KR20160098233A - 트라우스토키트리움 속 미세조류의 바이오매스의 ｄｈａ의 강화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 산소의 제어된 첨가에 의해 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속 미세조류, 구체적으로 쉬조키트리움(Schizochytrium) sp. 또는 쉬조키트리움 망그로베이(Schizochytrium mangrovei)의 바이오매스(biomass)에서 도코사헥산산(또는 DHA)을 강화시키는 발효 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속의 미세조류, 더욱 특히 쉬조키트리움(Schizochytrium) sp. 또는 쉬조키트리움 망그로베이(Schizochytrium mangrovei)의 바이오매스(biomass)에서 도코사헥산산(DHA)을 강화시키는 신규한 발효 방법과, 또한 이러한 미세조류 바이오매스로부터 추출된 오일에 관한 것이다.
지질은 단백질 및 탄수화물과 함께 다량영양소의 3가지 주요 패밀리(family) 중 하나를 구성한다.
지질 중에서 특히 트리글리세라이드 및 인지질이 눈에 띈다:
- 트리글리세라이드 (트리아실글리세롤 또는 트리아실글리세라이드 또는 TAG로도 칭해짐)는 글리세롤의 3개의 히드록실기가 지방산으로 에스테르화된 글리세라이드이다. 이것은 식물유 및 동물성 지방의 주요 구성 성분이다.
트리글리세라이드는 인간에 의해 섭취되는 식이 지질의 대략 95%를 나타낸다. 상기 유기체에서, 트리글리세라이드는 주로 지방 조직에 존재하며 주요한 에너지 저장 형태를 구성한다.
- 인지질은 양쪽성 지질이며, 즉, 1개의 극성 (친수성) "헤드(head)" 및 2개의 지방족 (소수성) "테일(tail)"로 이루어진 지질이다.
인지질은 구조 지질이며, 그 이유는 인지질이 그가 제공하는 세포 막 (특히, 유동성)의 구성 성분이기 때문이다.
트리글리세라이드 및 인지질은 지방산으로 주로 구성되는데, 이들 둘 모두 식사(diet)에 의해 제공되며, 이들 중 일부의 경우에는 상기 유기체에 의해 합성된다.
생화학적 분류 (지방산 분자에 함유된 이중 결합의 수를 기반으로 함)에 의하면 포화 지방산(saturated fatty acid; SFA), 단일불포화 지방산(monounsaturated fatty acid; MUFA) 및 다중불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid; PUFA)은 구별된다.
생리학적 견지에서, 하기가 구별된다:
- 인체의 발달 및 올바른 기능에 필요하지만 신체가 생성할 수 없는 필수 지방산;
- 세포의 정상적인 성장 및 생리학적 기능에 필수적이지만, 이것이 식사에 의해 제공되는 경우 그의 전구체로부터 생성될 수 있는 "조건부" 필수 지방산. 따라서 이는 그의 필수 전구체가 부재할 경우 절대적으로 요구된다;
- 비-필수 지방산.
모든 필수 및 "조건부" 필수 지방산은 필수 지방산을 구성한다.
다른 지방산은 비-필수인 것으로 지칭된다.
비-필수 지방산은 특히 하기를 포함한다:
- 오메가 3 지방산 패밀리의 에이코사펜타엔산(EPA),
- 우리의 식사에서 주된 단일불포화 지방산인 올레산과, 팔미톨레산,
- 포화 지방산, 예컨대 라우르산, 미리스트산 또는 팔미트산.
다중불포화 지방산
다중불포화 지방산은 최종 메틸 작용체로부터 시작하여, 제1 이중 결합의 위치에 따라 분류된다.
따라서, 명명법에서 오메가 "x" 또는 "nx"에 있어서, "x"는 제1 불포화체의 위치에 상응한다.
필수 지방산의 2가지 주요 패밀리가 구별된다: 오메가 6 지방산 (또는 n-6 PUFA) (이의 전구체이면서 주요 대표자는 리놀레산(LA)임), 및 오메가 3 지방산 (또는 n-3 PUFA) (이의 전구체는 알파-리놀렌산(ALA)임).
생물학적 관심 대상의 다중불포화 지방산의 대다수는 오메가 6 패밀리 (아라키돈산 또는 ARA) 또는 오메가 3 패밀리 (에이코사펜타엔산 또는 EPA, 도코사헥사엔산 또는 DHA)에 속한다.
게다가, 명명법에서, 사슬을 구성하는 탄소의 수가 또한 정의되며, 따라서, EPA는 C20:5로서, 그리고 DHA는 C22:6으로서 기술된다.
따라서 "5" 및 "6"은 각각 EPA 및 DHA에 의해 표시되는 탄소쇄의 불포화체의 수에 상응한다.
오메가 3 지방산 패밀리의 DHA는 유기체가 알파-리놀렌산으로부터 합성할 수 있거나 기름기가 많은 생선 (참치, 연어, 청어 등)의 소비에 의해 제공되는 지방산이다.
DHA는 막 구조에서, 그리고 뇌 및 망막의 발달 및 기능에서 중요한 역할을 한다.
어유는 DHA 및 EPA와 같은 오메가 3 지방산의 공급원으로서 주로 사용되지만, 이는 미세조류 오일에서도 발견되는데, 이는 미세조류로부터 혼합물로서, 또는 별도로 추출되며, 이는 예를 들어 특정한 선택된 주(strain), 예컨대 쉬조키트리움 속의 것으로부터 유래된 오일에서 흔히 있는 일로서, 이는 단지 미량의 EPA를 함유하지만 고 DNA 함량을 함유한다.
포화 지방산
포화 지방산 중에서, 헥사데칸산 또는 세틸산으로도 지칭되는 팔미트산이 동물 및 식물에 있어서 가장 일반적인 C16:0 포화 지방산 중 하나이다.
팔미트산은 지방 합성(lipogenesis) 동안 생성되는 제1 지방산이며; 더 긴 지방산은 상기 팔미트산으로부터 생성될 수 있다.
더욱이, 이것은 ATP를 합성하는 데 우선적으로 사용되는 지방산이다. 이의 연소의 에너지 균형은 129 ATP를 나타낸다. 따라서 이것은 탁월한 에너지 식품을 구성한다.
산업상, 팔미트산은 마가린 및 경질 비누의 생성에 또한 사용된다.
페인트 분야에서, 이것이 포화되어 있다면, 팔미트산은, 일단 대기중 산소와 접촉할 경우 중합되어 강성으로 되는 것이 불가능하다 (올레산, 리놀레산 및 리놀렌산과는 다름). 따라서, 이것은 여전히 그의 연질 고체 형태로 남아 있고, 중합된 유성 결합제를 위한 가소제로서 작용한다 (스테아르산과 함께). 따라서, 이것은 스테아르산과 함께, 시간이 지남에 따른 오일-함유 회화 재료의 우수한 보존성에 요구되는 탄성을 제공한다.
단일불포화 지방산
단일불포화 지방산 전구체로서, 팔미트산은 과실 또는 산자나무(sea buckthorn)의 펄프에 천연적으로 다량으로 존재하는 팔미톨레산 (16:1, n-7)으로 이어진다.
