KR20130073794A

KR20130073794A - 줄기세포 분비 단백질을 이용한 아토피 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20130073794A
Application number: KR1020110146948A
Authority: KR
Inventors: 이정우; 국일; 한충성
Original assignee: (주)치아줄기세포뱅크
Priority date: 2011-12-23
Filing date: 2011-12-30
Publication date: 2013-07-03
Also published as: KR101479566B1

Abstract

본 발명은 줄기세포 분비 단백질을 이용한 아토피 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 적절한 배지 및 조건에서 배양된 치아 또는 골수 유래 줄기세포 배양액은 아토피 개선 효과를 나타낸다.

Description

줄기세포 분비 단백질을 이용한 아토피 개선용 조성물{Composition for improvement atopy using protein secreted from stem cells}

본 발명은 컨디션드 배지에서 배양된 치아 또는 골수 유래 줄기세포의 배양액을 아토피 개선에 사용하는 줄기세포 분비 단백질을 이용한 아토피 개선용 조성물에 관한 것이다.

아토피 피부염(Atopic dermatitis, AD)은 유아와 소아에서 가장 흔한 염증성 피부질환으로 심한 소양감, 홍반, 부종, 삼출, 가피, 태선화 등을 특징으로 하며 재발이 잦고 만성으로 경과하며 반복적으로 소파로 인한 찰상과 태선화 등 2차적인 병변이 특징적으로 나타난다. 또한 천식 알레르기 비염이나 식품 알레르기와도 연관이 많은 만성적인 피부의 염증성 질환이다. 또한 최근에는 성인에서도 아토피 피부염이 증가하고 있으며, 성인에서 아토피 피부염의 위험 인자로 얼굴과 목에 병변이 있는 경우나 동물, 꽃가루, 니켈 알레르기가 있는 경우등이 제시되고 있다. 아토피 피부염 증상이 나타나는 시기는 대체로 2-6개월이며 특히, 1세 미만에서 가장 많이 나타나고 97%가 5세 이전에 나타나는 것으로 보고되었다.

아토피 피부염을 유발하는 데에는 여러세포들(T lymphocytes, Langerhans cells, eosinophils, keratinocytes)과 인자(cytokines과 immunoglobulin, 특히 IgE)들이 관여하는 것으로 알려져 있다. 아토피 초기단계에서 Th2 타입의 T세포들에서 IL4와 IL10이 과도하게 분비되고 따라서 IL-12가 불안정하게 생산되어 IFN-γ분비가 감소된다.

최근에 골수 유래 줄기세포는 자가면역질환에 대한 면역조절기능이 있다는 것이 연구되어 보고되어 있으며, 구강내 줄기세포의 경우 면역 조절기능이 골수 유래 줄기세포보다 뛰어나다는 보고에 주목하였다.

1. 대한민국 공개특허 제2010-0105166호, 2010.09.29 2. 대한민국 공개특허 제2011-0001830호, 2011.01.06 3. 미국 공개특허 제2009-0246181호, 2009.10.01

본 발명의 목적은 다양한 성장인자와 사이토카인을 함유하는 줄기세포 배양액을 아토피 개선에 사용하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 치아 또는 골수 유래의 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 아토피 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 치아 또는 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 컨디션드 배지에서 배양하는 단계; 및

상기 단계에서 얻은 배양액을 수득하는 단계를 포함하는 상기 아토피 개선용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

일 구체예에 따르면, 치아 유래의 중간엽 줄기세포 배양액은

분리된 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸 유래의 세포를 bFGF를 함유하는 혈청 배지에서 계대배양하여 치아 유래의 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계;

상기 중간엽 줄기세포를 bFGF 함유 무혈청 배지 및 IL-b1 하에서 1 내지 2일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계; 및

상기 컨디션드 배지로부터 얻은 배양액을 수득하는 단계를 거쳐 얻을 수 있다.

