CN114848677A - 一种含有干细胞外泌体的组合物和在抗瘢痕、制备抗瘢痕化妆品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有干细胞外泌体的组合物和在抗瘢痕、制备抗瘢痕化妆品中的应用。本发明提供的由脐带间充质干细胞外泌体与人参皂苷Rb1组成的组合物相比脐带间充质干细胞外泌体或人参皂苷Rb1具有更为优异的抗瘢痕作用，协同试验证明脐带间充质干细胞外泌体与人参皂苷Rb1在抗瘢痕活性方面存在明显的协同作用。

Description

一种含有干细胞外泌体的组合物和在抗瘢痕、制备抗瘢痕化 妆品中的应用
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种含有干细胞外泌体的组合物和在抗瘢痕、制备抗瘢痕化妆品中的应用。
背景技术
瘢痕是皮肤组织受损后异常愈合的一种皮肤疾病，主要原因在于瘢痕疙瘩成纤维细胞异常增殖导致细胞胶原分泌量增加进而促使结缔组织增生或变形最终形成瘢痕。瘢痕疙瘩的形成已严重影响患者身心健康，目前临床主要采用手术、药物、激光等技术进行治疗。研究表明，抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖或促进其凋亡可有效改善瘢痕。
外泌体(exos)是细胞外囊泡组成中不可或缺的一部分，广泛存在于人体的各种体液中。外泌体参与调节细胞的生物学行为，包括血管生成、免疫调节、细胞的增殖和迁移等。据报道，外泌体表现出与其来源细胞相似的生物学效应，但相比于外泌体的来源细胞，外泌体有稳定性好、免疫原性低、便于保存运输、剂量易控制等优势，这使得外泌体的应用前景较为明朗。目前，在防治瘢痕这一领域中，研究人员关于外泌体的研究主要集中在间充质干细胞(骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐血间充质干细胞等)、人羊膜上皮细胞、表皮干细胞等。多种干细胞来源的外泌体可通过多种途径抑制瘢痕增生，甚至可成为促进创面无瘢痕修复的治疗工具(外泌体在瘢痕中的作用，生命的化学，2021)。
人参皂苷Rb1主要存在于五加科植物人参的根部，属于固醇类化合物。人参皂苷Rb1具有多种药理活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗病毒与神经保护等。李昕珊等研究发现人参皂苷Rb1可以抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并诱导其凋亡(人参皂苷Rb1对增生性瘢痕影响的研究，天然产物研究与开发，2014)。
现在的问题是，外泌体作为一种生物制品具有生物制品普遍存在的治疗成本较高的不足。与传统小分子化合物联合抑制瘢痕或许可以是一个突破口，实现降本增效的效果。
发明内容
本发明为了克服现有技术的不足，提供一种含有干细胞外泌体的组合物和在抗瘢痕、制备抗瘢痕化妆品中的应用，该组合物由干细胞外泌体和人参皂苷Rb1组成。
本发明技术方案如下：
一种含有干细胞外泌体的组合物，该组合物由干细胞外泌体和人参皂苷Rb1组成。
优选地，所述干细胞外泌体为脐带间充质干细胞外泌体。
优选地，所述干细胞外泌体与人参皂苷Rb1的质量比为1:2。
上述任一组合物在制备抗瘢痕化妆品中的应用。
上述任一组合物在制备抗瘢痕药品中的应用。
有益技术效果：
本发明提供的由脐带间充质干细胞外泌体与人参皂苷Rb1组成的组合物相比脐带间充质干细胞外泌体或人参皂苷Rb1具有更为优异的抗瘢痕作用，协同试验证明脐带间充质干细胞外泌体与人参皂苷Rb1在抗瘢痕活性方面存在明显的协同作用。
附图说明
图1为hUC-MSCs的倒置显微镜下观察图，从图中可以看出hUC-MSCs生长状态良好，且呈梭形旋涡状生长，符合hUC-MSCs的生长形态特点。
图2为MSC-exos的鉴定结果；其中：A为透射电镜观察图，外泌体形态良好；B为粒径分布，粒径大小符合外泌体大小；C为western blot结果，外泌体标志蛋白CD9、CD63和CD81均呈明显的阳性表达。
具体实施方式
下面通过具体的实施例详细介绍本发明实质性内容，但不能以此限定本发明的保护范围。
一、试验材料
人脐带间充质干细胞hUC-MSCs购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司。
人瘢痕疙瘩成纤维细胞HKF购自上海雅吉生物科技有限公司，品牌为ATCC。
人参皂苷20(S)-Rg3、Rb1购自上海源叶生物，规格为分析标准品，HPLC≥98％。
胎牛血清和DMEM低糖培养基购自Gibco公司。
青链霉素、western blot材料和MTT试剂购自碧云天生物。
二、试验方法
1、hUC-MSCs培养
将hUC-MSCs用DMEM完全培养基(体积分数为10％胎牛血清+1％青链霉素+DMEM低糖培养基)置于37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中培养，隔天换液，当细胞达约75％融合时，消化传代。倒置显微镜下观察细胞生长状态。
2、MSC-exos制备和鉴定
2.1MSC-exos制备
取生长状态良好的hUC-MSCs，接种于含有DMEM低糖培养基的培养瓶中，培养72h后，收集培养上清液，加入100kD超滤离心管中，4000×g离心30min，弃上清液，加入pH 7.4的PBS重悬，梯度离心(300×g离心10min，2000×g离心10min，10000×g离心30min，100000×g离心70min×2次)，收集贴壁的淡黄色沉淀物即得外泌体。pH 7.4的PBS重悬，-80℃冻存。