게다가, 식품 형태의 팔미톨레산의 제공의 증가는 혈중 콜레스테롤 감소 및 혈중 트리글리세라이드 감소 효과를 가지며, 뇌졸중의 위험을 감소시키고, 또한 혈관 평활근 세포에서의 대사를 개선시킬 수 있는 것으로 기술되었다.
미세조류에 의한 지질, 특히 지방산의 생성
쉬조키트리움 속의 미세조류는 통상적으로 발효기에서 배양된다 (종속 영양 조건: 암소에서 그리고 탄소원의 존재 하에).
이러한 미세조류의 유익한 이용은 일반적으로 발효 조건의 제어를 요구함이 주지되어야 한다.
따라서, 이러한 결과를 달성하기 위하여 고 세포 밀도(high cell density; HCD)를 수득하는 것이 가능해지게 하는 첫 번째 발효 방법이 크게 발달되어 최대 지질 수율 및 생산성이 수득되었다.
이러한 HCD 배양의 목적은 가능한 가장 짧은 시간 기간 내에 가능한 최고의 농도의 요망되는 지질을 수득하는 것이었다.
그러나, 예를 들어 미세조류가 많은 지질 저장체를 생성하도록 하는 것이 요망될 때 미세조류의 성장을 제한하는 영양 스트레스를 미세조류에 가하는 것이 필요함이 이 분야의 전문가에게 빠르게 명백해지게 되었다.
따라서, 성장 및 생성은 발효 방법에서 통상적으로 분리된다.
예를 들어, 다중불포화 지방산 (이 경우 도코사헥산산 또는 DHA)의 축적을 촉진하기 위하여, 국제 공개 제01/54510호에서는 세포 성장과 다중불포화 지방산의 생성을 구분할 것이 권고되어 있다.
더욱 특히, 미생물 지질의 생성 방법이 청구되며, 이 방법은
(a) 미생물, 탄소원 및 제한 영양소 공급원을 포함하는 배지의 발효를 실시하고, 상기 발효 배지에서 대략 4% 이상의 포화도의 용존 산소 함량을 유지하기에 충분한 조건을 보장하여 바이오매스를 증가시키는 단계;
(b) 그 후 상기 발효 배지 중 대략 1% 이하의 포화도의 용존 산소 함량을 유지하기에 충분한 조건을 제공하고, 상기 미생물이 상기 지질을 생성하도록 하기에 충분한 조건을 제공하는 단계; 및
(c) 15% 이상이 다중불포화 지질로 이루어진 상기 미생물 지질을 수집하는 단계로 이루어진 단계를 포함하고,
여기서, 대략 100 g/ℓ 이상의 바이오매스 밀도가 발효 과정에 걸쳐 수득된다.
미세조류 쉬조키트리움 sp ., ATCC 20888 주에서, 제1 성장기는 더욱 특히는, 고 세포 밀도의 수득을 촉진하도록 탄소원 및 질소원의 존재 하에 그러나 산소를 제한하지 않고서 실시되며, 그 후, 제2 시기에서, 질소의 공급을 중단하고, 산소의 공급을 서서히 늦추어서 (용존 산소 압력 또는 pO2를 10%로부터 4%까지, 그 후 0.5%까지 되도록 관리), 미세조류에게 스트레스를 주고, 그의 성장을 늦추고, 관심 대상의 지방산의 생성을 트리거링한다(trigger).
미세조류 크립테코디늄 코흐니이(Crypthecodinium cohnii)에서, 더 높은 DHA 함량이 저 글루코스 농도 (대략 5 g/ℓ)에서, 그리고 그에 따라 저 성장 속도에서 수득된다 (문헌[Jiang and Chen, 2000, Process Biochem., 35(10), 1205-1209]).
그 결과, 생성물의 형성이 고 세포 성장성과 상관되지 않는 경우, 세포 성장 속도를 제어하는 것이 현명하다는 것이 교시되어 있다.
일반적으로, 당업자라면 발효 조건 (온도, pH)의 제어에 의해 또는 발효 배지에의 영양 성분의 조절 공급에 의해 ("유가식"으로 지칭되는 반연속식 조건) 미세조류의 성장을 제어하는 것을 선택한다.
당업자가 탄소원의 공급원을 통하여 종속 영양 상태에서 미세조류의 성장을 제어하는 것을 선택할 경우, 일반적으로 당업자라면 생성되는 대사 산물 (예를 들어, DHA 유형의 다중불포화 지방산)의 함수로서 탄소원 (순수 글루코스, 아세테이트, 에탄올 등)을 미세조류 (씨. 코흐니이, 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) 등)에 맞추는 것을 선택한다.
또한 온도가 핵심 파라미터일 수 있다. 예를 들어, 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima)에 의한 EPA와 같이 미세조류의 일부 종에서 불포화 지방산의 합성이 상기 미세조류의 최적 성장에 요구되는 것보다 더 낮은 온도에서 촉진됨이 보고되었다.
트리글리세라이드의 생성을 최적화하기 위하여, 당업자는 또한 발효 배지의 영양 환경에 작용함으로써 탄소 흐름을 오일 생성 쪽으로 최적화하게 하였다.
따라서, 충분한 탄소원이 있지만 질소 결핍의 조건 하에 있을 때 오일이 축적된다는 것이 공지되어 있다.
따라서, C/N 비는 여기서 결정 요인이며, 최상의 결과는 질소 함량에 직접적으로 작용함으로써 수득됨이 인정되며, 이때 글루코스 함량은 제한 요인이 아니다.
따라서, 오일 생성을 최적화하기 위하여, 당업자라면 탄소 흐름을 오일 생성 쪽으로 옮겨서 단백질 생성을 손상시키는 쪽으로 탄소 흐름을 제어하는 것이 필수적이며; 탄소 흐름은 미세조류가 질소-결핍 배지 중에 두어질 때 지질 축적 물질로서 재분배되어 축적된다.
이 모든 것 외에, DHA 및 팔미트산이 풍부한 미세조류 바이오매스의 상업적 제제가 표준 발효 조건의 구현에 의해 입수가능하다.
그러나, 고 DHA 함량 및 제어된 팔미트산 및/또는 팔미톨레산 함량을 갖는 양질의 미세조류 바이오매스를 생성하는 대안적인 방법에 대한 만족되지 않은 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명은 도코사헥산산(DHA)이 강화된 트라우스토키트리움 속의 미세조류의 바이오매스의 생성 방법에 관한 것으로서, 이는 종속 영양 조건 하에서의 배양기 동안 1) 세포 유지에 필요한 에너지 생성을 위한, 2) 베이스(base) 지질 생성을 위한, 그리고 3) 지방산 외의 바이오매스의 성장을 위한 산소 요구량만을 충족시키도록 산소의 공급량을 제어하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 방법은 1), 2) 및 3)의 요구량만을 충족시키는 데 필요한 산소의 공급량을 하기 등식 2에 의해 계산하는 것을 특징으로 한다:
[등식 2]
여기서,
qO2표적은 지방산 외의 바이오매스 1 g당 그리고 시간당 그램 단위의 산소의 양이며;
qm은 지방산 외의 바이오매스 1 g당 그리고 시간당 글루코스의 g 단위로 표현되는 유지 계수이고;
q베이스 지질은 지방산 외의 바이오매스 1 g당 그리고 시간당 베이스 지질의 g 단위로 표현되는 베이스 지질의 축적률이며;
yO2/지질은 지질 1 g당 산소의 g 단위로 표현되는 지질 형성에 대한 산소 소비 계수이고;
μ는 지방 외의 바이오매스 1 g당 그리고 시간당 (또는 (h-1)) 지방산 외의 형성된 바이오매스의 g 단위로 표현되는 성장 속도이며;
yO2/x는 지방산 외의 바이오매스 1 g당 산소의 g 단위로 표현되는 지방산 외의 바이오매스 형성에 대한 산소 소비 계수이다.
