WO2022124482A1 - 단일 미세조류로부터 단백질 및 오메가-3 지방산을 포함하는 바이오매스를 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 바이오매스 - Google Patents

단일 미세조류로부터 단백질 및 오메가-3 지방산을 포함하는 바이오매스를 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 바이오매스 Download PDF

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장성훈
김지영
최정운
강혜원
곽준석
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씨제이제일제당(주)
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the present application relates to a method for producing a biomass containing protein and omega-3 fatty acids from a single microalgae and the biomass produced thereby.
  • An unsaturated fatty acid is a fatty acid having one or more double bonds in the fatty acid chain, and when it contains two or more double bonds, it is called a polyunsaturated fatty acid (PUFA).
  • PUFA polyunsaturated fatty acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • omega-3 fatty acids which are essential fatty acids for the brain, eye tissue, and nervous system.
  • they are known to play an important function in the development of the nervous system such as eyesight and motor nerve ability of infants and the prevention of cardiovascular diseases, and are the most abundant components in the structural lipids of the brain.
  • the main source of industrially supplying polyunsaturated fatty acids such as omega-3 fatty acids is fish oil extracted from oil of blue fish, and fish meal is also widely used as a protein source for food or feed.
  • fish oil extracted from oil of blue fish and fish meal is also widely used as a protein source for food or feed.
  • fish meal is also widely used as a protein source for food or feed.
  • Patent Document 1 US Patent Publication US 2016/0208297 A1
  • An object of the present application is to culturing a single strain of Thraustochytrid family microalgae in a medium; And to provide a method for producing thraustochytrid-based microalgae-derived biomass comprising the step of continuously supplying a nitrogen source during the culturing step, and a single microalgae-derived biomass of the thraustochytrid-based microalgae produced thereby .
  • One aspect is thraustochytrid (Thraustochytrid) culturing a single strain of microalgae in a medium; And it provides a method for producing thraustochytrid-based microalgae-derived biomass comprising the step of continuously supplying a nitrogen source during the culturing step.
  • Thraustochytrid thraustochytrid
  • Thraustochytrid refers to microalgae of the order Thraustochytriales.
  • the thraustochytrid family of microalgae is Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp., Aurantiochytrium sp., or Thraustochytriidae sp. ) may be microalgae.
  • Thraustochytrium sp.” is one of the genus names belonging to the family Thraustochytriaceae of the order Thraustochytriaceae, and the terms “genus Thraustochytrium “, “genus Schizochytrium , respectively”", genus Aurantiochytrium , and “genus Thraustochytriidae " may be used interchangeably.
  • microalgae refers to organisms that cannot be seen with the naked eye among photosynthetic plants with chlorophyll, can only be seen through a microscope, and live freely in water, and is also called phytoplankton.
  • the thraustochytrid family microalgae are, for example, microalgae CD01-6003 of the genus Troustochytridae deposited with accession number KCTC14346BP, or microalgae CD01- of the genus Schizochytrium deposited with accession number KCTC14345BP 5004, but is not limited thereto.
  • biomass refers to organisms such as plants, animals, and microorganisms that can be used as chemical energy, that is, an energy source of bioenergy, and is ecologically specific to exist within a unit time and space. It also refers to the weight or amount of energy of an organism.
  • the biomass includes, but is not limited to, a compound secreted by a cell, and may contain an extracellular material as well as a cell and/or intracellular content.
  • the biomass may be thraustochytrid-based microalgae itself, its culture, its dried product, its lysate, or a product produced by culturing or fermenting the microalgae, or a concentrate of the biomass Or it may be a dried product, but is not limited thereto.
  • the "culture” of the thraustochytrid-based microalgae refers to a product produced by culturing the microalgae, specifically, it may be a culture solution containing microalgae or a culture solution from which microalgae is removed, but is limited thereto it is not
  • the "dry matter" of the thraustochytrid-based microalgal culture is that moisture is removed from the microalgal culture, for example, may be in the form of a dry cell of the microalgae, but is not limited thereto.
  • the "shredded material" of the dried product is a generic term for the result of crushing the dried material from which moisture has been removed from the microalgal culture, and may be, for example, dry cell powder, but is not limited thereto.
  • the culture of thraustochytrid-based microalgae can be prepared according to a culture method comprising inoculating and culturing the microalgae in a microalgal culture medium, and continuously supplying a nitrogen source during the culturing step. And, the dried product of the culture and its lysate can be prepared according to the treatment or drying method of microalgae or culture known in the art.
  • the nitrogen source may be supplied from immediately after inoculation of the microalgae to the culture medium until the end of the culture.
  • the nitrogen source may be continuously supplied so that the total nitrogen concentration in the culture medium is 300 ppm or more.
  • the nitrogen source has a total nitrogen concentration in the culture medium of 300 to 10,000 ppm, 300 to 8,000 ppm, 300 to 5,000 ppm, 300 to 3,000 ppm, 300 to 2,000 ppm, 300 to 1,500 ppm, 350 to 10,000 ppm, 350 to 8,000 ppm, 350 to 5,000 ppm, 350 to 3,000 ppm, 350 to 2,000 ppm, or may be to be continuously supplied to be maintained within the range of 350 to 1,500 ppm.
  • the medium may include a carbon source and a nitrogen source.
  • the nitrogen source in the step of continuously supplying the nitrogen source and the nitrogen source included in the medium are i) from the group consisting of yeast extract, beef extract, peptone and tryptone.
  • the step of continuously supplying the nitrogen source may be performed, for example, by continuously supplying a medium containing a nitrogen source to the culture medium, or by continuously supplying ammonia gas to the fermentor for culturing the microalgae. can, but is not limited thereto.
  • Continuously supplying the medium containing the nitrogen source to the culture medium is, for example, a fed-batch culture method for intermittently supplying the medium, or continuous culture for continuously supplying the medium ) may be performed by the method.
  • the method may further include the step of continuously supplying a carbon source during the culturing step.
  • the step of continuously supplying the carbon source may be performed by, for example, continuously supplying a medium containing the carbon source to the culture medium, but is not limited thereto.
  • the continuous supply of the medium containing the carbon source to the culture medium may be performed by, for example, a fed-batch culture method or a continuous culture method.
  • the continuously supplying the carbon source may be performed while maintaining the carbon source concentration in the culture medium to be 5% (w/v) or less.
  • the carbon source in the step of continuously supplying the carbon source and the carbon source included in the medium may be any one or more selected from the group consisting of glucose, fructose, maltose, galactose, mannose, sucrose, arabinose, xylose and glycerol.
  • glucose fructose
  • maltose maltose
  • galactose mannose
  • sucrose sucrose
  • arabinose xylose
  • glycerol glycerol
  • the medium may further include a suitable phosphorus source, inorganic compound, amino acid and/or vitamin, etc. used for culturing thraustochytrid-based microalgae.
  • the phosphorus source may include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, a sodium-containing salt corresponding thereto, or the like, individually or in combination, but is not limited thereto.
  • the culturing step may be performed for 95 hours or less.
  • the culturing may be performed for 30 to 95 hours, 35 to 95 hours, 40 to 95 hours, 45 to 95 hours, 30 to 90 hours, 35 to 90 hours, 40 to 90 hours, or 45 to 90 hours. may be performed.
  • the culturing step may be carried out at 20 to 35 °C.
  • the culturing step may be carried out at 25 to 35 °C, 20 to 30 °C, or 25 to 30 °C, but is not limited thereto.
  • oxygen or oxygen-containing gas is injected into the culture, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas is injected without injection of gas to maintain anaerobic and microaerobic conditions.