다른 구체예에 따르면, 골수 유래 중간엽 줄기세포 배양액은

분리된 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 글루코스 및 글루타민 함유 혈청 배지에서 계대배양하는 단계;

상기 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지 및 IL-b1 하에서 1 내지 2일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계; 및

본 발명은 성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 유효성분, 특히 구강 내 치아 또는 골수 유래의 줄기세포 배양물은 아토피 재생에 우수한 치료 활성을 갖는다. 본 발명의 조성물은 줄기세포가 아닌 줄기세포가 분비하는 활성 단백질 복합물을 함유함으로써, 줄기세포를 사용할 때 나타날 수 있는 면역학적 문제점, 안전성에 대한 문제점, 제제학적 문제점, 개체 편차를 최소화할 수 있다.

도 1 및 2는 아토피 유발 마우스 모델에서 줄기세포 배양액의 처리 전 및 후를 나타낸 결과이다.
도 3은 아토피 유발 마우스 모델에서 줄기세포 배양액의 처리 전 및 후 혈중 IgE의 농도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 아토피 유발 마우스 모델에서 줄기세포 배양액의 처리 전 및 후 유치(젖니) 및 골수 파라크린 팩터를 비교한 실험 결과를 나타낸 것이다.
<도면 내 용어 설명>
Normal: D.W 처리(아토피 유발 없이)
Vehicle: 아세톤, 올리브오일(4:1)(아토피 유발 없이)
Control: 증류수 도포(아토피 유발 후)
ABCM: 골수 유래 줄기세포에서 얻어진 배양액(IL-b1 5pg/mL로 처리)
ADCM: 성인치수 줄기세포에서 얻어진 배양액(IL-b1 5pg/mL로 처리)
ASCM: 탈락유치 줄기세포에서 얻어진 배양액(IL-b1 5pg/mL로 처리)
CSCM: 탈락유치 줄기세포에서 얻어진 배양액
SHED : 유치(젖니)줄기세포
BMMSC : 골수중간엽줄기세포

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명자들은 자가면역질환 중 아토피 피부 질환을 대상으로 하여 인체 내에서의 활성을 유지하면서 낮은 가격과 제조 공정개발에 대하여 연구를 진행하던 중 구강 내 치아 또는 골수 유래의 줄기세포가 아토피 질환에 개선효과 있다는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 구강 내 치아 또는 골수 유래의 줄기세포의 배양액의 성분을 분석하고 제조 공정을 간단하게 제조하고 동결건조를 하여 단백질의 활성을 최대로 하였다. 이후 다양한 동물 실험을 통하여 치아 또는 골수 유래 줄기세포의 배양액의 성분이 아토피 개선에 우수한 효과가 있다는 것을 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 치아 또는 골수 유래의 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 아토피 개선용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)"라 함은 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등에도 존재하며, 이들로부터 수득할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 치아 또는 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 의미한다.

본 발명의 치아 또는 골수 유래의 중간엽 줄기세포는 (a) CD90, CD105, CD44 및 CD73 에 대하여 모두 양성의 면역학적 특징을 나타내고, (b) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내며, (c) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 "분화(differentiation)"란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 다능성 중간엽 줄기세포는 계통이 한정된 전구세포(예컨대, 중배엽성 세포)로 분화한 후, 다른 형태의 전구세포로 더 분화될 수 있고(예컨대, 골모세포 등), 그 뒤 특정 조직(예컨대, 뼈 등)에서 특징적인 역할을 수행하는 말기 분화세포(예컨대, 지방세포, 골세포, 연골세포 등)로 분화될 수 있다.

상기 치아 또는 골수 유래의 중간엽 줄기세포 배양액은 상기 줄기세포에서 분비되는 bFGF, IFN-γ, PDGF, VEGF 및 HGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장인자 또는 사이토카인을 다량 포함할 수 있다.

본 발명의 치아 또는 골수 유래의 줄기세포 배양액은 IL-b1을 첨가한 배지에서 배양하여 IFN-γ(자가면역 인자 저하물질)의 발현이 증대되어 아토피 유발 마우스 모델의 질환 부위에 액상 형태로 또는 증류수, 생리식염수, 물 등에 용해되어 도포되거나, 혈관 투여 시 IGE, IL-4, IL-10의 자가면역 관련 인자가 저하되어 아토피 상처가 치유되는 특징이 있다.

