KR101538969B1 - 감태 추출물을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 배지 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감태(Ecklonia cava) 추출물을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 배지 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 배지 조성물을 이용한 중간엽 줄기세포의 배양방법 또는 분화방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포 배양 배지 조성물은 중간엽 줄기세포의 성장률을 크게 증가시킬 수 있어, 줄기세포 생산효율을 높일 수 있다. 또한, 본 발명의 배양방법에 따라 배양된 중간엽 줄기세포는 다양한 세포로 분화가 가능하며, 이러한 분화된 조직의 세포는 세포 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

감태 추출물을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 배지 조성물{Medium Composition for Culturing Mesenchymal Stem Cells Comprising Extract of Ecklonia cava}

본 발명은 중간엽 줄기세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용하여 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법 및 분화시키는 방법에 관한 것이다.

줄기세포는 미분화 상태에서 일정기간 동안 자신과 동일한 세포를 지속적으로 만들어 낼 수 있는 성질과 적당한 조건하에서는 특정한 세포로 분화하는 성질을 가지고 있다.

줄기세포는 분화능과 생성시기에 따라 크게 배아줄기세포(embryonic stem cell)와 성체 줄기세포(adult stem cell)로 구분될 수 있다. 인간 배아 줄기세포는 인간 생명체로 발생할 수 있는 배아로부터 만들어지기 때문에 많은 윤리적인 문제점을 가지고 있으나, 성체 줄기세포에 비하여 세포증식 및 분화 능력이 우수한 것으로 알려져 있다. 성체 줄기세포는 골수, 혈액, 뇌, 피부 등에서 얻을 수 있어 윤리적인 문제가 적으나, 배아 줄기세포에 비하여 한정된 분화능력을 가지고 있다.

대표적인 성체줄기세포에는 조혈모세포(hematopoietic stem cells; HSCs)와 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)가 있다. 조혈모세포에는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등 주로 혈액내의 혈구세포로 분화하는 반면, 중간엽 줄기세포는 연골 세포(chondroblast), 골세포(osteoblast), 지방세포(adipocyte), 근육세포 (myocyte), 신경세포 등의 중배엽성 조직의 세포로 분화하는 것으로 알려져 있다. 상기한 성체줄기세포의 분리 및 배양방법이 알려지면서 세포 치료제로서의 임상적 적용에도 관심이 고조되고 있으며, 줄기세포를 이용하여 파킨슨씨병, 알츠하이머 병과 같은 신경퇴행성 질환이나 척추손상에 의한 사지마비, 간경화, 소아 당뇨병, 백혈병, 기타 만성질환 등과 같은 질환에 의해 파괴되어 부족한 세포를 외부로부터 공급해주는 세포 대체요법(cell replacement therapy)이 효과적인 치료법으로 제시되면서 많은 연구가 진행되고 있다.

중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell)는 최초 성체 골수에서 분리되었고(Y. Jiang et al., Nature, 418:41, 2002), 그 후 피부, 혈관, 근육 및 뇌 조직으로부터 골수와 같은 중간엽 줄기세포가 확인되었다(J.G. Toma et al., Nat . Cell Biol., 3:778, 2001; M. Sampaloesi et al., Science, 301:487, 2003; Y. Jiang et al., Hematol., 30:896, 2002). 또한, 최근 지방조직으로부터 골수와 같은 분화능을 가지는 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adiopose-derived stem cell)가 확인되었다(B. Cousin et al,. BBRC., 301:1016, 2003; A. Miranville et al., Circulation, 110:349, 2004; S. Bronthos et al., J. Cell Physiol., 189:54, 2001; M.J. Seo et al., BBRC., 328:258, 2005).

인간 골수로부터 중간엽 줄기세포의 분리를 위한 기법과 지방조직에서 중간엽 줄기세포를 분리하는 기법은 각각 Pittenger 등(Science 284: 143, 1997)과 van 등(J. Clin . Invest., 58: 699, 1976)의 문헌들에 개시되어 있다. 이들 문헌에서는 세포배양을 위하여 alpha-MEM이나 DMEM 배지 및 10-20% 소태아 혈청을 사용하였다.

