KR20160128816A - 지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법 - Google Patents

지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이오디젤의 원료인 지질을 생산하는 미세조류의 배양방법에 관한 것으로서, 미세조류 세포의 성장 속도와 미세조류 세포 내 지질 함량을 모두 증가시킬 수 있는 미세조류의 배양방법을 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 고농도의 질소 농도 조건 및 상기 조건에서의 배양방법과 최적의 유기탄소 첨가 농도 조건 등 미세조류 세포의 성장 속도와 미세조류 세포 내 지질 함량을 모두 증가시킬 수 있는 최적의 배양조건 및 배양방법을 제공함으로써, 바이오디젤 원료인 미세조류의 지질 생산성을 증가시켜 미세조류를 이용한 바이오디젤의 대량 생산을 가능하게 하는 효과가 있다.

Description

지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법{CULTURING METHOD OF MICROALGAE FOR INCREASING LIPID PRODUCTIVITY}
본 발명은 바이오디젤의 원료인 지질을 생산하는 미세조류의 배양방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 미세조류 세포의 성장 속도와 미세조류 세포 내 지질 함량을 모두 향상시켜 지질 생산성을 증가시킬 수 있는 미세조류의 배양방법에 관한 것이다.
석유 고갈에 대한 위기감이 높아지면서 대체에너지에 대한 중요성이 점점 높아지고 있는 현재, 전 세계적으로 대체에너지 개발에 지구적인 노력을 기울이고 있다. 그 중에서도 화석연료를 대체할 수 있는 재생에너지로 바이오 연료(biofuel)가 각광을 받고 있다. 바이오 연료는 식물 및 동물 배설물, 생물성 폐물 등을 활용한 바이오 매스(biomass)로부터 얻은 연료를 의미하는 것으로, 경유와 휘발유를 대체할 수 있는 바이오디젤과 바이오에탄올이 대표적이다.
바이오디젤은 석유 기반인 경유의 대안으로 식물성 기름이나 동물성 지방과 같이 재생 가능한 자원을 바탕으로 제조되는 것을 말하는데, 특별히 광합성 미생물인 미세조류는 모든 바이오디젤 생산 작물 중 오일 생산성이 가장 우수하여 바이오디젤 생산의 원료로 각광 받고 있다.
더욱 구체적으로, 미세조류는 10만 종 이상이 존재하는데 물, 햇빛, 이산화탄소만 공급해주면 광합성을 하며 무제한 증식이 가능한 광합성 생물로 다양한 환경에서 짧은 시간 동안 대량 생산이 가능하고, 이산화탄소를 고정화시킬 수 있으며 또한, 단백질 및 지질 함량이 높으므로 식품, 사료 또는 연료 생산용 바이오매스로 활용될 수 있다.
특히, 미세조류에 함유된 지질 성분은 액체 연료로 사용되는 바이오디젤 생산의 원료로 사용할 수 있다. 즉, 미세조류의 지질 성분 중 트리글리세라이드(triglyceride)와 같은 중성지방을 세포로부터 추출한 후 메탄올과 같은 저분자 알코올과 에스테르교환(trans-esterification) 반응으로 바이오디젤인 지방산 알킬 에스테르로 전환시키는 것이다.
지질 생산성은 (미세조류 세포 성장 속도(g/L/d)) × (세포 건조 중량당 지질 함량(%))으로 산출하는데, 미세조류 바이오매스에는 통상적으로 15~30 %의 지질이 포함되어 있고, 일부 특별한 종에서는 50 % 이상이 포함되어 있다. 하지만 고지질 함유 미세조류는 보통 성장 속도가 느려 바이오디젤용 지질 생산의 생산성이 높지 않으므로 지질 함량이 15~30 %로 다소 낮더라도 성장 속도가 빠른 미세조류를 사용하는 것이 생산성 면에서 유리하다.
