KR102373368B1 - 효소를 이용한 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 제조방법 - Google Patents

효소를 이용한 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특정 고정화 효소의 존재하에서 팔미톨레산이 농축된 지방산 (39.9% - 55.8%)과 글리세롤을 반응시켜 고농도의 팔미톨레산을 함유하는 트리글리세라이드(triglyceride)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 팔미톨레산이 농축된 지방산을 요소 분별법으로 얻는 방법 또는 효소를 이용한 선택적 가수분해 방법을 통하여 얻는 방법에 관한 것이다.

Description

효소를 이용한 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 제조방법{Preparation method of palmitoleic acid-enriched triglyceride using an enzyme}
본 발명은 특정 고정화 효소의 존재하에서 팔미톨레산(palmitoleic acid)을 30중량%이상 포함하는 지방산과 글리세롤(glycerol)을 반응시켜 고농도의 팔미톨레산을 함유하는 트리글리세라이드(triglyceride)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 팔미톨레산을 30중량% 이상 포함하는 지방산을 요소 분별법으로 얻는 방법 또는 효소를 이용한 선택적 가수분해 방법을 통하여 얻는 방법에 관한 것이다.
최근 기능성 지방산들의 연구가 활발히 진행되고 있다. 몇몇 불포화 지방산들은 뇌 및 심혈관 기능과 관련된 질병의 예방과 혈관 기능의 향상 등 다양한 기능들이 보고되고 있다. 팔미톨레산(Δ-9 C16:1)은 많은 생리활성을 갖는 n-7 계열의 단일 불포화 지방산이다. 팔미톨레산은 인간의 모든 조직에 존재하며 스테알로일-CoA 불포화효소-1의 작용에 의해 팔미트산으로부터 생합성된다.
자연계에 많은 지방산은 트리글리세라이드 형태로 존재한다. 즉, 글리세롤의 세 개의 OH기에 3분자의 지방산이 에스테르 결합되어 있는 형태로 존재하는데, 이때 하나의 글리세롤에 결합된 3개의 지방산은 지방산의 성질, 즉 탄소수, 포화, 불포화 등의 점에서 동일하지 않다. 따라서 트리글리세라이드 형태로부터 특정의 지방산만을 얻고자 하는 노력이 있어 왔다.
이러한 지방산, 특히 불포화지방산의 농축을 위해서 여러 가지 방법들이 시도되어 왔다. 그 예로서 초임계 이산화탄소 분별 추출, 효소적 가수분해를 통한 기름 에스테르 교환, 분별 증류, 요소 분별법 등이 있으며 각각의 방법은 장단점을 갖고 있다. 초임계 이산화탄소 추출의 경우 친환경적인 방법이지만 값비싼 시설이 요구되고 시간이 오래 걸리며, 효소적 가수분해 또한 친환경적이지만 분별 증류와 같은 추가적인 공정이 요구되어 수율이 떨어진다는 단점이 있다. 요소 분별법의 경우 비교적 저렴하고 간단한 방법이지만 잔류 요소에 대한 독성이 문제로 남아있다.
한편, 유리 지방산은 트리글리세라이드 형태보다 산화적 안정성이 낮다. 또한 트리글리세라이드의 형태가 유리 지방산 형태보다 우수한 체내 흡수성을 나타낸다고 보고되었다.
공개특허 10-2001-0062288
이에 유리되어 농축된 기능성 지방산들을 글리세롤과 에스테르 반응을 통하여 트리글리세라이드 형태로 다시 에스테르화시키는 것에 대한 연구가 있어왔으나 수율이나 반응 경제적 면에서 만족할 만한 기술이 개발되지 않고 있다.
본 발명의 목적은 고농도로 농축된 팔미톨레산과 글리세롤을 반응시켜 고농도의 팔미톨레산을 함유하는 트리글리세라이드(triglyceride)를 제조하는 경제적으로 유용한 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 상기 트리글리세라이드 제조에 사용되는 고농도로 농축된 팔미톨레산을 얻는 유용한 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적 달성을 위하여 본 발명은 고농도로 농축된 팔미톨레산을 포함하는 지방산과 글리세롤을 소수성 담체에 고정화 된 Thermomyces lanuginosus 유래 Eversa transform 2.0 효소를 사용하여 에스테르화 반응시켜 고농도의 팔미톨레산을 함유하는 트리글리세라이드(triglyceride)를 제조하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 고농도로 농축된 팔미톨레산을 포함하는 지방산이 요소분별법을 이용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 고농도로 농축된 팔미톨레산을 포함하는 지방산이 Candida rugosa 유래 리파제 효소를 이용한 선택적 가수분해를 통하여 제조되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법을 이용하면 저농도의 팔미톨레산을 포함하는 기름을 원료로 고농도로 팔미톨레산을 포함하는 트리글리세라이드를 저비용으로 경제적이고 효율적으로 제조할 수 있는 효과가 있다. 또한 팔미톨레산을 고농도로 포함하는 글리세라이드 형태를 제공하는 효과가 있다.
본 발명은 요소분별으로 팔미톨레산을 농축함으로써 초기 농도 대비 약 2.5 배 이상 농축하여 고농도의 팔미톨레산을 포함하는 지방산을 얻을 수 있는 효과가 있고 이를 활용하여 고농도로 팔미톨레산을 포함하는 트리글리세라이드를 저비용으로 제공하는 효과가 있다.
본 발명은 특정 효소를 이용한 선택적 가수분해를 통하여 팔미톨레산을 농축함으로써 초기 농도 대비 약 2 배 이상 농축할 수 있는 효과가 있고 이를 활용하여 고농도로 팔미톨레산을 포함하는 트리글리세라이드를 저비용으로 제공하는 효과가 있다.