임의로, 발효 방법 동안 영양소, 특히 탄소 또는 질소 공급원이 제한되지 않는다.
임의로, 성장기 및 DHA 생성기는 동시적이다.
바람직하게는, 미세조류는 쉬조키트리움 속 sp 또는 쉬조키트리움 망그로베이이다. 더 구체적으로, 미세조류는 각각 2011년 4월 14일 및 2012년 11월 22일자로 엥스튀티에 파스퇴르(Institut Pasteur)의 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)에 기탁된 CNCM I-4469 주(strain) 및 CNCM I-4702 주로부터 선택되는 주일 수 있다.
임의로, 본 방법은 바이오매스를 수확하는 단계, 임의로, 세포 추출물 또는 용해물(lysate)을 이 바이오매스로부터 제조하는 단계, 그 후, 임의로, DHA-풍부 조 오일을 추출하는 단계를 또한 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 수득된 바이오매스가 하기를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
- 전체 지방산의 중량을 기준으로 40% 이상의 DHA; 및/또는
- 전체 지방산의 중량을 기준으로 40% 이하의 팔미트산; 및/또는
- 바이오매스의 건조 중량을 기준으로 25% 이상의 지방산.
본 발명의 맥락 내에서, 본 출원인은 당업자에 의해 통상적으로 구상되는 것에 대한 대안적인 해법을 제안함으로써 DHA 생성을 최적화하기 위한 독창적인 경로를 찾아서 조사해 왔다.
이와 같이, 본 출원인은, 본 기술 분야에서의 기술적 예상을 거슬러서, 팔미트산 및 팔미톨레산의 양을 조정하거나 제어하면서
- 미세조류 성장기를 지질 생성기와 분리시킬 필요 없이 (이와는 대조적으로, 지질 생성은 세포 성장과 동시적이며, 따라서 단일 시기에서 실시됨),
- 종래 기술에 기술된 바와 같이, 질소 제한 또는 임의의 다른 영양소의 제한을 유도하는 것이 필수 불가결하지 않고서, 및
- 또한, pO2를 통하여 발효를 제어하는 것이 필수 불가결하지 않고서
발효에 의해 지질-풍부 (바이오매스의 건조 중량을 기준으로 45% 초과) 미세조류 바이오매스 (이의 주된 지방산은 도코사헥산산(DHA)임)를 생성하는 것이 가능함을 밝혀 냈다.
이와 같이 본 출원인은 발효 배지의 산소화의 제어에 의해 바이오매스의 지질 조성, 특히 DHA와 팔미트산 및 팔미톨레산의 비율을 제어하는 것이 가능함을 밝혀 냈다.
실제, 본 출원인은 하기의 우선하는 것에 따라 산소가 미세조류에 의해 사용됨을 알게 되었다:
- 유지를 위한 에너지 생성,
- DHA가 우세한, 베이스 지질로 칭해지는 지방산의 어레이(array)의 생성,
- 지방산 외의 바이오매스의 성장, 및
- 과잉 산소를 이용한 팔미트산의 생성.
환언하면, 본 발명에 따른 방법은 처음의 3가지 사항에 상응하는 산소 요구량을 충족시키는 것 및 그에 따라 DHA-풍부 바이오매스를 (이것이 쉬조키트리움 sp에 의해 생성되든지 에스. 망그로베이에 의해 생성되든지 간에) 수득하기에 최적인 양의 산소를 제공하는 것으로 이루어진다.
다음, 하기 실험 섹션(section)에서 입증되는 바와 같이, 추가의 산소가 공급되어 팔미톨레산이 있거나 없이 (쉬조키트리움 sp에 의해 잘 예시됨), 팔미트산의 빠른 과다 생성을 초래할 수 있다 (에스. 망그로베이에 의해 잘 예시됨).
본 출원인은 쉬조키트리움 sp 주 ATCC 2088을 기반으로 하여 일을 시작하였다.
종래 기술의 교시에 따라, 특히 국제 공개 제01/54510호의 것에 따라, 본 출원인은 우선, 개시된 것과는 대조적으로, 전체 발효 지속 시간에 대하여 pO2를 0%가 되도록 또는 10% 초과가 되도록 일정하게 조절하면 pO2의 순차적 감소 (10%, 그 후 4%, 그 후 0.5%의 포화도)에 의한 관리된 작업에서처럼, 지방산 중 35% 초과의 PUFA (전체 지방산에 대하여 25% 초과의 DHA)를 생성하는 것이 가능해짐을 밝혀 냈다.
반면에, 후자의 작업 주 CNCM I-4702에 적용된 후자의 작업 (국제 공개 제01/54510호에 따름)은 최종적으로, 팔미트산이 60% 초과로 고도로 우세하고 반면에 DHA는 20%에 도달하지 않는 지방산의 생성을 초래하며; 이러한 작업은 10%의 일정한 pO2에서의 작업에 의해 이 주에 대하여 수득되는 것과 동일한 결과를 제공한다.
게다가, 기술적 관점에서, pO2의 측정은 프로토콜이 실험실 규모로부터 산업적 규모로 증대될 때 (환언하면, 1 내지 20 ℓ 발효기에서 1 내지 200 m3 반응기까지 증대) 큰 문제를 제기한다.
실제로, pO2는 포화 상태의 발효 머스트(must) 중에 용해된 상대적인 산소 농도로서 정의된다. 예를 들어, 물이 실온 및 대기압에서 공기 중에서 충분히 오랫 동안 통기될 경우, pO2는 100% (이는 t=0에서 발효기의 산소화 상태에 상응함)인 것으로 간주된다. 실제, pO2 탐침자가 발효기에서 보정될 때, 용존 산소 함량은 잔류 염의 농도에 의해 그리고 발효 온도에 의해 영향을 받는다.
게다가, 실험실용 발효기에 있어서, pO2는 단지 발효 머스트의 높이에 의해 생성되는 압력에 의해 그리고 혼합 효과에 의해 영향을 받음이 통상적으로 인정된다. 그러나, 이와는 대조적으로, (대략 1 m3의) 배지의 발효기에서 (대략 수 백 m3의) 대용량까지의 발효기에서의 산업화 동안, 발효 머스트의 높이는
- 용존 산소 압력에 영향을 주고;
- "완벽하게 교반되는 것이 아닌" 발효기에서 복합적인 현상을 야기한다.
따라서, 이런 의미에서, 실험실 규모로 확립된 pO2 값이 산업적 규모까지는 외삽될 수 없다.