  • oxygen or oxygen-containing gas is injected into the culture, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas is injected without injection of gas to maintain anaerobic and microaerobic conditions.
  • nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas is injected without injection of gas to maintain anaerobic and microaerobic conditions.
  • the culturing step may be performed while adjusting the pH, for example, using a basic compound (eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia) or an acidic compound (eg, phosphoric acid or sulfuric acid) pH 3.5 to 9.0, It may be carried out while adjusting to maintain pH 4.0 to 9.0, pH 4.5 to 9.0, pH 5.0 to 9.0, pH 3.5 to 8.0, pH 4.0 to 8.0, pH 4.5 to 8.0, or pH 5.0 to 8.0, but limited thereto not.
  • a basic compound eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia
  • an acidic compound eg, phosphoric acid or sulfuric acid
  • the biomass production method may further include recovering biomass from the strain, the culture of the strain, the dried product of the culture, or a lysate of the dried product.
  • the step of recovering the biomass may be collecting the desired biomass using a suitable method known in the art. For example, centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, HPLC, etc. may be used, and may further include a purification process.
  • the biomass produced by the method may include 50% by weight or more of protein and 37% by weight or less of fat based on the total weight of the biomass.
  • the biomass may comprise, for example, 50 to 80% by weight, 50 to 75% by weight, 50 to 70% by weight, 55 to 80% by weight, 55 to 75% by weight, or 55 to 70% by weight of protein; and 5-37 wt%, 5-35 wt%, 5-30 wt%, 5-25 wt%, 10-37 wt%, 10-35 wt%, 10-30 wt%, 10-25 wt%, 15 to 37% by weight, 15 to 35% by weight, 15 to 30% by weight, or 15 to 25% by weight of fat.
  • the biomass produced by the method may include 50% by weight or more of protein and omega-3 fatty acids based on the total weight of the biomass.
  • the omega-3 fatty acid may include any one or more of docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA).
  • DHA docosahexaenoic acid
  • ALA alpha-linolenic acid
  • EPA sapentaenoic acid
  • cervonic acid the common name is cervonic acid, and may also be expressed as 22:6 n-3 as an abbreviation.
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • EPA is one of polyunsaturated fatty acids having a chemical formula of C 20 H 30 O 2 , and corresponds to omega-3 fatty acids along with ALA and DHA, It can also be written as 20:5 n-3 as an abbreviation.
  • the biomass comprising 50% by weight or more of protein, and omega-3 fatty acids
  • the biomass is 3 to 30% by weight, 3 to 25% by weight, 3 to 20% by weight, or It may include 3 to 15% by weight of omega-3 fatty acids.
  • the biomass may include 15 to 60% by weight, 15 to 55% by weight, or 15 to 50% by weight of omega-3 fatty acids relative to the total fatty acid weight.
  • Another aspect comprises the steps of culturing a single strain of thraustochytrid family microalgae in a medium; And it provides a biomass derived from a single microalgae of the thraustochytrid series, prepared by a biomass production method comprising the step of continuously supplying a nitrogen source during the culturing step.
  • the biomass production method is as described above.
  • the biomass may include 50 wt% or more of protein and 37 wt% or less of fat based on the total weight of the biomass.
  • the biomass may comprise, for example, 50 to 80% by weight, 50 to 75% by weight, 50 to 70% by weight, 55 to 80% by weight, 55 to 75% by weight, or 55 to 70% by weight of protein; and 5-37 wt%, 5-35 wt%, 5-30 wt%, 5-25 wt%, 10-37 wt%, 10-35 wt%, 10-30 wt%, 10-25 wt%, 15 to 37% by weight, 15 to 35% by weight, 15 to 30% by weight, or 15 to 25% by weight of fat.
  • the biomass may include 50% by weight or more of protein and omega-3 fatty acids based on the total weight of the biomass, and the omega-3 fatty acids include any one or more of docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid. may include.
  • the biomass comprising 50% by weight or more of protein, and omega-3 fatty acids
  • the biomass is 3 to 30% by weight, 3 to 25% by weight, 3 to 20% by weight, or It may include 3 to 15% by weight of omega-3 fatty acids.
  • the biomass may include 15 to 60% by weight, 15 to 55% by weight, or 15 to 50% by weight of omega-3 fatty acids based on the total fatty acid weight.
  • Another aspect comprises the steps of culturing a single strain of thraustochytrid family microalgae in a medium; And a biomass derived from a single microalgae of the thraustochytrid series, prepared by a biomass manufacturing method comprising the step of continuously supplying a nitrogen source during the culturing step, or a concentrate or dry matter of the biomass comprising A composition is provided.
  • the biomass production method and the biomass derived from a single microalgae of the thraustochytrid series are as described above.
  • the concentrate or dried product of the biomass may be prepared according to a method for treating, concentrating or drying microbial biomass known in the art.
  • the composition may be in the form of a solution, powder, or suspension, but is not limited thereto.
  • the composition may be, for example, a food composition, a feed composition or a feed additive composition.
  • feed composition refers to food fed to animals.
  • the feed composition refers to a material that supplies organic or inorganic nutrients necessary for maintaining animal life or producing meat, milk, and the like.
  • the feed composition may additionally include nutrients necessary for maintaining animal life, or for producing meat, milk, and the like.
  • the feed composition can be prepared in various types of feed known in the art, and specifically, a concentrated feed, roughage and/or special feed may be included.
  • feed additive is added to feed for various effects such as nutrient supplementation and weight loss prevention, enhancement of digestibility of fiber in feed, improvement of oil quality, prevention of reproductive disorders and improvement of fertility, prevention of high temperature stress in summer contains substances that The feed additives of the present application correspond to auxiliary feeds under the Feed Management Act, and mineral preparations such as sodium bicarbonate, bentonite, magnesium oxide, and complex minerals, and trace minerals such as zinc, copper, cobalt, selenium, and kerotene.
  • vitamin E vitamins A, D, E, nicotinic acid
  • vitamins such as vitamin B complex
  • protective amino acids such as methionine and lyic acid
  • protective fatty acids such as fatty acid calcium salt
  • probiotics lactic acid bacteria
  • yeast culture yeast culture
  • mold Live bacteria such as fermented products, yeast agents, etc.
  • the term "food composition” includes all forms of functional food, nutritional supplement, health food and food additives, and the like,
  • the food composition can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • composition of the present application may include grains such as milled or crushed wheat, oats, barley, corn and rice; plant protein feeds, for example feeds based on soybean and sunflower; animal protein feeds such as blood meal, meat meal, bone meal and fish meal; Sugar and dairy products, for example, may further include dry ingredients made of various types of milk powder and whey powder, and in addition, may further include nutritional supplements, digestion and absorption enhancers, growth promoters, and the like.
  • composition of the present application may be administered to an animal alone or in combination with other feed additives in an edible carrier.
  • the composition can be easily administered to the animal as a top dressing, directly mixing them into a feed, or as an oral formulation separate from the feed.
  • a pharmaceutically acceptable edible carrier as well known in the art to prepare an immediate release or sustained release formulation.
  • Such edible carriers may be solid or liquid, for example corn starch, lactose, sucrose, soy flakes, peanut oil, olive oil, sesame oil and propylene glycol.
  • a solid carrier the composition may be a tablet, capsule, powder, troche or sugar-containing tablet, or a top dressing in microdispersed form.
  • a liquid carrier is used, the composition may be in the form of a gelatin soft capsule, or a syrup or suspension, emulsion, or solution.