도 1은 요소분별법으로 얻은 고농도로 농축된 팔미톨레산을 포함하는 지방산을 효소 종류를 달리하여 에스테르화 반응시켰을 때의 지방산의 에스테르로의 전환율을 나타낸다.
도 2는 요소분별법으로 얻은 고농도로 농축된 팔미톨레산을 포함하는 지방산을 에버사 고정화효소를 사용하고, 반응온도를 달리하여 에스테르화 반응시켰을 때의 지방산의 에스테르로의 전환율을 나타낸다.
도 3은 요소분별법으로 얻은 고농도로 농축된 팔미톨레산을 포함하는 지방산을 에버사 고정화효소를 사용하고, 사용되는 효소량을 달리하여 에스테르화 반응시켰을 때의 지방산의 에스테르로의 전환율을 나타낸다.
도 4는 요소분별법으로 얻은 고농도로 농축된 팔미톨레산을 포함하는 지방산을 에버사 고정화효소를 사용하고, 진공도를 달리하여 에스테르화 반응시켰을 때의 지방산의 에스테르로의 전환율을 나타낸다.
도 5는 효소를 이용한 선택적 가수분해 후 얻어진 반응물에 대해 분자 증류를 수행하기 위한 장치를 나타낸다.
도 6은 효소를 이용한 선택적 가수분해 반응을 온도를 달리하며 수행한 결과를 나타낸다.
도 7은 효소를 이용한 선택적 가수분해로 얻은 고농도로 농축된 팔미톨레산을 포함하는 지방산을 효소 종류를 달리하여 에스테르화 반응시켰을 때의 지방산의 에스테르로의 전환율을 나타낸다.
도 8은 선택적 가수분해로 얻은 고농도로 농축된 팔미톨레산을 포함하는 지방산을 에버사 고정화효소를 사용하고, 온도를 달리하여 에스테르화 반응시켰을 때의 지방산의 에스테르로의 전환율을 나타낸다.
도 9는 선택적 가수분해로 얻은 고농도로 농축된 팔미톨레산을 포함하는 지방산을 에버사 고정화효소를 사용하고, 효소량을 달리하여 에스테르화 반응시켰을 때의 지방산의 에스테르로의 전환율을 나타낸다.
도 10은 선택적 가수분해로 얻은 고농도로 농축된 팔미톨레산을 포함하는 지방산을 에버사 고정화효소를 사용하고, 진공도를 달리하여 에스테르화 반응시켰을 때의 지방산의 에스테르로의 전환율을 나타낸다.
이하，본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
팔미톨레산은 식이로 섭취하거나 도포하였을 때 신체 내·외부적으로 다양한 효과가 알려져 있다. 일예로서 팔미톨레산을 섭취할 경우 콜레스테롤 수치를 낮추고 인슐린 저항성과 간기능 저하를 막을 수 있다. 팔미톨레산을 피부에 도포했을 경우에는 세포의 염증 반응을 완화하고 세균의 감염에 대한 저항이 증가할 수 있다. 팔미톨레산은 화장품의 성분으로도 이용될 수 있고, 높은 항균 활성을 바탕으로 박테리아 감염 국소 치료제나 그람 양성균에 대한 방부제로의 활용이 가능할 수 있다. 더불어 팔미톨레산의 식이 섭취가 암의 위험성 감소와 연관이 있다는 보고도 있다.
한편, 팔미톨레산은 이런 다양한 효과 대비 독성의 위험이 없으며 세포 자멸을 유발하는 세포의 조절도 관여한다.
팔미톨레산은 동식물계에 널리 분포하며 생선기름, 고래유 등의 수산유지에 대량으로 함유되어 있고, 식물계로는 마카다미아(Macadamia integrifolia and M. tetraphylla) 너트 기름, 산자나무(Hippophae rhamnoides) 기름, 시벅손 기름, 피그미꽃 기름 등이 알려져 있으나 그 함유량은 마카다미아 너트 기름에 17~34%, 산자나무 기름에 19~29% 정도로 높지 않다. 그러므로 본 발명은 팔미톨레산이 고농도로 농축된 지방산을 얻고자 하였다.
한편, 유리 지방산은 트리글리세라이드 형태보다 산화적 안정성이 낮아서 쉽게 산화되어 변질될 우려가 있는 한편 트리글리세라이드의 형태보다 체내 흡수성이 낮은 것으로 보고되었다.
따라서 본 발명은 상기 팔미톨레산이 고농도로 농축된 지방산을 이용하여 글리세롤과 에스테르화 반응을 시켜서 트리글리세라이드 형태를 제공하고자 하였다.
본 발명은 식물성 오일로부터 요소분별법 또는 효소를 이용한 선택적 가수분해를 통하여 팔미톨레산이 고농도로 농축된 지방산을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 팔미톨레산이 고농도로 농축된 지방산을 고정화 효소를 사용하여 글리세롤과 반응시켜 트리글리세라이드 형태를 제조하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명의 각 단계를 구체적으로 설명한다.
[요소 분별법]
특정 지방산을 분별하는 방법인 요소 분별법은 단쇄 포화지방산과 포화지방산을 제거하여 불포화 지방산을 농축하는 방법이다.
본 발명은 요소 분별법으로 팔미톨레산이 고농도로 농축된 지방산을 얻기 위하여 먼저 팔미톨레산이 함유된 기름을 가수분해하여 유리 지방산 을 얻는다.
상기 팔미톨레산이 함유된 기름은 마카다미아(Macadamia integrifolia and M. tetraphylla) 너트 기름, 산자나무(Hippophae rhamnoides) 기름, 시벅손 기름, 피그미꽃 기름일 수 있고 바람직하게는 마카다미아 너트 기름 또는 산자나무 기름일 수 있다.
구체적으로 기름에 수산화나트륨 수용액과 에탄올을 넣고 환류하여 검화(saponification)시키고 이후 염산 수용액을 첨가하여 유리 지방산을 얻는다.