상기 치아 유래 중간엽 줄기세포 배양액은

상기 골수 유래의 중간엽 줄기세포 배양액은

상기 중간엽 줄기세포는 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸, 또는 골수 내에 존재하는 세포 중에서 정제과정을 거쳐 수득할 수 있으며, 각 조직의 특성에 따라 줄기세포를 추출하는 과정은 공지의 방법을 사용할 수 있는 당업자의 주지의 사실이며, 현재는 인간 유래의 중간엽 줄기세포를 연구용 목적으로 사용 가능한 세포주를 판매하고 있어 쉽고 용이하게 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있다.

본 발명에 사용된 중간엽 줄기세포 역시 론자(Lonza)에서 판매하는 세포주를 구입하여 사용할 수 있어 기본 배지에서 배양하여 용이하게 수득할 수 있다.

중간엽 줄기세포의 배양 과정과 관련하여 필수적으로 포함되는 과정들은 문헌들을 통해 공개되어 있으며, 세포배양에 앞서 공지의 방법을 통해 공급원으로부터 추출한 생검 즉, 골수, 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸 등은 일반적인 항생제를 포함한 세척배지를 이용한 반복적인 세척과정을 통해 후속배양에서의 오염 가능성을 최소한으로 감소시킬 수 있다.

혈청을 포함한 초기단계 세포배양을 위한 배지는 중간엽 줄기세포와 같은 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지인 것이 좋다. 본 발명에서는 일반적으로 세포배양에 사용하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), aMEM(alpha Minimal essential Medium)을 사용하고, 세포배양에 통상적으로 사용되는 혈청을 포함한다.

혈청은 0.1 내지 20％의 소 태아 혈청(FBS)을 첨가하는 것이 바람직하고, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가하는 것이 좋다.

항생제로는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 폰지존(fungizone) 등의 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있다. 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있다.

필요에 따라 글루타민 등의 산화영양소와 소디움 피루베이트등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 배지는 1∼2mM 의 글루타민, 0.5∼1mM 소디움 피루베이트, 0.1∼10％ FBS, 1％ 항생제(100IU/mL)로 보충된 글루코오스 및 DMEM을 함유하는데 이를 완전혈청배지라 한다. 이때 글루코스의 농도범주는 대략적으로 1g/L ∼ 4.5g/L일 수 있다. 상기 완전혈청배지는 골수 또는 제대혈 유래 줄기세포의 보관과 유지 및 시험관내 안정된 기본배양조건을 제공해 주며 효과적인 세포의 안정화를 보여준다.

초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90∼95％, 온도 35∼39℃, 5∼10％ CO₂ 배양기에서 배양하고, 5∼10％ CO2 배양 시에는 최종농도가 0.17∼0.22 중량％가 되게 소디움 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해줄 수 있다.

본 발명의 줄기세포 계대배양을 위한 배지에는 bFGF를 더 포함할 수 있다.

초기배양 단계 동안 조직단편은 배양 용기 바닥에 부착된 상태를 유지시키는게 바람직하며, 세포 배양의 표준 기술에 따른 트립신-EDTA 처리로 인한 짧은 자극으로 성장을 촉진할 수 있다.

누적집단배증시간 (doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 75∼85％ 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게는 80％ 합류시기에 세포를 채취하여 계대배양을 한다.

상기 단계 배양된 세포에서는, 구강내 치아 또는 골수 유래의 줄기세포를 무혈청 배지에 48시간 배양하여 컨디션드 배지를 제조한다.

상기 컨디션드 배지에는 IL-b1을 배지 1mL 당 1 내지 10 pg으로 첨가시켜 IFN-γ를 증대시킬 수 있다.

본 발명에서 용어, "컨디션드 배지(conditioned medium)" 란 세포를 세포분열 최성기인 대수성장기에 도달했을 때 무혈청 배지로 교환한 후 배양액만 수거한 배지를 말한다. 이는 분열중인 세포로부터 배지 내에서 추출되어 나오는 미지의 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine)을 이용하는 것을 말한다. 본 발명의 목적상, 본 발명에서의 컨디션드 배지 조성물이란 구강내 치아 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 배지에서 구강내 치아 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포를 제거한 용액을 포함하는 조성물로서, 구강내 치아 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 성장인자 등의 물질이 풍부하게 함유되어 있는 조성물을 말하며, 그 조성물은 에탄올 침전법으로 침전시킨 후 동결 건조를 진행하여 분말 형태의 제제를 제조할 수 있다. 따라서, 치아 또는 골수 유래의 중간엽 줄기세포 배양액은 동결건조한 파우더로 된 성상 형태이거나, 액상 형태로 포함될 수 있다.