2.2MSC-exos鉴定
(1)透射电镜观察和粒径测定
取适量外泌体的PBS悬液，滴加于铜网上，静置5min，吸去残余液体，置于磷钨酸(pH 6.8)液滴上行负染5min，采用透射电镜观察并拍照。
粒径采用纳米颗粒分析仪检测。
(2)Western blot检测外泌体标志蛋白
取适量外泌体，裂解提取总蛋白，使用BCA试剂盒测量蛋白质浓度。取40μg总蛋白上样经SDS-PAGE凝胶电泳，然后转移到PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭2h，加入抗CD9、CD63和CD81的一抗，4℃孵育过夜，PBS洗涤，二抗常温孵育1h，PBS洗涤，加入ECL化学发光液，凝胶成像系统显影后进行拍照。
3、HKF培养
将HKF用DMEM完全培养基(体积分数为10％胎牛血清+1％青链霉素+DMEM低糖培养基)置于37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中培养，隔天换液，当细胞达约85％融合时，消化传代。
4、HKF增殖抑制试验
取对数生长期的HKF细胞，消化用完全培养基重悬，接种于96孔板中，每孔100μL、1×104个细胞，置于37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中培养。24h后，根据如下分组加入100μL含药或不含药培养基，混匀，继续培养48h。每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液，继续培养4小时，吸弃孔内液体，用150μLDMSO复溶，振荡10min，于570nm波长下测定各孔的吸光度值。分组如下，每组5个复孔：
对照组：完全培养基；
单MSC-exos(低浓度)：含终浓度10μg/mL的MSC-exos；
单Rg3(低浓度)：含终浓度20μg/mL的20(S)-Rg3；
单Rb1(低浓度)：含终浓度20μg/mL的Rb1；
MSC-exos+Rg3(低浓度)：含终浓度10μg/mL的MSC-exos+20μg/mL的20(S)-Rg3；
MSC-exos+Rb1(低浓度)：含终浓度10μg/mL的MSC-exos+20μg/mL的Rb1；
单MSC-exos(高浓度)：含终浓度20μg/mL的MSC-exos；
单Rg3(高浓度)：含终浓度40μg/mL的20(S)-Rg3；
单Rb1(高浓度)：含终浓度40μg/mL的Rb1；
MSC-exos+Rg3(高浓度)：含终浓度20μg/mL的MSC-exos+40μg/mL的20(S)-Rg3；
MSC-exos+Rb1(高浓度)：含终浓度20μg/mL的MSC-exos+40μg/mL的Rb1。
根据如下公式计算药物组HKF增殖抑制率。
抑制率(％)＝(对照组吸光度值-药物组吸光度值)÷对照组吸光度值×100％
5、数据处理
采用SPSS 20.0软件进行分析，数值以平均值±s表示。两组间数据比较采用独立样本t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析。协同作用评价指标采用金正均Q值法：当Q值小于0.85时，认为两种药物存在拮抗效应；当Q值介于0.85到1.15之间时，认为两种药物之间相互独立，为相加效应；当Q值大于1.15时，认为两种药物存在协同作用(金正均.合并用药中的相加.中国药理学报,1980)。
三、试验结果
1、hUC-MSCs培养鉴定
hUC-MSCs生长状态良好，倒置显微镜下观察图如图1，呈梭形旋涡状生长，符合hUC-MSCs的生长形态特点。
2、MSC-exos制备鉴定
透射电镜观察图如图2中A，外泌体形态良好；粒径分布如图2中B，粒径大小符合外泌体大小；外泌体标志蛋白CD9、CD63和CD81均呈明显的阳性表达，如图2中C。
3、HKF增殖抑制率和协同参数计算
各组吸光度值、增殖抑制率、金正均Q值计算公式和结果如表1(见下页)，MSC-exos与人参皂苷Rg3或人参皂苷Rb1在抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖方面均呈现明显的协同效应。MSC-exos与人参皂苷Rg3或人参皂苷Rb1联合抑制瘢痕可以实现降本增效的效果。
表1各组吸光度值、增殖抑制率、金正均Q值计算公式和结果
Figure BDA0003596362040000051
根据金正均Q值法，当Q值大于1.15时，认为两种药物存在协同作用，且Q值越大代表协同作用越强。上表说明，MSC-exos与人参皂苷Rg3或人参皂苷Rb1在抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖方面均呈现明显的协同效应。该结果表明，MSC-exos与人参皂苷Rg3或人参皂苷Rb1联合抑制瘢痕可以实现降本增效的效果。因此，MSC-exos与人参皂苷Rg3或人参皂苷Rb1的组合物可以用于制备抑制瘢痕的化妆品或药品。

Claims (5)

1.一种含有干细胞外泌体的组合物，该组合物由干细胞外泌体和人参皂苷Rb1组成。
2.根据权利要求1所述的组合物，所述干细胞外泌体为脐带间充质干细胞外泌体。
3.根据权利要求2所述的组合物，所述干细胞外泌体与人参皂苷Rb1的质量比为1:2。
4.权利要求1～3任一所述组合物在制备抗瘢痕化妆品中的应用。
5.权利要求1～3任一所述组合物在制备抗瘢痕药品中的应用。
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