KR20150008306A - 인터페론-감마를 유효성분으로 포함하는 배지 조성물 및 이를 이용한 이식 거부 반응이 제거된 유도 만능 줄기세포의 제조 방법 - Google Patents

인터페론-감마를 유효성분으로 포함하는 배지 조성물 및 이를 이용한 이식 거부 반응이 제거된 유도 만능 줄기세포의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인터페론-감마를 유효성분으로 포함하는 배지 조성물 및 이를 이용한 이식 거부 반응이 제거된 유도 만능 줄기세포 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 인터페론-γ는 유도 만능 줄기세포의 MHC 클래스Ι 발현을 증가시켜, 인터페론-γ가 포함된 배지 조성물을 이용하여 유도 만능 줄기세포를 배양하여 상기 세포를 수여자에게 이식하는 경우, 이식 거부 반응이 제거되어 환자 맞춤용 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

인터페론-감마를 유효성분으로 포함하는 배지 조성물 및 이를 이용한 이식 거부 반응이 제거된 유도 만능 줄기세포의 제조 방법{Media composition comprising interferon-γ and method for producing iduced pluripotent stem cell having none-graft rejection}
본 발명은 인터페론-감마를 유효성분으로 포함하는 배지 조성물 및 이를 이용한 이식 거부 반응이 제거된 유도 만능 줄기세포의 제조 방법에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)란, 미분화 상태를 유지하면서 무한히 증식할 수 있으며 일정한 환경과 조건이 주어질 경우 특정 기능과 형태를 갖도록 분화할 수 있는 세포를 말한다. 다능성줄기세포(human pluripotent stem cell)는 적당한 체외 배양조건에서 무한 증식(자가재생산능; self-renewal)을 할 수 있고, 개체를 이루고 있는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 특성(다능성 또는 전분화능; pluripotency)으로 인해 개체의 발생, 분화 및 성장에 대한 기초 지식 이해 측면뿐만 아니라 개체의 손상 또는 다양한 질병의 근복적인 치료 방법인 세포 치료제 개발 및 다양한 신약후보물질의 약효 검색, 질환의 원인 규명, 치료법 개발 등 다양한 측면에서 이를 대상으로한 연구성과의 활용범위가 확대되고 있다.
그러나, 줄기세포를 이용한 치료제의 경우, 제한된 배아로부터 유래하므로 각 개체간 면역 적합성 부재로 인하여 세포 치료제로 개발 시 이식 거부반응을 피할 수 없다. 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 최근 역분화 인자를 이용하여 성체세포로부터 배아줄기세포와 거의 유사한 다능성줄기세포의 특성을 가진 유도만능줄기세포를 제작하는 방법이 성공(Cell 126, 663-676, 2006; Cell 131, 861-872, 2007; Nature 441, 1061-1067, 2006; Nature 451, 141-146, 2008)함에 따라 다능성줄기세포를 이용한 줄기세포 실용화 기술 개발에 대한 기대가 높아지고 있는 실정이다. 특히, 유도 만능 줄기세포는 제작과정에 배아가 필요하지 않으며, 환자 자신에게서 추출한 세포를 이용하는 경우 면역거부에 대한 문제가 없어 기술적인 활용가치가 매우 높다. 이에, 역분화 효율을 증진시키기 위한 방법론으로 세포 외부 환경조절이나 첨가물 특히, 저분자 화합물을 이용한 유도효율 증가에 대한 성공사례들이 보고되고 있다. 또한, 배아줄기세포의 환경과 유사한 저산소 상태에서 역분화 줄기세포의 유도 효율이 효과적으로 증가됨이 보고된바 있으며(Cell Stem Cell, 5: 237-241, 2009), Ding 박사팀(Shi et al., Cell Stem Cell, 2008)은 BIX-01294(G9a histone methyltransferase inhibitor), BayK8644(L-type calcium channel agonist), RG108(DNA methyltransferase inhibitor)등의 저분자 화합물이
