KR101806401B1 - 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도용 조성물 및 그를 이용한 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 효율이 향상된, 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도용 조성물, 그를 포함하는 배지 및 그를 이용한 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도용 조성물 및 그를 이용한 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법 {Composition for inducing differentiation of induced pluripotent stem cell into mesenchymal stem cell and method for preparing mesenchymal stem cell using the same}

역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도용 조성물, 그를 함유하는 배지 및 그를 이용한 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

줄기세포는 모든 세포와 조직을 만들어 내는 근간이 될 수 있는 세포이다. 따라서 배양을 통해 줄기세포를 증식시킨 후 특정 세포로 분화시키는 기술은 세포 치료라는 측면에서 여러 질병을 치료할 수 있는 잠재력을 갖는다. 줄기세포는 분화 능력에 따라 전분화능 (pluripotency), 다분화능 (multipotency) 또는 단일분화능 (unipotency)로 나누어지며, 줄기세포의 종류는 배아줄기세포 (착상 전 배아의 내세포), 성체줄기세포 (각 조직 및 장기에 극소수로 존재) 및 역분화 줄기세포 (유도만능 줄기세포: 체세포에 유전자 및 단백질을 삽입하여 역분화가 유도된 세포)가 있다. 배아줄기세포는 무한한 잠재력을 가지고 있으나, 세포 추출의 생명윤리 문제와 더불어 분화 조절의 어려움, 기형종과 같은 암세포화, 변이 발생과 같은 단점이 있어 임상시험에 적용에 많은 어려움이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 어려움으로 인해 이미 분화가 끝난 세포들을 인위적으로 역분화시켜 만능분화능(pluripotent)을 가지도록 유도된 유도만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cell, iPSC)가 많은 관심을 받고 있다.

야마나카에 의해 처음으로 제작된 역분화 줄기세포는 배아줄기세포가 가지고 있는 윤리적 및 면역학적 단점을 극복할 수 있다는 장점을 가지고 있는 세포로 사람세포를 포함하는 다양한 종의 동물세포로부터 제작되었다.

최근, 말의 섬유아세포 또는 각질세포 유래의 역분화 줄기세포의 제작이 보고 되고 있다 (Stem Cell. Rev. 2011;7:693-702, Stem Cells Dev. 2013;22:611-621, Stem Cells Int. 2012;2012:429160, Stem Cells Dev. 2014;23:1524-1534). 이러한 세포는 피부의 상처를 유발해야 하는 단점을 가지고 있다. 이에 비해 지방유래 줄기세포는 다양한 장점을 가지고 있다. 지방유래 줄기세포는 세포만을 위한 수술 없이, 복강 수술시에 추가적으로 채취하면 되는 등, 채취가 쉽고 안정적인 성장 및 증식이 가능하다 (Stem Cells. 2007;25(4):818-827, Discov Med.2011;11(57):160-170). 또한 지방유래 줄기세포는 다양한 성장인자를 분비한다 (Discov Med. 2011;11(57):160-170).

한편, 줄기세포 중에서도 중간엽 줄기세포는 증식능이 우수하며 뼈, 연골, 근육, 지방 등으로 분화할 수 있는 다분화성 줄기세포로서, 배아줄기세포 등의 만능 줄기세포에 비해 훨씬 유전적으로 안정화되어 있어 발암성이 낮다는 장점을 바탕으로 연골재생, 심근경색 치료, 이식편대숙주질환의 치료 등을 위한 세포 치료제로 개발되어 왔다. 중간엽 줄기세포가 높은 자가재생산 능력을 보이는 것은 사실이나, 중간엽 줄기세포로의 분화를 촉진하기 위한 최선의 조건을 구비하여야 한다.

역분화 줄기세포를 세포치료제로 활용하기 위해서는 미분화세포가 가지는 종양발생 위험이 제거되어야 하며, 목적세포로의 분화가 선행되어야 한다. 하지만 아직까지 역분화 줄기세포의 분화 및 증식 효율은 매우 낮으며, 이를 개선하기 위한 요구 존재한다.

일 양상은 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄을 포함하는, 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

일 양상은 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄을 포함하는, 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도용 배지를 제공하는 것이다.

