KR102126331B1

KR102126331B1 - 컨디션드 배지 분말의 제조방법

Info

Publication number: KR102126331B1
Application number: KR1020120018657A
Authority: KR
Inventors: 국일; 이정우
Original assignee: 주식회사 탑셀바이오
Priority date: 2012-02-23
Filing date: 2012-02-23
Publication date: 2020-06-25
Also published as: WO2013125927A1; KR20130096993A

Abstract

본 발명은 컨디션드 배지 분말의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 알코올류 극성용매를 이용하여 유효성분이 고농축되어 있는 컨디션드 배지 분말을 제조하여 저비용 고효율로 대량생산할 수 있고, 상기 컨디션드 배지 분말은 줄기세포의 세포분열 및 분화를 촉진할 수 있다.

Description

컨디션드 배지 분말의 제조방법{Method for preparing conditioned medium powder}

본 발명은 세포 배양액의 유효성분을 효과적으로 분리 농축시켜 저비용으로 고효율의 효과를 얻을 수 있는 컨디션드 배지 분말의 제조방법에 관한 것이다.

단백질의 특성들, 즉 크기, 아미노산 조성, 아미노산 서열, 극성, 키랄성, 아미노산 변형 등을 파악하고 원하는 단백질을 분리할 경우 다양한 방법을 분리 및 정제를 진행한다. 기존의 단백질 침전 및 농축 방법으로는 암모늄 설페이트 침전법, PEG 침전법, 초미세여과법, 투석법, 크기별 용출(Size-exclusion) 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등이 정제비용 및 시간이 많이 소모된다는 단점이 있다.

예를 들어, 암모늄 설페이트 침전법의 경우 고농도의 염 용액 속에서는 단백질이 뭉쳐서 침전하는 경향이 있다. 염(salt)의 이온 강도는 각 이온의 농도에 비례하므로 염(salt)을 많이 넣으면 용액의 이온력(ionic strength)가 증가한다. 염(salt)의 양이 많아질수록 단백질이 침전되는 것이다. 각각의 단백질이 염(salt)에 의해 다르게 침전하는 특성을 이용해 단백질 정제에 이용되곤 한다. 하지만 침전된 단백질은 염(salt)을 용출하기 위하여 투석(Dialysis)이라는 방법을 사용하기 때문에 대량화 하기 위해서는 일정한 온도 조건과 대규모의 시설, 그리고 많은 노동력이 필요로 하여 적당하지 않다.

크로마토그래피 공정은 이동상(분리하고자 하는 물질)과 고정상(분리할 수 있는 지지체)으로 이루어진다. 고정상은 흡착제, 이온교환수지, 다공성 물질 또는 겔 등이 사용되며, 이들은 원통형 관에 충진되어 있다. 이동상에는 분리하려는 용질이 포함된 용액과 용액을 고정상으로 운반하는 용출액이 있다. 시료성분은 고정상과 이동상으로 분배를 반복하면서 고정상 내를 이동하는데 각 성분에 따라 그 분배의 비율이 다르고, 고정상 내의 이동속도에 차이가 생겨 각 성분이 분리된다. 따라서 고정상의 가격이 매우 고가이며 공정이 매우 까다로운 단점이 있다. 이온 교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography)는 이온 또는 하전된 화합물이 정전기적인 힘(electrostatic force)에 의해 이온교환수지에 결합되어 있는 단백질을 용출하는 방법이다. 이온 교환 크로마토그래피의 고정상(분리할 수 있는 지지체)은 다양한 종류의 기능기가 부착된 지지체인 이온교환수지(ion exchange resin)을 사용한다. 단백질을 분리하기 위해서 역시 고정상의 가격이 매우 고가이며 공정이 매우 까다로운 단점이 있다.

또한, 단백질의 농축을 위해서는 시료를 대량화하여 생산해야 하는 단점이 있다.