게다가, 쉬조키트리움 sp에 대하여 기술된 국제 공개 제01/54510호의 권고는 트라우스토키트리움 속의 모든 주에 대하여 일반화가능한 것으로 보이지 않으며, 환언하면, 본 발명에서, 미세조류가 그의 저장 지질 (이 경우 DHA)을 생성하게 하기 위하여 미세조류에게 "스트레스를 주도록" 하는 산소 공급량의 감소는 없으며, 오히려, pO2를 참조하지 않고서 미세조류의 지질 생성의 방향을 조정하기 위하여 상기 미세조류에 의해 표현되는 요구량의 정도까지 산소 공급량의 제어가 있다.
게다가, 산소 공급량을 제어함으로써 발효를 가동시키는 선택은, 일부 영양 물질의 공급을 제한하는 것 또는 성장기와 생성기를 분리하는 것이 유용하지 않고서도 본 출원인이 하기의 주목할 만한 결과를 수득하도록 하였다:
- 관심 대상의 지질, 특히 DHA의 전체 함량의 증가, 및
- 냄새의 감소 (특히, CNCM I-4469의 수확된 바이오매스의 강렬한 냄새의 감소가 주목할 만함).
미생물의 선택
본 발명의 방법에서 사용될 주는 트라우스토키트리움 속의 것, 더욱 특히는 쉬조키트리움 sp 또는 쉬조키트리움 망그로베이이다. 그러한 주는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 국제 공개 제01/54510호에 기술되어 있고 연구된 쉬조키트리움 sp 주 ATCC 번호 20888이 언급될 수 있다.
그의 연구 과정에서, 출원인은 DHA를 생성하는 큰 관심 대상의 몇몇 미세조류 주를 확인하였다. 특별히 출원인은 그가 확인한 두 주에 꽤 특히 관심이 있다.
제1 주는 프랑스에서 2011년 4월 14일자로 엥스튀티에 파스퇴르의 CNCM에 번호 I-4469로 기탁되고 또한 중국 P.R. 우한 430072 소재의 유니버시티 오브 우한(University of Wuhan)의 CCTCC(CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE COLLECTION)에 번호 M 209118로 기탁된 쉬조키트리움 sp .의 주이다. 이 주는 주로 DHA를 생성하며, 더 적은 정도로 팔미트산 및 팔미톨레산을 생성한다. 이것은 18 S RNA를 코딩하는 유전자의 부분 서열결정에 의해 특성화되었으며 (서열 번호 1), 이는 이것을 쉬조키트리움 sp 타입의 주인 것으로 확인하는 것을 가능하게 하였다:
이 주는 후속적으로 본 출원에서 "CNCM I-4469"로 표시된다.
게다가, 제2 주는 쉬조키트리움 망그로베이의 주이다. 이것은 DHA와 팔미트산을 상대적으로 동일한 비율로 생성한다. 이것은 본 출원인에 의해 프랑스에서 2012년 11월 22일자로 엥스튀티에 파스퇴르의 CNCM에 번호 CNCM I-4702로 기탁되었다. 이것은 18 S rRNA를 코딩하는 유전자의 서열결정에 의해 특성화되었으며 (서열 번호 2), 이는 이것을 쉬조키트리움 망그로베이 타입의 주인 것으로 확인하는 것을 가능하게 하였다:
이 주는 후속적으로 본 출원에서 "CNCM I-4702"로 표시된다.
필요한 산소의 양, 특히 qO2의 결정 및 사용
배양 배지 내로 도입되는 전체 산소 유량은 조정가능하며, 본질적으로 하기에 의존한다:
- 도입되는 공기의 유량,
- 배지 중 산소의 용해를 촉진하는 교반 속도.
이러한 유량은 OTR(산소 전달 속도(Oxygen Transfer Rate))로서 칭해진다.
배양에 의한 산소의 소비량은 OUR(산소 흡수 속도(Oxygen Uptake Rate))로 칭해진다.
바이오매스가 발효기에서 성장할 때, 그의 전체 산소 소비량은 모든 전달된 산소가 흡수될 때까지 증가하며; 그러면 OUR은 OTR과 동일한 것으로 간주된다.
OTR 및 OUR은 배양 배지 전체에 대한 데이터이다. 따라서, 배양 체적에 대한 OUR은 이 체적을 점유하는 세포의 양에 대한 것일 수 있다.
따라서, 세포의 소비량은 qO2로 칭해지며, 세포 1 g당, 그리고 시간당 흡수되는 그램 단위의 O2의 양을 나타낸다. 그 후 이러한 소비량은 그대로의 세포의 질량에 대하여, 즉, 지방산의 질량 없이 계산되며, 그 이유는 지질 축적이 산소 흡수에서 능동적인 역할을 갖지 않기 때문이다.
배양 배지로의 산소의 제어된 공급에 의해, 본 발명의 방법은 지질 생성에 영향을 주고 이것을 미세조류 성장 조건 (접종 크기, 배양령 등)의 함수로서 최적화하는 것이 가능해지게 한다.
전체 O2 소비량은 세포에 의한 산소의 다양한 사용의 합계에 상응한다. 본 출원인에 의해 4가지의 산소 소비 경로가 구별되며, 이는 세포의 근본적인 요구량에 상응하는데, 상기 요구량은 그 산소 공급의 정도까지 우선하는 것의 순서에 따라 연속적으로 충족된다.
이러한 요구량은 우선하는 것의 순서로, 하기이다:
1. 세포 유지.
2. 베이스 지질 생성.
3. 지방산 외의 바이오매스의 형성.
4. 대사 과잉과 연관된 지질 축적.
따라서, 본 출원인은 qO2가 하기 식에 의해 결정됨을 알아냈다:
[등식 1]
상기 등식의 "qm", "q베이스 지질", "yo2/지질", "μ", "yo2/x", 및 "q과도한 지질"이라는 항목은 하기와 같이 이해되어야 한다.
세포 유지. 상기 등식의 항목 (1)
세포 유지는 임의의 지질 생성 또는 바이오매스 성장과는 관계 없이, 세포의 유지를 위하여 세포에 의해 요구되는 에너지에 상응한다.
"qm"은 이 에너지를 생성하는 데 사용되는 탄소계 기질 (일반적으로 글루코스)의 양이며, 이것은 지방산 외의 바이오매스 1 g당 그리고 시간당 글루코스의 g 단위로 표현된다. 이 항목은 통상적으로 이 분야에서 "유지 에너지" 또는 유지 계수)로 표시된다.
연관된 산소 요구량은 비례한다. 실제로, 1개의 글루코스 분자 (몰질량: 180 g)를 전환시키기 위하여 6개의 O2 분자 (몰질량: 32 g)가 필요하다 (따라서 등식 (1)에서 "
"이라는 항목).
베이스 지질 생성. 상기 등식의 항목 (2)
본 출원인은 지질 축적이 성장과 동시적이며, 단지 후자가 중단될 때 나타나는 현상이 아님을 관찰하였다. 지질 축적은, 비록 단지 세포막 형성을 위한 것일지라도, 성장의 전조 현상(precursor)이다.
이러한 베이스 지질의 조성은 주의 함수로서 상이하며, 특히, DHA 생합성 전구체로서 팔미트산 또는 팔미톨레산을 포함하지만, DHA가 항상 주된 구성 성분인데, 이의 정량화는 실시예 2에 의해 예시된다.
