KR20140054630A

KR20140054630A - 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 포함하는 골 재생용 조성물

Info

Publication number: KR20140054630A
Application number: KR1020120120345A
Authority: KR
Inventors: 국일; 이정우
Original assignee: (주)치아줄기세포뱅크
Priority date: 2012-10-29
Filing date: 2012-10-29
Publication date: 2014-05-09
Also published as: KR101486314B1

Abstract

본 발명은 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 포함하는 골 재생용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 줄기세포의 컨디션드 배지 분말이 골 재생에 탁월한 효과가 있어 골 질환 등의 예방과 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포 컨디션드 배지 분말을 포함하는 골 재생용 조성물{Composition for bone regeneration comprising conditioned medium powder of stem cell}

본 발명은 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 포함하는 골 재생용 조성물에 관한 것이다.

골 재생에 대하여 현재 시술되고 있는 방법은 자가골, 이종골, 합성 이식재 또는 세라믹, 골 형성 단백질이 있다. 자가골의 경우 공여 부위의 손상이 불가피하고 자가골의 양이 한계가 있으며, 골 결손 부위의 모양을 맞추기가 어렵고 골 결손 부위의 크기가 클 때는 골 재생이 불충분하다는 단점이 있다. 이종골의 경우 감염의 위험성과 거부 반응이 일어날 수 있으며 골이 조기 흡수가 될 수있고 골 재생이 우수하지 못한 단점이 있다. 합성 이식재 또는 세라믹의 경우 골 유도성이 없으며 수산화아파타이트는 생분해가 느리다는 단점을 가지고 있다. 골 형성 단백질의 경우에도 원치 않는 부위에서도 골 재생이 이루어질 수 있으며 골 형성의 전도성이 떨어지는 단점이 있다.

골수 유래 줄기세포는 생체의 성장인자를 외부에서 공급하게 되면 생체의 노화를 억제할 수 있다는 것이 연구되고 있으며, 그 물질의 구체적인 효과에 대해서도 연구가 진행되고 있다[비특허문헌 1] 구체적으로 이 성장인자의 구조와 합성에 대한 연구가 진행되었지만 대부분의 성장인자는 단백질의 구조를 가지고 있으며 그 구조가 3차원적으로 복잡하여 화학적으로 합성하는데 여러 가지 문제점이 발생되고 합성에 들어가는 비용 또한 매우 고가인 것이 현실이다. 또한, 단백질의 특성에 따라 정제 공정이 달리 진행됨으로 제조 공정을 확립하기에도 어려운 점이 있다.

본 발명자들은 인체 내에서의 활성을 유지하면서 저비용과 효과적인 제조공정 개발에 대하여 연구를 진행하던 중 골수 유래 줄기세포가 성장인자와 사이토카인 및 다양한 단백질을 분비한다는 보고에 주목하였다[비특허문헌 2]. 그러나, 골수 유래 줄기 세포에 관한 연구는 대부분 그 세포 자체를 이용하는 것이나 분화에 관한 연구가 있을 뿐 배양액 내에 있는 성장인자 및 사이토카인에 대한 전임상 연구가 미약한 상태이다

GE Pierce and TA Mustoe, Annu Rev Med, 46. 467-481(1995) Rehman, J. etal.,Circulation, 109: 1292-1298 (2004)

이에, 본 발명자들은 줄기세포 컨디션드 배지 분말이 골 재생에 우수한 효과가 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 포함하는 골 재생용 조성물 또는 골 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 줄기세포 컨디션드 배지 분말 및 콜라겐 스폰지를 포함하는 골 재생용 키트를 제공하는데 다른 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 골 재생용 조성물을 포함하는 골 이식재 또는 골 충전제를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은

줄기세포 컨디션드 배지 분말을 포함하는 골 재생용 조성물을 제공한다:

상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은,

줄기세포 컨디션드 배지 분말 및 콜라겐 스폰지를 포함하는 골 재생용 키트를 제공한다.

상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은,

상기 골 재생용 조성물을 포함하는 골 이식재 또는 골 충전재를 제공한다.

본 발명은 줄기세포의 컨디션드 배지 분말이 골 재생에 탁월한 효과가 있어 골 질환 등의 예방과 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 두개관 결손(calvarial defect)된 쥐에 대조군(a), 실시예 1의 BMMSC-CM(b), 실시예 2의 DPSC-CM(c)을 이식하고 8주 후 두개관을 분리하고 고정액에 24시간 고정 후에 마이크로 CT로 분석한 3D 사진이다.
도 2는 두개관 결손(calvarial defect)된 쥐에 대조군(a), 실시예 1의 BMMSC-CM(b), 실시예 2의 DPSC-CM(c)을 이식하고 8주 후에 두개관을 분리하고 고정액에 24시간 고정 후에 마이크로 CT로 확인한 사진이다.
도 3은 두개관 결손(calvarial defect)된 쥐에 대조군(a), 실시예 1의 BMMSC-CM(b), 실시예 2의 DPSC-CM(c)을 이식하고 8주 후에 두개관의 뼈 부피를 나타낸 그래프이다.

상기 줄기세포 컨디션드 배지 분말은 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하여 얻은 배양액을 동결 건조하여 얻은 것을 의미한다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 컨디션드 배지 분말은 줄기세포의 혈청 배지 배양액인 컨디션드 배지 분말 내에 유효성분을 다량 함유함으로써 상기 분말이 골 재생 효과가 뛰어나, 골 질환 예방, 개선 또는 치료에 뛰어난 효과를 갖도록 할 수 있다.

따라서, 본 발명의 골 재생용 조성물은 골 질환 예방 및 치료용으로 사용될 수 있다.

상기 골 질환은 대사성 골 질환 또는 정형외과적 골 질환을 포함할 수 있는데, 대사성 골 질환의 예로는 골다공증, 골형성 부전증, 골연화증 또는 암 환자의 골량 감소증 등을 들 수 있고, 정형외과적 골 질환의 예로는 골절, 골결손 또는 고관절 감소증 등을 들 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 컨디션드 배지 분말의 제조방법은 보다 구체적으로 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하여 얻은 배양액 즉, 컨디션드 배지를 동결 건조하여 얻을 수 있다.

본 명세서에서, "컨디션드 배지(conditioned medium)"란 줄기세포를 세포분열 최성기인 대수성장기에 도달했을 때 무혈청 배지로 교환한 후 배양액만 수거한 배지를 말한다. 이는 분열중인 줄기세포로부터 배지 내에서 추출되어 나오는 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine)을 이용하는 것을 말한다. 일 구체예에 따르면 상기 컨디션드 배지는 치수 유래 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 후 치수 유래 중간엽 줄기세포를 제거한 용액을 포함하는 것으로서, 치수 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 성장인자, 사이토카인 등의 물질이 풍부하게 함유되어 있을 수 있다.

상기 줄기세포는 인간의 배낭, 태반, 제대, 제대혈, 피부, 말초혈액, 골수, 지방, 근육, 간, 신경조직, 골막, 태아막, 활액막, 활액, 양막, 반월상연골, 전십자 인대, 관절 연골세포, 치아, 치수, 혈관주위세포, 지주골, 슬개골하지방괴, 비장 및 흉선을 포함한 간엽 줄기세포가 존재하는 조직으로부터 분리 및/또는 배양된 간엽 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 줄기세포는 다음의 특성을 나타낼 수 있다:

(a) CD90, CD105, CD44 및 CD73 에 대하여 모두 양성의 면역학적 특징을 나타내고, (b) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태(spindleshape)의 형태학적 특성을 나타내며, (c) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서, "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)"라 함은 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등에도 존재하며, 이들로부터 수득할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 골수, 치아 또는 치수 유래의 중간엽 줄기세포를 의미한다.

본 발명에서 "분화(differentiation)"란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 다능성 중간엽 줄기세포는 계통이 한정된 전구세포(예컨대, 중배엽성 세포)로 분화한 후, 다른 형태의 전구세포로 더 분화될 수 있고(예컨대, 골모세포 등), 그 뒤 특정 조직(예컨대, 뼈 등)에서 특징적인 역할을 수행하는 말기 분화세포(예컨대, 지방세포, 골세포, 연골세포 등)로 분화될 수 있다.

또한, 상기 무혈청 배지는 혈청을 포함하지 않는 초기단계 세포배양을 위한 배지로서 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지라면 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), aMEM(alpha Minimal essential Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute medium) 등을 사용할 수 있다.

상기 무혈청 배지는 상기 배지에 성장인자 또는 사이토카인을 더 포함할 수 있다.

상기 성장인자로 IGF, bFGF, TGF, HGF, EGF, VEGF 또는 PDGF 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 사이토카인으로 IL-1, IL-4, IL-6, IFN-γ, IL-10 또는 IL-17 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 컨디션드 배지는 세포를 25 내지 40 ℃에서 1 내지 3일간 무혈청 배지에서 배양하여 제조할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

일 구체예에 따르면, 줄기세포를 이용하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계는 분리된 골수, 치아, 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸 유래의 세포를 혈청 함유 배지에서 계대 배양하여 치수 유래의 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계; 및

상기 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포는 골수, 치아, 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸 내에 존재하는 세포 중에서 정제과정을 거쳐 수득할 수 있으며, 각 조직의 특성에 따라 줄기세포를 추출하는 과정은 공지의 방법을 사용할 수 있는 당업자의 주지의 사실이며, 현재는 인간 유래의 중간엽 줄기세포를 연구용 목적으로 사용 가능한 세포주를 판매하고 있어 쉽고 용이하게 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있다.

중간엽 줄기세포의 배양 과정과 관련하여 필수적으로 포함되는 과정들은 문헌들을 통해 공개되어 있으며, 세포배양에 앞서 공지의 방법을 통해 공급원으로부터 추출한 생검 즉, 골수, 치아, 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸 등은 일반적인 항생제를 포함한 세척배지를 이용한 반복적인 세척과정을 통해 후속 배양에서의 오염 가능성을 최소한으로 감소시킬 수 있다.

혈청을 포함한 초기단계 세포배양을 위한 배지는 중간엽 줄기세포와 같은 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지인 것이 좋다. 본 발명에서는 일반적으로 세포배양에 사용하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), aMEM(alpha Minimal essential Medium)을 사용하고, 세포배양에 통상적으로 사용되는 혈청을 포함한다.

혈청은 0.1 내지 20％의 우태아혈청(FBS)을 첨가하는 것이 좋고, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가하는 것이 좋다. 항생제로는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 폰지존(fungizone) 등의 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있다. 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있다. 필요에 따라 글루타민 등의 산화영양소와 소듐 피루베이트 등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.

초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90 내지 95％, 온도 25 내지 40℃, 5 내지 10％ CO₂ 배양기에서 배양하고, 5 내지 10％ CO₂ 배양 시에는 최종농도가 0.17 내지 0.22 중량％가 되게 소듐 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해줄 수 있다.

누적집단배증시간(doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 70 내지 80％ 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게는 75％ 합류시기에 세포를 채취하여 계대배양을 한다.

상기 단계 배양된 치수 유래의 줄기세포를 무혈청 배지에서 25 내지 40 ℃에서 1 내지 3일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조한다.

상기 컨디션드 배지를 6 내지 10 시간 동안 동결 건조하여 본 발명의 컨디션드 배지 분말을 얻을 수 있다.

본 발명의 컨디션드 배지 분말은 유효성분이 고농축으로 존재할 수 있으며, 예컨대, Decorin, MCP-1, DKK-3, TIMP-2, Angiogenin, Follistatin, Osteoprotegerin, betaIG-H3, MMP-10, MMP-7, LYVE-1, XEDAR, IL-22, RANK, IGFBP-6, Axl, FLRG, NRG1-beta1, PAI-1, Ferritin, Galectin-7, Resistin, Bate2 M, TSLP, VEGF-C, CD40, sTNT R1, IL-6, TRAIL R2, Osteopontin, TIMP-1, Growth Hormon, Thromboppoietin, CXCL-16, DPPIV, HVEM, IL-17B, IL-3, bFGF, IFN-γ, TGF, HGF 또는 PDGF 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 골 재생용 조성물은 줄기세포가 분비하는 활성 단백질 복합물을 함유함으로써 줄기세포를 사용할 때 나타날 수 있는 면역학적 문제점, 안전성에 대한 문제점, 제제학적 문제점, 개체 편차를 최소화 할 수 있다. 또한 인체 내 세포 주입으로 인하여 발생할 수 있는 부작용을 근본적으로 방지할 수 있다.

최근 골 형성을 촉진하는 물질로서, 혈소판 유도 성장 인자 (Platelet-derived growth factor, PDGF), TGF-β, IGF-I, IGF-Ⅱ, FGF 또는 BGDF-Ⅱ 등과 같은 골 형성을 촉진하는 성장인자를 포함하는 생리활성 고분자가 주로 사용되고 있는데, 본 발명의 골 재생용 조성물은 상기와 같은 성장인자를 포함하는 생리활성 고분자를 함께 사용할 수 있다.

본 발명의 골 재생용 조성물은 전신 또는 국소 투여할 수 있으며, 상기 투여는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 골 재생용 조성물로서 투여되는 경우, 적절한 투여 형태를 제공하도록 적합한 양의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 함께 제형화될 수 있다. 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 담체는 비경구적 전달 또는 비경구적 삽입을 위한 담체일 수 있다.

주사제와 같은 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제 등이 포함된다.　 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜 (Polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 유효량은 중증의 경중도, 환자의 성별, 나이, 체중 등을 고려하여 적절히 선택될 수 있으나, 일반적으로 성인 기준 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 하루에 1회 내지 수회 분할 투여할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 쉽게 결정될 수 있으며, 사용되는 특정 활성 성분, 투여의 방식, 제제의 효과 및 질환 상태의 발전에 따라 변화할 수 있을 것이다. 또한, 환자의 나이, 체중, 식이 및 투여의 시간을 포함한 치료받는 환자 개개인의 인자들에 따라 적절한 치료적 수준에 따른 투여량 조절이 필요할 것이다.

특히, 본 발명의 골 재생용 조성물은 골질환의 예방 및 치료용으로 사용되므로, 골 충진재 또는 골 이식재(임플란트)로서 사용되기에 적합한 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 예를 들어 골 이식재나 골 충진재는 협의로는 골 조직 내의 공간을 충진하기 위하여 사용될 수도 있고, 광의로는 뼈나 치아의 일부를 대체하는데 사용될 수 있으며, 압착, 압축, 가압접촉, 패킹, 압박, 굳힘 등의 방법을 사용하여 퍼티, 페이스트, 주형 가능한 스트립, 블록, 칩 등의 형태로 사용하여 사용할 수도 있고, 화학적 첨가물을 이용하여, 겔, 과립, 페이스트, 정제, 펠렛 등의 형태로 제형화하여 사용할 수 있고, 분말 형태로 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 골 재생용 조성물을 제형화할 때 생물학적 활성물질을 첨가하여 사용할 수 있으며, 생물학적 활성물질로는 골 형성을 촉진하는 성장 인자, 피브린, 골 형성단백질, 골 성장제, 화학요법제, 항생제, 진통제, 비스포스포네이트, 스트론튬염, 불소염, 마그네슘염 및 나트륨염 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 골 재생용 조성물을 제형화할 때 화학적 첨가물로서 히알루론산, 콘드로이틴 황산 알긴산, 키토산, 콜라겐, 수산화인회석, 탄산칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘, 세라믹 등이 있으며, 상기 첨가물의 종류에 따라 겔, 스트립, 과립, 칩, 펠렛, 정제, 페이스트 등의 형태로 제형화가 가능하다.

본 발명은 또한, 줄기세포 컨디션드 배지 분말 및 콜라겐 스폰지를 포함하는 골 재생용 키트를 포함할 수 있다.

상기 키트는 주사용 완충액을 함유하는 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트에서 사용되는 용기는 예컨대, 본 발명의 의약 조성물을 담고 있고 밀봉 가능한 유리 또는 플라스틱 용기일 수 있다. 본 발명의 의약 조성물을 담기 위한 것이면 족할 뿐 특별한 형태를 요구하는 것은 아니다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

제조예 1: 골수 유래 중간엽 줄기세포의 수득

골수 유래 중간엽 줄기세포 hMSC는, Human Mesenchymal stem cells (Lonza, PT-2501)에서 구매하였고, 22세 건강한 여자의 골수로부터 분리된 세포였다. 골수 유래 중간엽 줄기세포의 초기 계대 배양은 4.5 g/L의 D-글루코스, 584 mg/L의 L-글루타민, 110 mg/L의 소디움피루베이트, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로서 암포테리신B가 보충된 DMEM 배지에 가하고, 약 90%의 습도 및 약 37 ℃ 온도 조건 하에서 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

계대 배양은 배양액을 제거한 플라스크를 인산완충용액으로 세척하고 0.25% Trypsin-EDTA(GIBCO)로 세포를 떨어뜨린 후 세포 부유액을 원심분리한 다음, 세포수 측정과 생존능을 검사한 뒤 다시 3배로 계대 배양하였다.

계대 배양에 사용한 배지는 4.5 g/L의 D-글루코스, 584 mg/L의 L-글루타민, 110 mg/L의 소디움피루베이트, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로서 암포테리신B가 보충된 DMEM 배지였다.

세포의 컨플루언시가 약 70∼80%가 되었을 때 파이펫을 사용하여 배양된 배양물로부터 배양액을 제거한 후, 인산완충용액으로 2회 세척한 후, 4.5 g/L의 D-글루코스, 584 mg/L의 L-글루타민, 110 mg/L의 소디움피루베이트, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 폰지존이 보충된 DMEM 배지를 가한 후 약 90%의 습도 및 약 37 ℃ 온도 조건 하에서 5% CO₂ 배양기에서 48시간 배양하였다.

실시예 1: 골수 중간엽 줄기세포 유래 컨디셔드 배지 분말의 제조

상기 제조예 1에서 얻은 골수 중간엽 줄기세포(BMMSC) 5 X 10⁵개의 세포를 DMEM(Invitrogen-Gibco-BRL) 무혈청 배지에 48시간 배양하였다. 상기 무혈청 배지(컨디셔드 배지)에서 배양한 배양액 50 mL을 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리한 뒤 상층액을 새로운 튜브로 옮긴 후 3000 rpm에서 3분 동안 원심분리한 뒤 잔여 부유물을 제거한 뒤, 100% 에탄올을 2-3배 첨가하여 -20 ℃에 한 시간 동안 방치하였다. 이후 15분간 4 ℃에서 15000 rpm으로 원심분리 하였다. 이후 침전물에 90% 에탄올을 처리하여 다시 15000 rpm으로 7분간 원심분리 하였다. 최대한 에탄올 상층액을 피펫을 사용하여 버린 후, 주사용수 2.5 mL을 1.8 mL-튜브에 500 ㎕씩 분주한 후 -80 ℃ 디프리져에서 3시간 방치하였다. 이후 동결건조를 8시간 진행한 후 분말 형태로 제조하였다.

제조예 2: 구강 내 줄기세포의 수득

구강 내 줄기세포 DPSC는 16세 영구치에서 분리된 세포였다.

탈락한 영구치로부터 치수를 추출한 다음 콜라게나아제(3 mg/mL), 디스페이즈(4 mg/mL)에 37 ℃ 1시간 동안 반응시킨 뒤, 70 ㎛의 셀스트레이너에 통과시켜 한 개의 세포로 분리하였다. 분리된 세포는 10% FBS가 들어있는 aMEM으로 효소를 불활성화시킨 후 aMEM, 50 ㎍의 아스코비르산, 10 ng의 bFGF, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 또는 암포테리신 B가 들어 있는 배양배지로 바꾼 후 약 90%의 습도 및 약 37 ℃의 온도 조건 하에서 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

계대배양은 배양액을 제거한 플라스크를 인산완충용액으로 세척하고 0.25% Trypsin-EDTA(GIBCO)로 세포를 떨어뜨린 후 세포 부유액을 원심분리 한 다음, 세포수 측정과 생존능을 검사한 뒤 다시 3배로 계대 배양하였다.

계대 배양에 사용한 배지는 50 ㎍의 아스코비르산, 10 ng의 bFGF, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로 암포테리신B가 보충된 a-MEM 배지였다.

세포의 컨플루언시가 약 70∼80%가 되었을 때 파이펫을 사용하여 배양된 배양물로부터 배양액을 제거한 후, 인산완충용액으로 2회 세척한 후 무혈청 배지(50 ㎍의 아스코비르산, 10 ng의 bFGF, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로 암포테리신B가 보충된 aMEM 배지)를 가한 후 약 90%의 습도 및 약 37 ℃ 온도 조건 하에서 5% CO₂ 배양기에서 48시간 배양하였다.

실시예 2: 구강 내 줄기세포 컨디셔드 배지 분말의 제조

상기 제조예 2에서 얻은 구강 내 줄기세포(DPSC) 2~5 X 10⁶개의 세포를 를 무혈청 배지(50 ㎍의 아스코비르산, 10 ng의 bFGF, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로 암포테리신B가 보충된 aMEM 배지)에서 48시간 배양하였다.

상기 무혈청 배지(컨디셔드 배지)에서 배양한 배양액 50 mL을 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리한 뒤 상층액을 새로운 튜브로 옮긴 후 3000 rpm에서 3분 동안 원심분리한 뒤 잔여 부유물을 제거한 뒤, 100% 에탄올을 첨가하여 -20 ℃에 한 시간 방치하였다. 이후 15분간 4 ℃에서 15000 rpm으로 원심분리 하였다. 이후 침전물에 다시 90% 에탄올을 처리하여 salt 세척한 후, 15000 rpm으로 7분간 원심분리 하였다. 최대한 에탄올 상층액을 피펫을 사용하여 버린 후, 주사용수 2.5 mL을 1.8 mL-튜브에 500 ㎕씩 분주한 후 -80 ℃ 디프리져에서 3시간 방치하였다. 이후 동결건조를 8시간 진행한 후 분말 형태로 제조하였다.