  • composition of the present application may contain, for example, a preservative, a stabilizer, a wetting or emulsifying agent, a cryoprotectant, or an excipient.
  • the cryoprotectant may be at least one selected from the group consisting of glycerol, trehalose, maltodextrin, powdered skim milk and starch.
  • the preservative, stabilizer, or excipient may be included in the composition in an effective amount sufficient to reduce the deterioration (deterioration) of the thraustochytrid-based microalgae included in the composition.
  • the cryoprotectant may be included in the composition in an effective amount sufficient to reduce the degradation of the thraustochytrid-based microalgae included in the composition when the composition is in a dried state.
  • composition can be used by being added to animal feed by immersion, spraying, or mixing.
  • the composition of the present application may be applied to a diet of many animals including, but not limited to, mammals, birds, fish, crustaceans, cephalopods, reptiles and amphibians.
  • the mammal may include pigs, cattle, sheep, goats, laboratory rodents, or pets, and the birds may include poultry, wherein the poultry is chicken, turkey, duck, geese, It may include, but is not limited to, a pheasant, or a quail.
  • the fish may include commercial livestock fish and fry thereof, ornamental fish, and the like, and the crustacean may include shrimp, barnacles, etc., but is not limited thereto.
  • the composition can be applied to the diet of zooplankton, rotifers.
  • a single microalgae-derived biomass containing a high content of protein and omega-3 fatty acid can be manufactured, and the biomass produced through this The mass can be usefully utilized as a single microbial source of protein and omega-3 fatty acids.
  • Example 1 Confirmation of fat and protein production according to the method of culturing microalgae in the genus Troustochytridae
  • Microalgae CD01-6003 (Accession No.: KCTC14346BP) of the genus Traustochytriae were sterilized in MJW01 medium (glucose 30g/L, MgSO 4 7H 2 O 3.0 g/L, Na 2 SO 4 10 g/L, NaCl 1.0 g/ L, yeast extract 9.0 g/L, MSG 1H 2 O 1.0 g/L, NaNO 3 1.0 g/L, KH 2 PO 4 0.1 g/L, K 2 HPO 4 0.5 g/L, CaCl 2 0.5 g/L , and vitamin mixed solution 10mL/L) and inoculated in a 250 mL flask at 20 to 35 °C and 100 to 300 rpm conditions for 10 to 30 hours.
  • MJW01 medium glucose 30g/L, MgSO 4 7H 2 O 3.0 g/L, Na 2 SO 4 10 g/L, NaCl 1.0 g/ L
  • the sterilized MJW01 medium was added to the seed culture prepared in Example 1-1, ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 ⁇ SO 4 ) 6 g/L and yeast extract 5 g/L as a nitrogen source. It was dispensed into a 5L fermenter and cultured under conditions of 20 to 35°C, 100 to 500 rpm, and 0.5 to 1.5 vvm until the volume of the culture solution in the fermenter reached 2.8 L, and cultured for a total of 101 hours.
  • ammonium sulfate (NH 4 ) 2 ⁇ SO 4 ) 6 g/L
  • yeast extract 5 g/L as a nitrogen source. It was dispensed into a 5L fermenter and cultured under conditions of 20 to 35°C, 100 to 500 rpm, and 0.5 to 1.5 vvm until the volume of the culture solution in the fermenter reached 2.8 L, and cultured for a total of 101 hours.
  • ammonia gas was continuously supplied to the fermenter so that the total nitrogen concentration in the culture medium was 300 ppm or more for 14 hours, and then the ammonia gas supply was stopped, and the carbon source in the culture medium during the entire culture process. Feed containing a carbon source was continuously supplied so that the concentration was maintained below 5%.
  • ammonia gas was continuously supplied to the fermentor so that the total nitrogen concentration in the culture solution was 300 ppm or more, and only 18 g/L of ammonium sulfate was added as a nitrogen source to the sterilized MJW01 medium.
  • the culture was carried out in the same manner as described in -1 and cultured for a total of 75 hours.
  • ammonia gas was continuously supplied to the fermentor so that the total nitrogen concentration in the culture solution was 300 ppm or more, and 10 g/L of ammonium sulfate was added as a nitrogen source to the feed containing the carbon source.
  • the culture was carried out in the same manner as described in 1-2-1 above and cultured for a total of 55 hours.
  • ammonia gas is continuously supplied to the fermentor so that the total nitrogen concentration in the culture medium is 300 ppm or more, and only 6 g/L of ammonium sulfate is added as a nitrogen source to the sterilized MJW01 medium, and as a nitrogen source to the feed containing a carbon source. Except that 12 g/L of ammonium sulfate was further added and supplied, the culture was performed in the same manner as described in 1-2-1 above and cultured for a total of 92 hours.
  • Each microalgal culture cultured in 1-2-1 to 1-2-5 was recovered and centrifuged, and the obtained cells were washed 3 times with PBS and dried at 60° C. for 16 hours.
  • An 8.3 M hydrochloric acid solution was added to 2 g of the dried cells, followed by a hydrolysis reaction at 80°C. Then, 30 mL of ethyl ether and 20 mL of petroleum ether were added to the reaction mixture, mixed for 30 seconds, and centrifuged three times or more.
  • the separated solvent layer was transferred to a pre-weighed round flask, and then placed in a container from which the solvent and residual moisture were removed through nitrogen purging (N2 purging) and dried.
  • the total oil content was calculated by drying the solvent and measuring the weight of the remaining oil, and the content of omega-3 fatty acids (DHA and EPA) contained in the oil was measured in methanolic 0.5N NaOH and 14% trifluoroboranemethanol solution (BF 3 -MeOH), followed by measurement by gas chromatography.
  • DHA and EPA omega-3 fatty acids
  • the crude fat (total fatty acid: TFA) content in the biomass was reduced compared to Comparative Example (1) in Examples (1) to (4) in which the nitrogen source was continuously supplied and cultured.
  • the EPA, DHA and omega-3 contents in the crude fat were equal to or higher than those of Comparative Example (1) in Examples (1) to (4).
  • the nitrogen content in the sample was quantitatively analyzed using an elemental analyzer for 0.5 to 1 g of each dried cell body obtained in the same manner as described in 1-3 above.
  • the weight ratio (TN%) of nitrogen present in each sample was multiplied by 6.25 and calculated as the crude protein content in the sample.
  • Schizochytrium microalgae CD01-5004 (Accession No.: KCTC14345BP) were seed cultured in the same manner as described in Example 1-1.
  • the seed culture prepared in Example 2-1 was dispensed into a 5L fermentor containing sterilized MJW01 medium, and the volume of the culture medium in the fermenter was 2.8 L at 20 to 35 ° C, 100 to 500 rpm, and 0.5 to 1.5 vvm. and incubated for a total of 105 hours.
  • the ammonia gas supply was stopped thereafter, and the carbon source concentration in the culture medium during the entire culture process Feed containing a carbon source was continuously supplied so that it was maintained at 5% or less.
  • ammonia gas was continuously supplied to the fermentor so that the total nitrogen concentration in the culture medium was 300 ppm or more, and 6 g/L of ammonium sulfate and 10 g/L of yeast extract were added as nitrogen sources to the sterilized MJW01 medium. Then, culture was performed in the same manner as described in 2-2-1 above, and cultured for a total of 84 hours.
  • Each microalgal culture cultured in 2-2-1 to 2-2-6 was recovered, and the fatty acid content was analyzed in the same manner as described in Example 1-3.