1. 미국 공개특허 제2003-0161818호, 2003.08.28

1. Developmental Brain Research, vol.152, pp. 189-197, 2004

이에, 본 발명자들은 알코올류 극성용매를 사용하여 컨디션드 배지에 있는 유효성분을 분리 및 농축하여 세포의 분열 및 분화에 대한 효과를 확인하고, 유효성분을 대량생산화는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 컨디션드 배지 내 유효성분을 효과적으로 분리 농축하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 통해 유효성분이 고농축된 컨디션드 배지 분말 및 이의 약제학적 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포를 무혈청 배지에서 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계; 및

알코올, 알코올 수용액 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 극성용매와 상기 컨디션드 배지를 반응시키는 단계를 포함하는 컨디션드 배지 분말의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 컨디션드 배지 분말의 제조방법에 따라 제조되고, 유효성분으로 Decorin, MCP-1, DKK-3 및 TIMP-2를 포함하는 컨디션드 배지 분말을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 컨디션드 배지 분말을 포함하는 줄기세포 분열 및 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명은 세포 배양액 내 유효성분을 알코올류 극성용매를 이용하여 분말화함으로써 제조공정이 단축되고 저비용으로 고효율의 유효성분을 획득할 수 있다.

본 발명의 줄기세포 컨디션드 배지 분말은 성장인자, 사이토카인 등의 유효성분이 고농축되어 있어 줄기세포의 분열 및 분화에 뛰어난 효과를 나타낼 수 있다.

도 1은 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 컨디션드 배지 분말을 골수 유래 중간엽 줄기세포에 처리하여 세포분열 능력을 조사한 결과이다.
도 2는 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 컨디션드 배지 분말을 골수 유래 중간엽 줄기세포에 처리하여 세포증식율을 조사한 결과이다.
도 3은 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 컨디션드 배지 분말을 골수 또는 치수 유래 줄기세포에 처리하여 줄기세포의 골아세포로의 분화 능력을 조사한 결과이다.
도 4는 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 컨디션드 배지 분말의 구성 성분을 분석한 그래프이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 세포를 무혈청 배지에서 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계; 및

본 발명은 세포를 적정한 배지 및 조건에서 배양한 후 유효성분을 포함한 컨디션드 배지(무혈청 배지 배양액)를 알코올류 극성용매를 이용하여 상기 유효성분을 고농축시키는 것을 특징으로 한다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 컨디션드 배지 분말의 제조방법은 줄기세포의 무혈청 배지 배양액인 컨디션드 배지 분말 내에 유효성분을 다량 함유함으로써 상기 분말이 줄기세포의 분열과 분화에 뛰어난 효과를 갖도록 할 수 있다.

본 발명의 컨디션드 배지 분말의 제조방법은 컨디션드 배지 내에 유효성분을 저비용 고효율로 농축함으로써 경제성을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 컨디션드 배지 분말의 제조방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.

제1단계는 세포를 무혈청 배지에서 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계이다.

본 명세서에서, "컨디션드 배지(conditioned medium)" 란 세포를 세포분열 최성기인 대수성장기에 도달했을 때 무혈청 배지로 교환한 후 배양액만 수거한 배지를 말한다. 이는 분열중인 세포로부터 배지 내에서 추출되어 나오는 미지의 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine)을 이용하는 것을 말한다. 일 구체예에 따르면 상기 컨디션드 배지는 골수 또는 치수 유래 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 후 골수 또는 치수 유래 중간엽 줄기세포를 제거한 용액을 포함하는 것으로서, 골수 또는 치수 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 성장인자, 사이토카인 등의 물질이 풍부하게 함유되어 있을 수 있다.

상기 세포는 통상의 세포배양에 사용할 수 있는 세포라면 특별히 제한하는 것은 아니며, 예컨대 줄기세포일 수 있다.

상기 줄기세포는 다음의 특성을 나타내는 골수 또는 치수 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있다:

(a) CD90, CD105, CD44 및 CD73 에 대하여 모두 양성의 면역학적 특징을 나타내고, (b) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내며, (c) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서, "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)"라 함은 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등에도 존재하며, 이들로부터 수득할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 골수 또는 치수 유래의 중간엽 줄기세포를 의미한다.

본 발명에서 "분화(differentiation)"란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 다능성 중간엽 줄기세포는 계통이 한정된 전구세포(예컨대, 중배엽성 세포)로 분화한 후, 다른 형태의 전구세포로 더 분화될 수 있고(예컨대, 골모세포 등), 그 뒤 특정 조직(예컨대, 뼈 등)에서 특징적인 역할을 수행하는 말기 분화세포(예컨대, 지방세포, 골세포, 연골세포 등)로 분화될 수 있다.

또한, 상기 무혈청 배지는 혈청을 포함하지 않는 초기단계 세포배양을 위한 배지로서 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지라면 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), aMEM(alpha Minimal essential Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute medium) 등을 사용할 수 있다.

상기 무혈청 배지는 상기 배지에 성장인자 또는 사이토카인을 더 포함할 수 있다.