일 양상은 분리된 체세포 또는 분리된 성체줄기세포에 역분화 유도인자 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여, 분리된 체세포 또는 분리된 성체줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 유도하는 단계;및

상기 유도된 역분화 줄기세포를 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄을 포함하는 조성물을 함유하는 배지에서 배양하여, 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는, 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄을 포함하는, 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 인슐린(Insulin), 트랜스페린(Transferrin) 및 셀레늄(Selenium)을 포함한다. 상기 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄 각각은 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 인슐린은 혈액 속의 포도당의 양을 일정하게 유지시키는 호르몬이고, 트랜스페린은 혈중에서 3가의 철이 혈장단백질 중의 β-글로불린과 결합한 당 단백질이며, 셀레늄은 항산화력을 가지면서, 셀레늄 의존적인 효소들이 지방의 과산화를 감소시키도록 하는 물질이다. 상기 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄을 포함하는 조성물은 역분화 줄기세포로부터 CD29⁺ 줄기세포, 즉 중간엽 줄기세포의 유도를 촉진할 수 있다. 상기 조성물을 역분화 줄기세포에 전달하는 방법은 배양액에 투여하는 방법을 사용할 수 있다. 이러한 경우, 인슐린은 0.5 내지 50μg/ml, 5 내지 15μg/ml, 8 내지 12μg/ml 또는 10μg/ml로 포함될 수 있고, 트랜스페린은 0.1 내지 50μg/ml, 1 내지 10μg/ml, 3 내지 8μg/ml 또는 4 내지 6μg/ml로 포함될 수 있으며, 셀레늄은 0.0001 내지 0.05μg/ml, 0.001 내지 0.01μg/ml, 0.004 내지 0.008μg/ml 또는 0.005 내지 0.007μg/ml로 포함될 수 있다. 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄의 상기 범위에서 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 효율이 더욱 우수하다.

상기 "역분화(de-differentiation)"는 분화된 세포가 새로운 유형의 분화 잠재력을 갖는 상태로 복원될 수 있는 프로세스를 의미한다. 또한, 상기 역분화는 세포 리프로그래밍과 동일한 의미로 사용될 수 있다. 이러한 세포의 역분화 또는 리프로그래밍 기작은 핵 내의 후생유전학 (뉴클레오타이드 서열에서의 변화 없이 기능에서의 유전적 변화를 일으키는 것과 관련된 DNA 상태)적 마크가 삭제된 후, 상이한 세트의 후생유전학적 마크를 수립하는 것을 의미한다. 상기 '역분화'란 0% 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 분화된 세포들을 미분화 상태로 되돌리는 과정이라면 모두 이에 포함될 수 있고, 예를 들면, 0%의 분화능을 가지는 분화된 세포 또는 0% 초과 내지 100% 미만의 분화능을 가지는 일정부분 분화된 세포를 100% 분화능을 가지는 세포로 복원 또는 전환시키는 것을 포함할 수 있다.

상기 "역분화 줄기세포"는 "유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell:iPSC)"와 동일한 의미로서, 재프로그램 인자의 발현 또는 발현 유도에 의해 체세포 또는 성체줄기세포를 재프로그램하여 생성된 유도 다능성 줄기 세포를 포함한다. 상기 역분화 줄기세포는 말, 개, 고양이, 태아, 송아지, 인간, 마우스 등을 포함하는 포유류의 지방, 골수, 제대혈 또는 태반으로부터 유래될 수 있으며, 예를들면 말 또는 인간일 수 있다.

상기 "중간엽 줄기세포(Mesenchymal sterm cell:MSC)"는 역분화 줄기세포가 분화하여 형성된 줄기세포로서, 다양한 세포 예컨대 지방세포, 연골세포 및 골세포 등으로 분화할 수 있는 다능성(multipotent) 줄기세포를 의미한다.

다른 양상은 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄을 포함하는 조성물, SB431542 및 bFGF를 함유하는, 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도용 배지를 제공한다. 상기 SB431542는 C₂₂H₁₆N₄O₃로, TGF-β (transforming growth factor-β)의 억제제로서 세포 증식, 분화를 조절할 수 있으며, bFGF는 (염기성 섬유모세포생장인자, Basic fibroblast growth factor)는 세포 증식, 분화 유도를 촉진할 수 있다. 상기 SB431542는 0.5 내지 50uM, 1 내지 20uM, 5 내지 15uM 또는 8 내지 12uM로 포함될 수 있고, bFGF는 0.1 내지 50ng/ml, 0.5 내지 20ng/ml, 1 내지 10ng/ml 또는 3 내지 7ng/ml로 포함될 수 있다. SB431542 및 bFGF의 상기 범위에서 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 효율 및 중간엽 줄기세포의 증식능이 더욱 우수하다. 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄을 포함하는 조성물에 대하여는 상기한 바와 같다.