상기 유리 지방산과 요소를 메탄올 용매하에서 반응시킨 후 냉각 방치하였다. 지방산에 대한 우레아 비율은 바람직하게는 중량비로 1:2.5-1:3.5이고 결정화 조건은 이에 제한되지 않지만 2-6℃, 10-15시간이다. 이후 생성된 요소 결정물을 제거하고 남은 여액을 농축하고 염산 및 헥산을 가하여 지방산이 함유된 핵산층을 얻는다.
핵산을 제거하여 팔미톨레산이 농축된 지방산을 얻는다.
요소 분별법을 이용한 농축에서는 팔미톨레산 함량이 초기 약 20중량%에서 50중량%이상으로 약 2.5배이상 농축될 수 있으며, 이때 팔미틴산(C16:0) 및 올레산(C18:1)의 함량은 감소한다.
[선택적 가수분해]
본 발명자들은 특정 효소가 특히 팔미톨레산에 대한 선택적 가수분해 효율이 높음을 발견하고 이를 이용하여 선택적 가수분해 반응을 수행하였다.
ARA, EPA, DHA, 등의 불포화도가 높은 오메가-3 지방산과 같은 기능성 고도불포화지방산들은 선택적 가수분해를 통하여 농축될 때 가수분해 이후 글리세라이드류 (모노글리세라이드, 디글리세라이드, 트리글리세라이드)에 농축되는 것과 달리 본 발명자들이 개발한 효소를 이용하여 팔미톨레산이 포함된 트리글리세라이드에 대해 선택적 가수분해 반응을 시키는 경우 팔미톨레산이 지방산으로 농축되었다. 즉, 본 발명에서는 target 지방산인 팔미톨렌산을 선택적으로 가수분해시켜 유리된 지방산으로 팔미톨레산이 농축되었다.
가수분해 반응에 사용된 효소는 Candida rugosa 유래 리파제, 바람직하게는 Lipase OF(상품명)로 팔리톨레산 포함 기름과 인산 나트륨 완충 용액(50mM, pH 7.0)을 바람직하게는 1:1의 중량비 혼합한 용액에 효소를 총 기름 양 기준 0.001-0.05중량%, 바람직하게는 0.003-0.048중량%(12-192 U/g) 넣어 수행될 수 있다. 효소를 상기 함량으로 넣음으로써 특히 팔미톨레산에 대한 선택적 가수분해가 효율적으로 수행되었다.
반응은 25-40℃ 온도에서 40-100분간 시켰다. 선택적 가수분해가 상기 온도에서 이루어지는 경우 특히 팔미톨레산에 대한 선택적 가수분해 반응 정도가 크게 증가하였다. 즉, 선택성이 증가하였다. 반응 완료 후 반응물을 클로로포름에 용해시키고 물을 이용하여 세척하였으며, 클로로포름을 제거하고 생성물을 회수한다.
효소를 이용한 선택적 가수분해 후 얻어진 생성물로부터 분자증류를 통하여 팔미톨레산이 농축된 유리 지방산을 회수하였으며, 분자증류는 바람직하게는 약 1-5torr의 진공조건에서 진행하여 팔리톨레산이 농축된 지방산을 얻었다.
[트리글리세라이드 합성]
상기 요소 분별법 또는 선택적 가수분해로 얻은 팔미톨레산이 농축된 지방산과 글리세롤(glycerol)을 효소 존재하에서 반응시켜 트리글리세라이드(triglyceride)를 제조하였다. 상기 팔리톨레산이 농축된 지방산은 팔미톨레산을 30중량%이상, 바람직하게는 35중량% 이상 60중량%이하로 포함하는 지방산일 수 있다.
1) 고정화 효소의 제조
효소는 상업용 액체 리파제 효소, 바람직하게는 Thermomyces lanuginosus 유래 Eversa transform 2.0 (상품명) 효소를 소수성 담체인 Lewatit VP OC 1600에 고정화시켜 생산된 고정화 효소를 사용하였다.
상기 고정화 효소는 현재까지 트리글리세라이드 합성에 가장 효과적인 효소로 알려진 상업용 고정화 효소인 Novozym 435(Candida antarctica 유래) 등과 비교할 때 에스테르화 반응 활성이 매우 우수하고 비교적 마일드(mild)한 조건에서 에스테르화 반응이 진행되어 경제적이 유리하다는 장점이 있다.
본 발명에서 사용된 담체의 경우, 표면의 친수성을 높여 효소가 소수성 담체에 물리적으로 효과적으로 결합되게 하였다. 구체적으로 담체를 에탄올에 가하여 방치한 후 에탄올을 제거하면서 동시에 인산나트륨 완충 용액으로 교체되게 하여 완충 용액이 함유되고 표면의 친수성이 높은 담체를 제조하여, 효소가 담체에 효과적으로 결합할 수 있게 하였다.
상기 내부가 완충용액으로 채워진 담체와 효소 용액을 반응기에 넣고 30℃에서 10-24시간 교반하였다. 교반이 끝난 담체를 효소 용액으로부터 분리하고 동일한 완충용액으로 세척함으로서 결합되지 않은 효소를 제거하였다. 효소가 결합된 담체는 상온에서 8-24시간 건조시킨 후 약 35 ℃진공오븐에서 건조시킬 수 있다.
2) 에스테르화 반응
고정화 효소는 사용되기 전에 Mg(NO3)2 포화염 용액을 함유한 수분 활성도 챔버에서 48시간 이상 정치한 후 사용할 수 있다.