중간엽 줄기세포는 골수나 지방과는 달리 분만과정에서 버려지는 제대 (umbilical cord)로부터 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며, 그 양에 비해 많은 줄기세포를 포함하고 있다고 알려져 있다.

그러나, 상기 중간엽 줄기세포는 매우 드물게 존재하고 이러한 세포들은 미분화 상태에서 증식률이 낮으며 장기간 유지가 어려워, 보다 많은 양으로 빨리 성장할 수 있으며 생존율 또한 높일 수 있는 특이적 배양 배지 조성물에 대한 요청이 시급한 상황이다.

상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.

본 발명자들은 세포치료제로 유용한 중간엽 줄기세포를 보다 효율적으로 배양할 수 있는 방법을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 기존 세포 배양 배지에 감태 추출물을 포함시킬 경우 놀랍게도 중간엽 줄기세포의 증식률과 생존율이 매우 빠른 속도로 증가된다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 감태(Ecklonia cava) 추출물을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 배지 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 배지 조성물을 이용하여 중간엽 줄기세포를 배양하는 배양방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 중간엽 줄기세포를 분화시키는 분화방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 배양방법으로 배양된 다분화능 중간엽 줄기세포를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 감태(Ecklonia cava) 추출물을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 세포치료제로 유용한 중간엽 줄기세포를 보다 효율적으로 배양할 수 있는 방법을 찾고자 노력하였다. 그 결과, 기존 세포 배양 배지에 감태 추출물을 포함시킬 경우 놀랍게도 중간엽 줄기세포의 증식률과 생존율이 매우 빠른 속도로 증가된다는 것을 확인하였다.

본 발명의 배지 조성물에 포함되는 유효성분인 감태(甘苔, Ecklonia cava)는 주로 남해안, 제주도 해안 일대 및 울릉도 해안 일대에서 서식하는 갈조식물 다시마목 다시마과의 여러해살이 해조류로서, 주로 전복과 소라 등의 먹이가 되며, 알긴산이나 요오드·칼륨을 만드는 주요 원료나, 식용으로 이용하기도 한다.

현재 상기 감태 추출물을 화장료 등의 피부 조성물에 적용하기 위한 사례가 증가되고 있으나(대한민국 공개특허 제2013-0017159호, 제2012-0040488호, 제2010-0097293호 등 참조), 줄기세포 배양용 조성물로 개발된 사례는 전무하다.

본 발명에서 이용하는 중간엽 줄기세포는 포유동물 유래의 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포에서 분리한 세포로서, 무한정으로 증식할 수 있는 능력 및 여러 가지 세포형태(예를 들면, 지방세포, 연골세포, 근육세포, 골세포, 신경세포 등)로 분화가 가능한 세포이다.

상기 중간엽 줄기세포는 골수, 피부, 혈관, 근육, 뇌 조직이나 지방조직으로부터 채취할 수 있으며, 바람직하게는 태반과 태아를 연결하는 제대에서 채취하여 얻을 수 있다. 제대로부터 중간엽 줄기세포의 채취는 다양한 방법을 이용하여 이를 수행할 수 있으며, 예를 들어, 인체에서 제대를 채취하여 DPBS로 혈액이 나오지 않을 때까지 씻어주고, 씻은 제대를 수술용 칼날로 다지고 37℃에서 인큐베이션(incubation) 시켜서 단핵세포가 함유된 용액을 얻을 수 있다.

본 명세서에서, 용어 ‘배지’는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외 (in vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다.

당업계에는 다양한 배지가 시판되고 있으며, 인위적으로 제조하여 사용할 수도 있다. 시판 중인 배지로는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMPM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium(Gibco, Newyork, USA), Chang's Medium MesemCult-XF Medium(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada) 등이 있으며, 인위적으로 제조할 수 있는 배지와 더불어 본 발명의 배지 조성물에 포함되는 기본 배지로 사용할 수 있다.

본 발명의 배지 조성물은 중간엽 줄기세포 배양에 특이적인 배지로서, 상기 기본 배지에 감태 추출물을 첨가함으로써 달성될 수 있다.