  • Example (2) 41.91 2.53 39.18 41.71 1.06 16.42 17.48
  • Example (5) 24.39 4.25 42.92 47.17 1.04 10.47 11.50
  • Example (6) 20.12 3.90 37.81 41.70 0.78 7.60 8.39
  • Example (7) 20.95 3.68 39.54 43.22 0.77 8.28 9.05
  • Example (8) 19.99 4.50 38.84 43.34 0.90 7.76 8.66
  • Example (9) 24.90 3.98 39.27 43.25 0.99 9.78 10.77
  • Example (10) 25.04 5.07 42.02 47.09 1.27 10.52 11.79
  • Each microalgal culture cultured in 2-2-1 to 2-2-6 was recovered, and protein content was analyzed in the same manner as described in Example 1-4.
  • Example (10) cultured in 2-2-6 above Recovering the microalgal culture of Example (10) cultured in 2-2-6 above, obtaining dried cells in the same manner as described in 1-3 above, and then acidifying 0.5 to 1 g of the dried cells decomposed. Thereafter, liquid chromatography was performed on this to analyze the total amino acid content and the content of each individual amino acid. The concentration of individual amino acids in the sample was standardized with the amount of dry cells used to calculate the content (%) of individual amino acids relative to the dry cell weight, and the total amino acid content (%) relative to the dry cell weight was calculated by summing the content of all detected amino acids. Calculated.
  • Example 10 in which microalgae were cultured under the condition of continuously supplying a nitrogen source, the total amino acid content in the biomass was 43.09%, and the content of glutamate among individual amino acids was It was found that the content ratio of glutamate to arginine was 2.04.

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Abstract

본 출원은 단일 미세조류로부터 단백질 및 오메가-3 지방산을 포함하는 바이오매스를 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 바이오매스에 관한 것으로, 일 양상에 따른 바이오매스 제조방법에 의하면, 질소원을 배양 과정 동안 지속적으로 공급함으로써 고함량의 단백질 및 오메가-3 지방산을 포함하는 단일 미세조류 유래 바이오매스를 제조할 수 있는 바, 이를 통해 제조된 바이오매스는 단백질 및 오메가-3 지방산의 단일 미생물 공급원으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

단일 미세조류로부터 단백질 및 오메가-3 지방산을 포함하는 바이오매스를 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 바이오매스
본 출원은 단일 미세조류로부터 단백질 및 오메가-3 지방산을 포함하는 바이오매스를 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 바이오매스에 관한 것이다.
불포화지방산(unsaturated fatty acid)은 지방산 사슬 내에 한 개 이상의 이중 결합을 가지고 있는 지방산이며, 2 이상의 이중 결합을 포함하는 경우 다중불포화지방산(polyunsaturated fatty acid: PUFA)으로 불린다. 이 중 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)는 대표적인 오메가-3 지방산으로, 두뇌, 안구 조직 및 신경계에 필수적인 지방산이다. 또한, 이들은 유아의 시력 및 운동신경능력 등 신경계 발달 및 심혈관 질환 예방에 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있으며, 뇌의 구조적 지질에 가장 풍부한 구성요소이다.
산업적으로 오메가-3 지방산과 같은 다중불포화지방산을 공급하는 주요 공급원은 등 푸른 생선의 기름에서 추출된 어유이며, 어분(fish meal) 또한 식품 또는 사료의 단백질 공급원으로 많이 사용되고 있다. 그러나, 어획량 제한 등 지속적인 어유 및 어분 공급의 어려움으로 인하여, 어유 및 어분을 대체할 수 있는 오메가-3 지방산 및 단백질의 대체 공급원 개발 필요성이 있다.
최근 미세조류 배양에 의한 다중불포화지방산 제조에 관한 연구가 진행되고 있으나, 이는 지방산 등 오일 생산을 목적으로 한 연구로 집중되어 있으며, 미세조류로부터 고함량의 단백질을 생산할 수 있는 방법에 대해서는 연구가 미미한 실정이다. 이에, 본 출원의 발명자들은 단일 미세조류로부터 오메가-3 지방산 및 고함량의 단백질을 포함하는 바이오매스를 제조하는 방법을 도출하여 본 출원을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 미국 공개특허 US 2016/0208297 A1
본 출원의 목적은 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 계열 미세조류인 단일 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양하는 단계 중 질소원을 지속적으로 공급하는 단계를 포함하는 트라우스토키트리드 계열 미세조류 유래 바이오매스 제조방법, 및 이에 의해 제조된 트라우스토키트리드 계열의 단일 미세조류 유래 바이오매스를 제공하는 것이다.
본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
일 양상은 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 계열 미세조류인 단일 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양하는 단계 중 질소원을 지속적으로 공급하는 단계를 포함하는 트라우스토키트리드 계열 미세조류 유래 바이오매스 제조방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "트라우스토키트리드(Thraustochytrid)"는 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목의 미세조류를 의미한다. 상기 트라우스토키트리드 계열 미세조류는 트라우스토키트리움 속(Thraustochytrium sp.), 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.), 오란티오키트리움 속(Aurantiochytrium sp.), 또는 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.)의 미세조류일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "트라우스토키트리움 속(Thraustochytrium sp.)", "스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.)", "오란티오키트리움 속(Aurantiochytrium sp.)", 및 "트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.)" 은 트라우스토키트리알레스 목의 트라우스토키트리아세애(Thraustochytriaceae) 과에 속하는 속명 중 하나로, 각각 용어 "트라우스토키트리움 속(genus Thraustochytrium)", "스키조키트리움 속(genus Schizochytrium)", 오란티오키트리움 속(genus Aurantiochytrium), 및 "트라우스토키트리대 속(genus Thraustochytriidae)"과 혼용될 수 있다.
또한, 상기 용어 "미세조류(microalgae)"는 엽록소로 광합성을 하는 식물 중 육안으로 볼 수 없어 현미경을 통해서만 볼 수 있으며 물속에서 자유로이 부유하여 살아가는 생물을 의미하며, 식물플랑크톤(Phytoplankton)이라고도 불린다.
일 구체예에서, 상기 트라우스토키트리드 계열 미세조류는 예를 들어, 수탁번호 KCTC14346BP로 기탁된 트라우스토키트리대 속 미세조류 CD01-6003, 또는 수탁번호 KCTC14345BP로 기탁된 스키조키트리움 속 미세조류 CD01-5004일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "바이오매스(biomass)"는 화학적 에너지로 사용 가능한 식물, 동물, 미생물 등의 생물체, 즉 바이오에너지의 에너지원을 의미하며, 생태학적으로 단위 시간 및 공간 내에 존재하는 특정 생물체의 중량 또는 에너지량을 의미하기도 한다. 또한, 상기 바이오매스는 세포에 의해 분비되는 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 세포외 물질뿐만 아니라 세포 및/또는 세포 내 내용물을 함유하는 것일 수 있다. 본 출원에서 상기 바이오매스는 트라우스토키트리드 계열 미세조류 그 자체, 이의 배양물, 이의 건조물, 이의 파쇄물, 또는 상기 미세조류를 배양하거나 발효하여 생산된 산물일 수 있으며, 또는 상기 바이오매스의 농축물 또는 건조물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 트라우스토키트리드 계열 미세조류의 "배양물"은 상기 미세조류를 배양하여 생성된 산물을 지칭하는 것으로, 구체적으로 미세조류를 포함하는 배양액 또는 미세조류가 제거된 배양액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 트라우스토키트리드 계열 미세조류 배양물의 "건조물"은 상기 미세조류 배양물에서 수분이 제거된 것으로, 예를 들어 상기 미세조류의 건조 균체 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 건조물의 "파쇄물"은 상기 미세조류 배양물에서 수분이 제거된 건조물을 파쇄한 결과물을 총칭하는 것으로, 예를 들어 건조 균체 분말일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 트라우스토키트리드 계열 미세조류의 배양물은 미세조류 배양 배지에 상기 미세조류를 접종하고 배양하는 단계, 및 상기 배양하는 단계 중 질소원을 지속적으로 공급하는 단계를 포함하는 배양 방법에 따라 제조될 수 있고, 상기 배양물의 건조물 및 이의 파쇄물은 당업계에 공지된 미세조류 또는 배양액의 처리 또는 건조 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 바이오매스 제조방법에 있어서, 상기 질소원은 미세조류를 배지에 접종한 직후부터 배양 종료 시까지 공급하는 것일 수 있다.