에스테르화 반응 전에 바람직하게는 글리세롤과 팔미톨레산 농축 지방산의 수분을 제거할 수 있다. 이는 효소 에스테르화 반응이 수분 함량에 따라 매우 민감하기 때문에 초기 반응물 내 수분함량을 최소화 하는 것이다. 즉, 트리글리세라이드(triglyceride) 합성을 위하여 글리세롤과 지방산의 에스테르화 반응을 효과적으로 진행하기 위해서는 반응에 의해 생성된 물이 제거되어야 가수분해로 인하여 발생하는 문제점을 해결하고 반응의 최종 평형 위치가 에스테르화 쪽으로 이동하게 된다. 반응 혼합물의 수분 함량을 제어하는 방법에는 공지의 다양한 방법을 사용할 수 있는 것으로 바람직하게는 진공방법을 사용할 수 있다. 상기 수분함량 조절은 반응 혼합물의 수분 함량을 효과적으로 조절할 뿐만 아니라 지질의 산패를 방지한다.
일 실시예로 반응조에 글리세롤과 팔미톨레산 농축 지방산을 넣은 후 30-50℃, 3-10torr의 진공상태에서 유지시켜 수분을 제거할 수 있다.
에스테르화 반응은 상기 수분이 제거된 글리세롤과 팔미톨레산 농축 지방산에 효소를 넣고 일정한 진공도하에서 교반하여 진행할 수 있다. 반응 중에 반응물을 채취하여 가스크로마토그라피로 반응정도를 확인하였다. 에스테르화 반응의 글리세롤에 대해 팔미톨레산 농축 지방산은 1:3-1:4의 몰비로 반응시키는 경우 원하는 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드를 얻을 수 있다.
반응 온도는 30-70℃, 바람직하게는 60-70℃이고 사용되는 효소량은 기질 총 중량 대비 2.5-15중량%, 바람직하게는 7.5-12.5 중량%이다. 반응은 진공하에서 진행되는 것으로 5-200torr, 바람직하게는 20-150torr, 더욱 바람직하게는 50-150torr 이고 반응 시간은 5-24시간이다. 본 발명의 효소를 이용한 에스테르화 반응은 비교적 저진공에서 진행하여 종래기술대비 에너지 비용을 줄일 수 있는 효과가 있다.
종래의 효소를 이용한 트리글리세라이드 합성은 주로 Novozym 435를 효소로 사용하고 진공도는 최소 10 torr 이하 즉, 고진공상태에서 수행된다. 이에 반해 본 발명은 고진공 상태가 아닌 약100torr의 저진공 상태에서도 반응이 잘 이루어지는 장점을 갖고 있다. 따라서 고 진공을 유지하기 위한 고가의 설비가 불필요하고, 사용 에너지 즉 전기량도 훨씬 낮기 때문에 경제성이 높다.
따라서 본 발명은 상기 조건하에서 에스테르 반응을 시키는 경우 경제적으로 높은 수율의 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드를 얻을 수 있는 효과가 있다.
에스테르화 반응 생성물은 지방산(FA), 모노아실글리세롤(MAG), 디아실글리세롤(DAG), 트리아실글리세롤(TAG)로 다음 식을 이용하여 에스테르화 반응율을 확인하였다.
Conversion to TAG (%) =TAG/(FA+MAG+DAG+TAG) x 100
본 발명은 지방산의 조성에 있어서 에스테르화 반응 이후에도 큰 변화 없이 조성이 유지된다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예들을 상세하게 설명하면 다음과 같으나 본 발명이 이에 제한되지는 않는다. 다만, 본 발명을 설명함에 있어서, 이미 공지된 기능 혹은 구성에 대한 설명은, 본 발명의 요지를 명료하게 하기 위하여 생략하기로 한다.
실시예 1. 요소분별법을 이용한 팔미톨레산 농축
1. 검화를 통한 가수분해물 제조
마카다미아 너트 기름(함유 성분 및 함량은 표 1과 같다.) 150g을 수산화나트륨 30% 수용액 150mL, 95%에탄올 450mL와 함께 2L 둥근플라스크에 넣고 환류장치에서 300 rpm으로 1시간동안 가열 교반 하였다. 검화된 반응물을 2L 분액깔때기로 옮긴 뒤, 300ml의 증류수를 넣고 추가적으로 180mL의 진한 염산 (약 12N) 또는 6N 염산 360 mL를 첨가하여 검화된 비누 부분을 유리지방산으로 전환시켰다. 분리된 두 층으로부터 유리지방산이 함유된 상층부를 분리하기 위하여 하층부를 제거한 후 지방산이 함유된 상층부에 n-hexane 300mL를 가하고 증류수 150mL를 추가로 가하고 격렬하게 혼합한 후 수분 층인 하층부를 제거하였다. 이 과정은 잔존 염산을 제거하기 위한 과정으로써 추가 적으로 2회 반복 실시하였다. 최종으로 pH 종이를 이용해 잔존 염산이 제거된 것을 확인하였다. 유리지방산이 함유된 n-hexane내 수분 및 불순물 제거를 위해 무수황산나트륨을 통과시킨 후 회전진공농축기(N-N series, EYELA, Japan)를 이용하여 n-hexane을 제거하였다. 추가적으로 잔존 n-hexane은 50℃에서 질소를 이용 잔존 용매를 제거하였으며 효과적인 용매 제거를 위하여 질소 주입은 비교적 높은 기류 속도로 20분 동안 주입하였다.