Melton 박사팀(Huangfu et al., Nat Biotechnol, 2008)은 VPA(histone deacetylase inhibitor), TSA(histone deacetylase inhibitor), SAHA(histone deacetylase inhibitor)등의 저분자 화합물이 역분화 유도 효율을 증진시키는데 효과적임을 보고한바 있다. 바이러스 사용을 대체할 수 있는 방법론 개발에 있어 1) 다단백질발현단일벡터(single nonviral polycistronic vector)를 이용한 일시적 발현 기술(Gonzalez et al, PNAS USA, 2009; Chang et al, Stem cells, 2009), 2)아데노바이러스 형질도입 기술(Stadtfeld et al, Science 2008), 3)Cre/loxP 재조합 발현제어시스템 개발(Soldner et al, Cell, 2009). 다단백질 발현 단일벡터를 이용하여 iPSC를 확립하고, Cre 형질감염을 통해 역분화카세트 제거하는 기술(kaji et al, Nature, 2009), 4) piggyBac(PB)전이인자시스템(transposon system) 개발(Woltjen et al, Nature, 2009; kaji et al, Nature, 2009), 5)비 삽입성 에피솜 벡터( nonintegrating episomal vectors) 개발(Yu et al, Science, 2009)등에 대한 연구 결과가 도출되고 있으나, 여전히, 유전자 이상, 암화 유발 가능성 및 이식거부 현상을 완전히 배제하지 못하고 있는 실정이다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 적당한 동물 모델을 이용한 임상 전 평가가 필요하다. 그러나, 마우스의 경우 인간과 크기, 수명, 대사율 및 면역 시스템 특징이 상이하다. 그러나, 돼지의 경우, 상당한 부분 인간과 유사한 부분이 많고, 특히 돼지의 선천적 면역 시스템은 인간의 면역 시스템과 상당히 유사한 것으로 보고되고 있다.
한편, 일반적으로 이식된 유도 만능 줄기세포는 MHC 클래스 Ι의 발현이 낮다면 자연 킬러 세포의 표적화가 되기 때문에, MHC 클래스 Ι 분자를 낮은 수준으로 세포 표면으로 발현하기 때문에 자가 면역 시스템의 중요한 타겟이 된다는 점이 보고되고 있다. 따라서, MHC 클래스 I의 발현을 증가시킨다면, 이식 거부 반응을 낮출 수 있다.
한편, 인터페론은 항바이러스성 및 항증식성 활성를 나타내는 사이토카인의 하나이다. 생화학 및 면역학적 특성을 기초로 인체 인터페론은 3종류로 분류된다(인터페론-알파(백혈구), 인터페론-베타(섬유아세포) 및 인터페론-감마(면역)). 면역과 관련된 인터페론-γ가 바이러스에 대하여 방어와 관련한 기작은 밝혀졌으나, 유도 만능 줄기세포에서 MHC 클래스 Ι의 발현과 관련이 있다는 점에 대하여 밝혀진 바 없다.
이에 본 발명자들은 사람과 유사한 돼지의 귀 섬유아세포로부터 역분화된 유도 줄기 만능세포를 제조하였고, 상기 유도 만능 줄기세포에 인터페론-γ를 처리하는 경우, MHC 클래스Ι 발현이 증가됨을 확인함으로써, 이식 거부 반응이 감소될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인터페론-γ를 유효성분으로 포함하는 이식 거부 반응이 제거된 유도 만능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포 배양용 배지 조성물을 제공함에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 배지 조성물 상에서 유도 만능 줄기세포를 배양하는 단계;를 포함하는, 이식 거부 반응이 제거된 유도 만능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포의 제조 방법을 제공함 있다.
본 발명은 인터페론-γ를 유효성분으로 포함하는 이식 거부 반응이 제거된 유도 만능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포 배양용 배지 조성물을 제공함에 있다.