또한, 상기 질소원은 배양액 내 총 질소 농도가 300 ppm 이상이 되도록 지속적으로 공급하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 질소원은 배양액 내 총 질소 농도가 300 내지 10,000 ppm, 300 내지 8,000 ppm, 300 내지 5,000 ppm, 300 내지 3,000 ppm, 300 내지 2,000 ppm, 300 내지 1,500 ppm, 350 내지 10,000 ppm, 350 내지 8,000 ppm, 350 내지 5,000 ppm, 350 내지 3,000 ppm, 350 내지 2,000 ppm, 또는 350 내지 1,500 ppm의 범위 안에서 유지되도록 지속적으로 공급하는 것일 수 있다.
상기 바이오매스 제조방법에 있어서, 상기 배지는 탄소원 및 질소원을 포함하는 것일 수 있다.
상기 바이오매스 제조방법에 있어서, 상기 질소원을 지속적으로 공급하는 단계의 질소원 및 상기 배지에 포함되는 질소원은 i) 효모 추출물(yeast extract), 우육 추출물(beef extract), 펩톤 및 트립톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유기질소원, 또는 ii) 암모늄 아세테이트, 암모늄 나이트레이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 설페이트, 소듐 나이트레이트, 우레아, MSG(Monosodium glutamate), 및 암모니아로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기질소원일 수 있으나, 트라우스토키트리드 계열 미세조류를 배양하는데 사용되는 질소원이라면 이에 제한되지 않는다.
상기 질소원을 지속적으로 공급하는 단계는 예를 들면, 배양액에 질소원이 포함된 배지를 지속적으로 공급하는 것으로 수행될 수 있고, 또는 상기 미세조류를 배양하는 발효기에 암모니아 기체를 지속적으로 공급하는 것으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 배양액에 질소원이 포함된 배지를 지속적으로 공급하는 것은 예를 들어, 상기 배지를 간헐적으로 공급하는 유가식 배양(Fed-batch culture) 방법, 또는 상기 배지를 연속적으로 공급하는 연속식 배양(Continuous culture) 방법에 의해 수행되는 것일 수 있다.
상기 방법은 상기 배양하는 단계 중 탄소원을 지속적으로 공급하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 탄소원을 지속적으로 공급하는 단계는 예를 들면, 배양액에 탄소원이 포함된 배지를 지속적으로 공급하는 것으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 배양액에 탄소원이 포함된 배지를 지속적으로 공급하는 것은 예를 들어, 유가식 배양 방법 도는 연속식 배양 방법에 의해 수행되는 것일 수 있다. 상기 탄소원을 지속적으로 공급하는 단계는 상기 배양액 내 탄소원 농도가 5%(w/v) 이하가 되도록 유지하면서 수행하는 것일 수 있다.
상기 탄소원을 지속적으로 공급하는 단계의 탄소원 및 상기 배지에 포함되는 탄소원은 글루코스, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 만노스, 수크로스, 아라비노스, 자일로스 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 트라우스토키트리드 계열 미세조류를 배양하는데 사용되는 탄소원이라면 이에 제한되지 않는다.
상기 배지는 트라우스토키트리드 계열 미세조류를 배양하는데 사용되는 적당한 인 공급원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 더 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 인 공급원은 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유염 등을 개별적으로 포함하거나 또는 혼합하여 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 배양하는 단계는 95시간 이하로 수행되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 배양하는 단계는 30 내지 95시간, 35 내지 95시간, 40 내지 95시간, 45 내지 95시간, 30 내지 90시간, 35 내지 90시간, 40 내지 90시간, 또는 45 내지 90시간 동안 수행되는 것일 수 있다.
상기 배양하는 단계는 20 내지 35℃에서 수행되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 배양하는 단계는 25 내지 35℃, 20 내지 30℃, 또는 25 내지 30℃에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배양하는 단계는, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나, 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
상기 배양하는 단계는 pH를 조절하면서 수행되는 것일 수 있고, 예를 들면, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 pH 3.5 내지 9.0, pH 4.0 내지 9.0, pH 4.5 내지 9.0, pH 5.0 내지 9.0, pH 3.5 내지 8.0, pH 4.0 내지 8.0, pH 4.5 내지 8.0, 또는 pH 5.0 내지 8.0을 유지하도록 조절하면서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 바이오매스 제조방법은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물로부터 바이오매스를 회수하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 바이오매스를 회수하는 단계는 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 바이오매스를 수집하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있고, 정제 공정을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 제조방법에 의해 제조되는 바이오매스는 바이오매스 전체 중량을 기준으로 50 중량% 이상의 단백질 및 37 중량% 이하의 지방을 포함하는 것일 수 있다. 상기 바이오매스는 예를 들어, 50 내지 80 중량%, 50 내지 75 중량%, 50 내지 70 중량%, 55 내지 80 중량%, 55 내지 75 중량%, 또는 55 내지 70 중량%의 단백질; 및 5 내지 37 중량%, 5 내지 35 중량%, 5 내지 30 중량%, 5 내지 25 중량%, 10 내지 37 중량%, 10 내지 35 중량%, 10 내지 30 중량%, 10 내지 25 중량%, 15 내지 37 중량%, 15 내지 35 중량%, 15 내지 30 중량%, 또는 15 내지 25 중량%의 지방을 포함하는 것일 수 있다.
상기 제조방법에 의해 제조되는 바이오매스는 바이오매스 전체 중량을 기준으로 50 중량% 이상의 단백질, 및 오메가-3 지방산을 포함하는 것일 수 있다. 상기 오메가-3 지방산은 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA) 중 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA)"은 C22H32O2의 화학식을 갖는 다중불포화지방산 중 하나로, 알파-리놀렌산(α-linolenic acid: ALA) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)과 함께 오메가-3 지방산에 해당하며, 관용명은 세르본산(cervonic acid)이고, 약칭으로 22:6 n-3으로도 표기될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)"은 C20H30O2의 화학식을 갖는 다중불포화지방산 중 하나로, ALA 및 DHA와 함께 오메가-3 지방산에 해당하며, 약칭으로 20:5 n-3으로도 표기될 수 있다.
상기 50 중량% 이상의 단백질, 및 오메가-3 지방산을 포함하는 바이오매스에 있어서, 상기 바이오매스는 바이오매스 전체 중량을 기준으로 3 내지 30 중량%, 3 내지 25 중량%, 3 내지 20 중량%, 또는 3 내지 15 중량%의 오메가-3 지방산을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 바이오매스는 총 지방산(total fatty acid) 중량 대비 15 내지 60 중량%, 15 내지 55 중량%, 또는 15 내지 50 중량%의 오메가-3 지방산을 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 트라우스토키트리드 계열 미세조류인 단일 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양하는 단계 중 질소원을 지속적으로 공급하는 단계를 포함하는 바이오매스 제조방법에 의해 제조된, 트라우스토키트리드 계열의 단일 미세조류 유래 바이오매스를 제공한다.