이러한 지질의 축적률은 등식 (1)에서 "q베이스 지질"로 칭해지는 유량에 상응한다.
쉬조키트리움 sp 주 CNCM I-4469 및 쉬조키트리움 망그로베이 주 CNCM I-4702에 있어서, 이러한 축적률은 하기 실시예에 의해 예시된다.
연관된 산소 요구량을 얻기 위하여, 이러한 유량 또는 축적률에, 등식 (1)에서 "yo2/지질"로 표현되는, 지질 형성을 위한 산소 요구량 (지질 형성에 대한 산소 소비 계수로도 칭해짐)을 곱한다.
따라서, 산소 공급량은 베이스 지질 생성량을 위하여 두 번째로 사용된다.
지방산 외의 바이오매스의 형성. 상기 등식의 항목 (3)
전체 바이오매스는 지질 저장체를 포함한다.
후자 (지방산으로 이루어짐)는 분석에 의해 결정되며, 전체 바이오매스로부터 차감된다.
지방산 외의 ("F.A" 외의) 바이오매스의 형성은 단백질이 풍부하고 따라서 진정으로 활성을 갖는 바이오매스의 성장에 상응한다.
성장 속도는 등식 (1)에서 "μ"로 상징되며, 이는 (F.A 외의) 바이오매스 1 g당 그리고 시간당 또는 (h-1) 형성되는 g 단위의 (F.A 외의) 바이오매스를 나타낸다.
연관된 산소 요구량을 얻기 위하여, 이 성장 속도(μ)에, 등식 (1)에서의 "yO2/X"의 항목으로 표현되는, F.A 외의 바이오매스를 형성하기 위한 산소 요구량을 곱한다.
따라서, 산소 공급량은 지방산 외의 바이오매스의 생성량에 세 번째로 사용된다.
지방산 외의 바이오매스의 농도의 계산
본 발명의 방법에 따르면 영양소의 제한은 없기 때문에 성장은 계속된다. 그러나, 성장 속도의 지체가 관찰되며, 이는 배지의 고갈과는 관계가 없다.
F.A 외의 바이오매스의 농도는 초기 바이오매스 농도에 따라 다르며 이의 성장 속도에 따라 증가한다.
계산을 이용하여 각각의 경우에 바이오매스 농도를 예측하기 위하여 그리고 성장 속도 값을 추산하기 위하여, 본 출원인은 하기 등식 (3)을 이용하는 것을 권고한다.
[등식 3]
이 등식은 성장 속도의 관찰된 그리고 설명되지 않는 감소를 예시한다.
"μ"는 성장 속도 (h-1 단위로 표현됨) X F.A 외의 세포 농도 (g/ℓ 단위로 표현됨)를 나타낸다.
상기 파라미터는 2가지의 바람직한 주에 있어서 상이하며, 표 I에 재생되어 있다.
[표 I]
이 현상은 qO2를 또한 감소시키며, 그 이유는 성장 속도(μ)가 산소 소비량에 기여하기 때문이다 (등식 1).
바이오매스 농도는 도입된 그리고 공지된 (접종물) 바이오매스의 양 및 변화하는 이의 성장 속도로부터 계산된다.
대사 과잉과 연관된 지질의 축적. 상기 등식의 항목 (4)
본 출원인은 후자의 유량이 단지 일단 상기 요구량이 충족되었고 필요한 산소가 공급되면 존재한다는 것을 결정하였다.
등식 (1)에서 "q과도한 지질" x "yo2/지질"이라는 항목에 의해 표현되는 이러한 산소 공급량은 글루코스의 소비 속도의 증가를 야기하는데, 이는 지방산 유량으로 환산된다. 이러한 추가의 산소 공급량은 과도한 지질의 생성을 제어하도록 조정될 수 있다.
실시예 1에 예시된 바와 같이 지방산 생성의 이러한 가속화는 대사 과잉을 야기하며, 트라우스토키트리움의 경우 팔미트산의 축적을 초래하고 쉬조키트리움 sp의 경우 팔미트산 및 팔미톨레산의 축적을 초래한다. 이러한 이론에 구애됨이 없이, 본 출원인은 이러한 과잉이 대사 경로의 하류의 효소가 동일한 속도로 계속하여 작용하고 반면에 대사 경로의 시작에서의 효소는 그 활성을 높인다는 사실과 연관된다고 간주한다.
F.A 및 F.A 외의 바이오매스를 형성하기 위한 O2 요구량의 계산
O2 전환 수율은 F.A 외의 바이오매스 또는 지질의 생성의 함수로서의 O2 소비량을 알아 내는 것을 가능하게 한다.
전환 수율은 당업자에게 잘 알려진 파라미터이며, 따라서 당업자라면 일상적인 실험에 의해 상기 파라미터를 결정할 수 있다.
이러한 값은 표 II에 주어져 있으며, 상기 2가지의 바람직한 주에 특이적이다.
[표 II]
DHA-풍부 바이오매스의 수득 - 표적 qO2의 계산
DHA 함량을 증가시키기 위하여, 본 출원인은 단지 첫 번째의 3회의 산소 사용량 (유지, 베이스 지질 생성 및 F.A 외의 바이오매스의 성장)을 충족시키도록 산소 공급량을 제어하는 것이 적합하다는 것을 확립하였다. 이러한 공급량은 표적 qO2의 결정에 의해 정의될 수 있는데, 이는 세포 1 g당 그리고 시간당 그램 단위의 필요한 O2의 양에 상응한다.
따라서, 표적 qO2는 하기 등식 (2)에 의해 정의되는데, 이는 단지 등식 (1)의 첫 번째의 3개의 성분을 포함한다.
[등식 2]
다음, 이러한 세포의 O2 소비 속도는 이것에 F.A 외의 바이오매스의 농도를 곱함으로써 발효기용으로 증대되는데, 이는 각각의 경우에 있어서 계산에 의해 예측되거나 측정될 수 있다. 이 속도는 OUR에 상응한다.
조건이, OTR이 OUR에 상응하도록 하는 것일 경우, 그에 따라 발효 방법 동안 각각의 경우에 적용되는 것은 이 OTR일 것이다.
본 출원인은 표적 산소화의 이러한 제어를 존중함으로써 DHA-풍부 바이오매스가 수득됨을 알아냈다. 표적보다 더 큰 산소화는 더 많은 팔미트산 및/또는 팔미톨레산의 생성을 초래하며, 따라서 DHA의 희석을 초래한다. 표적 산소화 수준보다 더 적은 산소화는 생성되는 바이오매스의 양을 제한한다.
표적 qO2는 배양의 진전에 의해 달라지기 때문에, 하기 실시예에서, 관찰된 최대 OUR을 참조한다. 실시예 1 및 실시예 2는 쉬조키트리움 sp 주 CNCM I-4469 및 쉬조키트리움 망그로베이 주 CNCM I-4702에 대한 산소화 제어의 영향 및 비생산속도(specific production rate)를 수득하는 방법을 예시한다. 실시예 3은 쉬조키트리움 망그로베이 주 CNCM I-4702에 있어서, 산소화의 변화가 바이오매스의 팔미트산 및 DHA의 비율을 변경시키는 것을 가능하게 하는 작업의 효과를 예시한다.