본 발명은 상기 배지 조성물 상에서 유도 만능 줄기세포를 배양하는 단계;를 포함하는, 이식 거부 반응이 제거된 유도 만능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포의 제조 방법을 제공함 있다.
본 발명의 인터페론-γ는 유도 만능 줄기세포의 MHC 클래스Ι 발현을 증가시켜, 인터페론-γ가 포함된 배지 조성물을 이용하여 유도 만능 줄기세포를 배양하여 상기 세포를 수여자에게 이식하는 경우, 이식 거부 반응이 제거되어 환자 맞춤용 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 돼지의 유도 줄기 만능 세포 제조 후, 배아 단계에 따른 형태 나타낸 도이다(a:돼지의 섬유아세포의 단계 이미지; b 및 c:MEF 영양세포 상의 돼지의 iPSC; d: 알칼린 포스파타제(AP)로 염색한 돼지의 iPSC 콜로니).
도 2 면역 염색법을 이용한 돼지의 유도 만능 줄기세포에서 SSEA-1, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-91, SOX2 및 OCT4의 발현을 확인한 도이다.
도 3 및 도 4는 면역 염색법을 이용한 돼지의 유도 만능 줄기세포에서 SOX2 및 OCT4의 발현을 확인한 도이다.
도 5는 RT-PCR을 이용한 돼지의 유도 만능 줄기세포에서 SOX2, OCT4, NANOG, LIN28, REX1, CDH1 및 DNMT의 발현을 확인한 도이다.
도 6은 돼지의 유도 만능 줄기세포의 배상체 형성 및 분화를 확인한 결과를 나타낸 도이다(도 6의 a:배양 5일, b: 배양 10일, c: 배양 후 조직 배양 플레이트에 옮긴 후 2주 후, d 및 e:외배엽, f 및 g:중배엽, h 및 i: 내배엽)
도 7은 RT-PCR을 이용한 돼지의 유도 만능 줄기세포의 삼배엽 형성 및 전분화능이 있는지 여부를 확인한 도이다(내배엽에 대한 마커: Amylase , 중배엽에 대한 마커: Enolase, 외배엽에 대한 마커; Beta - tublin 전분화능에 대한 마커:SOX2 및 OCT4).
도 8은 핵형 분석을 이용하여, 돼지의 유도 만능 줄기세포의 염색체의 관찰결과를 나타낸 도이다.
도 9는 FACS를 이용하여, 돼지의 유도 만능 줄기세포의 분화 단계에 따른 형태를 나타낸 도이다.
도 10은 FACS를 이용하여, 돼지의 유도 만능 줄기세포의 분화 단계에 따른 MHC 클래스 Ι 및 Ⅱ의 발현 정도를 확인한 도이다.
도 11은 인터페론-γ 처리한 경우, 돼지의 유도 만능 줄기세포의 분화 단계에 따른 MHC 클래스 Ι의 발현 정도를 확인한 도이다.
도 12는 인터페론-γ 처리 후, 제거한 경우, 돼지의 유도 만능 줄기세포의 분화 단계에 따른 MHC 클래스 Ι의 발현 정도를 확인한 도이다.
본 발명은 인터페론-γ를 유효성분으로 포함하는 이식 거부 반응이 제거된 유도 만능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 배지 조성물에서 인터페론-γ는 유도 만능 줄기세포의 MHC 클래스Ι 발현을 증가시켜, 인터페론-γ가 포함된 배지 조성물을 이용하여 유도 만능 줄기세포를 배양하여 상기 세포를 수여자에게 이식하는 경우, 이식 거부 반응이 제거되어 환자 맞춤용 개발에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 배지 조성물에서 인터페론-γ의 농도는 배지 조성물에서 0.01ng/ml 내지 15ng/ml, 바람직하게는 1 내지 10ng/ml, 더욱 바람직하게는 6ng/ml가 포함될 수 있다.