상기 바이오매스 제조방법은 상기한 바와 같다.
상기 바이오매스는 바이오매스 전체 중량을 기준으로 50 중량% 이상의 단백질 및 37 중량% 이하의 지방을 포함하는 것일 수 있다. 상기 바이오매스는 예를 들어, 50 내지 80 중량%, 50 내지 75 중량%, 50 내지 70 중량%, 55 내지 80 중량%, 55 내지 75 중량%, 또는 55 내지 70 중량%의 단백질; 및 5 내지 37 중량%, 5 내지 35 중량%, 5 내지 30 중량%, 5 내지 25 중량%, 10 내지 37 중량%, 10 내지 35 중량%, 10 내지 30 중량%, 10 내지 25 중량%, 15 내지 37 중량%, 15 내지 35 중량%, 15 내지 30 중량%, 또는 15 내지 25 중량%의 지방을 포함하는 것일 수 있다.
상기 바이오매스는 바이오매스 전체 중량을 기준으로 50 중량% 이상의 단백질, 및 오메가-3 지방산을 포함하는 것일 수 있고, 상기 오메가-3 지방산은 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산 중 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 50 중량% 이상의 단백질, 및 오메가-3 지방산을 포함하는 바이오매스에 있어서, 상기 바이오매스는 바이오매스 전체 중량을 기준으로 3 내지 30 중량%, 3 내지 25 중량%, 3 내지 20 중량%, 또는 3 내지 15 중량%의 오메가-3 지방산을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 바이오매스는 총 지방산 중량 대비 15 내지 60 중량%, 15 내지 55 중량%, 또는 15 내지 50 중량%의 오메가-3 지방산을 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 트라우스토키트리드 계열 미세조류인 단일 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양하는 단계 중 질소원을 지속적으로 공급하는 단계를 포함하는 바이오매스 제조방법에 의해 제조된, 트라우스토키트리드 계열의 단일 미세조류 유래 바이오매스, 또는 상기 바이오매스의 농축물 또는 건조물을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 바이오매스 제조방법 및 트라우스토키트리드 계열의 단일 미세조류 유래 바이오매스에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 바이오매스의 농축물 또는 건조물은 당업계에 공지된 미생물 바이오매스의 처리, 농축 또는 건조 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 조성물은 용액, 분말, 또는 현탁액 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조성물은 예를 들어, 식품 조성물, 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "사료 조성물"은 동물에게 급여되는 먹이를 지칭한다. 상기 사료 조성물은 동물의 생명을 유지, 또는 고기, 젖 등을 생산하는데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 말한다. 상기 사료 조성물은 동물의 생명 유지, 또는 고기, 젖 등을 생산하는 필요한 영양성분을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 사료 조성물은 당업계의 공지된 다양한 형태의 사료로 제조 가능하며, 구체적으로는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "사료 첨가제"는 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 포함한다. 본 출원의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "식품 조성물"은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives)등의 모든 형태를 포함하며, 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
본 출원의 조성물은 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
본 출원의 조성물은 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 조성물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 조성물을 사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 상기 조성물은 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
본 출원의 조성물은, 예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 동결보호제, 또는 부형제 등을 함유할 수 있다. 상기 동결보호제는, 글리세롤, 트레할로스, 말토덱스트린, 탈지분유 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 보존제, 안정화제, 또는 부형제는 상기 조성물에 포함되는 트라우스토키트리드 계열 미세조류의 저하(deterioration)를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다. 또한, 상기 동결보호제는 상기 조성물이 건조된 상태일 때 조성물에 포함되는 트라우스토키트리드 계열 미세조류의 저하를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다.
상기 조성물은 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 출원의 조성물은 포유류, 조류, 어류, 갑각류, 두족류, 파충류 및 양서류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 포유류는 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물, 또는 애완 동물 등을 포함할 수 있고, 상기 조류는 가금류를 포함할 수 있고, 상기 가금류는 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 또는 메추라기 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 어류는 상업적 축양 어류 및 이의 치어류, 관상어 등을 포함할 수 있고, 상기 갑각류는 새우, 따개비 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 동물성 플랑크톤인 로티퍼(rotifer)의 식이에도 적용될 수 있다.
일 양상에 따른 바이오매스 제조방법에 의하면, 질소원을 배양 과정 동안 지속적으로 공급함으로써 고함량의 단백질 및 오메가-3 지방산을 포함하는 단일 미세조류 유래 바이오매스를 제조할 수 있는 바, 이를 통해 제조된 바이오매스는 단백질 및 오메가-3 지방산의 단일 미생물 공급원으로 유용하게 활용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 트라우스토키트리대 속 미세조류의 배양 방법에 따른 지방 및 단백질 생산량 확인
1-1. 미세조류의 준비 및 종균배양
트라우스토키트리대 속 미세조류 CD01-6003 (수탁번호: KCTC14346BP)을 멸균된 MJW01 배지(글루코스 30g/L, MgSO4·7H2O 3.0g/L, Na2SO4 10g/L, NaCl 1.0g/L, 효모 추출물 9.0g/L, MSG·1H2O 1.0g/L, NaNO3 1.0g/L, KH2PO4 0.1g/L, K2HPO4 0.5g/L, CaCl2 0.5g/L, 및 비타민 혼합 용액 10mL/L)에 접종하여 250 mL 플라스크에서 20 내지 35℃ 및 100 내지 300 rpm 조건으로 10 내지 30시간 동안 배양하였다.
1-2. 본 배양
1-2-1. 비교예 (1)
상기 실시예 1-1에서 준비한 종균배양물(seed culture)을, 질소원으로 암모늄 설페이트((NH4)2·SO4) 6 g/L 및 효모 추출물 5 g/L를 추가한 멸균된 MJW01 배지가 들어있는 5L 발효기에 분주하여 20 내지 35℃, 100 내지 500 rpm, 및 0.5 내지 1.5 vvm의 조건으로 발효기 내 배양액의 부피가 2.8 L가 될 때까지 배양하여, 총 101시간 동안 배양하였다. 추가 질소원으로 배양을 개시한 직후부터 14시간 동안 발효기에 배양액 내 총 질소 농도가 300 ppm 이상이 되도록 암모니아 기체를 지속적으로 공급한 후, 이후부터는 암모니아 기체 공급을 중단하였고, 전체 배양 과정 중에 배양액 내 탄소원 농도가 5% 이하로 유지되도록 탄소원이 포함된 Feed를 지속적으로 공급하였다.
1-2-2. 실시예 (1)
전체 배양 과정 중에 배양액 내 총 질소 농도가 300 ppm 이상이 되도록 발효기에 암모니아 기체를 지속적으로 공급한 것을 제외하고는, 상기 1-2-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양을 진행하여 총 86시간 동안 배양하였다.
1-2-3. 실시예 (2)
전체 배양 과정 중에 배양액 내 총 질소 농도가 300 ppm 이상이 되도록 발효기에 암모니아 기체를 지속적으로 공급하고, 멸균된 MJW01 배지에 질소원으로 암모늄 설페이트 18 g/L만을 추가한 것을 제외하고는, 상기 1-2-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양을 진행하여 총 75시간 동안 배양하였다.
1-2-4. 실시예 (3)
전체 배양 과정 중에 배양액 내 총 질소 농도가 300 ppm 이상이 되도록 발효기에 암모니아 기체를 지속적으로 공급하고, 탄소원이 포함된 Feed에 질소원으로 암모늄 설페이트 10 g/L를 더 첨가하여 공급한 것을 제외하고는, 상기 1-2-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양을 진행하여 총 55시간 동안 배양하였다.