또한, 미세조류의 지질 생산량을 증진시키는 방법 중 하나는 정상적으로 성장하는 조건이 아닌 스트레스적 조건을 부여하는 것으로, 많은 종류의 담수종 미세조류들은 활발하게 성장 분열하는 성장 속도가 빠른 조건에서는 지질 함량이 낮은 반면, 배양 조건 상의 특정 환경적 스트레스가 존재할 때 성장이 느려지면서 세포 내 지질 합성의 속도가 빨라져 지질 함량이 증가하는 경우가 많다.
즉, 일부 클로렐라종을 비롯한 몇 가지 담수 미세조류들은 배양시 필수적으로 필요한 영양분인 질소 및 인의 농도가 부족할 때 성장이 느려지면서 지질 생산량이 증가하는 경향이 있다. 또한, 다른 종들은 철, 마그네슘, 규소 등이 부족할 때 지질 생산량이 증가하는 경우도 보고되고 있다. 그 외에 온도, pH, 조도 등이 비정상적으로 높거나 낮을 때에도 지질생산량이 증가하는 경우도 있다. 이에 따라, 미세조류의 지질 생산량을 증진시키기 위한 방법으로 성장인자가 결핍된 스트레스 조건에서의 배양을 활용하고 있다.
그러나 상기 질소와 같은 미세조류의 주요 성장인자의 결핍 상태에서 지질 함량이 증가하는 현상은 일부 담수종에서만 효과적인 것으로, 다른 종에서는 주요 성장인자가 결핍되는 스트레스적 상태에서 배양하여도 지질 함량의 증가가 일어나지 않거나 오히려 지질 함량이 감소하는 경우도 있다.
특히, 높은 염도에서 성장하는 해양 미세조류 종들에서는 질소 부족 상태에서 세포의 성장 속도와 지질 함량이 모두 감소하는 경우가 많다. 또한, 질소는 미세조류의 성장에 필수적인 인자이므로 질소의 결핍 상태에서 지질 함량이 증가한다 하더라도 결국에는 미세조류의 성장 속도의 감소로 인하여 최종 지질 생산량 및 생산성이 저하되는 문제가 발생한다. 따라서, 지질 생산성을 향상시키기 위해서는 미세조류의 세포 성장 속도와 미세조류 내 지질 함량을 모두 증가시킬 수 있는 배양 조건 및 배양 방법이 필요한 실정이다.
관련 종래 기술로는 대한민국 공개특허 제10-2014-0121149호(미세조류의 동시 지질추출 및 에스테르 교환반응을 이용한 바이오디젤의 제조방법), 대한민국 등록특허 제10-1403464호(미세조류 내 지질 및 환원당 함량 증진용 미세조류 배양시스템) 등이 있다.
본 발명의 목적은, 질소의 농도가 고농도로 유지되고, 최적 농도의 유기탄소가 첨가된 배양 배지에서 미세조류의 세포 건조 중량과 세포 내 지질 함량이 모두 증가할 때까지 일정시간 동안 미세조류를 배양함으로써, 바이오디젤 원료로 사용되는 지질의 생산량 및 생산성을 증가시킬 수 있는 미세조류 배양방법을 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미세조류를 300 내지 5000 mg/L 의 고농도로 조절된 질소를 포함하는 배지에서 상기 미세조류의 세포 건조 중량과 세포 내 지질 함량이 모두 증가할 때까지 일정시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 배지에 유기탄소를 더 포함하여 배양하는 것을 특징으로 한다.
상기 유기탄소는 글루코스(glucose), 글리세롤(glycerol), 또는 아세테이트(acetate)인 것을 특징으로 한다.
상기 유기탄소의 농도는 0.1 내지 10 %(w/v)인 것을 특징으로 한다.
상기 질소는 질산성 질소(NO3-N) 또는 암모니아성 질소(NH4-N)인 것을 특징으로 한다.
상기 질산성 질소는 질산나트륨(NaNO3), 질산칼륨(KNO3) 및 질산암모늄(NH4NO3)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 암모니아성 질소는 염화암모늄(NH4Cl), 질산암모늄(NH4NO3), 중탄산암모늄(NH4HCO3), 초산암모늄(CH3COONH4), 우레아(CO(NH2)2), 글리신(NH2CH2COOH) 및 효소추출물(yeast extract)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 질소의 농도 유지를 위하여 12시간 이상의 시간 간격으로 하여 지속적으로 질소를 공급하는 것을 특징으로 한다.
