.9 ± 0.6 | 89.0 ± 0.5 | 89.3 ± 0.9 |
| 12 | 86.8 ± 0.8 | 89.2 ± 0.6 | 90.1 ± 0.7 | 90.5 ± 0.9 |
효소량에 따른 효과
본 실험에서는 Lipozyme TL IM을 이용한 최적의 효소량을 확인하기 위하여 다양한 효소량 조건에서 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드의 합성 효율을 평가하였다.
효소량에 따른 결과는 도 4에 나타내었다. 효소량은 2.5 ~ 20 % (총 기질 중량 기준) 범위에서 수행되었다. 이 실험에서 온도, 지방산과 글리세라이드내 히드록시그룹의 몰비율 그리고 진공도는 각각 50℃, 1:1, 5 mmHg였다.
전체 반응에 걸쳐 2.5%의 효소량이 가장 낮은 전환률을 보여주었다. 효소량이 2.5%에서 10%로 증가함에 따라 전체 반응 시간 동안 전환률이 현저하게 증가하였다. 효소량 15%와 20%를 사용하였을 때, 4시간 미만의 반응 시간에서는 10%의 효소량 보다 약간 더 높았지만 그 이후 시간에는 세 효소량의 전환률 사이에 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 약 92%의 최대 전환률을 보였으며 효소량 10%가 최적 효소량으로 판단되었다.
| 시간(h) | 2.5% | 5.0% | 10% | 15% | 20% |
| 0 | 70.5 ± 0.2 | 71.1 ± 0.1 | 71.4 ± 0.4 | 71.5 ± 0.3 | 71.7 ± 0.2 |
| 2 | 73.8 ± 1.9 | 81.4 ± 1.0 | 81.7 ± 2.5 | 83.3 ± 0. | 83.2 ± 1.3 |
| 4 | 77.0 ± 1.5 | 85.7 ± 2.1 | 86.4 ± 2.7 | 88.1 ± 0.9 | 87.8 ± 1.2 |
| 6 | 80.4 ± 2.3 | 87.9 ± 1.5 | 89.1 ± 1.7 | 89.4 ± 0.7 | 89.5 ± 1.2 |
| 8 | 82.3 ± 0.7 | 90.0 ± 0.7 | 90.8 ± 1.3 | 90.7 ± 0.5 | 91.0 ± 0.8 |
| 12 | 85.3 ± 0.3 | 90.4 ± 0.4 | 92.0 ± 0.5 | 92.0 ± 0.4 | 92.0 ± 1.7 |
진공도에 따른 효과
물이 생기면 효소를 저해하고 역반응 일어난다. 본 실험에서는 혼합물의 수분 함량을 제어하기 위해 진공 반응을 사용했으며, 최적의 진공도를 확인하기 위하여 다양한 진공 조건에서 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드의 합성 효율을 평가하였다.
진공도에 대한 결과는 도 5에서 나타내었다. 1 ~ 200 mmHg의 진공 범위에서 수행되었으며 이 실험에서 온도, 효소량, 지방산과 글리세라이드내 히드록시그룹의 몰비율은 50℃, 10% (총 기질 중량 기준), 1:1 이였다.
모든 진공도에서 초기 4시간 동안 전환률이 급증하였다. 하지만 8시간 이후 1mmHg와 20mmHg 진공도 사이의 전환률에는 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 에너지 효율 및 비용적인 측면을 고려했을 때, 20mmHg가 최적 진공도로 판단되었다. 최적 조건 하에서 약 91.7%의 최대 전환률을 보였다.
이전 연구에서, 효소를 이용한 트리글리세라이드 합성은 5mmHg 이상의 고진공 상태에서 많이 수행되었다. 이에 비해 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드의 합성에 Lipozyme TL IM을 사용했을 때 최적의 진공도는 20mmHg 정도로 낮다는 사실을 확인할 수 있었다.