1-2-5. 실시예 (4)
전체 배양 과정 중에 배양액 내 총 질소 농도가 300 ppm 이상이 되도록 발효기에 암모니아 기체를 지속적으로 공급하고, 멸균된 MJW01 배지에 질소원으로 암모늄 설페이트 6 g/L만을 추가하고, 탄소원이 포함된 Feed에 질소원으로 암모늄 설페이트 12 g/L를 더 첨가하여 공급한 것을 제외하고는, 상기 1-2-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양을 진행하여 총 92시간 동안 배양하였다.
1-3. 지방 함량 분석
상기 1-2-1 내지 1-2-5에서 배양한 각 미세조류 배양물을 회수하여 원심분리 후 수득한 균체를 PBS로 3회 세척하고, 60℃에서 16시간 동안 건조하였다. 건조된 균체 2g에 8.3M 염산 용액을 가하여 80℃에서 가수분해 반응을 진행시켰다. 이후, 상기 반응물에 에틸 에테르(Ethyl ether) 30mL와 석유 에테르(Petroleum ether) 20mL를 첨가한 후 30초간 섞어주고 원심분리하는 과정을 3회 이상 반복하였다. 분리된 용매층을 미리 무게를 측정한 라운드 플라스크에 옮긴 뒤, 질소 퍼징(N2 purging)을 통해 용매 및 잔여 수분을 제거한 용기에 넣어 건조하였다. 용매를 건조시키고 남은 오일의 무게를 측정하여 총 오일 함량을 계산하였으며, 오일 중에 포함된 오메가-3 지방산(DHA 및 EPA) 함량은 메탄올성 0.5N NaOH 및 14% 트리플루오로보란메탄올 용액(BF3-MeOH)으로 전처리를 진행한 뒤 기체 크로마토그래피법으로 측정하였다.
조건 조지방/바이오매스(%) EPA/조지방(%) DHA/조지방(%) 오메가-3/조지방(%) EPA/바이오매스(%) DHA/바이오매스(%) 오메가-3/바이오매스(%)
비교예(1) 43.42 0.49 10.06 10.55 0.21 4.37 4.58
실시예(1) 28.90 2.96 24.39 27.35 0.86 7.05 7.90
실시예(2) 14.97 2.54 26.58 29.12 0.38 3.98 4.36
실시예(3) 26.13 0.86 16.75 17.61 0.22 4.38 4.60
실시예(4) 17.91 2.71 36.12 38.83 0.49 6.47 6.95
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 바이오매스 내 조지방(total fatty acid: TFA) 함량은 비교예(1)에 비하여 질소원을 지속적으로 공급하여 배양한 실시예 (1) 내지 (4)에서 보다 감소하였으나, 조지방 내 EPA, DHA 및 오메가-3 함량은 실시예 (1) 내지 (4)에서 비교예(1) 대비 동등 이상의 함량을 나타내었다.
1-4. 단백질 함량 분석
상기 1-3에 기재된 것과 동일한 방법으로 수득한 건조된 각 균체 0.5 내지 1 g을 대상으로 원소분석기를 이용하여 시료 내 존재하는 질소 함량을 정량 분석하였다. 각 시료 내 존재하는 질소의 무게 비율(TN%)에 6.25를 곱하여 시료 내 조단백 함량으로 계산하여 나타내었다.
조건 조단백/바이오매스(%)
비교예(1) 최대 약 43.58 *
실시예(1) 최대 약 58.10 *
실시예(2) 55.7
실시예(3) 58.0
실시예(4) 57.5
(*: 추정치임)
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 (2) 내지 (4)의 경우, 모두 55% 이상의 조단백 함량을 나타내었으며, 실시예 (1)의 경우 상기 1-3에서 측정한 조지방 함량이 28.9%이고, 미세조류 바이오매스의 통상적인 탄수화물 함량은 약 2 내지 3% 정도이고, ash 함량이 약 8 내지 10% 정도임을 고려할 때, 조단백 함량은 최대 약 58.10% 수준에 이를 수 있음을 추정할 수 있다. 또한, 비교예 (1)의 경우 상기 1-3에서 측정한 조지방 함량이 43.42%인 점을 통하여 조단백 함량이 최대라고 하더라도 약 43.58% 수준에 불과할 것으로 추정할 수 있다. 이를 통하여, 질소원을 지속적으로 공급하는 조건으로 미세조류를 배양 시, 55% 이상의 고함량으로 단백질을 생산할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. 스키조키트리움 속 미세조류의 배양 방법에 따른 지방 및 단백질 생산량 확인
2-1. 미세조류의 준비 및 종균배양
스키조키트리움 속 미세조류 CD01-5004 (수탁번호: KCTC14345BP)를 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 종균배양하였다.
2-2. 본 배양
2-2-1. 비교예 (2)
상기 실시예 2-1에서 준비한 종균배양물을 멸균된 MJW01 배지가 들어있는 5L 발효기에 분주하여 20 내지 35℃, 100 내지 500 rpm, 및 0.5 내지 1.5 vvm의 조건으로 발효기 내 배양액의 부피가 2.8 L가 될 때까지 배양하여, 총 105시간 동안 배양하였다. 추가 질소원으로 배양을 개시한 직후부터 10시간 동안 발효기에 배양액 내 총 질소 농도가 300 ppm 이상이 되도록 암모니아 기체를 공급한 후, 이후부터는 암모니아 기체 공급을 중단하였고, 전체 배양 과정 중에 배양액 내 탄소원 농도가 5% 이하로 유지되도록 탄소원이 포함된 Feed를 지속적으로 공급하였다.
2-2-2. 실시예 (5)
전체 배양 과정 중에 배양액 내 총 질소 농도가 300 ppm 이상이 되도록 발효기에 암모니아 기체를 지속적으로 공급하고, 멸균된 MJW01 배지에 질소원으로 암모늄 설페이트 6 g/L 및 효모 추출물 10 g/L를 추가한 것을 제외하고는, 상기 2-2-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양을 진행하여 총 84시간 동안 배양하였다.
2-2-3. 실시예 (6)
총 53시간 동안 배양한 것을 제외하고는, 상기 2-2-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양을 진행하였다.
2-2-4. 실시예 (7) 및 (8)
총 50시간 동안 배양한 것을 제외하고는, 상기 2-2-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양을 진행하였다.
2-2-5. 실시예 (9)
총 47시간 동안 배양한 것을 제외하고는, 상기 2-2-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양을 진행하였다.
2-2-6. 실시예 (10)
멸균된 MJW01 배지에 질소원으로 MSG 5 g/L를 더 추가한 것을 제외하고는, 상기 2-2-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양을 진행하여 총 47시간 동안 배양하였다.
2-3. 지방 함량 분석
상기 2-2-1 내지 2-2-6에서 배양한 각 미세조류 배양물을 회수하여, 상기 실시예 1-3에 기재된 것과 동일한 방법으로 지방산 함량을 분석하였다.