상기 배지는 L-알라닌, L-아스파르트산, 및 L-프롤린의 비필수아미노산(non-essential amino acid)을 포함할 수 있다. 상기 아미노산은 산화영양소 또는 대사물질로서 제공될 수 있다. 상기 L-알라닌, L-아스파르트산, 및 L-프롤린은 각각 0.01 내지 1.0mM, 0.05 내지 0.5mM 또는 0.075 내지 0.15mM로 포함될 수 있다.

상기 분화 유도용 배지는 당해 분야에서 세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 포함할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지, M199/F12 혼합물, MEM-알파(alpha Minimal essential Medium) 배지, MCDB 131 배지, IMEM 배지, DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham`s F-12) 배지, PCM 배지 또는 MSC 확장 배지일 수 있다. 중간엽 줄기세포의 배양 시 동물 유래 혈청을 약 5% 내지 30% 정도 포함하여 분화하고자 하는 세포의 성장을 위한 범용적인 영양분을 제공할 수 있다.

또한, 중간엽 줄기세포 배양 시, 항생제, 항진균제 및 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가할 수 있다. 항생제로는 예를 들면 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 펀지존(fungizone) 등을 사용할 수 있다. 항진균제로는 예를 들면 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 사용할 수 있다. 마이코플라스마 오염을 방지하기 위해 예를 들면 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신 등을 사용할 수 있다.

또 다른 양상은 분리된 체세포 또는 분리된 성체줄기세포에 역분화 유도인자 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여, 분리된 체세포 또는 분리된 성체줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 유도하는 단계; 및

상기 유도된 역분화 줄기세포를 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄을 포함하는 조성물을 함유하는 배지에서 배양하여, 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 "분리된"은 자연적으로 발생하는 세포 내의 환경과는 다른 환경에 존재하는 세포를 의미할 수 있다. 예를 들면, 세포는 자연적으로 다세포 기관에서 발생하고, 상기 세포가 다세포 기관으로부터 제거되었다면 세포는 "분리된" 것이다.

상기 "체세포"는 성체를 구성하는 세포로서 분화능 및 자가생산능이 제한된 세포를 의미할 수 있다. 상기 체세포는 동물, 포유동물, 말, 개, 고양이, 태아, 송아지, 인간, 마우스, 원숭이, 돼지, 양 및 토끼 등의 지방, 골수, 제대혈, 태반, 신경, 근육, 피부, 모발 등 일 수 있으며, 예를 들면, 말 또는 인간의 지방일 수 있다.

상기 “성체줄기세포”는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 의미하며, 이는 그 분화능이 일반적으로 특정 조직을 구성하는 세포로만 한정된다. 상기 성체줄기세포는 신경세포로 분화할 수 있는 신경줄기세포, 혈액세포로 분화할 수 있는 조혈모세포, 뼈, 연골, 지방, 근육 등으로 분화할 수 있는 중간엽 줄기세포, 간세포로 분화할 수 있는 간줄기세포일 수 있다. 성체줄기세포의 경우 체세포에 비하여 증식능이 유지되고, 역분화 줄기세포로 유도될 수 있는 유효한 세포수를 확보하는데 유리하며, 역분화 줄기세포로의 유도 효율이 높을 수 있다. 예를 들면, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있고, 지방, 연골, 뼈, 골수간질, 근육, 신경, 피부 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 말, 개, 고양이, 태아, 송아지, 인간, 마우스 등을 포함하는 포유류의 지방, 골수, 제대혈 또는 태반으로부터 유래될 수 있다. 인간 또는 말 유래의 지방으로부터 유래되는 경우, 골수, 제대혈, 태반 줄기세포와 달리 비교적 용이하게 다량을 제공받을 수 있는 실용적인 장점을 가지고 있고, 지방 세포의 1% 정도가 줄기세포로 추정되므로 수득률이 높은 장점을 가진다. 자가의 세포를 이용하므로 면역에 의한 거부반응이 없으며, 배아줄기세포처럼 기형종과 같은 암을 발생시킬 염려가 적다. 또한, 체내에 이식되면 장기의 특성에 맞게 스스로 분화되고 증식할 수 있다.