상기 성장인자로 IGF, bFGF, TGF, HGF, EGF, VEGF 또는 PDGF 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 사이토카인으로 IL-1, IL-4, IL-6, IFN-r, IL-10 또는 IL-17 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 컨디션드 배지는 세포를 25 내지 40 ℃에서 1 내지 3일간 무혈청 배지에서 배양하여 제조할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

일 구체예에 따르면, 줄기세포를 이용하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계는

분리된 골수, 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸 유래의 세포를 혈청 함유 배지에서 계대배양하여 골수 또는 치수 유래의 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계; 및

상기 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포는 골수, 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸 내에 존재하는 세포 중에서 정제과정을 거쳐 수득할 수 있으며, 각 조직의 특성에 따라 줄기세포를 추출하는 과정은 공지의 방법을 사용할 수 있는 당업자의 주지의 사실이며, 현재는 인간 유래의 중간엽 줄기세포를 연구용 목적으로 사용 가능한 세포주를 판매하고 있어 쉽고 용이하게 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있다.

중간엽 줄기세포의 배양 과정과 관련하여 필수적으로 포함되는 과정들은 문헌들을 통해 공개되어 있으며, 세포배양에 앞서 공지의 방법을 통해 공급원으로부터 추출한 생검 즉, 골수, 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸 등은 일반적인 항생제를 포함한 세척배지를 이용한 반복적인 세척과정을 통해 후속배양에서의 오염 가능성을 최소한으로 감소시킬 수 있다.

혈청을 포함한 초기단계 세포배양을 위한 배지는 중간엽 줄기세포와 같은 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지인 것이 좋다. 본 발명에서는 일반적으로 세포배양에 사용하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), aMEM(alpha Minimal essential Medium)을 사용하고, 세포배양에 통상적으로 사용되는 혈청을 포함한다.

혈청은 0.1 내지 20％의 소 태아 혈청(FBS)을 첨가하는 것이 좋고, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가하는 것이 좋다.

항생제로는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 폰지존(fungizone) 등의 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있다. 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있다.

필요에 따라 글루타민 등의 산화영양소와 소디움 피루베이트등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 배지는 1∼2mM 의 글루타민, 0.5∼1mM 소디움 피루베이트, 5∼10％ FBS, 1％ 항생제(100IU/mL)로 보충된 글루코오스 및 DMEM을 함유하는데 이를 완전혈청배지라 한다. 이때 글루코오스의 농도범주는 대략적으로 1g/L∼4.5g/L일 수 있다. 상기 완전혈청배지는 골수 또는 치수 유래 줄기세포의 보관과 유지 및 시험관내 안정된 기본배양조건을 제공해 주며 효과적인 세포의 안정화를 보여준다.

초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90∼95％, 온도 35∼39℃, 5∼10％ CO₂ 배양기에서 배양하고, 5∼10％ CO₂ 배양 시에는 최종농도가 0.17∼0.22 중량％가 되게 소디움 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해줄 수 있다.

초기배양 단계 동안 조직단편은 배양 용기 바닥에 부착된 상태를 유지시키는 게 바람직하며, 세포 배양의 표준 기술에 따른 트립신-EDTA 처리로 인한 짧은 자극으로 성장을 촉진할 수 있다.

누적집단배증시간(doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 75∼85％ 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게는 80％ 합류시기에 세포를 채취하여 계대배양을 한다.

상기 단계 배양된 골수 또는 치수 유래의 줄기세포를 무혈청 배지에서 25 내지 40 ℃에서 1 내지 3일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조한다.

본 발명의 컨디션드 배지 분말의 제조방법에 있어서, 제2단계는 컨디션드 배지와 알코올류 극성용매를 반응시켜 유효성분을 농축시키는 단계이다.

상기 알코올류 극성용매는 탄소수 1 내지 6의 저급 알코올, 상기 알코올의 희석용액, 예컨대, 95%, 90% 알코올 수용액, 또는 환원제에 의해 아이소프로필 알코올이 되는 아세톤 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.

본 명세서에서, 알코올 수용액은 알코올의 희석용액을 의미하는 것으로, 예를 들어, 95% 에탄올, 90% 에탄올 등을 포함할 수 있다.

상기 알코올류 극성용매는 컨디션드 배지에 대하여 2 내지 5배의 중량비의 함량으로 혼합될 수 있다. 상기 범위 내일 경우, 컨디션드 배지 내의 유효성분의 효과적인 농축을 얻을 수 있다.