대안적인 실시 양태에서, 처음 3가지의 요구량, 즉, 요구량 (1), (2) 및 (3)을 충족시키는 데 필요한 산소 공급량은 또한 경험적으로 결정될 수 있다. 실시예 3에 예시된 바와 같이, 당업자라면 일련의 OTR을 이용하고 지질 및 바이오매스의 양을 측정하는 다양한 발효 방법을 실시할 수 있다. 이러한 결과를 기반으로 하여, 당업자라면 처음 3가지의 요구량을 충족시키는 것을 가능하게 하는 표적 OTR을 정의할 수 있다.
본 발명에 따른 발효 방법은 지방산이 풍부한 바이오매스를 수득하는 것을 가능하게 한다. 특히, 바이오매스는 바이오매스의 건조 중량을 기준으로 25% 이상, 바람직하게는 30% 이상의 지방산을 포함한다. 지방산 함량은 사용되는 주에 따라 달라질 수 있으며, 주 I-4702의 경우 바이오매스의 건조 중량을 기준으로 최소 40%에 도달할 수 있다.
게다가, 그리고 꽤 흥미롭게도, 이러한 지질-풍부 바이오매스는 높은 DHA 함량을 갖는다. 특히, 본 발명에 따른 발효 방법은 전체 지방산에 대하여 40 중량% 이상의 DHA를 포함하는 바이오매스를 수득하는 것을 가능하게 한다.
마지막으로, 본 발명에 따른 발효 방법은 팔미트산 함량이 감소된 바이오매스를 수득하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 바이오매스는 전체 지방산에 대하여 40 중량% 이하의 DHA를 포함한다. 팔미트산 함량은 사용되는 주에 따라 달라질 수 있으며, 주 I-4469의 경우 전체 지방산에 대하여 최대 10 중량%에 도달할 수 있다.
게다가, 본 발명은 또한 산소 공급량이 처음 3가지 요구량, 즉, 요구량 (1), (2) 및 (3)을 충족시키는 데 필요한 것보다 더 많은 발효 방법을 고려한다. 특히, 이러한 공급량은 생성되는 바이오매스의 양을 최적화하면서 DHA 및 팔미트산 및/또는 팔미톨레산의 요망되는 상대적인 비율을 수득하도록 제어된다.
게다가, 본 발명에 따른 발효 방법은 종속 영양 배양 조건 하에서 실시된다. 고려 중인 미세조류에 맞추어진 이러한 조건과, 또한 배양 배지는 당업자에게 잘 알려져 있다. 미세조류의 성장에 필요한 탄소원은 바람직하게는 글루코스이다. 질소원은 별도로 또는 조합되어 사용되는, 효모 추출물, 우레아, 글루탐산나트륨, 황산암모늄, 수성 암모니아 (pH가 조절됨)일 수 있다. 일반적으로, 배양 단계는 주를 소생시키는 전배양 단계, 그 후 적당한 배양 또는 발효 단계를 포함한다. 후자의 단계는 관심 대상의 지질, 특히 DHA의 생성 단계에 상응한다.
바이오매스 외에, 본 발명은 또한 이러한 바이오매스로부터 제조된 세포 추출물 또는 용해물에 관한 것이다. 특히, 이러한 추출물 또는 용해물은 발효 후 회수된 바이오매스로부터 제조된다. 이러한 추출물 또는 용해물은 DHA 및 임의로 팔미트산 및/또는 팔미톨레산이 풍부하다. 세포는 기계적, 화학적 및 효소적 경로를 포함하는 다양한 경로에 의해 지질 내용물을 추출하도록 파열될 수 있다.
후속적으로, 오일이 예를 들어 몇몇 연속적인 추출에서 헥산/에탄올에 의해 세포 용해물로부터 추출될 수 있다. 헥산 분획물을 후속적으로 분리하고, 그 후 헥산을 증발시켜 조 오일을 단리한다.
따라서, 관심 대상의 지질, 바람직하게는 DHA, 및 임의로 팔미트산 및/또는 팔미톨레산의 생성 방법은 본 발명에 따른 발효 방법, 바이오매스의 수확, 세포 추출물 또는 용해물의 제조 및 관심 대상의 지질, 바람직하게는 DHA, 및 임의로 팔미트산 및/또는 팔미톨레산을 포함하는 조 오일의 추출을 포함한다.
실시예
실시예 1: 주 CNCM I-4469 및 CNCM I-4702의 배양 조건 및 산소화 과잉에서의 비생산속도의 결정
배양 조건
프로토콜은 주 CNCM I-4469의 경우 0.1 g의 바이오매스/ℓ로 그리고 주 CNCM I-4702의 경우 5 g 이상의 바이오매스/ℓ로 발효기에 접종하기 위하여 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에서 전배양하는 것을 포함한다.
전배양
500 ml의 배플드(baffled) 삼각 플라스크에서의 전배양 (100 ml의 배지)은 28℃의 온도에서 24시간 동안 지속된다.
배지의 모든 성분을 함께 여과에 의해 살균하고, 클리어롤(Clearol) FBA 3107 소포제 드롭의 첨가 후 오토클레이브에서 사전에 살균한 삼각 플라스크 내에 도입한다.
[표 III]
배양
배지를 3개의 부분으로 살균한다.
글루코스를 T0 직전에 첨가를 위하여 삼각 플라스크에서 KH2PO4와 함께 살균한다.
나머지의 염을 발효기에서 0.05 ml/ℓ의 클리어롤 FBA 3107과 함께 살균한다. 미량 원소 및 비타민을 여과에 의해 살균한다.
T0에서의 체적은 최종 체적의 75%를 나타낸다. pH를 수성 암모니아를 이용하여 T0에서 조정하고, 그 후 이것을 여전히 수성 암모니아를 이용하여 6으로 조절한다.
[표 IV]
유가식의 글루코스 (농도: 공급물 1 ℓ당 500 g)를 마지막에 20 g/ℓ 및 5 g/ℓ보다 더 낮은 농도로 되지 않도록 (계산에 따라 맞추어지도록) 일정한 속도로 T0에서 출발하여 계속 공급한다.
배양을 28℃의 온도에서 65 내지 85시간의 지속 시간 동안 실시한다.
질소원으로서 옥수수 침지액(corn steep liquor; CSL) 또는 효모 추출물(yeast extract; YE)의 사용이 가능하며, 이는 약간 더 높은 DHA의 결과의 수득을 가능하게 한다.
스톡 용액
[표 V]
[표 VI]
비생산속도의 결정
비생산속도를 평가하기 위하여, 제1 배양을 10%의 pO2에서 실시하였는데, 이는 배지 중에 용해된 산소가 항상 있음을 의미한다. 이러한 배양을 영양 공급원의 제한 없이 실시하였다.
이러한 방법은 산소 과잉에서, 테스트할 주의 특성을 입증하는 것을 가능하게 한다 (도 1).
표 VII에서, 주어진 결과는 2가지의 주 CNCM I-4469 및 CNCM I-4702의 바이오매스의 배양의 T65에서 수득된 것이다.