상기 “역분화유도인자”는 체세포 또는 성체줄기세포를 역분화 줄기세포로 재프로그램하는데 사용되는 인자로서, 동물, 포유동물, 말, 개, 고양이, 태아, 송아지, 인간, 마우스, 원숭이, 돼지, 양 또는 토끼 유래일 수 있으며, 예를 들면, Oct4(Oct 3/4로도 지칭됨), Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog 및 Lin-28로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 조합을 포함한다. Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog 및 Lin-28의 각 단백질은 그의 야생형 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog 및 Lin-28의 각 단백질을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드는 야생형 단백질을 코딩하는 서열일 수 있으며, 또한 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 또한 상기 폴리뉴클레오티드는 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다.

체세포는 적어도 두 개의 재프로그램 인자, 적어도 세 개의 재프로그램 인자, 또는 네 개의 재프로그램 인자를 발현시킴으로써 재프로그램될 수 있다. 특정 역분화 줄기세포주는 그 발현 프로파일이 다양할 수 있으나, 역분화 줄기세포는 통상적으로 배아줄기세포와 동일한 마커의 발현에 의해 동정할 수 있다. 체세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5개의 재프로그램 인자를 발현함으로써 재프로그램된다. 재프로그램 인자는 상기 Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog 및 Lin-28로부터 선택될 수 있다. 재프로그램 인자의 발현은 재프로그램 인자의 발현을 유도하는 소 유기분자물질과 같은 적어도 하나의 물질과 체세포 또는 성체줄기세포를 접촉함으로써 유도될 수 있다.

체세포는 또는 성체줄기세포는 또한 재프로그램인자가 발현되고(예를 들면 바이러스 벡터, 플라스미드 등을 사용하여) 재프로그램인자의 발현이 유도되는(예를 들면 소 유기분자를 사용하여) 조합적 시도를 사용하여 재프로그램될 수 있다. 예를 들면, 재프로그램 인자는 체세포 또는 성체줄기세포에서 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 샌다이바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해 발현될 수 있다. 또한, 재프로그램 인자는 체세포 또는 성체줄기세포에서 에피소말 플라스미드와 같은 비-통합적 벡터를 사용하여 발현될 수 있다(Yu et al., Science. 2009 May 8;324(5928):797-801 참조). 재프로그램 인자가 비-통합적 벡터를 사용하여 발현될 때, 인자는 전기천공, 형질감염 또는 벡터로의 체세포 형질전환을 사용하여 발현될 수 있다. 예를 들면, 말, 개, 고양이, 태아, 송아지, 인간, 마우스 등을 포함하는 포유류의 세포에서 통합적 바이러스 벡터를 사용한 네 개의 인자(Oct4, Sox2, KlF4 및 c-Myc)들의 발현은 체세포 또는 또는 성체줄기세포를 재프로그램하는데 사용될 수 있다.

일단 재프로그램 인자가 세포내에서 발현되면, 세포는 배양될 수 있다. 시간이 경과되면서 배아줄기세포 특성을 지닌 세포가 배양 디쉬에 출현한다. 세포는 예를 들면, 배아줄기세포 형태에 기초하여 또는 선택 및 검출가능한 마커의 발현에 기초하여 선택 및 계대배양될수 있다. 역분화 줄기세포는 예를 들면, Oct4, 알칼리 포스파타제(AP), SSEA 3 표면 항원, SSEA 4 표면 항원, TRA 1 60, 및/또는 TRA 1 81를 발현할 수 있다.

역분화 줄기세포의 다능성을 확인하기 위해, 세포는 하나 이상의 다능성 어세이에서 검사될 수 있다. 예를 들면, 세포는 배아줄기세포 마커의 발현에 대해 검사될 수 있다; 세포는 SCID 마우스에 이식시 기형종을 제조할 수 있는 능력에 대해 평가될 수 있으며; 모든 세 배엽의 세포 타입을 생성하도록 분화하는 능력에 대해 평가될 수 있다.

역분화 인자로서 Oct4, Sox2, KlF4 및 c-Myc 를 체세포 또는 성체줄기세포에 도입시켰을 때, 지방 유래의 분리된 성체줄기세포가 역분화 줄기세포로 유도되는 것을 확인하였다.

상기 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄을 포함하는 조성물, SB431542 및 bFGF를 함유하는 배지로서, 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도용 배지에 대하여는 상기한 바와 같다.

또 다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 중간엽 줄기세포를 제공한다. 상기 중간엽 줄기세포는 통상적인 중간엽 줄기세포에 대하여 상기한 바와 같을 수 있고, 예를 들어 CD29, CD105, CD73 또는 CD90을 발현할 수 있다.