실험예 1: 골 형성 확인

임계 크기 결손(critical size defect)은 막내 골 수리를 유도하는 작용제 능력의 연구를 위한 하나의 중요한 모델이다. 골 재생에 대한 BMMSC-CM의 효과를 확인하기 위해, 두개관 결손(8 mm)을 수컷 쥐(350 g, Sprague Dawley)를 제작하였다.

BMMSC-CM(실시예 1), DPSC-CM(실시예 2) 각각 1 바이얼에 생리 식염수 2 ml로 부유시킨 후에 100 ㎕씩 콜라겐 스폰지에 침지시켰다. 시험군은 상기 BMMSC-CM, DPSC-CM가 각각 침지된 콜라겐 스폰지로 이식시키고, 대조군은 콜라겐 스폰지만 이식시켰다. 이식 8주 후, 두개관을 뽑아서 두개관을 수집하여 고정액에 24시간 고정하여, 마이크로 CT 3D 분석으로 확인하였다.

도 1에 나타내었듯이, 골 형성이 DPSC-CM 및 BMMSC-CM 군 모두에서 관찰되었다. 그러므로, DPSC-CM 및 BMMSC-CM이 골 형성에 영향을 주며, 임계 크기 결손 모델에 골 재생을 유도함으로써, 골 질환 예방 및 치료 효과를 확인할 수 있다(도 1은 도 2의 마이크로 CT 사진 약 1000여 장을 합하여 이루어진 3D 전체 사진임. 도 1의 원형 색상 부위는 실험 시 이식된 부위가 알아보기 쉽게 한 것임).

도 2의 마이크로 CT 결과에서도 골 형성이 DPSC-CM 및 BMMSC-CM 군 모두에서 관찰되었다.

도 3은 두개관 결손(calvarial defect)된 쥐에 대조군(a), 실시예 1의 BMMSC-CM(b), 실시예 2의 DPSC-CM(c)을 이식하고 8주 후에 두개관의 골 부피를 나타낸 그래프이다. 대조군의 콜라겐 스폰지에 비해 월등히 우수한 골 형성을 확인할 수 있었다.

Claims

줄기세포 컨디션드 배지 분말을 포함하는 골 재생용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 줄기세포는 다음과 같은 특성을 나타내는 골 재생용 조성물:
(a) CD90, CD105, CD44 및 CD73 에 대하여 모두 양성의 면역학적 특징을 나타내고,
(b) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내며,
(c) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가진다.
제 1 항에 있어서,
상기 줄기세포는 인간의 배낭, 태반, 제대, 제대혈, 피부, 말초혈액, 골수, 지방, 근육, 간, 신경조직, 골막, 태아막, 활액막, 활액, 양막, 반월상연골, 전십자 인대, 관절 연골세포, 치아, 치수, 혈관주위세포, 지주골, 슬개골하 지방괴, 비장 및 흉선을 포함한 간엽 줄기세포가 존재하는 조직으로부터 분리 또는 배양된 간엽 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 골 재생용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 컨디션드 배지 분말은 무혈청 배지에서 배양한 배양액을 동결 건조하여 얻은 것인 골 재생용 조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 무혈청 배지는 성장인자 또는 사이토카인을 더 포함하는 골 재생용 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 성장인자는 IGF, bFGF, TGF, HGF, EGF, VEGF 및 PDGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 골 재생용 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 사이토카인은 IL-1, IL-4, IL-6, IFN-γ, IL-10 및 IL-17로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 골 재생용 조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 배양은 25 내지 40 ℃에서 1 내지 3일간 실시하는 골 재생용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 골 질환 예방 및 치료용으로 사용되는 골 재생용 조성물.
줄기세포 컨디션드 배지 분말 및 콜라겐 스폰지를 포함하는 골 재생용 키트.
제 1 항 내지 제 9 항에서 선택된 어느 한 항의 골 재생용 조성물을 포함하는 골 이식재.
제 1 항 내지 제 9 항에서 선택된 어느 한 항의 골 재생용 조성물을 포함하는 골 충전재.