[표 VII]
DHA 및 팔미트산 (특히 팔미톨레산) 이외의 다양한 지방산을 "기타 지방산"이라는 표제 하에 포함시켜서 DHA 및 팔미트산에 대한 영향을 입증하지만, 이는 표적 qO2의 계산에 있어서 DHA와 함께 베이스 지질에 포함된다.
평균 속도의 계산을 포괄적으로 실시한다.
최종 바이오매스를 가스 크로마토그래피(GC)에 의해 분석한다. 그러면 전체 바이오매스 농도, 지방산 각각의 함량 및 지방산의 전체 함량이 알려진다.
활성 바이오매스로도 칭해지는, 지방산 외의 바이오매스를, 전체 바이오매스로부터의 이러한 지방산의 차감에 의해 계산한다.
그 후, 생성된 지방산 각각의 양을 존재하는 F.A 외의 바이오매스의 평균으로 그리고 시간으로 나눈다. 수득된 결과는 단위 시간당 그리고 F.A 외의 바이오매스 1 g당 전체 비생산속도이다.
이러한 속도는 하기 표 VII에 주어져 있다.
[표 VIII]
실시예 2: 제어된 산소 공급량을 이용한 주 CNCM I-4469 및 CNCM I-4702의 배양
산소 공급량을 제어하는 것을 제외하고는 동일한 배양 조건을 이용하였다.
본 방법은 10%에서 배양하는 동안 절반의 관찰 전달 값(OUR)을 이용하는 것으로 이루어진다 (여기서, 50 mmol/ℓ/h, 그래프 1 (즉, 25 mml/ℓ/h) 참조) (도 2).
게다가, 20 ℓ 발효기에 있어서, 산소화 요구량과 관계 없이 발효기의 적당한 작업을 존중하기 위하여, 대략 150 rpm의 최소 교반을 처음 10 내지 15시간의 배양 동안 t0에서 고정시킨다.
표 IX에서, 주어진 결과는 제어된 O2 공급의 조건 하에서의 2가지의 주 CNCM I-4469 및 CNCM I-4702의 바이오매스의 배양의 T65에서 수득된 것이다.
[표 IX]
평균 속도를 실시예 1에 나타낸 바와 같이 포괄적으로 계산한다. 결과는 표 X에 주어져 있다.
[표 X]
산소 과잉 조건에서의 (표 VIII로부터의 값) 그리고 제어된 산소 조건에서의 전체 비생산속도의 비교에 의하면, 하기가 관찰된다:
- 상기 산소 공급은 팔미트산의 생산 속도를 감소시키는 것을 가능하게 하였으며,
- 팔미트산의 생산 속도는 주 CNCM I-4469의 경우 9만큼 감소하고 주 CNCM I-4702의 경우 3만큼 감소하였다.
이러한 결과는 바이오매스 또는 DHA 생성 속도가 변하지 않은 채로 있음에도 불구하고 수득된다.
따라서, 대사 과잉의 맥락에서의 지질 생성은 방지된다.
이러한 방법에 의해 평가된 속도는 표적 qO2의 계산을 위한 기반으로서의 역할을 한다.
등식 1 및 2를 이용한 qO2의 계산
표 X에서의 지질 생성 속도는 여기서 베이스 지질의 일정한 유량 (등식 1 및 2에서 q베이스 지질)을 나타내는데, DHA는 이의 주된 구성 성분이지만, 이는 소량의 팔미트산을 또한 함유한다.
대사 과잉에 있어서의 유량은 표 VIII로부터의 속도와 표 X의 것 사이의 추가의 유량에 상응한다.
qm은 비-스트레스 배양 조건 하에서 무시가능하며; 0.006 g/g/h가 유지된다.
성장 속도는 바이오매스 농도가 증가함에 따라 감소하며; 최대 성장 속도는 5 g/ℓ로 접종할 경우 CNCM I-4702의 경우 4 g/ℓ 이하, 그리고 CNCM I-4469의 경우 7 g/ℓ 이하의, 지질 외의 바이오매스로 유지될 수 있다.
바이오매스 농도를 고려함으로써 qO2 (세포 수준에서의 소비량)를 OTR (발효기 수준에서의 공급량에 상응함)까지 증대시킬 수 있다.
μmax에서, 주 CNCM I-4469의 경우에,
등식 2 :
qO2표적x = 0.006 x 1.07 + (0.011 + 0.001 + 0.009) x 0.17 + 0.08 x 0.8 = 0.106 g/g/h
이는 하기에 상응함:
OTR표적 = 0.106 x 7 = 배양물 1 ℓ당 그리고 시간당 0.74 g의 O2
또는
OTR표적 = 0.106 x 7 x 1000 / 32 = 23 mmol (배양물 1 ℓ당 그리고 시간당 O 2 )
μmax에서, 주 CNCM I-4702의 경우에,
등식 2 :
qO2 표적 = 0.006 x 1.07 + (0.02 + 0.018 + 0.07) x 0.17 + 0.17 x 0.8 = 0.218 g/g/h
이는 하기에 상응함:
OTR표적 = 0.218 x 4 = 0.87 (배양물 1 ℓ당 그리고 시간당 O2의 g)
OTR표적 = 0.218 x 4 x 1000 / 32 = 27. 4 mmol (배양물 1 ℓ당 그리고 시간당 O 2 )
표 X로부터의 데이터를 이용한 이러한 등식의 사용은 배양을 시뮬레이션하고 적용할 OTR표적을 결정하는 것을 가능하게 한다.
후자는 성장 속도가 감소함에 따라 감소하지만, 이는 바이오매스 농도의 증가에 의해 부분적으로 보상된다.
따라서, OTR표적은 지질 외의 바이오매스의 성장 속도가 0에 도달될 때까지 상기에 주어진 것에 가깝게 남아 있다.
실시예 3: 상이한 OTR 조건들을 이용한 발효 작업
테스트를 영양 공급원을 제한하지 않고서 실시예 1 및 실시예 2에서 실시하였으며, 이는 등식 2에 의해 정의된 표적 qO2 (이는 배양물 1 ℓ당 그리고 시간당 27.4 mmol의 O2임; 실시예 2 참조)를 존중함으로써 지질 생성을 제어하는 것을 가능하게 하여 모델을 생성하는 것을 가능하게 한다.
이러한 초기 표적 qO2로부터 변화를 테스트하였다.
여기서 이러한 표적 qO2의 어느 한쪽에서의 변화의 정도는 배양 시작시의 최대 OTR에 의해 예시된다.
25 내지 30의 최대 OTR 값은 산소 공급량의 제어를 위하여 그리고 표적 qO2를 존중하기 위하여 본 발명의 맥락 내에서 정의된 배양 시작시의 최적 OUR에 상응한다.
표 XI는 CNCM I-4702를 이용하여 T65에서 측정한 발효 파라미터를 제공한다.
[표 XI]
따라서, 이러한 결과를 기반으로 하면, 산소가 등식 2에 의해 정의되는 값과 관련하여 과량으로 공급될 때, 과도한 지질, 특히 팔미트산 중 DHA의 희석이 관찰됨을 관찰할 수 있다.
이와는 대조적으로, 산소 공급량이 등식 2에 의해 정의되는 값과 관련하여 최적 미만의 양일 때, 생성되는 DHA의 양은 더 적다.