상기 역분화 줄기세포로부터 유도된 중간엽 줄기세포는 성체줄기세포의 중간엽 줄기세포에 비하여 계대를 반복하는 경우에도 노화가 지연되고 장기간 분열을 유지할 수 있다. 상기 역분화 줄기세포로부터 유도된 중간엽 줄기세포는 성체줄기세포의 중간엽 줄기세포에 비하여 환경조건에 따라 지방세포, 연골세포, 골세포 및 근육세포 등으로의 분화능이 우수하다. 예를 들면, 지방유래 성체줄기세포를 바로 연골세포, 골세포 및 근육세포로 분화시키는 경우보다, 상기 역분화 줄기세포로부터 유도된 중간엽 줄기세포를 연골세포, 골세포 및 근육세포로 분화시키는 경우 분화능과 증식능이 향상된다.

상기 역분화 줄기세포를 확보한 후, 미분화 상태를 유지시켜주는 환경에 배양하는 경우, 증식에 제한이 없이 대량으로 세포를 수득할 수 있다. 이러한 미분화 상태를 유지하고 있다가 필요에 따라 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄을 포함하는 조성물을 이용하여 중간엽 줄기세포로 대량으로 분화시킬 수 있다. 따라서, 이용가능한 중간엽 줄기세포의 수에 현저한 차이가 있다.

일 양상에 따른 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄을 포함하는 조성물, 그를 함유하는 배지, 및 그를 이용한 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법은, 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 효율을 증가시키므로, 세포치료제로서 활용이 가능하다. 또한, 분리된 체세포 또는 성체줄기세포는 인간 배아를 이용하는 윤리적인 문제나 이식 후 거부반응을 회피할 수 있으므로 유용하다.

도 1은 추출된 말의 지방유래 성체줄기세포, 말의 지방유래 성체줄기세포를 역분화 줄기세포로 역분화시키는 과정 및 형성된 역분화 줄기세포를 나타낸 도면이다.
도 2는 전분화능(Pluripotency) 마커를 발현하는 역분화 줄기세포의 알칼리성 인산가수분해 효소 염색, RT-PCR 산물, 면역 형광염색을 나타낸 도면이다.
도 3은 배양체 형성, 3배엽 마커를 이용한 RT-PCR 산물, 3배엽 구조의 테라토마가 형성된 역분화 줄기세포의 H&E 염색을 나타낸 도면이다.
도 4는 유도된 역분화 줄기세포를 인슐린-트랜스페린-셀레늄의 조성물을 함유하는 배지에서 중간엽 줄기세포로 분화시킨 분화 효율에 대한 유세포분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 유도된 역분화 줄기세포를 인슐린-트랜스페린-셀레늄의 조성물을 함유하는 배지에서 중간엽 줄기세포로 분화시킨 후 2일차, 5일차 및 22일차에 세포 형상을 나타낸 도면이다.
도 6은 유도된 역분화 줄기세포를 인슐린-트랜스페린-셀레늄의 조성물을 함유하는 및 함유하지 않는 배지에서 중간엽 줄기세포로 분화시킨 후 4일차 및 7일차에 세포 형상을 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 말 역분화 줄기세포 제작 및 분화 유도용 조성물을 이용하여 말 역분화 줄기세포의 분화 유도

1-1. 말의 지방유래 성체줄기세포 (adipose stem cell : ASC )의 분리

8개월령 말로부터 채취된 지방조직을 DPBS (Dulbecco's Phosphate-buffered saline) (GeneDEPOT) 및 70% 에탄올 (Duksan Pure Chemicals)을 이용하여 수세하였다. 이 지방조직을 단면도를 이용하여 잘게 자르고, 0.2%의 타입 I 콜라게나제(Worthington Biochemical)의 DPBS에 넣은 후, 쉐이킹(shaking) 배양기에서 37℃로 10분간 분해하였다. 분해된 조직을 70μm 나일론(nylon) 세포 스트레이너(strainer) (SPL life sciences)에 거르고, 세포 펠렛을 재현탁하고 DPBS로 수세하여 말의 지방유래 성체줄기세포를 추출하였다. 추출된 말의 지방유래 줄기세포는 로우 글루코우즈 DMEM, 10% FBS (소태아혈청) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 배양액 중에 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

1-2. 역분화 줄기세포의 제작

말의 지방유래 성체줄기세포는 한 번의 계대배양을 거친 후에 1 계대(1st passage)가 되었을 때 (형질 도입하기 하루 전), 1 X 10⁵의 세포를 0.1% 젤라틴이 코팅된 100mm 디쉬에 접종(seeding)하였다.