| 시간(h) | 1 mmHg | 5 mmHg | 10 mmHg | 20 mmHg | 50 mmHg | 100 mmHg | 200 mmHg |
| 0 | 71.4±1.0 | 70.9±0.4 | 71.6±0.5 | 71.4±0.3 | 71.0±0.6 | 71.8±0.0 | 70.9±0.1 |
| 2 | 82.3±0.7 | 83.3±2.0 | 94.1±1.5 | 78.6±0.2 | 80.6±0.9 | 77.8±0.5 | 76.9±0.2 |
| 4 | 87.8±0.1 | 86.5±2.2 | 97.6±1.2 | 85.2±0.6 | 86.7±0.8 | 81.7±0.2 | 81.0±1.0 |
| 6 | 89.7±0.2 | 88.5±1.7 | 89.1±0.5 | 88.5±0.9 | 88.3±0.6 | 84.7±0.6 | 83.0±0.6 |
| 8 | 90.2±0.1 | 89.6±0.8 | 90.2±0.6 | 90.4±0.7 | 89.9±0.8 | 87.1±0.4 | 84.7±0.6 |
| 12 | 91.7±0.2 | 92±0.5 | 91.5±0.5 | 91.7±0.8 | 90.7±1.1 | 88.7±0.2 | 86.6±0.7 |
결론적으로, 실리카를 담체로 사용하는 Lipozyme TL IM은 글리세롤과 응집 하는 반응을 보이며, 이러한 문제점을 극복하기 위해 본 실험에서는 트리글리세라이드로의 합성에 널리 사용하는 방법인 글리세롤과 지방산을 반응하는 것이 아닌 글리세롤 대신 보리지 오일에 효소를 이용 부분적 가수분해를 통하여 생산된 감마리놀렌산 고함유 글리세라이드 분획을 사용함으로써 트리글리세라이드 합성을 시도하였다. 그 결과, 기존에 글리세롤의 존재하에 응집하는 문제점 때문에 사용하지 못했던 Lipozyme TL IM이 진공 조건에서 감마리놀렌산이 풍부한 트리글리세라이드 합성에 성공하였다. 본 실험을 통하여 상업적으로 널리 사용하고 있는 저렴한 효소 중 하나인 Lipozyme TL IM을 트리글리세라이드의 합성에 사용할 수 있는 방안을 제시함으로써 트리글리세라이드 합성 비용의 절감 가능성을 나타내었다. 또한 본 실험은 Lipozyme TL IM을 이용한 트리글리세라이드 합성에 대한 최초의 보고이다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (8)
- a) 감마리놀렌산 함유 글리세라이드 분획물 및 감마리놀렌산 함유 지방산을 기질로 준비하는 단계; 및
b) 상기 기질에 고정화 효소로 Lipozyme TL IM를 혼합하여 반응시키는 단계를 포함하는, 감마리놀렌산 함유 트리글리세라이드의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 감마리놀렌산 함유 글리세라이드 분획물은 오메가 3 또는 오메가 6를 함유하는 오일에 칸디다 루고사(Candida rugose) 유래 효소를 가하여 가수분해하는 단계; 가수분해물에 헥산을 넣고 분별깔때기를 이용하여 효소 및 물을 제거하는 단계; 및 효소가 제거된 반응 혼합물을 증류 분리하는 단계를 통해 제조되는 것을 특징으로 하는, 감마리놀렌산 함유 트리글리세라이드의 제조방법. - 제2항에 있어서,
상기 오메가 3 또는 오메가 6를 함유하는 오일은 아마씨 오일, 청어 오일, 정어리 오일, 멸치 오일, 참치 오일, 미세조류 오일, 아히플라워 오일(ahiflower oil), 에키움 오일(echium Oil), 달맞이꽃 오일, 블랙커런트 오일 및 보리지 오일(borage oil)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 감마리놀렌산 함유 트리글리세라이드의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 감마리놀렌산 함유 지방산은 감마리놀렌산 함유 글리세라이드 혼합물을 비누화 반응을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는, 감마리놀렌산 함유 트리글리세라이드의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 b) 단계는 45℃ 내지 55℃의 온도조건에서 반응시키는 것을 특징으로 하는, 감마리놀렌산 함유 트리글리세라이드의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 b) 단계에서 고정화 효소는 기질의 무게 기준으로 5 내지 10 중량%로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 감마리놀렌산 함유 트리글리세라이드의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 b) 단계는 15 내지 20 mmHg의 진공 조건에서 반응시키는 것을 특징으로 하는, 감마리놀렌산 함유 트리글리세라이드의 제조방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 감마리놀렌산 함유 트리글리세라이드.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020220090569A KR20240012963A (ko) | 2022-07-21 | 2022-07-21 | 고정화 효소로 Lipozyme TL IM을 이용한 감마리놀렌산 고함유 트리글리세라이드 제조방법 |
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|---|---|---|---|
| KR1020220090569A KR20240012963A (ko) | 2022-07-21 | 2022-07-21 | 고정화 효소로 Lipozyme TL IM을 이용한 감마리놀렌산 고함유 트리글리세라이드 제조방법 |
Publications (1)
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220090569A KR20240012963A (ko) | 2022-07-21 | 2022-07-21 | 고정화 효소로 Lipozyme TL IM을 이용한 감마리놀렌산 고함유 트리글리세라이드 제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20240012963A (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20110069421A (ko) | 2009-12-17 | 2011-06-23 | (주) 켐포트 | 고도 불포화 지방산을 고농도로 함유하는 트리글리세라이드 유지의 제조방법 |
| KR102373368B1 (ko) | 2021-05-18 | 2022-03-11 | 대한켐텍 주식회사 | 효소를 이용한 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 제조방법 |
-
2022
- 2022-07-21 KR KR1020220090569A patent/KR20240012963A/ko unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20110069421A (ko) | 2009-12-17 | 2011-06-23 | (주) 켐포트 | 고도 불포화 지방산을 고농도로 함유하는 트리글리세라이드 유지의 제조방법 |
| KR102373368B1 (ko) | 2021-05-18 | 2022-03-11 | 대한켐텍 주식회사 | 효소를 이용한 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 제조방법 |
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