상기 미세조류의 배양 배지는 염도 30 내지 35 psu, 온도 10 내지 40 ℃, 광도 20 내지 500 μmol/m2/s 및 0.03 내지 15 %(v/v)의 CO2 를 포함하는 공기의 공급속도 0.01 내지 0.5 vvm의 조건을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 미세조류는 테트라셀미스(Tetraselmis), 두날리엘라(Dunaliella), 난노클로롭시스(Nannochloropsis), 아이소크리시스(Isochrysis), 포피리디움(Porphyridium), 코코믹사(Coccomyxa), 패오닥티룸(Phaeodactylum), 시조키트리움(Schizochytrium), 클로렐라(Chlorella), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 유글레나(Euglena), 카에토세로스(Chaetoceros), 헤마토코쿠스(Haematococcus), 크립테코디니움(Crypthecodinium), 네오클로리스(Neochloris), 나비쿨라(Navicula) 및 아르스로스피라(Arthrospira)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 상기 미세조류의 배양방법은, (a) 질소의 농도가 75 mg/L로 조절된 배지에서 미세조류를 1차 배양하는 단계; 및 (b) 상기 1차 배양한 미세조류를 질소의 농도가 300 내지 5000 mg/L의 고농도로 조절된 배지에서 2차 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 고농도의 질소 조건을 포함하는 배지에서 미세조류의 세포 건조 중량과 세포 내 지질 함량이 모두 증가될 때까지 일정시간 동안 미세조류를 배양하는 방법을 제공함으로써, 결과적으로 미세조류의 성장 속도와 지질 함량이 모두 증가되어 바이오디젤 원료인 지질의 생산량 및 생산성을 높일 수 있는 효과가 있다.
도 1에서 (a)는 실시예 1에 따른 배양 결과 미세조류의 세포 건조 중량을 나타내는 그래프 이고, (b)는 실시예 1에 따른 배양 결과 미세조류의 세포 내 지질 함량을 나타내는 그래프이다.
도 2에서 (a)는 실시예 2에 따른 배양 결과 배양 결과 미세조류의 세포 건조 중량을 나타내는 그래프 이고, (b)는 실시예 2에 따른 배양 결과 미세조류의 세포 내 지질 함량을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
미세조류(microalgae)는 광합성 색소를 가지고 광합성을 하는 생물들에 대한 통칭으로, 태양광 등 빛을 에너지원으로 하여 이산화탄소를 고정시키고 광합성을 하여 성장하는 마이크로 단위의 크기를 갖는 수중 생물을 말한다.
담수미세조류의 경우 질소나 인의 농도가 부족하면 게놈 복제를 제대로 할 수 없기 때문에 세포분열이 억제되고, 그 결과 광합성으로 축적된 유기물이 지방으로 전환되어 세포에 쌓이게 됨으로써 세포 내 지질 함량이 증가되는 것으로 알려져 있다. 그러나 미세조류는 그 종류가 매우 다양하고, 종에 따라 지질의 함량, 지질의 특성, 성장 속도, 최적의 성장을 위한 성장 환경 조건의 차이로 인하여 상기와 같은 영양 결핍 스트레스에 의한 미세조류 세포 내 지질 함량 증가의 방법이 적용되지 않는 경우가 많으며, 종에 따라서는 어떤 성분이 과잉인 경우가 스트레스로 작용할 수도 있고, 이러한 과잉적 스트레스 조건은 세포 성장에는 영향을 미치지 않으나 지질생산에 관련된 탄소대사에만 영향을 미칠 수도 있다. 따라서 이러한 미세조류종을 위한 지질 생산성 증가를 위한 방법이 필요하고, 이에 따라, 본 발명에서는 미세조류의 성장 속도와 미세 조류 내 지질 함량을 모두 증가시켜 바이오디젤 원료로서 미세조류에 의한 지질 생산성을 증가시킬 수 있는 미세조류의 배양방법에 관한 발명을 안출하였다.
구체적으로, 본 발명에서는 미세조류를 300 내지 5000 mg/L, 바람직하게는 300 내지 3500 mg/L, 더욱 바람직하게는 350 내지 1500 mg/L 의 고농도로 조절된 질소를 포함하는 배지에서 상기 미세조류의 세포 건조 중량과 세포 내 지질 함량이 모두 증가할 때까지 일정시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법을 제공한다.
질소는 미세조류의 배양에 있어서 반드시 필요한 주요 성장인자로서 배양과정에서 질소의 농도 조건은 미세조류의 성장과 지질 생산에 영향을 끼치는 바, 본 발명자들은 미세조류의 성장 속도의 지표로 삼을 수 있는 세포 건조 중량 및 세포 내 지질 함량을 모두 증가시켜 최종적으로 지질 생산성 증대에 이를 수 있는 고농도의 질소 조건을 찾아내기 위하여 다양한 조건에서 수많은 반복 실험과 분석을 수행하였다.
그 결과, 상기와 같이 300 내지 5000 mg/L 의 질소 농도가 미세조류의 지질 생산성을 증가시킬 수 있는 최적의 고농도 질소 조건임을 확인하였다. 배양 배지 내의 질소 농도가 300 mg/L 미만이면 미세조류 세포의 단백질 및 효소 합성과 광합성 등의 기초대사에 필요한 질소의 공급량이 부족하여 세포의 성장 및 지질 합성과 같은 탄소대사가 저해됨으로써, 지질 생산성 증대의 효율이 떨어질 수 있고 반면, 배양 배지 내의 질소 농도가 5000 mg/L 를 초과할 경우 적정한 질소 농도 수준에서 가역적으로 작용하던 일부 효소들이 적정 범위를 초과하는 고농도의 질소 조건에서는 세포의 활성을 저해하는 방향으로 작용할 수 있고 또한, 질소화합물을 구성하는 염의 농도가 과잉 증가하여 세포 활성에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 세포 건조 중량과 세포 내 지질 함량을 모두 증가시켜 최종적으로 지질 생산성을 증가시키기 위한 질소의 농도 조건은 300 내지 5000 mg/L인 것이 바람직하다.
본 발명의 미세조류의 배양방법에 따르면, 미세조류는 충분한 농도의 질소에 의해 성장 속도가 증가하며, 광합성에 의한 질소 소모는 일정 수준까지 진행되고, 지질 생산에 관여하는 단백질의 합성 및 관련 대사가 촉진되는 방향으로 질소가 사용되는 것으로 사료된다.
상기 질소는 질산성 질소(NO3-N) 또는 암모니아성 질소(NH4-N)인 것을 특징으로 한다. 질산성 질소는 유기물 속의 질소화합물이 산화 분해하여 무기화한 최종 산물로서, 질산나트륨(NaNO3), 질산칼륨(KNO3) 및 질산암모늄(NH4NO3)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 암모니아성 질소는 질소의 각종 화합물 중 암모니아 또는 암모늄염으로 존재하는 질소로서, 염화암모늄(NH4Cl), 질산암모늄(NH4NO3), 중탄산암모늄(NH4HCO3), 초산암모늄(CH3COONH4), 우레아(CO(NH2)2), 글리신(NH2CH2COOH) 및 효소추출물(yeast extract)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
더불어, 상기 질소의 농도 유지를 위하여 12시간 이상의 시간 간격으로 하여 지속적으로 질소를 공급하는 것을 특징으로 하고, 질소의 농도를 수시로 모니티링 하기 위해서 이온크로마토그래피(ion chromatography), 자외선 흡광도법, 이온전극법 등을 이용하여 그 농도를 측정한다.
또한, 본 발명은 상기 배양 배지에 유기탄소를 더 포함하여 배양하는 것을 특징으로 한다. 상기 유기탄소는 글루코스(glucose), 글리세롤(glycerol), 또는 아세테이트(acetate)인 것을 특징으로 하고, 그 농도는 0.1 내지 10 %(w/v)인 것이 바람직하다.
상기와 같은 적절한 유기탄소가 공급되면 미세조류는 이산화탄소 고정에 의한 독립영양(autotrophic) 탄소대사 외에 유기물의 지방산 합성 및 트리글리세라이드 합성으로 유도되는 혼합영양(mixotrophic) 또는 종속영양(hetetotrophic) 탄소대사가 병행되도록 적응하는 것으로 판단된다.
또한, 상기 유기탄소와 더불어 하ㆍ폐수에 포함된 다양한 유기물도 미세조류 성장의 영양공급원으로 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 미세조류의 배양방법에 따르면 배지는 염도 30 내지 35 psu, 온도 10 내지 40 ℃, 광도 20 내지 500 μmol/m2/s 및 0.03 내지 15 %(v/v)의 CO2 를 포함하는 공기의 공급속도 0.01 내지 0.5 vvm의 조건을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 제공하는 지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법을 적용할 수 있는 미세조류종은 담수종과 해양종을 모두 포함하나, 특히, 해양종 미세조류에 적용하는 것이 더욱 바람직하다.
해양종 미세조류를 인공적으로 배양할 때에는 바닷물을 직접 사용하거나 바닷물 채수의 번거로움을 덜기 위해 인공해수와 여기에 성장 촉진을 위한 몇 가지 영양분을 첨가한 인공해수배지를 사용한다. 바닷물의 평균 염분농도는 30 내지 35 g/L(30 내지 35 ‰(permile, 천분율) 또는 30 내지 35 psu(practical salinity unit))이며, 인공해수배지는 주로 NaCl을 사용하여 염분농도를 조절한다. 해양종 미세조류는 30 내지 35 psu의 통상적인 염도에서 가장 정상적으로 잘 자라는데, 이는 이 농도의 염분이 세포 내외 삼투압 균형을 맞게 하는 역할을 하기 때문이다. 따라서 본 발명에 따른 해양미세조류의 배양시 배지의 염도는 30 내지 35 psu 로 맞추는 것이 바람직하다.
보다 구체적으로, 본 발명의 배양방법을 적용할 수 있는 미세조류는 테트라셀미스(Tetraselmis), 두날리엘라(Dunaliella), 난노클로롭시스(Nannochloropsis), 아이소크리시스(Isochrysis), 포피리디움(Porphyridium), 코코믹사(Coccomyxa), 패오닥티룸(Phaeodactylum), 시조키트리움(Schizochytrium), 클로렐라(Chlorella), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 유글레나(Euglena), 카에토세로스(Chaetoceros), 헤마토코쿠스(Haematococcus), 크립테코디니움(Crypthecodinium), 네오클로리스(Neochloris), 나비쿨라(Navicula) 및 아르스로스피라(Arthrospira)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 상기 미세조류의 배양방법은, (a) 질소의 농도가 75 mg/L로 조절된 배지에서 미세조류를 1차 배양하는 단계; 및 (b) 상기 1차 배양한 미세조류를 질소의 농도가 300 내지 5000 mg/L의 고농도로 조절된 배지에서 2차 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 미세조류의 배양방법에 따르면 처음부터 300 내지 5000 mg/L의 고농도의 질소 조건에서 배양하여도 미세조류의 성장 속도와 지질 함량을 모두 증가시키는 것이 가능하지만, 고농도의 질소조건에서 지질 함량은 증가하지만, 성장속도가 감소하는 종의 경우 인공해수배지(f/2배지)의 표준 질소 농도인 75 mg/L의 질소 조건을 포함하는 배지에서 급속도로 세포를 성장시킨 후, 어느 시점에서 고농도의 질소 조건으로 전환하여 배양함으로써 지질을 생산하는 2단계의 배양도 가능하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 본 발명의 미세조류 배양방법에 따른 미세조류의 성장 속도 및 지질 함량의 증가 확인(질소의 농도 변화에 따라)
본 실시예에서는 성장하는 미세조류의 세포가 표준 농도 조건(75 mg/L)에서 고농도의 질소 조건으로 이동할 때의 영향을 확인하기 위하여 실험상 배양을 두 단계로 나누어 수행하였다.
먼저, 염도가 35 psu(practical salinity unit)인 정상적인 인공해수배지(f/2배지)에서 온도 25 ℃, 광도 100 내지 110 μmol/m2/s, 2 %(v/v)의 CO2 를 포함하는 공기의 공급속도 0.2 vvm, 질산나트륨(NaNO3)의 농도 75 mg/L를 유지하고 테트라셀미스(Tetraselmis)를 건조 중량으로 0.5 g/L의 농도로 접종하여 1차 배양하였다.
이 때, NaNO3 의 농도 유지를 위하여 24 시간 간격으로 하여 NaNO3 를 지속적으로 공급해 주었다.
이 후, 적정 농도로 성장한 테트라셀미스가 포함된 배양액을 나누어 서로 다른 질소 농도 조건(0, 75, 375, 750, 1500 mg/L) 에서 2차 배양하였다. 질소 농도 조건을 제외한 다른 조건은 1차 배양과 동일하게 유지하였다. 이 때, NaNO3 의 농도 유지를 위하여 24 시간 간격으로 하여 NaNO3 를 지속적으로 공급해 주었다.
그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, 인공해수배지에서의 표준 질소(NaNO3) 농도인 75 mg/L 에 대비하여 이보다 높은 375, 750, 1500 mg/L 의 질소(NaNO3) 농도 조건에서, 질소 농도가 높을수록 동일한 배양 시간 동안 테트라셀미스의 세포 건조 중량이 더 높은 것을 확인함으로써, 질소 농도가 높을수록 성장 속도가 증가함을 알 수 있다.
또한, 테트라셀미스의 세포 내 지질 함량도 375, 750, 1500 mg/L 의 고농도의 질소(NaNO3) 농도 조건에서 60시간 동안 20% 수준에서 30% 수준으로 증가한 것을 확인할 수 있는바, 저농도의 질소 농도 조건에 비하여 지질 함량의 증가폭이 큰 것을 확인할 수 있다.
그리고, 도 1을 통하여 볼 때 테트라셀미스의 경우 세포 건조 중량과 세포 내 지질 함량이 모두 최대한 증가될 때까지는 60시간 정도의 배양시간이 필요한 것을 확인할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 미세조류 배양방법에 따라 미세조류의 배양시 세포의 성장 속도와 지질 함량이 동시에 증가됨으로써, (미세조류 세포 성장 속도) × (세포 건조 중량당 지질 함량)으로 산출되는 지질 생산성이 증가됨을 알 수 있다.
실시예 2. 본 발명의 미세조류 배양방법에 따른 미세조류의 성장 속도 및 지질 함량의 증가 확인(유기탄소의 첨가에 따라)
염도가 35 psu(practical salinity unit)인 정상적인 인공해수배지(f/2배지)에서 온도 25 ℃, 광도 100 내지 110 μmol/m2/s, 2 %(v/v)의 CO2 를 포함하는 공기의 공급속도 0.2 vvm, NaNO3 의 농도 75 mg/L를 유지하고 테트라셀미스를 건조 중량으로 0.5 g/L의 농도로 접종하여 1차 배양하였다. 이 때, NaNO3 의 농도 유지를 위하여 24 시간 간격으로 하여 NaNO3 를 지속적으로 공급해 주었다.
이 후, 적정 농도로 성장한 테트라셀미스가 포함된 배양액을 나누어 2가지의 질소 농도 조건(75, 750, mg/L) 및 글리세롤 첨가 조건(글리세롤 농도 0, 0.5, 1 %(w/v) 에서 2차 배양하였다. 질소 농도 조건을 제외한 다른 조건은 1차 배양과 동일하게 유지하되, NaNO3 의 농도 유지를 위하여 12 시간 간격으로 하여 NaNO3 를 지속적으로 공급해 주었으며 교반을 위하여 여과된 공기(0.038%(v/v)의 CO2 포함)를 사용하였다. 본 실험에서는 탄소원으로 글리세롤을 사용하여 그 영향을 보는 것이므로 CO2의 공급을 최소화 하였고, 배양액의 교반을 위하여 공기를 공급해 주었다.