본 발명의 아토피 개선용 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 치아 또는 골수 유래의 중간엽 줄기세포의 배양액 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한, 상기 화장료 조성물은 그 효과를 증진시키기 위하여 피부 흡수촉진 물질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제,향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 예컨대 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여 중 경피투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은, 경구형 제형인 경우 성인 기준으로 0.1-100 ㎎/kg의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1일당 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한

치아 또는 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 컨디션드 배지에서 배양하는 단계; 및

상기 단계에서 얻은 배양액을 수득하는 단계를 포함하는 상기 아토피 개선용 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

일 구체예에 따르면, 상기 치아 유래의 중간엽 줄기세포 배양액은

다른 구체예에 따르면, 골수 유래의 중간엽 줄기세포 배양액은

분리된 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 글루코스 및 글루타민 함유 무혈청 배지에서 계대배양하는 단계;

상기 줄기세포의 계대배양 과정 및 컨디션드 배지 배양액을 제조하는 과정은 상술한 바와 같다.

상기 컨디션드 배지 배양액을 수거하여 본 발명에서 목적하는 아토피 개선용 조성물을 제조한다.

상기 컨디션드 배지 배양액의 수득 방법은 당업계에 공지된 방법에 의해 수행할 수 있으며, 원심분리 또는 여과하여 수거할 수 있다.

상기 컨디션드 배지 배양액은 수득 후 에탄올 침전법으로 침전시킨 후 동결 건조를 진행하여 분말 형태의 제제를 제조할 수 있다. 따라서, 동결건조한 파우더로 된 성상 형태이거나, 액상 형태로 사용할 수 있다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 구강 내 줄기세포의 수득

구강내 줄기세포 SHED는 6세 남아의 유치에서 분리된 세포였다. 탈락한 유치로부터 치수를 추출한 다음 콜라게나아제(3mg/mL), 디스페이즈(4mg/mL)에 37℃ 1시간 동안 반응시킨 뒤 70㎛의 셀스트레이너에 통과시켜 한 개의 세포로 분리하였다. 분리된 세포는 10% FBS가 들어있는 aMEM으로 효소를 불활성화시킨 후 aMEM, 50㎍ 아스코비르산, 10ng bFGF, 1%페니실린- 스트렙토마이신, 또는 암포테리신 B가 들어 있는 배양배지로 바꾼 후 약 90%의 습도 및 약 37도 온도 조건하에서 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

계대배양은 배양액을 제거한 플라스크를 PBS로 세척하고 0.25% Trypsin-EDTA(GIBCO)로 세포를 떨어뜨린 후 세포 부유액을 원심분리한 다음, 세포수 측정과 viability 검사한 뒤 다시 3배로 계대배양 하였다. 계대배양시 사용한 배지는 50ug 아스코비르산, 10ng bFGF, 10% 우혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로써 암포테리신B가 보충된 aMEM 배지를 사용하였다.

세포의 컨플루언시가 약 70-80%가 되었을 때 파이펫을 사용하여 배양된 배양물로부터 배양액을 제거한 후, 인산화 완충 용액으로 2 회 세척한 후, aMEM, 50㎍ 아스코비르산, 10ng bFGF, 페니실린-스트렙토마이신 또는 폰지존이 보충된 DMEM 배지와 IL-b1(5pg/mL)을 가한후 약 90 %의 습도 및 약 37 ℃ 온도 조건 하에서 5 % CO₂ 배양기에서 24-48시간 배양하였다.

<실시예 2> 골수 유래 중간엽 줄기세포의 수득

골수 유래 중간엽 줄기세포 hMSC는, Human Mesenchymal stem cells (Lonza, PT-2501)에서 구매하였고, 22세 건강한 여자의 골수로부터 분리된 세포였다.