렌티바이러스로 야마나카인자를 도입하기 위해 293FT 세포주에 TetO-FUW-OSKM 플라스미드(ADDGENE #20321) 혹은 FUW-M2rtTA 플라스미드 (ADDGENE #20342)를 비라파워(Virapower) 패키징 믹스(Invitrogen)와 더불어 트랜스펙션(transfection) 하였다. 이후 상청액(supernatant)을 취하고 0.45㎛ 필터(Millipore)로 여과하여 세포 파편을 제거한 후에, 폴리브렌(polybrene, 10㎍/㎖)(Sigma)을 첨가하여 24시간 동안 감염시켰다. 감염이 종료된 후, 하이 글루코오즈 DMEM, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 배양액으로 교환하여 24시간을 배양하였다. 이후 형질도입된 지방 성체줄기세포를 마이토마이신(mitomycin C)으로 성장을 억제한 피더(feeder) 위로 옮겨서, 고 글루코오즈 DMEM에 20% FBS, 1% 글루타맥스, 1% MEM-NEAA, 1% 페니실린/스트렙토마이신, LIF(1000 유닛/ml) 및 0.1% 머캅토에탄올(mercaptoethanol)을 함유하는 배양액(이하 ESC 배지)에 독시사이클린(doxycycline)을 2㎍/㎖의 농도로 혼합하여 이틀 간격으로 배양액을 교환해주면서 30일간 배양하였다. 형질도입 후, 18 내지 30일차에 인간 배아줄기세포와 유사한 표면 모양을 가진 콜로니(colony)를 채취하여 새로운 피더(feeder) 위로 옮기고, 2㎍/㎖ 독시사이클린을 포함하는 ESC 배지에서 계대배양하여, 말 역분화 줄기세포를 제작하였다.

1-3. 분화 유도용 조성물을 이용하여 역분화 줄기세포의 분화 유도

실시예 1-2에서 확립된 말의 역분화 줄기세포를 10mg/mL의 타입 IV 콜라게나제로 37℃에서 10분간 반응시켜 배양 용기에서 떼어내고, 1 X 10⁴ 세포/cm²의 밀도로 0.1% 젤라틴이 코팅된 100mm 디쉬에 접종(seeding)하였다. 이어서 하이 글루코우즈 DMEM에 10% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 10μM SB431542 및 5ng/ml bFGF (basic-fibroblast growth factor)을 함유하는 배양액 (이하 MSC 유도 배지)에서 배양하였다. 이때 MSC 유도 배지에 각각 1μM 인슐린, 1xITS (인슐린-트랜스페린-셀레늄) 및 10μM SB-216763를 첨가하여 세포를 5일간 배양한 후, 중간엽 줄기세포로 분화된 세포를 수득하였다.

실시예 2. 역분화 줄기세포 발현 및 분화 유도용 조성물을 이용한 중간엽 줄기세포로의 분화 확인

2-1. 말의 지방유래 성체줄기세포의 확인

실시예 1-1에서 수득한 말의 지방유래 성체줄기세포를 유세포분석(FACs)으로 확인하였다. 3계대가 되었을 때, 5 x 10⁵의 세포를 200μl의 PBS에 현탁하고, 1차 항체로 항-인간 CD31-FITC(fluorescein isothiocyanate) (BD), 항-인간 CD34-PE(Phycoerythrin) (eBioscience), 항-인간 CD44-PE(eBioscience), 항-인간 CD45-FITC(BD), 및 항-인간 CD90-PE(BD)을 사용하였다. CD29를 검출하기 위하여, 1차 항체로는 항-인간/말 인테그린(Integrin) β1/CD29 모노클로날 항체(R&D systems)를 사용하였으며, 이어서 2차 항체로는 FITC 결합된 항-마우스 IgG (Invitrogen)를 사용하였다. 도 1A에서, 말 지방유래 성체줄기세포는 기질 세포(stromal cell) 관련 마커인 CD29, CD44 및 CD90의 발현이 높은 것을 알 수 있다.

2-2. 역분화 줄기세포의 특성 확인

(1) 역분화 줄기세포의 형성 확인

실시예 1-2에서 수득한 말 역분화 줄기세포의 형상을 현미경 이미지로 확인하였다. 도 1C 및 D를 살펴보면, 형질도입 후 9일차 ESC 배지 및 독시사이클린에서 세포 형상이 변형된 것을 확인하였다. 도 1E 및 F에서, 16일차에 말 지방유래 성체줄기세포에서 역분화 줄기세포 콜로니가 형성된 것을 확인하였으며, 점차 그 수가 증가하는 것을 확인하였다.