상기 컨디션드 배지와 알코올류 극성용매의 반응은 -30 내지 0 ℃에서 5 내지 500분 동안 수행될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 컨디션드 배지를 원심분리 한 후 상층액을 수득하고, 상기 상층액에 100% 알코올을 부가하여 -30 내지 0 ℃에서 5 내지 500분 동안 방치한다. 이를 원심분리 한 후 침전물에 90% 알코올을 부가하여 다시 원심분리 한다. 이로부터 얻은 침전물에 멸균수를 첨가하여 현탁한 후 동결한다.

상기 단계를 거친 반응물을 6 내지 10 시간 동안 동결 건조하는 단계를 더 거칠 수 있다.

상기 동결 건조 후 분말 형태의 제제로 얻을 수 있다.

본 발명의 컨디션드 배지 분말의 제조방법에 따라 제조된 분말 형태의 제제는 유효성분이 고농축으로 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명은 유효성분으로 Decorin, MCP-1, DKK-3 및 TIMP-2를 포함하는 컨디션드 배지 분말을 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 컨디션드 배지 분말에는 Decorin, MCP-1, DKK-3, TIMP-2, Angiogenin, Follistatin, Osteoprotegerin, betaIG-H3, MMP-10, MMP-7, LYVE-1, XEDAR, IL-22, RANK, IGFBP-6, Axl, FLRG, NRG1-beta1, PAI-1, Ferritin, Galectin-7, Resistin, Bate2 M, TSLP, VEGF-C, CD40, sTNT R1, IL-6, TRAIL R2, Osteopontin, TIMP-1, Growth Hormon, Thromboppoietin, CXCL-16, DPPIV, HVEM, IL-17B, IL-3, bFGF, IFN-r, TGF, HGF 또는 PDGF 등이 포함될 수 있다.

상기 컨디션드 배지 분말은 유효성분으로 Decorin, MCP-1, DKK-3 및 TIMP-2를 다량 포함하고 있어 줄기세포의 분열 및 분화를 촉진하는 뛰어난 효과를 나타내므로, 본 발명은 또한 상기 컨디션드 배지 분말을 포함하는 줄기세포 분열 및 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 컨디션드 배지 분말은 줄기세포 분열 및 분화 촉진용 조성물 100 중량부에 대하여 1 내지 20 중량부로 포함되는 것이 좋다.

본 발명의 줄기세포 분열 및 분화 촉진용 조성물은 줄기세포가 분비하는 활성 단백질 복합물을 함유함으로써 줄기세포를 사용할 때 나타날 수 있는 면역학적 문제점, 안전성에 대한 문제점, 제제학적 문제점, 개체 편차를 최소화할 수 있다. 또한 인체 내 세포 주입으로 인하여 발생할 수 있는 부작용을 근본적으로 방지할 수 있다.

본 발명의 줄기세포 분열 및 분화 촉진용 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제,향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 예컨대 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여 중 경피투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은, 경구형 제형인 경우 성인 기준으로 0.1∼100 ㎎/kg의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1일당 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 골수 유래 중간엽 줄기세포의 수득

골수 유래 중간엽 줄기세포 hMSC는, Human Mesenchymal stem cells (Lonza, PT-2501)에서 구매하였고, 22세 건강한 여자의 골수로부터 분리된 세포였다. 골수 유래 중간엽 줄기세포의 초기 계대배양은 4.5g/L의 D-글루코스, 584mg/L의 L-글루타민, 110mg/L의 소디움피루베이트 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로써 암포테리신B가 보충된 DMEM 배지에 가하고, 약 90%의 습도 및 약 37 ℃ 온도 조건 하에서 5 % CO₂ 배양기에서 배양하였다.

계대배양은 배양액을 제거한 플라스크를 인산완충용액으로 세척하고 0.25% Trypsin-EDTA(GIBCO)로 세포를 떨어뜨린 후 세포 부유액을 원심분리 한 다음, 세포수 측정과 생존능을 검사한 뒤 다시 3배로 계대배양 하였다.

계대배양에 사용한 배지는 4.5g/L의 D-글루코스, 584mg/L의 L-글루타민, 110mg/L의 소디움피루베이트, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로써 암포테리신B가 보충된 DMEM 배지였다.

세포의 컨플루언시가 약 70∼80%가 되었을 때 파이펫을 사용하여 배양된 배양물로부터 배양액을 제거한 후, 인산완충용액으로 2회 세척한 후, 4.5g/L의 D-글루코스, 584mg/L의 L-글루타민, 110mg/L의 소디움피루베이트, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 폰지존이 보충된 DMEM 배지를 가한 후 약 90%의 습도 및 약 37℃ 온도 조건 하에서 5% CO₂ 배양기에서 48시간 배양하였다.