실시예 2에서 골수 유래 중간엽 줄기세포의 초기 계대배양은 4.5g/L의 D 글루코스, 584 mg/L의 L-글루타민, 110mg/L의 소디움피루베이트 10 % FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로써 암포테리신B가 보충된 DMEM 배지에 가하고, 약 90 %의 습도 및 약 37 ℃ 온도 조건 하에서 5 % CO₂ 배양기에서 배양하였다.

계대배양은 배양액을 제거한 플라스크를 PBS로 세척하고 0.25% Trypsin-EDTA(GIBCO)로 세포를 떨어뜨린 후 세포 부유액을 원심분리한 다음, 세포수 측정과 viability 검사한 뒤 다시 3배로 계대배양 하였다. 계대배양시 사용한 배지는 4.5g/L의 D 글루코스, 584 mg/L의 L-글루타민, 110mg/L의 소디움피루베이트, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로써 암포테리신B가 보충된 DMEM 배지를 사용하였다.

세포의 컨플루언시가 약 70-80%가 되었을 때 파이펫을 사용하여 배양된 배양물로부터 배양액을 제거한 후, 인산화 완충 용액으로 2 회 세척한 후, 4.5g/L의 D 글루코스, 584 mg/L의 L-글루타민, 110mg/L의 소디움피루베이트, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 폰지존이 보충된 DMEM 배지와 IL-b1(5pg/mL)을 가한 후 약 90 %의 습도 및 약 37 ℃ 온도 조건 하에서 5 % CO₂ 배양기에서 24-48시간 배양하였다.

<실시예 3> 컨디션드 배지 분말 제제의 제조

구체적으로, 골수 유래 중간엽 줄기세포와 구강내 줄기세포를 상기 실시예 1 및 2의 조건하에서 24-48시간 동안 배양한 배양액 50 mL을 1500rpm에서 5분 동안 원심분리한 뒤 상층액을 새로운 튜브로 옮긴 후 3000 rpm에서 2-3분 동안 원심분리한 뒤 잔여 부유물을 제거한 뒤, 100% 에탄올을 2-3배 첨가하여 -20℃에 한 시간 방치하였다. 이후 15분간 4℃에서 15000rpm으로 원심분리 하였다. 이후 침전물에 90% 에탄올을 처리하여 다시 15000rpm으로 5-10분간 원심분리 하였다. 원심분리한 침전물에 멸균수 2.5mL을 첨가하여 침전물을 녹인 후에 1.8mL-튜브에 500㎕씩 분주한 후 -80℃ 디프리져에서 2-3시간 방치하였다. 이후 동결건조를 8시간 진행한 후 분말 형태로 제조하였다.

<실시예 4> 성장 인자에 의한 아토피 개선을 위한 실험적 연구

(동물 배양)

6주령 수컷 BALB/c 마우스는 오리엔트 바이오로부터 공급받아 실험에 사용하였다. 실험동물 총 21 마리를 정상군, 비히클, 대조군, 시료처리군으로 나누었으며, 정상군 3마리, 비히클 3마리(vehicle), 대조군 3마리(DW), 시료처리군 12 마리로 나누었다. 시료처리군은 ABCM 3마리, ADCM 3마리, ASCM 3마리, CSCM 3마리로 나누었다. 사육 조건은 온도 21~23℃, 습도 40~60%, 조명 12 시간 명암으로 유지시켰으며, 시험동물은 분양받은 후 7일간 순화 과정 후 실험에 사용하였다.

(아토피 피부염 유발)

BALB/c 마우스의 등을 귀 하단부에서부터 꼬리 상단부까지 전체를 제모하고 24 시간 방치하였다. 피부 자극을 위해 사용한 DNCB(2,4-dinitrochlorobenzene)는 4:1 비율의 아세톤-올리브오일에 녹여 사용하였다. 먼저 피부감작을 위해 1% DNCB 용액 100㎕를 제모 부위에 0일째와 3일째에 도포하였다. 7일째와 10일째에는 0.2% DNCB 용액 100㎕를 이전과 같은 방법으로 도포하였다. 아토피 피부염 유발이 끝나면 각 시험 물질(ABCM, ADCM, ASCM, CSCM) 100㎕를 하루에 한 번씩 아토피 피부염 유발 부위에 도포하는 방법으로 총 7일간 처리하였다. 정상군의 경우 아무 처리를 하지 않았고, 비히클은 아세톤-올리브오일을 도포하였다. 대조군의 경우 아토피 피부염 유발 후 동량의 증류수를 처리하여 각 시험 물질의 아토피 개선 효능을 평가하였다.

(혈중 IgE의 농도 측정)

BALB/c 마우스로부터 혈액을 채취하여 13,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상등액인 혈청만 분리하였다. 이렇게 얻은 혈청은 분주하여 -70℃에 보관하면서 ELISA법을 사용하여 IgE 정량을 실시하였다. 1차 항체와 0.1 M 소듐 카보네이트 용액(pH 9.5)을 1:250으로 희석하여 96-웰 플레이트에서 4℃, 16 시간 이상 코팅한 후 혈청과 assay diluent를 1:250으로 희석하여 2시간 동안 반응시키고 비오틴이 부착된 1차 항체를 결합시킨 후 horseradish peroxidase (HRP)와 3,3',5,5'-tetramethyl benzidine (TMB)를 이용하여 발색시켜 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

도 1 내지 4에 나타난 바와 같이, 치아 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포 배양액은 혈중 IgE의 함량을 현저히 저하시키고, 아토피 유발 마우스 모델에서 아토피 상처가 치유됨을 확인하였다.

Claims

치아 또는 골수 유래의 중간엽 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 아토피 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
치아 또는 골수 유래의 중간엽 줄기세포는 다음과 같은 특성을 나타내는 아토피 개선용 조성물:
(a) CD90, CD105, CD44 및 CD73 에 대하여 모두 양성의 면역학적 특징을 나타내고,
(b) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내며,
(c) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가진다.
제1항에 있어서,
치아 또는 골수 유래의 중간엽 줄기세포 배양액은 상기 줄기세포에서 분비된 bFGF, IFN-γ, PDGF, VEGF 및 HGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장인자 또는 사이토카인을 포함하는 아토피 개선용 조성물.
제1항에 있어서, 치아 유래의 중간엽 줄기세포 배양액은
분리된 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸 유래의 세포를 bFGF를 함유하는 혈청 배지에서 계대배양하여 치아 유래의 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계;
상기 중간엽 줄기세포를 bFGF 함유 무혈청 배지 및 IL-b1 하에서 1 내지 2일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계; 및
상기 컨디션드 배지로부터 얻은 배양액을 수득하는 단계를 거쳐 얻은 것인 아토피 개선용 조성물.
제1항에 있어서, 골수 유래의 중간엽 줄기세포 배양액은
분리된 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 글루코스 및 글루타민 함유 혈청 배지에서 계대배양하는 단계;
상기 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지 및 IL-b1 하에서 1 내지 2일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계; 및
상기 컨디션드 배지로부터 얻은 배양액을 수득하는 단계를 거쳐 얻은 것인 아토피 개선용 조성물.
제4항 또는 제5항에 있어서,
IL-b1은 배지 1mL 당 1 내지 10 pg으로 포함되는 아토피 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
치아 또는 골수 유래의 중간엽 줄기세포 배양액은 동결건조한 파우더로 된 성상 형태이거나, 액상 형태인 아토피 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 화장료 조성물인 아토피 개선용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적 조성물인 아토피 개선용 조성물.
치아 또는 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 컨디션드 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 단계에서 얻은 배양액을 수득하는 단계를 포함하는 제1항의 조성물을 제조하는 방법.
제10항에 있어서, 치아 유래의 중간엽 줄기세포 배양액은
분리된 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸 유래의 세포를 bFGF를 함유하는 혈청 배지에서 계대배양하여 치아 유래의 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계;
상기 중간엽 줄기세포를 bFGF 함유 무혈청 배지 및 IL-b1 하에서 1 내지 2일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계; 및
상기 컨디션드 배지로부터 얻은 배양액을 수득하는 단계를 거쳐 제조되는 방법.
제10항에 있어서, 골수 유래의 중간엽 줄기세포 배양액은
분리된 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 글루코스 및 글루타민 함유 무혈청 배지에서 계대배양하는 단계;
상기 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지 및 IL-b1 하에서 1 내지 2일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계; 및
상기 컨디션드 배지로부터 얻은 배양액을 수득하는 단계를 거쳐 제조되는 방법.