본 발명에서 '유도 만능 줄기세포'란, 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 역분화줄기세포 (iPSC: induced pluripotent stem cells)라고도 한다. 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함한다. 유도 만능 줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가지며, 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여주며, 유전자, 단백질 발현 패턴이 유사하며, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 가지며, 테라토마 (teratoma)를 형성하고, 생쥐의 배반포 (blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라 (chimera) 생쥐를 형성하고, 유전자의 생식선 전이(germline transmission)가 가능하다. 본 발명의 유도 만능 줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 유도 만능 줄기세포를 포함하나, 바람직하게는 돼지의 유도 만능 줄기세포, 더욱 바람직하게는 돼지의 귀 섬유아세포 유래의 유도 만능 줄기세포이다.
본 발명에서 용어 "유도 만능 줄기세포로부터 분화된 세포"는 유도 만능 줄기세포가 성장한 배상체, 삼배엽이 형성된 배아 및 삼배엽 형성 후, 유도 만능 줄기세포로부터 유래한 모든 종류의 세포를 의미한다.
본 발명에서 용어, '배양 배지(culture media)'는 체외배양 조건에서 줄기세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배양액을 의미하고, 줄기세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 또한, 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium; CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 조성물 상에서 유도 만능 줄기세포를 배양하는 단계;를 포함하는 이식 거부 반응이 제거된 유도 만능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포의 제조 방법을 제공한다.
상기 유도 만능 줄기세포는 a)OCT4, SOX2, KLF4 및 cMYC 유전자를 세포에 형질 도입하는 단계; 및 b)상기 형질도입된 세포를 MEF 영양 세포(mouse embryonic fibroblast feeder cell)와 공 배양하는 단계;로 제조된 유도 만능 줄기세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 a)단계에서 OCT4, SOX2, KLF4 및 cMYC 유전자는 세포에 전분화능을 부여하기 위한 역분화를 위한 유전자로서, 상기 유전자들은 줄기세포능을 평가하기 위한 마커로 사용된다.
상기 b)단계는 유도 만능 줄기세포로 제조하는 단계로, DEAM 또는 Ham`s F10 배양배지, 또는 이들의 혼합 배지에서 유도 만능 줄기세포를 제조할 수 있으며, 상기 배지에는 15% FBS, 2mM L-글루타민, 0.01mM 내지 10mM의 비 필수 아미노산, 0.01mM 내지 10mM의 2-머캅토에탄올, 10 내지 30ng/ml의 인간 재조합 섬유아세포 성장 인자 및 10μg/ml의 페니실린-스트렙토마이신을 포함할 수 있다. 또한, 여러번에 걸쳐 계대 배양할 수 있으며, '계대 배양'이란, 세포증식 방법의 하나로 균주를 보존하고 세포의 대를 이어가기 위해 5 내지 7일마다 주기적으로 새로운 배지에 이식시키는 것을 의미하나, 특히 본 발명에서의 '계대(passage)'는 배양용기에서 초기 종배양부터 동일한 배양 용기에 세포가 왕성하게 자라는 시기(confluence)까지의 유도만능줄기세포의 성장으로 정의한다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다. 실시예는 발명을 예시하기 위한 용도일 뿐, 실시예의 기재에 의하여 본 발명의 범위는 제한되지 않는다.
[ 실시예 1]돼지의 귀 섬유아세포로부터 유도 만능 줄기세포의 제조.
1. 돼지의 귀 섬유아세포 분리
돼지의 귀 섬유아세포를 6mm 피부 생검 펀치를 이용하여, 4 개월령의 혼합 교배된 농장의 돼지로부터 얻었다. PEF(porcine embryonic fibroblast)를 분리하기 위하여, 귀 조직을 가위로 짜르고, 높은 농도의 글루코오스를 함유하는 DMEM(Dulbecco`s modifed eagle medium; Hyclone, Logan, Utah), 10% FBS(fetal bovine serum; Hyclone, Logan, Utah), 10μg/ml 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Carlsband, CA)을 포함하는 35mm 접시에 위치시켰다. 7 내지 10일 후에 섬유아세포의 과성장(outgrowth)이 나타나면 트립신화(trypsinization)를 통해 계대 배양하였다.
2.돼지의 귀 섬유아세포 유래의 유도 만능 줄기세포의 제조
OCT4, SOX2, KLF4 및 cMYC 서열과 연결된 피코르나 바이러스의 2A 플라스미드(예일대학교, CT, USA의 박인현으로부터 기증받음)를 포함하는 레트로바이러스 벡터(Retroviral polycistronic vector; pEA-OSKM)를 재프로그램화에 사용하였다. VSV-G(vesicular stomatitis virus G protein vector; plasmid 8454, R weinberg) 및 플라스미드 8455(Gag-Pol vector; R weinberg)를 Addgene으로부터 얻었다. 레트로바이러스는 14μg의 pEA-OSKM, 1.4μg의 VSV-G 및 12.6μgdml Gag-Pil 벡터를 18mM의 폴리에틸렌이민 28μl를 이용하여 T175 플라스크에서 인간의 배아 신장 세포주 293T(이하, HEK293T)에 형질도입하여 생산하였다. 레트로바이러스-함유 배지를 형질도입 2 내지 3일 후에 수집하였고, 0.45㎛ 공극 크기의 필터로 여과하였고, 23,000rpm에서 4℃, 90분 동안 원심분리하여 바이러스 펠렛을 얻었다. 이 후, 돼지의 iPCS(유도 만능 줄기세포)를 생산하기 위하여, 5×104 PEF(돼지의 귀 섬유아세포)를 접시에서 37℃로 하룻밤 동안 배양하였고, 상기 제조된 바이러스를 10의 MOI(multiplicity of infection)로 PEF에 감염시켰다. 또한, 감염시킬 때 프로타민 황산염(protamine sulfate; 5μg/ml)을 감염율을 높이기 위하여 사용하였다. 레트로바이러스를 감염시킨 후, 하루가 지나서 세포를 PBS로 세번 세척하였고, 추가적인 72시간 동안 실시예 1-1과 동일한 배양 배지에 배양하였다. 감염된 세포들을 순차적으로 10cm 접시에 1×106의 MEF 영양 세포(mouse embryonic fibroblast feeder cell)와 함께 이동시켜 배양하였다. 돼지의 배아줄기세포를 얻기 위하여, DEAM(Welgene, Daegue, Korea) 및 Ham`s F10[Invitrogen, Carsbad, CA; 15% FBS(Hyclone, Logan, Utah), 2mM L-글루타민(Invitrogen, Carlsbad, CA), 0.1mM 비 필수 아미노산(invitrogen, Carlsbad, CA), 0.1mM의 2-머캅토에탄올(Sigma, st.Louis, MO), 20ng/ml의 인간 재조합 섬유아세포 성장 인자(Millipore, Billerica, MA) 및 10μg/ml의 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Carlsbad, CA) 포함]의 2:1 혼합 배지에서 배양하였다. 돼지의 유도 줄기 만능 세포 제조 후, 배아 단계에 따른 형태를 도 1에 나타내었다(a:돼지의 섬유아세포의 단계 이미지; b 및 c:MEF 영양 세포 상의 돼지의 iPSC; d: 알칼린 포스파타제(AP)로 염색한 돼지의 iPSC 클로니).
도 1 a 내지 c에 나타난 바와 같이, 레트로바이러스 감염 후 11일 후, 초기 콜로니가 나타났고, 밀착 세포 부착 및 선명한 콜로니 경계를 갖는 배아줄기세포 같은 형상을 관찰하였다. 상기 형상이 나타난 후, 콜로니를 선별하여 각각의 7일 동안 계대 배양하였고, 첫번째 계대 배양 후, 1mg/ml의 콜라게나제 타입 Ⅳ를 1:5 비율로 계대 배양에 이용하였다. 상기 돼지의 iPSC는 25대 계대까지 유지되었으며, DT(doubling time)는 24.9 시간임을 확인하였다.
[ 실시예 2]만능 줄기세포 마커 유전자의 발현 확인
1. AP ( alkaine phosphatase ) 염색 또는 면역염색법을 이용한 만능 줄기세포 마커의 발현 확인
유도 만능 줄기세포의 마커가 발현되는지 확인하기 위하여, AP 검출 키트(Chemicon, Billerica, MA)를 이용하여 AP 염색을 수행하였다. 면역 염색법은 통상의 방법으로 수행하였고, 항체로 항-OCT4(SC-9081, 1:300; Santa Cruz; Dallas TX), 항-SOX2(AB5603, 1:300), 항-SSEA1(stage-specific embryonic antigen-1; MAB4301, 1:50), 항-SSEA4(MAB4301, 1:50), 항-Tra-1-60(MAB4360, 1:50) 및 항-Tra-1-81(MAB4381, 1:50; Millipore; Billerica, MA)를 사용하여 측정하였다. 또한, FITC이 결합된 이차항체를 Millupore로부터 구입하여 사용하였다. 상기의 모든 항체는 PBS에서 1:300으로 희석하여 사용하였다. AP로 염색한 결과를 도 1의 d에 나타내었고, SOX2 및 OCT4 등 줄기세포 대한 마커의 면역염색 결과를 도 2 내지 4에 나타내었다.
도 2 내지 4에 나타난 바와 같이, 돼지의 유도 만능 줄기세포에 SSEA-1, SSEA-4, Tra-1-60, Tra-1-91, SOX2 및 OCT4가 발현됨을 확인하였다.
2. RT - PCR 을 이용한 만능 줄기세포 마커 유전자의 발현 확인.
실시예 1에서 제조한 돼지의 유도 만능 줄기세포에서 RNA를 추출하였다. 보다. 보다 구체적으로, RNA를 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 추출하였고, PCR을 표 1에 표시된 프라이머 및 Tprofessional standard 96 gradient machine(Biometra, Goettingen, Germany)으로 수행하였다. 이의 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 돼지의 유도 만능 줄기세포(piPS-1 내지 3)에서 SOX2, OCT4, NANOG, LIN28, REX1, CDH1 및 DNMT를 포함하는 유전자가 발현됨을 확인하였다. 이러한 유전자는 돼지의 섬유아세포(도 5의 PEF 래인) 및 레트로바이러스 벡터(pE4 래인)에서는 발현되지 않음을 확인하였고, 돼지의 유도 만능 줄기세포에서 내재성 유전자 또는 외부적으로 도입된 트랜스유전자 모두에서 계속적으로 상기 유전자가 발현됨을 확인하였다.
[ 실시예 3]돼지 유도 만능 줄기세포의 배상체(embryoid body)의 형성 및 분화 확인
1. 면역 염색법을 이용한 돼지의 유도 만능 줄기세포의 배상체 형성 및 분화 확인
상기 실시예 1에서 제조한 돼지의 유도 만능 줄기세포 클로니를 수집하여 박테리아-그래이드 페트리 디쉬(bacterial-grade petri dish)안의 분화 배지(10%의 FBS가 포함된 DMEM)에 옮겼다. 이 후, 상기 줄기세포를 10일 동안 배양하였고, 삼배엽이 형성된 줄기세포를 조직 배양 플레이트에 옮겨 분화 배지에서 2주 동안 배양하였다. LSAB+System-HRP 키트(K0679, Dako, Glostrup, Denmark)를 삼배엽(three germ layer)으로 분화를 관찰하기 위하여 사용하였다. 외배엽에 대한 일차항체로 항-신경섬유(MAB1615, Millipore, Billerica, MA)를 사용하였고, 중배엽에 대한 일차항체로 항-알파 평활근 액틴(ab5694, AbCam, Cambridge, UK)을 사용하였고, 내배엽에 대한 일차항체로 항-케라틴(MAB1625, Chemicon, Billerica, MA)을 사용하였다. 상기 배상체 형성 및 분화를 확인한 결과를 도 6에 나타내었다(도 6의 a:배양 5일, b: 배양 10일, c: 배양 후 조직 배양 플레이트에 옮긴 후 2주 후, d 및 e:외배엽, f 및 g:중배엽, h 및 i: 내배엽)
도 6에 나타난 바와 같이, 유도 만능 줄기세포 배양 3 내지 5일 후, 배상체의 생성을 확인하였고, 이 후 10일까지 배상체 형성이 유지됨을 확인하였다(도 6의 a 및 b). 이 후, 조직 배양 플레이트에 옮기고 2 주 후(도 6의 c), 세포가 부착하고 계속적으로 증식되고, 일부의 세포는 낭성(cystic-like) 구조를 생성함을 확인하였다. 또한, 도 6의 d 내지 i의 결과, 삼배엽으로 분화됨을 확인하였다.
2. RT - PCR 을 이용한 돼지의 유도 만능 줄기세포의 삼배엽 형성 및 분화 확인
실시예 2와 같은 방법으로, 내배엽에 대한 마커로 Amylase , 중배엽에 대한 마커로 Enolase, 및 외배엽에 대한 마커로 Beta - tublin에 대하여 RT-PCR을 수행하였다. 이의 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, 분화 배지에서 배양 5일 후, 상기 마커들이 발현을 확인하여 내배엽, 외배엽 및 중배엽을 포함하는 삼배엽이 형성됨을 확인하였고, 조직 배양 플레이트에 옮긴 후 2주 후까지 상기 마커 유전자들이 발현됨을 확인하였다. 또한, SOX2 및 OCT 4는 발현되지 않아 전분화능을 상실한 것을 확인하였다.
[ 실시예 4]돼지의 유도 만능 줄기세포에 대한 핵형분석( Karyotyping )
유도 만능 줄기세포로 재프로그래밍 단계에서 염색체의 전위(translocation)가 있었는지 확인하기 위하여, 핵형분석 및 G 밴딩 분석을 수행하였다.
보다 구체적으로, 핵형 분석은 GenDix(Seoul, Korea)에서 높은 해상도의 G-밴딩으로 표준 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 이의 결과를 도 8에 확인하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 돼지의 유도 만능 줄기세포는 일반적인 38개 염색체 및 XY 염색체를 포함하고 있었다. 그러나, 염색체 17번에서 q11이 결실됨을 확인하였다. 그러나, 원래의 돼지 섬유아세포에서 q11이 똑같이 결실됨을 확인하여, 염색체의 전위가 유도되지 않았음을 확인하였다.
[ 실시예 5]돼지의 유도 만능 줄기세포 및 상기 세포에서 분화된 세포에서 MHC 발현 확인
MHC 단백질 발현을 평가하기 위하여, 두개의 돼지의 유도 만능 줄기세포 주를 사용하였고, 돼지의 대식세포를 이용하여 MHC 발현을 비교하였다.
MHC 클래스 Ι 발현의 분석을 위하여, 항-SLA 클래스 Ι 항체(MCA2261)를 사용하였고, MHC 클래스 Ⅱ 발현의 분석을 위하여, 항-SLA 클래스 Ⅱ 항체 DQ(MCA1335) 및 DR(MCA2314)를 사용하였다. 보다 구체적으로, FACS 분석을 FACSCalibur(Becton Dickinson, Frankilin Laske, NJ) 상에서 CELLQUEST 소프트웨어(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 이용한 Vis 488 laser optics system으로 수행하였다. 세포를 상기 항체를 일차항체로 염색하였다, 이 후, 세척한 후에 FITC-결합 이차 항체를 처리하였다. 돼지의 대식세포를 얻기 위하여, 돼지의 혈액으로부터 주변 혈액 단일핵 세포(peripheral blood mononuclear cell)를 추출하여, 알려진 방법으로 대식세포로 분화시켜 사용하였다. 세포분화의 타임라인 및 FACS 를 한 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.
도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, 돼지의 섬유아세포와 반대로, 돼지의 유도 만능 줄기세포에서 MHC 클래스 Ι의 발현이 낮음을 확인하였고, 이 후, 배상체 형성기에서는 MHC 클래스 Ι의 발현이 높아짐을 확인하였다. 배상체가 형성되고, 분화배지에서 2주간 배양하고, 세포에 트립신화 시키고, 분화 배지 동안 2주 동안 서브배양(subculture)하였다. 총 4주동안 분화배지에서 배양한 경우, 배상체의 경우보다 다소 높은 MHC 클래스 Ι이 발현됨을 확인하였다.
또한, MHC 클래스 Ⅱ는 대식세포에서 발현되었으나, 돼지의 유도 만능 줄기세포 및 이로부터 분화된 세포에서는 거의 발현되지 않음을 확인하였다.
[ 실시예 6]인터페론-γ 처리 후, MHC 클래스 Ι 발현 확인
인터페론-γ의 MHC 발현에 대한 영향을 확인하기 위하여, 48시간 동안, 인터페론-γ를 4주 동안 분화시킨 유도 줄기 만능세포에 처리한 후, MHC 클래스 Ι의 발현을 실시예 5와 같은 방법으로 확인하였다. 또한, 인터페론-γ를 배양배지에서 제거한 후, MHC 클래스 Ι의 발현을 확인하였다.
보다 구체적으로, 인터페론-γ(ProSpec, Est Brunswick, NJ)의 농도를 0 내지 10ng/ml로 세포 배양 배지에 48시간 동안 처리하였다. 또한, 0.6ng/ml의 인터페론-γ를 세포배양 배지에 48시간 동안 처리 후, 세포를 PBS로 세척한 다음, 사이토카인이 없는 배양배지에 옮기고, MHC 클래스 Ι의 발현을 확인하였다. 이의 결과를 도 11(인터페론-γ 처리) 및 12(인터페론-γ 처리 후, 제거)에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, MHC 클래스 Ι의 발현이 인터페론-γ의 처리에 의하여 높아짐을 확인하였고, 0.6ng/ml의 인터페론-γ처리 시 가장 높은 발현을 보였으며, 인터페론-γ 처리 후, 배양 배지로부터 제거한 다음, MHC 클래스 Ι의 발현이 감소함을 확인하였다. 이에 비하여 MHC 클래스 Ⅱ의 발현은 인터페론-γ처리와 관련이 없음을 확인하였다.

Claims (8)

  1. 인터페론-γ를 유효성분으로 포함하는 이식 거부 반응이 제거된 유도 만능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포 배양용 배지 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 인터페론-γ는 유도 만능 줄기세포에서 MHC 클래스 Ι을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 인터페론-γ의 농도는 0.01ng/ml 내지 15ng/ml인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 유도 만능 줄기세포는 돼지 유래의 유도 만능 줄기세포인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 유도 만능 줄기세포는 돼지의 귀 섬유아세포 유래의 유도 만능 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  6. 제 1항의 배지 조성물 상에서 유도 만능 줄기세포를 배양하는 단계;를 포함하는 이식 거부 반응이 제거된 유도 만능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포의 제조 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 유도 만능 줄기세포는,
    a)OCT4, SOX2, KLF4 및 cMYC 유전자를 세포에 형질 도입하는 단계; 및
    b)상기 형질도입된 세포를 MEF 영양 세포(mouse embryonic fibroblast feeder cell)와 공 배양하는 단계;로 제조된 유도 만능 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 이식 거부 반응이 제거된 유도 만능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포의 제조 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 세포는 돼지의 귀 섬유아세포인 것을 특징으로 하는, 이식 거부 반응이 제거된 유도 만능 줄기세포 또는 이로부터 분화된 세포의 제조 방법.







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