<실시예 2> 무혈청 배지 분말 제제의 제조

상기 실시예 1에서 배양한 배양액 50mL을 1500rpm에서 5분 동안 원심분리한 뒤 상층액을 새로운 튜브로 옮긴 후 3000 rpm에서 3분 동안 원심분리한 뒤 잔여 부유물을 제거한 뒤, 100% 에탄올을 3배 첨가하여 -20℃에 한 시간 동안 방치하였다. 이후 15분간 4℃에서 15000rpm으로 원심분리 하였다. 이후 침전물에 90% 에탄올을 처리하여 다시 15000rpm으로 7분간 원심분리 하였다. 원심분리 한 침전물에 멸균수 2.5mL을 첨가하여 침전물을 녹인 후에 1.8mL-튜브에 500㎕씩 분주한 후 -80℃ 디프리져에서 3시간 방치하였다. 이후 동결건조를 8시간 진행한 후 분말 형태로 제조하였다.

<실시예 3> 성인, 유치 치수 줄기세포의 수득

성인 치아 및 유치(젖니)의 치수 줄기세포는 치아 발치 시 공여 되는 치아에서 분리하였다. 치아에서 치수를 회수한 다음 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로써 암포테리신 B가 보충된 a-MEM배지 10mL에 콜라게네이즈(3mg/mL) 및 디스페이즈(4mg/mL)를 첨가하여 치수에 처리하여 약 90%의 습도 및 약 37℃ 온도 조건하에서 5% CO₂ 배양기에서 한 시간 반응 시켰다. 반응이 끝난 조직을 70㎛의 스트레이너에 통과시켜서 세포를 수득하였다.

치수 줄기세포의 초기 계대배양은 a-MEM, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로써 암포테리신B가 보충된 DMEM 배지에 가하고, 약 90%의 습도 및 약 37℃ 온도 조건 하에서 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

계대배양에 사용한 배지는 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로써 암포테리신B가 보충된 a-MEM 배지였다.

세포의 컨플루언시가 약 70∼80%가 되었을 때 파이펫을 사용하여 배양된 배양물로부터 배양액을 제거한 후, 인산완충용액으로 2회 세척한 후 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 폰지존이 보충된 DMEM 배지 또는 aMEM을 가한 후 약 90%의 습도 및 약 37℃ 온도 조건 하에서 5% CO₂ 배양기에서 48시간 배양하였다.

<실시예 4> 무혈청 배지 분말 제제의 제조

상기 실시예 3에서 배양한 배양액 50mL을 1500rpm에서 5분 동안 원심분리한 뒤 상층액을 새로운 튜브로 옮긴 후 3000 rpm에서 3분 동안 원심분리한 뒤 잔여 부유물을 제거한 뒤, 100% 에탄올을 첨가하여 -20℃에 한 시간 방치하였다. 이후 15분간 4℃에서 15000rpm으로 원심분리 하였다. 이후 침전물에 다시 90% 에탄올을 처리하여 15000rpm으로 7분간 원심분리 하였다. 원심분리 한 침전물에 멸균수 2.5mL을 첨가하여 침전물을 녹인 후에 1.8mL-튜브에 500㎕씩 분주한 후 -80℃ 디프리져에서 3시간 방치하였다. 이후 동결건조를 8시간 진행한 후 분말 형태로 제조하였다.

<실시예 5> 세포분열 능력 분석

골수 유래 중간엽 줄기세포에 상기 실시예 2 및 4에서 제조된 컨디션드 배지 분말을 배양배지 100 중량부에 대해 10중량부로 첨가한 다음 세포 증식율을 세포 수 측정(Cell counting) 및 MTT 분석을 실시하여 5일간 평가하였다(각 그룹 당 n=3).

도 1에 나타난 바와 같이, 컨디션드 배지 분말을 첨가하지 않은 대조군에 비해 세포수가 현저히 증가하여 상기 실시예 2 및 4에서 제조된 컨디션드 배지 분말은 세포분열을 촉진함을 알 수 있었다.