실시예 4: 제한 질소 결핍을 이용한, 그리고 이를 이용하지 않는 비교예
테스트를 하기를 이용하여 실시하였다:
- 대조구로서, 국제 공개 제01/54510호로 이루어진 종래 기술에서 정의된 조건 하에서 배양한, 즉, 성장기와 생산기가 결합되지 않은 주 CNCM I-4702 (후자는 질소 공급 제한 단계 동안 유도됨). 여기서 처음 세 번째의 배양의 마지막에 수성 암모니아를 이용한 pH 조절을 방해함으로써 이러한 제한을 유도하였다.
단지 주 CNCM I-4702의 거동을 질소 결핍 조건 하에서의 그의 지질 생성과 관련하여 고려하기 위하여, 통기를 순차적인 방식으로 조절하지 않았으며, 오히려 10% 초과의 pO2로 유지하였다;
- 전체 배양 지속 시간 내내 상기 주에 임의의 영양 제한을 가하지 않았으며 또한 pO2를 10%가 되도록 조절한 발효.
결과는 하기와 같다:
[표 XII]
바이오매스의 지방산-풍부도는 영양 제한이 없을 경우 단지 매우 약간 감소한다. 따라서, 본 기술 분야의 기술적 예상과는 대조적으로, 질소원의 제한은 지질 생성의 유도에 필요하지 않다.
실시예 5: 주 ATCC 20888을 이용한 비교예
배양 프로토콜은 국제 공개 제01/54510호의 실시예 4에 기술된 것이다. 사용한 주는 쉬조키트리움 sp ATCC 20888이다.
상기 출원의 교시를 따르며, 이때 하기 2가지 절차를 비교한다:
1. 10% 초과의 영구적인 조절.
2. 0%의 일정한 pO2.
수득된 결과는 하기 표 XIII에 주어져 있다.
[표 XIII]
이와 같이, 종래 기술의 교시, 특히 국제 공개 제01/54510호의 것을 따름으로써, 개시된 것과는 대조적으로, 전체 발효 지속 시간 동안 pO2를 0%가 되도록 또는 10% 초과가 되도록 일정하게 조절하면, pO2의 순차적 감소 (10%, 그 후 4%, 그 후 0.5%의 포화도)를 이용한 관리된 작업과 마찬가지로, 지방산 중 35% 초과의 PUFA를 생성하는 것이 가능해진다는 것이 밝혀졌다.
SEQUENCE LISTING
<110> ROQUETTE FRERES
<120> PROCEDE D'ENRICHISSEMENT EN DHA DE LA BIOMASSE DE MICROALGUES DU
GENRE TRAUSTOCHYTRIUM
<130> B1734PC
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 479
<212> DNA
<213> Schizochytrium sp
<400> 1
gagggtttta cattgctctc attccaatag caagacgcga agcgccccgc attgatattt 60
ctcgtcacta cctcgtggag tccacattgg gtaatttacg cgcctgctgc cttccttgga 120
tgtggtagcc gtctctcagg ctccctctcc ggagtcgagc cctaactccc cgtcacccgt 180
tatagtcacc gtaggccaat accctaccgt cgacaactga tggggcagaa actcaaacga 240
ttcatcgctc cgaaaagcga tctgctcaat tatcatgact caccaagaga gttggcttag 300
acctaataag tgcggccctc cccgaaagtc gggcccgtac agcacgtatt aattccagaa 360
ttactgcagg tatccgtata aaggaactac cgaagggatt ataactgata taatgagccg 420
ttcgcagttt cacagtataa ttcgcttata cttacacatg catggcttag tctttgaga 479
<210> 2
<211> 454
<212> DNA
<213> Schizochytrium mangrovei
<400> 2
ggttttacat tgctctcatt ccgatagcaa aacgcataca cgcttcgcat cgatatttct 60
cgtcctacct cgtggagtcc acagtgggta atttacgcgc ctgctgctat ccttggatat 120
ggtagccgtc tctcaggctc cctctccgga gtcgagccct aactctccgt cacccgttat 180
agtcaccgta gtccaataca ctaccgtcga caactgatgg ggcagaaact caaacgattc 240
atcgaccaaa awagtcaatc tgctcaatta tcatgattca ccaataaaat cggcttcaat 300
ctaataagtg cagccccata cagggctctt acagcatgta ttatttccag aattactgca 360
ggtatccata taaaagaaac taccgaagaa attattactg atataatgag ccgttcgcag 420
tctcacagta caatcgctta tacttacaca gcag 454
Claims (10)
- 도코사헥산산(DHA)이 강화된 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속의 미세조류의 바이오매스(biomass)의 생성 방법으로서, 종속 영양 조건 하에서의 배양기 동안 1) 세포 유지에 필요한 에너지 생성을 위한, 2) 베이스(base) 지질 생성을 위한, 그리고 3) 지방산 외의 바이오매스의 성장을 위한 산소 요구량만을 충족시키도록 산소의 공급량을 제어하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 1), 2) 및 3)의 요구량만을 충족시키는 데 필요한 산소의 공급량을 하기 등식 2에 의해 계산하는 것을 특징으로 하는 방법:
[등식 2]
(여기서,
qO2표적은 지방산 외의 바이오매스 1 g당 그리고 시간당 그램 단위의 산소의 양이며;
qm은 지방산 외의 바이오매스 1 g당 그리고 시간당 글루코스의 g 단위로 표현되는 유지 계수이고;
q베이스 지질은 지방산 외의 바이오매스 1 g당 그리고 시간당 베이스 지질의 g 단위로 표현되는 베이스 지질의 축적률이며;
yO2/지질은 지질 1 g당 산소의 g 단위로 표현되는 지질 형성에 대한 산소 소비 계수이고;
μ는 지방산 외의 바이오매스 1 g당 그리고 시간당 (또는 (h-1)) 지방산 외의 형성된 바이오매스의 g 단위로 표현되는 성장 속도이며;
yO2/x는 지방산 외의 바이오매스 1 g당 산소의 g 단위로 표현되는 지방산 외의 바이오매스 형성에 대한 산소 소비 계수임). - 제1항 또는 제2항에 있어서, 영양소, 특히 탄소원 또는 질소원을 발효 방법 동안 제한하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 성장기와 DHA 생성기가 동시적인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 미세조류는 쉬조키트리움(Schizochytrium) 속 sp 또는 쉬조키트리움 망그로베이(Schizochytrium mangrovei)의 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 미세조류는 각각 2011년 4월 14일 및 2012년 11월 22일자로 엥스튀티에 파스퇴르(Institut Pasteur)의 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)에 기탁된 CNCM I-4469 주 및 CNCM I-4702 주로부터 선택되는 주인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오매스를 수확하는 단계, 임의로, 세포 추출물 또는 용해물(lysate)을 이 바이오매스로부터 제조하는 단계, 그 후, 임의로, DHA-풍부 조 오일을 추출하는 단계를 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 바이오매스는 전체 지방산의 중량을 기준으로 40% 이상의 DHA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 바이오매스는 전체 지방산의 중량을 기준으로 40% 이하의 팔미트산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 바이오매스는 바이오매스의 건조 중량을 기준으로 25% 이상의 지방산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |