BRPI0709516A2 - um meio de cultura e um composto farmacêutico para regenerar tecido cartilaginoso, método, usos e produtos a ela relacionados - Google Patents

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Gian Piero Pescarmona
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Maria Augusta Roos
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Abstract

<B>UM MEIO DE CULTURA E UM COMPOSTO FARMACêUTICO PARA REGENERAR TECIDO CARTILAGINOSO, MéTODO, USOS E PRODUTOS A ELA RELACIONADOS.<D> Descrição de composto para uso ín vitro como um meio de cultura ou uso in vivo como composto farmacêutico ou dispositivo médico capaz de acelerar a diferenciação de células-tronco em células com um fenótipo de condrócito e de restaurar o trofismo original de condrócitos. O composto contém, em combinação, pelo menos uma enzima proteolítica, um fator de crescimento e um fator de açúcar, um aminoácido, um fator de vitamina, uma vitamina, um nucleotideo e um nucleosideo, em um transportador ou diluente fisiologicamente aceitável. Também é descrito um método para diferenciar células-tronco em células que tenham um fenótipo de condrócito, células obtidas pelo método e seus usos, por exemplo, em terapia celular humana ou animal, como em CBMP (Produtos Medicinais Baseados em Célula).

Description

Um meio de cultura e um composto farmacêutico para regenerar tecidocartilaginoso, método, usos e produtos a ela relacionados.
A presente invenção refere-se a um meio de cultura, umcomposto farmacêutico e um dispositivo médico, método, usos e produtos a elarelacionados, para estimular o crescimento de tecido cartilaginoso. Em particular, o objetoda presente invenção é de estimular a diferenciação de células-tronco pluripotentes emtecido cartilaginoso, regeneração de tecido cartilaginoso, bem como melhorar aviabilidade de cartilagens articulares, mesmo em locais comprometidos, induzindo aregeneração de condrócitos de células-tronco pluripotentes nativas e não nativas.
O tecido cartilaginoso, ou cartilagem, é uma formaespecializada de tecido conectivo caracterizado por funções de suporte e resistência àfricção ou stress esterno Esse tecido é constituído por células chamadas condrócitos quesão envolvidas por uma substância intercelular com fibras submersas em uma matriz defase de gel amorfa e compacta.
A cartilagem não é vascularizada nem possui intervalos, hátrês tipos distintos:
- cartilagem hialina,
- cartilagem fibrosa,
- cartilagem elástica.
A cartilagem é coberta por tecido conectivo denso evascularizado, o pericôndrio, que está ausente tanto na cartilagem articular hialina ou"incrustação" quanto na cartilagem fibrosa.
O pericôndrio contém duas camadas: uma camada externaque compreende uma cápsula de revestimento de tecido conectivo (tecido conectivodenso e fibrilar), e uma camada mais interna formada por células dentro de uma rede detecido conectivo do tipo reticulado; tais células são chamadas de condrogênicas, pois sãocapazes de realizar divisão, formando novas células cartilaginosas.
A cartilagem articular envolve o osso das juntas móveisQuntas diartrodiais) auxiliando no movimento das superfícies do osso, e é desprovida depericôndrio que poderia atrapalhar esse movimento. Os nutrientes são levados para acartilagem articular pelo líquido sinovial, produzido pela sinóvia. O líquido sinovialtambém age como lubrificante.
A cartilagem hialina possui esse nome devido a suaaparência vítrea transparente, sendo a forma mais abundante no corpo. Em adultos, ela éencontrada em locais como as juntas esternocostais, nas superfícies articulares dosossos, na cartilagem de crescimento dos ossos longos, nos anéis traqueais, no brônquiomais amplo, nas estruturas da cartilagem do nariz e partes da cartilagem laríngea. Comoem todos os tecidos conectivos, a cartilagem hialina possui células imersas em umamatriz extracelular que contém fibras e substâncias amorfas fundamentais.
As cartilagens fibrosa e elástica são variantes da cartilagemhialina, na qual há predominância de fibras de colágeno ou fibras de elastina,respectivamente. A cartilagem fibrosa é encontrada próxima aos tendões e inserções doligamento; ela é similar ao tecido conectivo fibrilar denso, mas contém condrócitos aoinvés de fibroblastos. A cartilagem elástica é encontrada na cartilagem nasal e laríngea(epiglote) e na aurícula.
A matriz da cartilagem é um gel denso, mas, por não sermineralizada como o tecido ósseo, permite a difusão de nutrientes das veias que sãoencontrados na extremidade da própria cartilagem.
As células cartilaginosas são os condroblastos econdrócitos.
O uso de moléculas capazes de estimular a proliferação e adiferenciação de células-tronco em condrócitos é conhecido como [1-5]. Essassubstâncias são geralmente constituídas de colágeno, proteoglicanos (para referência,ver US-A-2004/0082623), aminoácidos (como descrito em WO-A-03/050250; US-B-6 596274; US-A-2004/0151709), vitaminas (ver W0-A-03/024463; US-A-2001/0012965; US-B-6 365 405), ácido hialurônico, açúcares (por exemplo, US-A-2003/0026786; US-A-2004/0235165), ácido linolênico/araquidônico (ver US-A-2005/0118714; US-A-2003/0175964), bem como fatores de crescimento como, por exemplo, fator decrescimento fibroblasto, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento tipoinsulina, ITS (Insulina-Transferina-Selênio), fator de crescimento transformador beta(TGF-beta), e outros (como descrito em WO-A-97/18299WO-A-00/17321; EP-A-1 077253; US-A-5 962 325; US-A-6 150 163; US-A-2002/0115647; WO-A-2004/083415; WO-A-2004/093934; US-A-2004/0137612; US-A-2005/0090002) ou ainda peptídeos ou váriasproteínas (para referência, ver EP-A-1 441 028; US-B-6 464 983; US-B-6 610 656).
Também é conhecido o uso de matrizes de vários tipos ecompostos nas quais são introduzidas células-tronco para sua diferenciação emcondrócitos e então para a cópia dos condrócitos com uma estrutura tridimensionaldefinida. Os substratos normalmente usados são constituídos por polímeros de váriostipos (camadas, ao invés de pastilha) e vários compostos (como sais, hidroxiapatita,estruturas de colágeno, polímeros baseados em ácido poliglicólico e outros). As patentesUS-B-6 637 437 e US-A-2004/0214322 são citadas como exemplos.
Um esboço de patologias do tecido cartilaginoso
Os distúrbios osteoarticulares afetam mais de 17% dosItalianos (dados do ISTAT 2001), e espera-se que esse número aumente no futuro, juntocom a crescente expectativa de vida da população da Itália, Europa e dos paísesindustrializados em geral (70% da população dos Estados Unidos com idade superior a65 anos e 42% da população Européia). Os distúrbios do movimento da articulaçãosejam da articulação sacroilíaca ou articulação tíbio-femural, ou na coluna vertebral,conseqüentemente, possuem um grande impacto na vida social e familiar, especialmenteem pessoas mais velhas. Entretanto, os distúrbios de articulação também ocorrem comfreqüência durante a idade ativa (de trabalho), tanto artrite (artrite reumatóide juvenil,artrite reativa, artrite infecciosa) e como conseqüência do trabalho ou trauma relacionadoao percurso. Os distúrbios de articulação alteram a capacidade de movimento e aaparência física (deformidade, gibosidade) e, em qualquer caso, afeta a vida pessoal esocial.
Os distúrbios da cartilagem da articulação podem afetarpessoas de qualquer idade, mas são particularmente importantes quando ocorrem empacientes jovens que levam uma vida ativa.
É sabido que, diferentemente do tecido ósseo que possuigrande capacidade de regeneração, a cartilagem hialina é caracterizada pela ausência desuporte sangüíneo, linfático e nervoso, indispensáveis para a reparação do tecido. Semdúvida, somente pequenas perdas de massa são substituídas por tecidofibrocartilaginoso, enquanto que grandes perdas são raramente preenchidas: lesões decerta profundidade (Outerbridge graus 111-IVr) não têm possibilidade de cicatrizaçãoespontânea e, no progresso a longo prazo em direção à degeneração da superfície daarticulação.