<실시예 6> 콜로니 형성 능력

골수 유래 중간엽 줄기세포에 상기 실시예 2 및 4에서 제조된 컨디션드 배지 분말을 배양배지 100 중량부에 대해 10중량부로 첨가한 다음 세포 증식율을 콜로니 형성능력을 확인하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 2 및 4에서 제조된 컨디션드 배지 분말 둘 다 골수 유래 중간엽 줄기세포(BMMSC)의 콜로니 형성 능력을 향상시킴을 알 수 있었다.

<실시예 7> 골분화 능력 테스트

골수 유래 중간엽 줄기세포 및 치수 유래 줄기세포를 골아세포로 분화시키기 위해, 상기 줄기세포들에 상기 실시예 2 및 4에서 제조된 컨디션드 배지 분말을 배양배지 100 중량부에 대해 10중량부로 각각 첨가한 다음 100mM 덱사메타손(dexamethasone), 10mM β- 글리세롤 인산염(β-glycerol phosphate) 및 50nM 아스코르브산-2-인산염(ascorbate-2-phosphate)과 10% 우태아혈청으로 처리하였다. 골아세포로 분화되었는지 여부는 골아세포의 경우 알리잘린 레드(Alizarin red) 염색법을 사용하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 2 및 4에서 제조된 컨디션드 배지 분말은 각각 골수 유래 줄기세포와 치수 유래 줄기세포의 골아세포로의 분화를 촉진함을 알 수 있었다.

RSD: 유치로부터 분리한 세포를 DMEM에서 배양한 후 제조한 컨디션드 분말을 10% 처리한 시료
RSa: 유치로부터 분리한 세포를 aMEM에서 배양한 후 제조한 컨디션드 분말을 10% 처리한 시료
RDa: 성인치아로부터 분리한 세포를 aMEM에서 배양한 후 제조한 컨디션드 분말을 10% 처리한 시료
RDD: 성인치아로부터 분리한 세포를 DMEM에서 배양한 후 제조한 컨디션드 분말을 10% 처리한 시료
RBD: 골수 유래 중간엽 줄기세포를 DMEM에서 배양한 후 제조한 컨디션드 분말을 10% 처리한 시료
RBa: 골수 유래 중간엽 줄기세포를 aMEM에서 배양한 후 제조한 컨디션드 분말을 10% 처리한 시료
SHED: Stem cells From Human Exfoliated Deciduous Teeth(인간의 자연 탈락되는 유치 또는 젖니 유래 줄기세포) 컨디션드 배지
DPSC: Dental Pulp Stem Cell(치아 치수 줄기세포) 컨디션드 배지

Claims

골수 또는 치수 유래 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계; 및
상기 컨디션드 배지 및 100% 에탄올을 1: 2 내지 5의 중량비로 혼합하여 -30 내지 0 ℃에서 5 내지 500분 동안 에탄올 침전시키고, 이로부터 얻은 침전물에 90% 에탄올을 처리하여 원심분리 후 동결건조시키는 단계를 포함하는 컨디션드 배지 분말의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서,
골수 또는 치수 유래 줄기세포는 다음과 같은 특성을 나타내는 골수 또는 치수 유래의 중간엽 줄기세포인 컨디션드 배지 분말의 제조방법:
(a) CD90, CD105, CD44 및 CD73 에 대하여 모두 양성의 면역학적 특징을 나타내고,
(b) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내며,
(c) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가진다.
제1항에 있어서,
무혈청 배지는 성장인자 또는 사이토카인을 더 포함하는 컨디션드 배지 분말의 제조방법.
제4항에 있어서,
성장인자는 IGF, bFGF, TGF, HGF, EGF, VEGF 및 PDGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 컨디션드 배지 분말의 제조방법.
제4항에 있어서,
사이토카인은 IL-1, IL-4, IL-6, IFN-r, IL-10 및 IL-17로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 컨디션드 배지 분말의 제조방법.
제1항에 있어서,
배양은 25 내지 40 ℃에서 1 내지 3일간 실시하는 컨디션드 배지 분말의 제조방법.
삭제
삭제
삭제
제1항 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 제조되고, 유효성분으로 Decorin, MCP-1, DKK-3 및 TIMP-2를 포함하는 치수 유래 줄기세포의 컨디션드 배지 분말.
제1항 및 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 제조되는 골수 유래 중간엽 줄기세포 또는 치수 유래 줄기세포의 컨디션드 배지 분말을 포함하는 골수 유래 중간엽 줄기세포 증식 촉진용 조성물.
제11항의 치수 유래 줄기세포의 컨디션드 배지 분말을 포함하는 치수 유래 줄기세포의 골아세포로의 분화 촉진용 조성물.