그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 인공해수배지에서의 표준 질소(NaNO3) 농도인 75 mg/L 에 대비하여 이보다 10배 높은 750 mg/L 의 질소(NaNO3) 농도 조건에서 배양한 경우 테트라셀미스의 세포 건조 중량이 동일한 시간 동안 더 높은 것을 확인함으로써, 750 mg/L의 고농도 질소 조건에서 성장 속도가 증가하는 것을 알 수 있다. 또한, 테트라셀미스 세포 내 지질 함량도 750 mg/L 의 고농도의 질소(NaNO3) 농도 조건에서 배양한 경우에는 3일 동안 20% 에서 25% 수준으로 증가한 것을 확인할 수 있으나, 75 mg/L 의 질소 농도 조건에서 배양한 경우에는 세포 내 지질 함량의 변화가 없음을 알 수 있다.
또한, 배양 배지에 유기탄소로서 글리세롤을 5, 10 g/L 첨가한 경우 세포의 성장 속도가 더욱 빨라져 10일 동안 세포의 농도가 1.7 g/L 에서 3.7 g/L 로 큰 폭으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.
이와 같이, 본 발명에서 제공하는 농도의 질소 조건과 적정 농도의 유기탄소 첨가 등을 포함하는 배양방법 및 배양조건에 따르면 미세조류 세포의 성장 속도 및 세포 내 지질 함량이 동시에 증가되고, 이로 인하여 최종적으로 지질 생산성을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 미세조류를 300 내지 5000 mg/L의 고농도로 조절된 질소를 포함하는 배지에서 상기 미세조류의 세포 건조 중량과 세포 내 지질 함량이 모두 증가할 때까지 일정시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 배지에 유기탄소를 더 포함하여 배양하는 것을 특징으로 하는 지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 유기탄소는 글루코스(glucose), 글리세롤(glycerol), 또는 아세테이트(acetate)인 것을 특징으로 하는 지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 유기탄소의 농도는 0.1 내지 10 %(w/v)인 것을 특징으로 하는 지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 질소는 질산성 질소(NO3-N) 또는 암모니아성 질소(NH4-N)인 것을 특징으로 하는 지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 질산성 질소는 질산나트륨(NaNO3), 질산칼륨(KNO3) 및 질산암모늄(NH4NO3)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 암모니아성 질소는 염화암모늄(NH4Cl), 질산암모늄(NH4NO3), 중탄산암모늄(NH4HCO3), 초산암모늄(CH3COONH4), 우레아(CO(NH2)2), 글리신(NH2CH2COOH) 및 효소추출물(yeast extract)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 질소의 농도 유지를 위하여 12시간 이상의 시간 간격으로 하여 지속적으로 질소를 공급하는 것을 특징으로 하는 지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 배지는 염도 30 내지 35 psu, 온도 10 내지 40 ℃, 광도 20 내지 500 μmol/m2/s 및 0.03 내지 15 %(v/v)의 CO2 를 포함하는 공기의 공급속도 0.01 내지 0.5 vvm의 조건을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 미세조류는 테트라셀미스(Tetraselmis), 두날리엘라(Dunaliella), 난노클로롭시스(Nannochloropsis), 아이소크리시스(Isochrysis), 포피리디움(Porphyridium), 코코믹사(Coccomyxa), 패오닥티룸(Phaeodactylum), 시조키트리움(Schizochytrium), 클로렐라(Chlorella), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 유글레나(Euglena), 카에토세로스(Chaetoceros), 헤마토코쿠스(Haematococcus), 크립테코디니움(Crypthecodinium), 네오클로리스(Neochloris), 나비쿨라(Navicula) 및 아르스로스피라(Arthrospira)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 미세조류의 배양방법은,
    (a) 질소의 농도가 75 mg/L로 조절된 배지에서 미세조류를 1차 배양하는 단계; 및 (b) 상기 1차 배양한 미세조류를 질소의 농도가 300 내지 5000 mg/L의 고농도로 조절된 배지에서 2차 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 생산성을 증가시키는 미세조류의 배양방법.
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