조건 조지방/바이오매스(%) EPA/조지방(%) DHA/조지방(%) 오메가-3/조지방(%) EPA/바이오매스(%) DHA/바이오매스(%) 오메가-3/바이오매스(%)
비교예(2) 41.91 2.53 39.18 41.71 1.06 16.42 17.48
실시예(5) 24.39 4.25 42.92 47.17 1.04 10.47 11.50
실시예(6) 20.12 3.90 37.81 41.70 0.78 7.60 8.39
실시예(7) 20.95 3.68 39.54 43.22 0.77 8.28 9.05
실시예(8) 19.99 4.50 38.84 43.34 0.90 7.76 8.66
실시예(9) 24.90 3.98 39.27 43.25 0.99 9.78 10.77
실시예(10) 25.04 5.07 42.02 47.09 1.27 10.52 11.79
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 바이오매스 내 조지방(total fatty acid: TFA) 함량은 비교예(2)에 비하여 질소원을 지속적으로 공급하여 배양한 실시예 (5) 내지 (10)에서 보다 감소하였으나, 조지방 내 EPA, DHA 및 오메가-3 함량은 실시예 (5) 내지 (10)에서 비교예(2) 대비 동등 이상의 함량을 나타내었다.
2-4. 단백질 함량 분석
상기 2-2-1 내지 2-2-6에서 배양한 각 미세조류 배양물을 회수하여, 상기 실시예 1-4에 기재된 것과 동일한 방법으로 단백질 함량을 분석하였다.
조건 조단백/바이오매스(%)
비교예(2) 최대 약 45.1*
실시예(5) 62.4
실시예(6) 64.9
실시예(7) 65.6
실시예(8) 66.3
실시예(9) 60.7
실시예(10) 58.7
(*: 추정치임)
그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 (5) 내지 (10)의 경우, 모두 58% 이상의 조단백 함량을 나타내었으며, 비교예 (2)의 경우 상기 2-3에서 측정한 조지방 함량이 41.91%이고, 미세조류 바이오매스의 통상적인 탄수화물 함량은 약 2 내지 3% 정도이고, ash 함량이 약 8 내지 10% 정도임을 고려할 때, 조단백 함량은 최대 약 45.1% 수준일 것으로 추정할 수 있다. 이를 통하여, 질소원을 지속적으로 공급하는 조건으로 미세조류를 배양 시, 58% 이상의 고함량으로 단백질을 생산할 수 있음을 확인하였다.
2-5. 아미노산 함량 및 조성 분석
상기 2-2-6에서 배양한 실시예 (10)의 미세조류 배양물을 회수하여, 상기 1-3에 기재된 것과 동일한 방법으로 건조 균체를 수득한 후, 건조된 균체 0.5 내지 1 g을 산 가수분해하였다. 이후, 이를 대상으로 액체 크로마토그래피를 수행하여 총 아미노산 함량 및 각 개별 아미노산 함량을 분석하였다. 시료 내 개별 아미노산의 농도를 사용된 건조 균체의 양으로 표준화하여 건조 세포 중량 대비 개별 아미노산의 함량(%)을 계산하였고, 검출된 모든 아미노산의 함량을 합하여 건조 세포 중량 대비 총 아미노산 함량(%)을 계산하였다.
바이오매스 내 함량(%) 바이오매스 내 함량(%) 바이오매스 내 함량(%)
총 아미노산 43.09 알라닌 2.50 티로신 1.24
아스파르트산 3.62 시스테인 0.56 페닐알라닌 1.63
트레오닌 1.80 발린 2.06 리신 2.27
세린 2.02 메티오닌 0.82 히스티딘 0.78
글루타메이트 12.47 이소루신 1.36 아르기닌 6.11
글리신 0.00 루신 2.77 프롤린 1.07
총 아미노산 내 함량(%) 총 아미노산 내 함량(%) 총 아미노산 내 함량(%)
총 아미노산 100.00 알라닌 5.81 티로신 2.88
아스파르트산 8.39 시스테인 1.30 페닐알라닌 3.79
트레오닌 4.18 발린 4.78 리신 5.27
세린 4.69 메티오닌 1.90 히스티딘 1.82
글루타메이트 28.93 이소루신 3.15 아르기닌 14.19
글리신 0.00 루신 6.43 프롤린 2.48
그 결과, 표 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 질소원을 지속적으로 공급하는 조건으로 미세조류를 배양한 실시예 (10)의 경우 바이오매스 내 총 아미노산 함량이 43.09%이었고, 개별 아미노산 중 글루타메이트의 함량이 가장 높았으며, 아르기닌 대비 글루타메이트의 함량 비율이 2.04임을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2021003477-appb-I000001
Figure PCTKR2021003477-appb-I000002

Claims (17)

  1. 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 계열 미세조류인 단일 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양하는 단계 중 질소원을 지속적으로 공급하는 단계를 포함하는 트라우스토키트리드 계열 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 질소원은 미세조류를 배지에 접종한 직후부터 배양 종료 시까지 공급하는 것인, 트라우스토키트리드 계열 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 질소원은 배양액 내 총 질소 농도가 300 ppm 이상이 되도록 지속적으로 공급하는 것인, 트라우스토키트리드 계열 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 배지는 탄소원 및 질소원을 포함하는 것인, 트라우스토키트리드 계열 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  5. 청구항 1 또는 4에 있어서, 상기 질소원은 i) 효모 추출물(yeast extract), 우육 추출물(beef extract), 펩톤 및 트립톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유기질소원, 또는 ii) 암모늄 아세테이트, 암모늄 나이트레이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 설페이트, 소듐 나이트레이트, 우레아, MSG(Monosodium glutamate), 및 암모니아로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기질소원인 것인, 트라우스토키트리드 계열 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 탄소원은 글루코스, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 만노스, 수크로스, 아라비노스, 자일로스 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 트라우스토키트리드 계열 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 트라우스토키트리드 계열 미세조류는 트라우스토키트리움 속(Thraustochytrium sp.), 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.), 오란티오키트리움 속(Aurantiochytrium sp.), 또는 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.)인 것인, 트라우스토키트리드 계열 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물로부터 바이오매스를 회수하는 단계를 더 포함하는 것인, 트라우스토키트리드 계열 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 바이오매스는 바이오매스 전체 중량을 기준으로 50 중량% 이상의 단백질 및 37 중량% 이하의 지방을 포함하는 것인, 트라우스토키트리드 계열 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 바이오매스는 바이오매스 전체 중량을 기준으로 50 중량% 이상의 단백질, 및 오메가-3 지방산을 포함하는 것인, 트라우스토키트리드 계열 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 오메가-3 지방산은 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA) 중 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 트라우스토키트리드 계열 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 바이오매스는 총 지방산(total fatty acid) 중량 대비 15 내지 60 중량%의 오메가-3 지방산을 포함하는 것인, 트라우스토키트리드 계열 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  13. 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 계열 미세조류인 단일 균주를 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양하는 단계 중 질소원을 지속적으로 공급하는 단계를 포함하는 바이오매스 제조방법에 의해 제조된, 트라우스토키트리드 계열의 단일 미세조류 유래 바이오매스.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 바이오매스는 바이오매스 전체 중량을 기준으로 50 중량% 이상의 단백질 및 37 중량% 이하의 지방을 포함하는 것인, 트라우스토키트리드 계열의 단일 미세조류 유래 바이오매스.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 바이오매스는 바이오매스 전체 중량을 기준으로 50 중량% 이상의 단백질, 및 오메가-3 지방산을 포함하는 것인, 트라우스토키트리드 계열의 단일 미세조류 유래 바이오매스.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 오메가-3 지방산은 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산 중 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 트라우스토키트리드 계열의 단일 미세조류 유래 바이오매스.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 바이오매스는 총 지방산 중량 대비 15 내지 60 중량%의 오메가-3 지방산을 포함하는 것인, 트라우스토키트리드 계열의 단일 미세조류 유래 바이오매스.
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