또한, 본 발명의 배양 배지는 영양혼합물(Nutrient Mixture)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 영양 혼합물은 세포배양에 일반적으로 사용되는 각종 아미노산, 비타민, 무기염 등을 포함하는 혼합물로서, 상기 아미노산, 비타민, 무기염 등을 혼합하여 제조하거나 상업적으로 제조된 영양 혼합물을 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 영양혼합물은 M199, MCDB110, MCDB202, MCDB302 등을 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 중간엽 줄기세포 배양용 배지 조성물에 포함되는 감태 추출물의 함량은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 전체 배지 조성물 기준 1 내지 1,000 ㎍/㎖ 농도로, 보다 바람직하게는 1 내지 200 ㎍/㎖ 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 감태 추출물을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 배지 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명이 포함하는 감태 추출물은 물, (a) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (b) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (c) 아세톤, (d) 에틸 아세테이트, (e) 클로로포름, (f) 1,3-부틸렌글리콜, (g) 헥산, (h) 디에틸에테르 등의 유기용매를 이용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올과 물과의 혼합용매를 이용하여 추출할 수 있다. 혼합용매를 이용하여 추출할 경우 메탄올 또는 에탄올의 함량은 50-80%가 바람직하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 배지 조성물로 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양방법을 제공한다.

상기 배양은 다양한 방식으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 제대 유래 단핵세포를 감태 추출물을 포함하는 제대 유래 중간엽 줄기 세포 배양 배지 조성물에 넣어서 습도 95%, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 조건의 배양기에 배양한 다음 5일 후에 뜨는 세포를 제거하고 3~4일 마다 배지를 교체하여 배양하였다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 감태 추출물이 추가된 중간엽 줄기세포 배양용 배지 조성물을 이용한 경우 씨딩 후 7일째 되는 날 약 10배의 증식률을 나타내어, 상기 기본 배지만이 첨가된 대조군과 비교하여 약 3배의 증식률 증가를 확인할 수 있었으며, 생존율 면에서도 2 내지 3배의 증가를 확인할 수 있었다(참고: 도 1 및 2).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상기 배양방법에 의해 배양되어 CD44, CD73, CD90에 대한 항체에는 양성반응, CD34, CD45에 대한 항체에는 음성반응을 나타내는 면역표현형을 갖는 다분화능 중간엽 줄기세포를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 방법으로 분리된 세포가 중간엽 줄기세포의 특성을 가지는지를 확인하기 위해 얻어진 세포의 표현 항원 발현 양상을 확인하였다. 확인 결과, 중간엽 줄기세포 마커 CD44, CD73, CD90에 대한 항체에는 양성반응, 음성 대조군인 CD34, CD45에 대한 항체에는 음성반응을 나타내는 면역표현형을 갖고 있었다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 배양방법으로 배양된 중간엽 줄기세포를 조직세포로 분화시키는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 분화방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 조직세포는 연골세포, 골세포, 지방세포, 근육세포 또는 신경세포인 것이다.

연골세포로의 분화는 다양한 연골세포 분화 배지를 이용하여 수행할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 DMEM, 0.1 uM dexamethason, 50 ㎍/mL AsA, 100 ㎍/mL sodium pyruvate, 40 ㎍/mL proline, 10 ng/mL TGF-β1, 50 ㎎/mL ITS + premix(6.25 ㎍/mL insulin, 6.25 ㎍/mL transferring, 6.25 ng/mL selenius scid, 1.25 ㎎/mL bovine serum albumin, 5.35 ㎎/mL lioleic acid)를 포함한 배양액을 이용하여 분화시켰다.

골세포로의 분화 또한 다양한 골세포 분화 배지를 이용하여 수행할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 IMDM, 1 uM dexamethasone, 10 mM β-glycerol phosphate, 0.2 mM ascorbic acid을 포함한 배양액을 이용하여 분화시켰다.

지방세포로의 분화 역시 다양한 지방세포 분화 배지를 이용하여 수행할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 IMDM, 0.2 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 1 uM hydrocortisone, 0.1 mM indomethacin 및 10% rabbit serum을 포함한 배양액을 이용하여 분화시켰다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 배양방법으로 배양된 중간엽 줄기세포 또는 상기 분화방법으로 분화된 조직세포를 포함하는 세포 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 임의의 투여경로에 의해서, 구체적으로는 복강 또는 흉강 투여, 피하 투여, 정맥 또는 동맥 혈관내 투여, 근육내 투여, 주사에 의한 국소 투여 등의 방법에 의해서 투여 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 통상의 방법에 기초하여 주사제, 현탁제, 유화제 등의 형태로 투여할 수 있고, 필요에 따라서 프로인트 완전 보조제 등의 보조제에 현탁되거나, 또는 BCG와 같은 보조제 활성을 갖는 물질과 함께 투여하는 것도 가능하다. 상기 조성물은 멸균되거나 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 의한 세포 치료용 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체나 첨가제를 함유할 수 있는데, 유효성분 이외에 희석제(예를 들어, 덱스트로즈, 솔비톨, 셀룰로즈, 글리신, 락토즈, 스쿠로즈, 만니톨), 결합제(예를 들어, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 트라가칸스, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈), 붕해제(예를 들어, 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 감미제, 향미제 및 착색제를 함유할 수 있다.

본 발명의 세포 치료용 조성물은 퇴행성 관절염, 다발성관절염, 간질환 등에 적용이 가능하며, 추후 사람에 대한 임상시험 결과에 따라서는 사람에 대한 동종세포치료제로의 가능성도 있다.

본 발명은 또한, 지방세포로 분화되는 특성을 가지는 상기 인체 제대 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 호로몬이나 내분비기질환의 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명은 또한, 연골세포로 분화되는 특성을 가지는 상기 인체 제대 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유 하는 골관절염 치료용 세포 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한, 골형성 세포로 분화되는 특성을 가지는 상기 인체 제대 유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 골결실 치료용 세포 치료제를 제공한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 감태(Ecklonia cava) 추출물을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 또한, 본 발명은 상기 배지 조성물을 이용한 중간엽 줄기세포의 배양방법 또는 분화방법을 제공한다.

(ⅲ) 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포 배양 배지 조성물은 중간엽 줄기세포의 성장률을 크게 증가시킬 수 있어, 줄기세포 생산효율을 높일 수 있다. 또한, 본 발명의 배양방법에 따라 배양된 중간엽 줄기세포는 다양한 세포로 분화가 가능하며, 이러한 분화된 조직의 세포는 세포 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 감태 추출물 농도에 따른 중간엽 줄기세포 증식률을 비교한 결과이다. Normal은 감태 추출물이 포함되지 않은 대조군을 나타내며, P2는 계대배양을 두 번째 한 인간 제대 유래 중간엽 줄기세포를, P3는 계대배양을 세 번째 한 인간 제대 유래 중간엽 줄기세포를 나타낸다.
도 2는 감태 추출물 농도에 따른 중간엽 줄기세포 생존율을 비교한 결과이다. Normal은 감태 추출물이 포함되지 않은 대조군을 나타내며, P2는 계대배양을 두 번째 한 인간 제대 유래 중간엽 줄기세포를, P3는 계대배양을 세 번째 한 인간 제대 유래 중간엽 줄기세포를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따라 배양된 중간엽 줄기세포의 세포 표면 특성을 유세포 분석기로 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따라 배양된 중간엽 줄기세포의 골세포로의 분화 여부를 확인한 결과를 나타낸다. A는 분화배지 처리 전, B는 처리 후를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따라 배양된 중간엽 줄기세포의 연골세포로의 분화 여부를 확인한 결과를 나타낸다. A는 분화배지 처리 전, B는 처리 후를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따라 배양된 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화 여부를 확인한 결과를 나타낸다. A는 분화배지 처리 전, B는 처리 후를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험예 1: 감태 추출물의 제조

실험에 사용된 감태(Ecklonia cava) 시료들은 제주도에서 구입하여 전문가의 정확한 감정을 거친 후 실험에 사용하였다. 건조된 생약 시료 100 g을 70% 메탄올 1 ℓ에 넣고 16시간 동안 환류 추출하고 여과지를 사용하여 여과하였다. 여액을 회전감압증발기에서 농축시키고 즉시 동결 건조하였다.

실험예 2: 인체 제대에서 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양

실험예 2-1: 인체 제대 채취

제대 조직은 출산 직후 바로 수집된다. 시료가 실험실로 옮겨지기 전에 우선 깨끗이 헹군 다음 즉시 이송용 배지(50 IU/㎖의 페니실린, 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(Invitrogen))이 첨가된 F-12 배지가 들어있는 500 ㎖의 멸균 유리병로 옮겨진다. 실험실에서는 멸균 상태하에서 라미나 플로우 후드에서 줄기세포의 추출이 수행된다. 시료는 우선 멸균 스테인레스 스틸의 용기로 옮겨진다. PBS로 수회 세정한 후 제대 조직 시료는 이후 2 ㎝의 길이로 잘라져 10 ㎝ 지름의 세포 배양 접시로 옮겨지며, 여기서 추가적인 세정 및 70% 에탄올로 항감염처리하고, 항생제 혼합물(50 IU/㎖의 페니실린, 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(Invitrogen))이 첨가된 PBS로 상기 용액이 깨끗해 질 때까지 수차례 세정한다.

실험예 2-2: 인체 제대에서 줄기세포 분리 및 배양

제대의 혈관 및 기타 내부요소들로부터 와튼젤리(제대의 기질)를 분리하기 위해 제대조직의 절개가 우선 이루어진다. 혈관을 제거한 후 분리된 와튼젤리는 세포의 추출을 위해 작은 조각(0.5 ㎝ x 0.5 ㎝)의 크기로 잘라진다. 외식(explant)은 상피 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포의 추출에 적합한 세포배양 조건이 갖추어져 있는 각기 다른 조직배양 접시에 제대 와튼젤리의 조각을 넣어 수행된다.

중간엽 세포의 분리/배양을 위해 상기의 외식된 조직은 10% 우태혈청(FBS, Hyclone)이 첨가된 5 ㎖의 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) F-12(Gibco), 10% FBS, 100 unit/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신에 담가져 이산화탄소 세포배양기에서 37℃로 유지되었다. 배지는 매 3일 또는 4일마다 교체되었다. 세포의 신장(outgrowth)은 광학현미경으로 모니터링 되었다. 신장하는 세포들은 추가적인 확장 및 냉동보관(DMEM/10% FBS 이용)을 위해 트립신 처리(0.125% 트립신/0.05% EDTA)하였다.

상기배지는 매 2일 또는 3일마다 교체되었다.

중간엽 줄기세포의 추출을 위해, 세포의 펠렛은 배지 DMEM F-12(Gibco), 10% FBS, 100 unit/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신에 재현탁 및 카운트되었으며, 10 ㎝ 조직배양 접시에 1 x 10⁶ 세포/접시의 밀도로 접종되었다. 상기 배지는 매 2일 또는 3일마다 교환되었다. 세포의 성장(growth) 및 클론형성은 광학현미경으로 모니터링 되었다. 약 90%의 세포수(confluence)에서, 세포들은 상기에 설명된 바와 같이 서브-배양(sub-culture)되었다.

실시예 1: 배양 배지 조성물에 따른 줄기세포 성장률 비교

실시예 1-1: 감태 추출물 농도에 따른 인간 유래 중간엽 줄기세포 증식률 비교

제주 감태 추출물의 농도에 따라 인간 제대 유래 줄기세포의 성장률을 검정하기 위한 실험으로, 대조군은 MSC의 전용 배지로 DMEM F-12(Gibco), 10% FBS, 100 unit/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 기본배지로 사용하였으며, 실험군 1은 계대배양을 두 번째 한 인간 제대 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 배지에 제주 감태 추출물을 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖의 농도로 첨가하였고, 실험군 2는 계대배양을 세 번째 한 인간 제대 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 배지에 제주 감태 추출물을 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖의 농도로 첨가하였다(도 1). 계대배양 두 번째와 세 번째의 인간 제대 유래 중간엽 줄기세포들을 분리하여 세척된 단핵구 세포를 6-웰 플레이트에 1 x 10⁴개의 세포를 접종하여 37℃와 5% CO₂를 유지하여 배양하였다. 4일 후에 세포를 수확하여 트리판블루(trypan blue)로 염색하여 전기적 세포 계수기를 이용 세포 증식률을 확인하였다.

그 결과, 실험군 1과 2군에서는 제주 감태 추출물의 농도가 증가할수록 증식률이 증가하였으며, 100 ㎍/㎖ 첨가군의 경우 대조군과 비교하여 약 3배의 증식률 증가를 확인할 수 있었다(도 1).

실시예 1-2: 감태 추출물 농도에 따른 인간 유래 중간엽 줄기세포 생존율 비교

제주 감태 추출물의 농도에 따라 인간 제대 유래 줄기세포의 생존율을 검정하기 위한 실험으로, 대조군은 MSC의 전용 배지로 DMEM F-12(Gibco)를 기본배지로 사용하였으며, 실험군 1은 계대배양을 두 번째 한 인간 제대 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 배지에 제주 감태 추출물을 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖의 농도로 첨가하였고, 실험군 2는 계대배양을 세 번째 한 인간 제대 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 배지에 제주 감태 추출물을 1 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖의 농도로 첨가하였다. 계대배양 두 번째와 세 번째의 인간 제대 유래 중간엽 줄기세포들을 분리하여 세척된 단핵구 세포를 6-웰 플레이트에 1 x 10⁴개의 세포를 접종하여 37℃와 5% CO₂를 유지하여 배양하였다. 4일 후에 세포를 수확하여 트리판블루로 염색하여 전기적 세포 계수기를 이용 세포 생존율을 확인하였다.

그 결과, 실험군 1과 2군에서는 제주 감태 추출물의 농도가 증가 할수록 생존율 또한 증가하였으며, 100 ㎍/㎖ 첨가군의 경우 대조군과 비교하여 2 내지 3배의 생존율 증가를 확인할 수 있었다(도 2).

실시예 2: 유세포 분석기로 인간 제대 유래 줄기세포의 세포 표면 특성 분석

본 발명의 방법으로 분리된 세포가 중간엽 줄기세포의 특성을 가지는지를 확인하기 위해 얻어진 세포의 표현 항원 발현 양상을 확인하였다.

수득한 제대 유래 줄기세포를 PBS로 세척하고, 0.5% 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA ; Gibco)를 사용하여 세포를 수거하고 5분 동안 1000 rpm으로 원심분리 하였다. 상층액을 버린 후 2% FBS 및 PBS의 혼합액을 넣어서 세척한 후 1000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버린 후 세포를 PBS에 부유시켜 시료 수만큼 2 x 10⁵세포를 분주하였다. 2 x 10⁵ 세포수/100 ㎕를 준비하여 PBS로 2회 세척하고 각 항체(R-phycoerythrin-conjugated mouse anti-cat monoclonal antibody) 10 ㎕ 넣어 15분간 얼음에 암반응시켰다. 인큐베이션 후에 1500 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 뒤 세정액(2 mM EDTA, 0.5% BSA in PBS)으로 세척하고 1500 rpm으로 7분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 다음 세정액 (2 mM EDTA, 5% BSA in PBS)으로 2회 세척하고 마지막으로 유세포 분석용 PBS를 500 ㎕ 넣어서 유세포분석기(FACScan, Becton Dickinson)로 세포 표면 특성을 분석하였다.

분석에 사용한 항체는 단핵구 항원(monocyte marker)인 CD44, CD73, CD90, CD34, CD45를 사용하였다(BD science).

확인 결과, 중간엽 줄기세포 마커 CD44, CD73, CD90에 대한 항체에는 양성반응, 음성 대조군인 CD34와 CD45에 대한 항체에는 음성반응의 결과를 얻었다(도 3).

실시예 3: 인간 제대 유래 중간엽 줄기세포의 분화

상기와 같이, 세포 표면의 항원들의 발현 결과들로 미루어 볼 때, 제대에서 분리, 배양된 세포들이 중간엽 줄기 세포임이 확인되었다. 본 발명자들은 본 발명의 조직 분쇄기법으로 분리한 세포들이 줄기세포의 특성을 가지고 있는지를 알아보기 위한 또 다른 방법으로 분화실험을 실시하였다.

실시예 3-1: 골아세포 분화

골세포로의 분화를 유도하기 위하여 계대배양 세번째의 인간 제대 유래 중간엽 줄기세포들을 0.25% 트립신/1 mM EDTA(Gibco-Brl)로 처리하여 수득한 다음 세포수를 측정하여 2 x 10⁴ 세포를 6-웰 플레이트 전용세포용기에 파종하였다. 배양배지 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) F-12(Gibco), 10% FBS, 100 unit/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 넣어서 습도 95%, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에 배양한 다음 2일 후에 골세포 분화용액 IMDM, 1 uM dexamethasone, 10 mM β-glycerol phosphate, 0.2 mM ascorbic acid에서 2주 동안 배양하였다. 골세포로의 분화 검증을 위해 Von kossa 조직화학 염색을 통하여 확인한 결과 도 4에 나타난 바와 같이 분화배지를 처리하기 전에서는 음성반응이었고, 처리한 후에는 양성반응을 보여 중간엽 줄기세포로 예상되었던 세포들이 골아세포로 분화될 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 3-2: 연골세포 분화

연골세포로의 분화를 유도하기 위하여 계대배양 세번째의 인간제대 유래 중간엽 줄기세포들을 0.25% 트립신/1 mM EDTA(Gibco-Brl)으로 처리하여 수득한 다음 세포수를 측정하여 2 x 10⁴ 세포를 6-웰 플레이트 전용세포용기에 파종하였다. 배양배지 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) F-12(Gibco), 10% FBS, 100 unit/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 넣어서 습도 95%, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에 배양한 다음 2일 후에 연골세포분화 전용 배지 DMEM, 0.1 uM dexamethason, 50 ㎍/mL AsA, 100 ㎍/mL sodium pyruvate, 40 ㎍/mL proline, 10 ng/mL TGF-β1, 50 ㎎/mL ITS + premix(6.25 ㎍/mL insulin, 6.25 ㎍/mL transferring, 6.25 ng/mL selenius scid, 1.25 ㎎/mL bovine serum albumin, 5.35 ㎎/mL lioleic acid)를 포함한 배양액에 37℃, 5% CO₂ 조건에서 4주간 배양하였다. 연골세포로의 분화 검정을 위해 PBS로 2번 씻은 후에 포르말린으로 20분간 고정시킨 후 PBS로 2번 씻었다. 물기를 완전히 제거 후에 알시안블루 조직화학 염색을 통하여 확인한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 비교 세포군에서는 음성반응이었고, 실험 세포군에서는 양성반응을 보여 중간엽 줄기세포로 예상되었던 세포들이 연골세포로 분화될 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 3-3: 지방세포로의 분화

지방세포로의 분화를 유도하기 위하여 계대배양 세 번째의 인간제대 유래 중간엽 줄기세포들을 0.25% 트립신 /1 mM EDTA(Gibco-Brl)으로 처리하여 수득한 다음 세포수를 측정하여 2 x 10⁴세포를 6-웰 플레이트 전용세포용기에 파종하였다. 배양배지 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) F-12(Gibco), 10% FBS, 100 unit/㎖ 페니실린, 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 넣어서 습도 95%, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에 배양한 다음 2일 후에 파종 후 지방세포 분화용액 IMDM, 0.2 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 1 uM hydrocortisone, 0.1 mM indomethacin 및 10% rabbit serum에서 2주 동안 배양하였다. 지방세포로의 분화 검증을 위해 세포내 지방 축적을 확인하기 위한 Oil-Red-O 조직화학 염색을 통하여 확인한 결과 도 6에서 나타난 바와 같이 비교세포군에서는 음성반응이었고, 실험세포군에서는 양성반응을 보여 중간엽 줄기세포로 예상되었던 세포들이 지방세포로 분화될 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

1. 세포 배양 배지에 감태(Ecklonia cava) 추출물이 추가된 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 증식용 배지 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium 및 Chang's Medium MesemCult-XF Medium으로 구성된 군으로부터 선택되는 기본 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 감태 추출물은 전체 배지 조성물 기준 1 내지 1,000 ㎍/㎖ 농도로 포함된 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
   
4. 감태 추출물을 세포 배양 배지에 첨가하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 증식용 배지 조성물의 제조방법.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 감태 추출물은 유기용매를 이용하여 추출된 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 중간엽 줄기세포 증식용 배지 조성물로 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양방법.
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