(2) 인산가수분해 효소 염색(Alkaline Phosphatase staining)

실시예 1-2에서 수득한 말 역분화 줄기세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 AP 검출 키트(Millipore)로 염색하였다. 도 2A를 살펴보면, 알칼리성 인산가수분해 효소 염색이 진하게 형성된 것을 알 수 있다.

(3) 면역 형광염색

말 역분화 줄기세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 각각 Oct3/4, Sox2 및 SSEA-1, Nanog를 1차 항체로 면역 염색하였다. FITC(Fluorescein isothiocyanate) 결합된 IgG 및 TRITC(5/6-tetramethyl-rhodamine isothiocyanate) 결합된 IgG를 2차 항체로 사용하였다. 도 2C 및 D에서 또한 Oct4, Sox2, Nanog, SSEA-1가 발현되었음을 알 수 있다.

(4) 역전사 중합효소 연쇄반응(RT- PCR )

말 역분화 줄기세포로부터 분리한 총 RNA를 cDNA로 합성하였다. 도 2B를 살펴보면, RT-PCR 결과 말의 지방유래의 성체줄기세포에서 유도된 역분화 줄기세포에서, 말의 지방유래의 성체줄기세포에 비하여 Oct4, Sox2, Nanog, Lin28 및 Rex1의 발현이 증가된 것을 확인하였다. 이 때, B-actin의 발현은 일정하였다. Oct4은 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머, Sox2는 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머, Nanog는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머, Lin28은 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머, Rex1은 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머, B-actin은 서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.

또한, 도 3B를 살펴보면, 말의 지방유래의 성체줄기세포에 형질도입 후 6일차에 TBX-4(paraxial mesodermal marker, 중배엽 마커) 및 PAX6(ectodermal marker, 외배엽 마커)의 발현이 높게 나타났으며, 9일차 및 12일차에 감소하였다. BMP4(mesodermal marker, 중배엽 마커) 및 AFP(endodermal marker, 내배엽 마커)는 시간이 지남에 따라 발현이 점점 높게 나타났다. TBX-4는 서열번호 15 및 16의 프라이머, PAX6는 서열번호 19 및 20의 프라이머, BMP4는 서열번호 13 및 14의 프라이머, AFP는 서열번호 17 및 18의 프라이머를 사용하였다.

(5) 배양체(Embryoid body) 형성 확인

6일차, 9일차 및 12일차에 배양체의 형상을 현미경으로 확인하였다. 도 3A에서, 각종 세포들을 뭉쳐 놓은 공 모양의 배양체가 완전하게 형성된 것을 확인하였다.

(6) 테라토마 ( Teratoma ) 형성 확인

역분화 줄기세포를 8주령 마우스에 주입하였다. 주입 2 내지 3개월 후, 테라토마의 형성을 확인하였다. 도 3C를 살펴보면, H&E 염색 결과, 내배엽, 중간엽, 외배엽의 3배엽이 구별되어 형성된 종양을 관찰하였다.

2-3. 분화 유도용 조성물을 이용한 중간엽 줄기세포로의 분화 확인

(1) 중간엽 줄기세포 마커 , CD29의 유세포분석 ( FACs )

중간엽 줄기세포 마커인 CD29에 대해 면역형광염색을 실시하였다. 1차 항체로는 세포액 200μL당 인간/말 CD29를 2.5μL를 사용하였으며, 2차 항체로는 항-마우스 FITC를 1/200의 농도로 사용하였다. 음성대조군(negative control)에는 2차 항체만을 적용함으로써 비특이적 발광을 배제하도록 하였다. 음성대조군 샘플, 인슐린 첨가 샘플, ITS 첨가 샘플, SB-216763 첨가 샘플에 대한 유세포분석(FACs)을 실시하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 유세포분석 결과, 인슐린과 ITS을 포함하는 조성물을 첨가한 샘플에서 음성대조군 세포에 비해 중간엽 줄기세포 마커, CD29의 발현이 증가하였다. 상기의 결과로 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄이 역분화 줄기세포를 중간엽 줄기세포로 유도하는 촉진 인자로서 작용하여, 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 효율을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.