Figure 112021057638950-pat00001
2. 요소 분별법
상기에서 얻은 유리지방산 27g과 요소 81g을 1L 둥근플라스크에 넣고 메탄올 300mL를 가한 후 혼합물이 투명해질 때까지 환류 냉각하였다. 이때 교반 속도는 300 rpm이었으며, 1시간동안 실시하였다. 실온에서 냉각한 후 둥근플라스크를 4℃에서 12시간 이상 방치하였다. 냉각을 통하여 얻어진 요소결정물을 감압여과기 (Buchner funnel)를 이용 제거한 후 여과액을 분리하였다. 분리된 여액을 1L 둥근 플라스크로 옮긴 후 회전진공농축기를 이용하여 메탄올을 약 90%까지 제거(슬러시 정도)한 후 여기에 물 중탕으로 가열된 0.1N 염산 150 mL를 가한 후 2L의 분액깔때기로 이동하였다. 이후 300 mL n-hexane으로 둥근 플라스크에 잔존한 지방산을 분액깔때기로 이동하였다. 지방산이 함유된 n-hexane층에 함유된 염산을 100 mL 증류수로 3회 이상 수세하여 제거하였다. 지방산이 함유된 n-hexane층에 함유된 수분 및 불순물 제거를 위해 무수황산나트륨을 통과시킨 후 회전진공농축기(N-N series, EYELA, Japan)를 이용하여 n-hexane을 제거하였다. 추가적으로 잔존 n-hexane은 50℃에서 질소를 이용하여 제거하였으며 효과적인 용매 제거를 위하여 질소 주입은 비교적 높은 기류 속도로 20분 동안 주입하였다.
표 2에 초기 마카다미아 너트 기름의 지방산 조성과 요소 분별 후 얻어진 고농도 팔미톨레산 지방산의 조성을 나타내었다. 요소처리 후 팔미틴산(C16:0)과 올레산(C18:1) 함량은 크게 감소한 반면에 팔미톨레산(C16:1)함량은 20.2%에서 55.8% 약 2.7배 증가하였다.
Figure 112021057638950-pat00002
실시예 2. 고정화 효소를 이용한 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 제조
1. 효소 고정화
액상 리파제 효소인 Eversa transform 2.0(Thermomyces langinosus 유래, 24 mL)을 원료 효소로 이용하고 담체로는 소수성의 Lewatit VP OC 1600을 이용하여 고정화 효소를 제조하였으며 그 과정은 다음과 같다. 액상의 효소 용액을 인산나트륨 완충 용액 (6 mL, 50mM, pH 7.0)과 혼합하여 80% 농도의 효소 용액을 희석하여 고정화 효소 제조를 위한 원료 효소용액으로 사용하였다. 사용된 담체 표면의 친수성을 높이고 효소가 소수성 담체에 물리적으로 결합하는 것을 돕기 위해 120mL 비이커에 담체 3g을 넣고 30mL 99% 에탄올을 가하여 담체를 3 시간 동안 정치하였다.
이후 매시 재질 필터를 낀 시린지에 담체를 부어 에탄올을 흘려보냈고, 담체의 표면을 인산나트륨 완충 용액 (150 mL, 50mM, pH 7.0)으로 세척하여 담체로부터 에탄올을 완충용액으로 교체하였다. 완충 용액이 함유된 담체 3g과 30mL 효소용액을 120mL의 삼각플라스크에 넣고 300rpm, 30℃에서 17시간 동안 orbital shaker에서 교반하면서 효소를 담체에 결합시켰다. 교반이 끝난 담체를 여과를 통해 효소 용액으로부터 분리하고 즉시 완충 용액 (150 mL)으로 세척하여 결합되지 않은 효소를 제거하였다. 효소가 결합된 담체는 실온에서 12시간 동안 건조시킨 뒤 진공 오븐에서 40℃의 온도로 12 시간 동안 건조시켰다. 담체에 결합된 단백질량은 초기 단백질 농도에서 담체에 결합 후 효소 용액에 잔존한 단백질 함량으로부터 계산하였다. 단백질 농도는 Lowry의 방법에 따라 측정하였다. 담체에 결합 된 단백질 량(mg / g)은 아래 함수식으로 계산하였다.
Fixation level(%) = (a-b)/a x 100
Protein amount in particles(mg / g) = (a-b)/(c+a-b) x 100
여기서 a는 효소 용액의 초기 단백질 양 (mg), b는 고정화 후 효소 용액의 결합되지 않은 단백질의 양 (mg), c는 고정화에 사용된 담체의 양 (g)이다.
2. 에스테르화 반응을 통한 트리글리세라이드 합성
고정화 효소는 사용되기 전에 Mg(NO3)2 포화염 용액을 함유한 수분 활성도 챔버 (Aw=0.5)에 48시간 이상 정치한 후 반응에 사용하였다. 반응은 50mL 워터 자켓 유리 반응조에서 수행되었으며 반응조에 글리세롤 0.31g (3.3mM)과 팔미톨레산 농축 지방산 2.69g (10.1mM)을 넣은 후 40℃에서 5torr의 진공상태에서 10분 동안 유지하여 기질에 존재하는 수분을 제거하였다. 반응은 혼합물을 300rpm의 속도로 교반시키며 효소(기질 총 중량의 10%)를 넣고 일정한 진공도를 유지하면서 시작되었다. 진공도는 디지털 진공 게이지 (Teledyne, Thousand Oaks, CA, USA)를 사용하여 측정되었고 미세 조절 밸브 (Swagelok, Solon, OH, USA)를 통해 제어되었다. 반응물은 일정 시간 간격으로 반응조에서 100uL 취한 후 1mL의 클로로포름에 용해시킨후 0.45㎛ 마이크로 필터(Pall Corporation, Port Washington, NY, USA)를 통과시킨 후 가스크로마토그래피로 분석하였다.
비교 실시예 1. Novozym 435를 이용한 트리글리세라이드 합성
트리글리세라이드 합성을 위한 효소를 Novozym 435(Candida Antarctica 유래)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 유사하게 실시하여 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드를 합성하였다.
비교 실시예 2. Lipozyme TL IM을 이용한 트리글리세라이드 합성
트리글리세라이드 합성을 위한 효소를 Lipozyme TL IM(Thermomyces lanuginosus 유래)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 유사하게 실시하여 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드를 합성하였다.
비교 실시예 3. Lipozyme RM IM을 이용한 트리글리세라이드 합성
트리글리세라이드 합성을 위한 효소를 Lipozyme RM IM (Rhizomucor miehei 유래)를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 유사하게 실시하여 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드를 합성하였다.
실험예 1. 지방산 조성 분석
반응을 통해 얻은 50㎕의 샘플을 350㎕의 클로로포름에 녹인 후 TLC 실리카겔 60 F254 플레이트 (Merck, Darmstadt, Germany)에 주입하였다. 전개 용매는 Petroleum ether : Diethyl ether : Acetic acid (80 : 20 : 0.5, v / v / v)의 비율로 사용되었다. TLC 플레이트를 공기 중에서 건조시키고 2,7-dichlorofluorescein solution (0.2% in 95% methanol)을 분무하여 지방산 및 합성된 글리세라이드 분획을 UV에서 확인하였다. 밴드에 분획된 구간들을 각각 긁어내었고 지방산 조성은 AOCS법(1990)에 따라 지방산 메틸에스테르화한 후에 Supelcowax10 fused-silica capillary column (30 m0.25 mm i.d.; Supelco, Bellefonte, PA, USA)과 불꽃이온화검출기(FID detector)가 장착된 가스 크로마토그래피 (model 3800; Varian Inc., Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 칼럼 온도는 180℃에서 1분 동안 정치한 다음 1.5℃/min의 속도로 210℃까지 승온시켰다. 운반 가스로는 헬륨이 1.5mL/min의 유속으로 사용되었으며 split ratio는 50:1이고 injector와 detector의 온도는 각각 240℃와 250℃로 설정하였다. 지방산 메틸 에스터는 각각의 retention time을 표준 물질과 비교하여 확인하였다.
실험예 2. 에스테르 반응물 분석
<효소 종류에 따른 에스테르화 반응 분석>
에스테르반응 후 반응물로부터 트리글리세라이드 전환률을 측정하기 위해 가스크로마토그래피로 분석하였고 그 과정은 다음과 같다. 반응물 10㎕에 클로로포름 1mL를 가한 후 가스 크로마토그래피로 분석하였다. 사용된 칼럼은 DB-1HT (15m length, 0.25mm id; J&W Scientific, Folsom, CA, USA) capillary 칼럼이었고 불꽃이온화검출기(FID detector)가 장착된 가스 크로마토그래피(model 3800; Varian Inc, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 분석에 사용되었고 분석조건은 다음과 같았다. 컬럼 온도는 120℃에서 3분 동안 정치하고 25℃/min의 속도로 370℃로 승온시켰고 5분 동안 370℃에서 유지하였다. 운반 가스로는 헬륨이 1.5mL/min의 유속으로 사용되었으며 split ratio는 50:1이고 injector와 detector의 온도는 370℃로 설정되었다. 합성된 물질들의 조성은 지방산(FA), 모노아실글리세롤(MAG), 디아실글리세롤(DAG), 트리아실글리세롤(TAG)의 면적으로부터 다음 함수식을 사용하여 계산하였다.
Conversion to TAG (%) = TAG/(FA+MAG+DAG+TAG) x 100
얻어진 트리글리세라이드 제조 결과는 다음과 같다.
고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 합성에 대한 효소별 전환율을 비교하여 보았다 (도 1). 반응 조건으로, 글리세롤과 지방산의 몰비율은 1:3, 반응온도는 50℃, 효소량은 기질 총 중량 기준 10%, 진공도는 5torr이다. 전체적으로 비교실시예 1의 Novozym 435(B)과 실시예 2의 에버사 고정화효소(A)의 트리글리세라이드 전환률은 유의적으로 큰 차이를 보여주지 않았다. 이에 반해 상기 두 효소와 비교하여 비교실시예 2의 Lipozyme TL IM(C)과 비교실시예 3의 Lipozyme RM IM(D)의 전환율은 매우 낮았으며 특히 Lipozyme TL IM은 24시간이후에도 전환률이 3%에 불과 하였다.
즉, 본 발명의 에버사 고정화효소 (Eversa immobilized enzyme)는 시판 중인 Novozym 435 대비 그 효과가 유사한 것을 알 수 있는데 Novozym 435는 매우 고가의 효소라는 점을 상기할 때 본 발명의 에버사 고정화 효소를 사용한 에스테르화 반응은 경제적으로 월등한 효과가 있음을 알 수 있다.
실험예 3. 반응온도에 따른 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 제조
에버사 고정화효소를 사용하고 에스테르화 반응 온도를 40, 60, 70, 80℃로 하는 것을 제외하고는 실험예 2와 동일하게 수행하여 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드를 제조하였다.
<반응온도에 따른 분석>
상기 실험예 2 및 실험예 3의 반응 온도에 따른 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 합성 효과를 분석하였다. 반응속도 및 트리글리세라이드로의 전환율은 온도가 40℃에서 70℃로 증가함에 따라 점차 증가하여 최대 89.2%이었다. 한편, 온도가 70℃에서 80℃로 증가할 때에는 전환률이 감소(전환율이 40%정도)하였다.
실험예 4. 효소량 변화에 따른 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 제조
에버사 고정화효소를 사용하고 에스테르화 반응을 위한 반응 온도를 60℃로 하고, 효소량을 변경한 것을 제외하고는 실험예 2와 동일하게 수행하여 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드를 제조하였다.
<효소량의 차이에 의한 분석>
반응 속도 및 트리글리세라이드로의 전환률은 효소량이 증가함에 따라 점차 증가하였다. 한편, 5%의 효소량 조건에서는 2시간까지 반응속도가 매우 느렸으며 최종 반응에서 60%를 달성하였다. 효소량이 증가함에 따라 반응속도 및 전환율 및 평형에 도달하는 시간의 경우 12.5%와 15% 사이에는 큰 차이는 보이지 않았으며, 두 효소량의 경우 8시간 이내에 최대값에 도달하였다. 따라서 전체적인 비용을 고려할 때 12.5%의 효소량이 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 합성을 위한 최적의 조건으로 선택되었다.
실험예 5. 진공도에 따른 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 제조
에버사 고정화효소를 사용하고 에스테르화 반응을 위한 반응온도를 60℃로 하고, 효소량을 12.5%로 하고 진공도를 변경한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 수행하여 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드를 제조하였다.
<진공도 차이에 의한 분석>
도 4는 효소 촉매 에스테르화를 통한 고농도 팔미톨레산 함량 트리글리세라이드 합성에 대한 진공의 효과이다. 전체 반응을 통해 무 진공 상태에서는 전체적으로 10% 이하이 매우 낮은 전환율을 보인 반면에 진공 상태에서는 전환율이 매우 높았고 진공이 수준이 증가할수록 전환율이 증가하는 경향을 보여주었다. 4시간 이상의 반응 시간에서 5 ~ 100torr 사이 트리글리세라이드로의 전환률에는 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 5torr와 100torr 사이의 압력에서 트리글리세라이드로의 전환률은 12시간 후 평형에 도달하였으며 큰 차이는 없었고 89%의 최대값을 나타내었다. 따라서 반응 속도와 전환률, 경제성을 고려했을 때 최적의 진공도는 100torr였고 이는 종래기술대비 저진공에서 반응이 진행되는 것을 의미하는 것으로 본 발명의 방법이 경제적으로 우수함을 알 수 있다.
실험예 6. 고정화 효소를 이용한 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 제조 후 지방산 함량 분석
하기 표 3에 요소 분별 후, 그리고 에스테르화 반응 이후 생성된 트리글리세라이드의 지방산 조성을 비교하였다. 기질로 사용된 지방산의 팔미톨레산 함량이 55.84%였으며 에스테르화 반응 이후에도 56.07%로 큰 차이를 보이지 않았다.
Figure 112021057638950-pat00003
실험예 7. 효소를 이용한 선택적 가수분해 및 분자 증류를 이용한 지방산 분리
선택적 가수분해 반응은 교반기, 물 순환 장치와 함께 50mL의 워터 재킷 유리 반응조에서 수행되었다. 마카다미아 너트 기름과 인산나트륨 완충 용액 (50mM, pH 7.0)을 1:1의 무게 비로 50g씩 반응조에 넣었으며, 가수분해를 위해 리파제(Lipase OF, Candida rugosa 유래)를 총 기름의 양을 기준으로 0.0067% 사용하였다. 이후 온도 범위 20-60℃에서 일정한 온도를 유지시켜주며 60분간 반응하였다. 반응시간이 끝난 후 혼합물을 2L의 분별깔때기로 옮긴 뒤, 600mL의 클로로포름을 첨가하고 300mL의 증류수로 3회 수세하였다. 이후 용액을 무수황산나트륨에 통과시켜 수분과 불순물을 제거한 뒤, 회전진공농축기(N-N series, EYELA, Japan)과 질소 플러싱을 통해 클로로포름을 제거하였다. 샘플은 일정 시간 간격으로 반응조에서 1mL씩 추출하였으며 0.45㎛ 멤브레인 필터 (Pall Corporation, Port Washington, NY, USA)로 여과하여 반응이 일어나지 않게 효소를 완전히 제거하였다. 이후 원심분리하여 분리된 기름 층을 샘플로 하여 GC (DB-1ht 칼람사용)를 이용하여 반응물 내 지방산 및 글리세라이드 분리 그리고 반응물 내 지방산분획, 글리세라이드 분획의 지방산 조성분석을 TLC와 GC (Supelcowax-10 칼람사용)를 이용하여 진행하였다. 이상의 분석을 통하여 부분적 가수분해를 통하여 생성되는 지방산 분획내 팔미톨레산 함량 및 지방산 분획으로 얻어지는 팔미톨레산 수득율 (yield)을 계산하였다.
효소를 이용한 선택적 가수분해 후 얻어진 반응물로부터 분자 증류를 통하여 팔미톨레산이 농축된 유리지방산을 회수하였다. 이때 사용된 분자증류 장치는 도 5와 같은 falling type thin film evaporator로서 189℃의 증류온도와 2torr 진공도에서 수행되었으며, 시료 dropping 속도는 분당 30방울이었다.
30℃에서는 지방산 내 팔미톨레산이 최대 36.5%, 40℃에서는 39.9%만큼 농축되었다.
[표 4]에 효소를 이용한 선택적 가수분해의 최적 조건에서 마카다미아 너트 기름의 지방산 조성을 나타내었다.
Figure 112021057638950-pat00004
실험예 8. 부분적 가수분해를 통해 얻은 지방산에 의한 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 제조
<효소 종류에 따른 에스테르화 반응 분석>
마카다미아 너트 기름으로부터 부분적 가수분해를 통해 얻어진 고농도 팔미톨레산 지방산을 원료로 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드를 합성하였다. 효소로 에버사 고정화효소(A), Novozym 435(B), Lipozyme TL IM(C)과 Lipozyme RM IM(D)를 사용하였고 트리글리세라이드 합성을 위한 반응 조건은 글리세롤과 지방산을 1:3의 몰 비율, 60℃의 온도, 기질 총 중량 기준 5%의 효소량, 5torr의 진공도로 진행하였다. 최종 반응 시간은 24시간이었다. 그 결과 Novozym 435(B)는 초기 5시간까지 자체 고정화로부터 생산된 에버사 고정화효소(A)에 비해 높은 전환률을 보여주었다. 그러나 반응시간 24시간에서는 두 효소 사이에 큰 차이를 보여주지 않았으며 전환율은 87.1%로 나타났다. 한편 Lipozyme RM IM(D)과 Lipozyme TL IM(C)은 24시간 이후 전환율이 각각 31.4%, 5.7% 이었다.
결과를 도 7에 나타내었다.
실험예 9. 온도에 따른 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 제조
온도를 달리하는 것을 제외하고 실험예 8와 같이 실시하였으며 사용된 효소는 에버사 고정화효소이다.
<반응온도의 차이에 의한 분석>
반응 속도 및 트리글리세라이드로의 전환률은 온도가 30℃에서 70℃로 증가함에 따라 점차 증가하였다. 또한 60℃와 70℃의 24시간에서의 트리글리세라이드로의 전환률은 89.5%로 유의한 차이가 없었다. 결과를 도 8에 나타내었다.
실험예 10. 효소량 변화에 따른 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 제조
에스테르화 반응을 위한 반응 온도를 60℃로 하고, 효소량을 7.5-15%로 변경한 것을 제외하고는 실험예 9와 동일하게 수행하여 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드를 제조하였다.
<효소량의 차이에 의한 분석>
결과를 도 9에 나타내었다. 반응 속도 및 트리글리세라이드로의 전환률은 효소량이 증가함에 따라 점차 증가하였다. 5%이상의 효소량에서는 초기 반응속도의 차이는 관찰되었으나 12.5%이상에서는 초기 반응속도가 매우 빨랐으며 최종 반응에서의 트리글리세라이드로의 전환률은 모두 동일하게 나타났다. 따라서 전체적인 비용을 고려할 때 전체 총 기질 대비 12.5%의 효소량이 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 합성을 위한 최적의 조건으로 선택되었다.
실험예 11. 진공도에 따른 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드 제조
에스테르화 반응을 위한 반응온도를 60℃로 하고, 효소량을 12.5%로 하고 진공도를 50-760torr 변경한 것을 제외하고는 실험예 9와 동일하게 수행하여 고농도 팔미톨레산 함유 트리글리세라이드를 제조하였다.
<진공도 차이에 의한 분석>
도 10은 효소 촉매 에스테르화를 통한 고농도 팔미톨레산 함량 트리글리세라이드 합성에 대한 진공의 효과이다. 전체 반응을 통해 무 진공 상태에서는 전체적으로 10% 이하이 매우 낮은 전환율을 보인 반면에 진공 상태에서는 전환율이 매우 높았고 진공이 수준이 증가할수록 전환율이 증가하는 경향을 보여주었다. 100torr 압력에서 트리글리세라이드로의 전환률은 12시간 후 평형에 도달하였으며 89%의 최대값을 나타내었다. 따라서 반응 속도와 전환률, 경제성을 고려했을 때 최적의 진공도는 100torr였고 이는 종래기술대비 저진공에서 반응이 진행되는 것을 의미하는 것으로 본 발명의 방법이 경제적으로 우수함을 알 수 있다.

Claims (12)

  1. 식물성 기름으로부터 요소분별법 또는 선택적 가수분해 방법으로 추가의 농축과정 없이, 30중량% 이상의 농도로 농축된 팔미톨레산을 포함하는 지방산을 제조하고
    상기 30중량% 이상의 농도로 농축된 팔미톨레산을 포함하는 지방산과 글리세롤을 소수성 담체에 고정화 된 Thermomyces lanuginosus 유래 에버사 고정화효소(Eversa transform 2.0 효소, 노보자임스사제)를 사용하여 에스테르화 반응시키며,
    상기 에스테르화 반응이 글리세롤에 대해 팔미톨레산 농축 지방산 1:3-1:4의 몰비로 수행되며,
    상기 에스테르화 반응이 반응 온도는 30-70℃, 사용되는 효소량은 기질 총 중량 대비 2.5-15중량%에서 수행되며,
    상기 에스테르화 반응이 100-200torr 진공하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 고농도의 팔미톨레산을 함유하는 트리글리세라이드(triglyceride)를 제조하는 방법
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 요소분별법이 식물성 기름에 수산화나트륨 및 에탄올을 넣고 환류하여 검화시켜 유리지방산을 얻고, 상기 유리 지방산과 요소를 메탄올 용매하에서 반응시키는 것이고,
    상기 유리 지방산과 요소를 메탄올 용매하에서 반응시키는 단계가 지방산에 대한 우레아 비율이 중량비로 1:2.5-1:3.5이고, 2-6℃에서 10-15시간 동안 결정화 시키는 것을 특징으로 하는 고농도의 팔미톨레산을 함유하는 트리글리세라이드(triglyceride)를 제조하는 방법
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 선택적 가수분해 방법이 효소로 Candida rugosa 유래 리파제 효소를 이용한 선택적 가수분해이고,
    상기 선택적 가수분해가 효소를 총 식물성 기름 양 기준 0.001-0.05중량% 사용하고, 25-40℃ 온도에서 40-100분간 수행하고 이후 분자증류를 통하여 팔미톨레산이 농축된 유리 지방산을 얻는 것임을 특징으로 하는 고농도의 팔미톨레산을 함유하는 트리글리세라이드(triglyceride)를 제조하는 방법
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 식물성 기름이 마카다미아(Macadamia integrifolia and M. tetraphylla) 너트 기름, 산자나무(Hippophae rhamnoides) 기름, 시벅손 기름 또는 피그미꽃 기름인 것을 특징으로 하는 고농도의 팔미톨레산을 함유하는 트리글리세라이드(triglyceride)를 제조하는 방법
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 청구항 1에 있어서, 상기Thermomyces lanuginosus 유래 Eversa transform 2.0 효소가 소수성 담체인 Lewatit VP OC 1600(LANXESS 사)에 고정화 된 것을 특징으로 하는 고농도의 팔미톨레산을 함유하는 트리글리세라이드(triglyceride)를 제조하는 방법
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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