(2) 중간엽 줄기세포의 형상 확인

도 5에서, 역분화 줄기세포의 중간엽 줄기세포로의 분화 유도 2일차, 5일차 및 22일차의 모양을 살펴보면, ITS 첨가 샘플은 중간엽 줄기세포로와 유사한 콜로니가 증가하여 중간엽 줄기세포로의 분화가 유도되는 것을 알 수 있다.

또한 도 6에서, 역분화 줄기세포의 중간엽 줄기세포로의 분화 유도 4일차 및 7일차의 모양을 살펴보면, ITS 첨가 샘플은 음성대조군 샘플에 비하여 입방형(cuboidal) 및 방추형(spindle)과 유사한 형태의 콜로니가 현저하게 증가하여 중간엽 줄기세포로의 분화 유도가 촉진되는 것을 알 수 있다.

<110> kyungpook national university <120> Composition for inducing differentiation of induced pluripotent stem cell into mesenchymal stem cell and method for preparing mesenchymal stem cell using the same <130> pn113475 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E-B-action <400> 1 atggtggcaa tgggtcagaa ggac 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E-B-action <400> 2 ctctttgatg tcacgcacga tttc 24 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E-Oct4 <400> 3 gggacctcct agtgggtca 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E-Oct4 <400> 4 tggcaaattg ctcgaggtct 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E-Sox2 <400> 5 cacccacagc aaatgacagc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E-Sox2 <400> 6 tttctgcaaa gctcctaccg 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E-Nanog <400> 7 tcctcaatga cagatttcag aga 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E-Nanog <400> 8 gagcaccagg tctgactgtt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E-Lin28 <400> 9 catgggctct gtgtcaaacc 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E-Lin28 <400> 10 cggtcatgga caggaagc 18 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E-Rex1 <400> 11 gacgggaaag gcctggatag aag 23 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E-Rex1 <400> 12 ggcggtaaga agctgttgag aaagg 25 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E-BMP4 <400> 13 tcgttacctc aagggagtgg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E-BMP4 <400> 14 ggctttgggg atactggaat 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E-T-box4(TBX4) <400> 15 cagcactacc agtatgagaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E-T-box4(TBX4) <400> 16 ctcagcatct gttggtcgta 20 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E-a-Fetoprotein(AFP) <400> 17 cttacacaaa gaaagcccct caac 24 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E-a-Fetoprotein(AFP) <400> 18 aaactcccaa agcagcacga g 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E-Paired box6(Pax6) <400> 19 tggggatgct ttggtgagac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E-Paired box6(Pax6) <400> 20 ggttgtggga ttggctggta 20

Claims (13)

1. 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄을 포함하는, 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도용 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 역분화 줄기세포는 지방조직, 골수, 제대혈 또는 태반으로부터 유래된 것인 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 역분화 줄기세포는 말, 개, 고양이, 태아, 송아지, 인간, 마우스 또는 포유류로부터 유래된 것인 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 인슐린은 5 내지 15μg/ml, 트랜스페린은 1 내지 10μg/ml 및 셀레늄은 0.001 내지 0.01μg/ml로 포함되는 것인 조성물.
5. 청구항 1의 조성물, SB431542 및 bFGF를 포함하는 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화 유도용 배지.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 SB431542는 5 내지 15uM 및 bFGF는 1 내지 10ng/ml로 포함되는 것인 배지.
7. 청구항 5에 있어서, 상기 배지는 L-알라닌, L-아스파르트산, 및 L-프롤린을 포함하는 것인 배지.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 L-알라닌, L-아스파르트산, 및 L-프롤린은 각각 0.05 내지 0.5mM로 포함되는 것인 배지.
9. 분리된 체세포 또는 분리된 성체줄기세포에 역분화 유도인자 단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여, 분리된 체세포 또는 분리된 성체줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 유도하는 단계;및
   상기 유도된 역분화 줄기세포를 청구항 1의 조성물을 함유하는 배지에서 배양하여, 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는 역분화 줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법으로서,
   상기 역분화 유도인자는 Oct4, Sox2, KlF4, c-Myc, Nanog 및 Lin-28로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인자인 것인 방법.
10. 청구항 9에 있어서, 분리된 체세포 또는 분리된 성체줄기세포는 지방조직, 골수, 제대혈 또는 태반으로부터 유래된 것인 방법.
11. 청구항 9에 있어서, 분리된 체세포 또는 분리된 성체줄기세포는 말, 개, 고양이, 태아, 송아지, 인간, 마우스 또는 포유류로부터 유래된 것인 방법.
12. 삭제
13. 삭제

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