As patologias reumáticas podem ser distinguidas em trêsgrandes grupos: reumatismos inflamatórios, extra-articulares e degenerativos. A últimacategoria é a mais freqüente (artrose).
A poliartrite reumatóide, normalmente chamada de artrite,espondiloartrite anquilosante e colagenose estão no grupo de reumatismos inflamatóriosou artrite.
Os reumatismos extra-articulares não afetam a articulação.Isso inclui, por exemplo, tendinite e fibromialgia. A última é uma doença crônicacaracterizada por dor generalizada e alastrada, acompanhada por fatiga profunda.
O termo "reumatismo degenerativo" ou artrose normalmenteindica um distúrbio não inflamatório que resulta da degeneração de uma ou maisarticulações e que afeta as articulações do joelho, do quadril, dos dedos e da colunaespinhal. Esse distúrbio resulta da alteração progressiva da cartilagem que envolve asextremidades dos ossos. Na artrite, a cartilagem que age como proteção para absorver ochoque permite que as articulações se movam livremente, deteriorando-se para que asuperfície se torne áspera. Uma vez degradada, a cartilagem é incapaz de se regenerarcompletamente, e então não há amortecimento para o impacto resultante do movimento.Com o tempo, as extremidades do osso tornam-se progressivamente menos lisas. Asdeformações da articulação podem ocorrer e os ossos podem assumir posiçõesincorretas. Nessa situação, os tendões e os músculos ficam sujeitos ao stress incomum,causando sobrecarga, dor, rigidez e mobilidade reduzida. Pode haver também inflamaçãoespasmódica (isto é, com fases agudas) que resulta em fragmentos de cartilagem dentroda cavidade da articulação; com excesso de produção de fluido e efusão intra-articular.
A condropatia é o dano do tecido cartilaginoso (chamado decondromalacia, quando há processo degenerativo em andamento).
A policondrite recorrente é um distúrbio inflamatórioepisódico e destrutivo que afeta a cartilagem e outros tecidos conectivos, inclusiveorelhas, articulações, nariz, laringe, traquéia, olhos, válvulas do coração e veias.
O condroma é um tumor benigno derivado do tecidocartilaginoso. Ele começa em segmentos do esqueleto e é chamado de encondromaquando se desenvolve profundamente no osso, e econdroma quando se desenvolve dolado de fora.
A condromatose é uma doença de origem desconhecida,caracterizada pela presença de massas cartilaginosas dentro do osso. Através docrescimento, essas massas podem formar tumores que podem ter vários tamanhos epodem causar crescimento interrompido nos segmentos esqueléticos afetados.
Outra patologia do tecido cartilaginoso é a condromatosemúltipla. Os locais mais freqüentemente afetados são os ossos tubulares das mãos epés, e as metáfises dos ossos longos. Esses são condromas que se desenvolvem dentrodo osso.
Outras patologias incluem a doença de Ollier ouencondromatose (condição de deformação geneticamente herdada, aparece quando acriança tem dois anos, com tumores cartilaginosos de vários tamanhos e de crescimentoprogressivo localizado em vários ossos) e condrossarcoma (tumor maligno derivado dotecido cartilaginoso freqüentemente localizado na pélvis, fêmur ou úmero).Os tratamentos terapêuticos para patologias do tecido cartilaginoso
As lesões na cartilagem da articulação são eventos queocorrem freqüentemente e que podem causar dor crônica, restrição na articulação edegeneração artrítica progressiva.
A cartilagem não é um tecido vascularizado (isto é, nãocontém veias). Há um equilíbrio delicado entre suas proteínas, glicoproteínas (condroitinae proteoglicanos) e água. A cartilagem combina água e os nutrientes necessários duranteo movimento da articulação. Ao cuidar das articulações e fazer com que elas se movamcorretamente e constantemente, é possível, dentro de certos limites, evitar o desgaste dacartilagem e garantir a regeneração. Entretanto, para promover esse processo énecessário fornecer tecido cartilaginoso com os nutrientes necessários.Até o momento, há vários procedimentos cirúrgicosdisponíveis para o tratamento da artrose, mas eles diferem dependendo do tipo de lesãoe da idade do paciente. Neste caso, a indicação é o fator determinante. Osprocedimentos cirúrgicos normalmente usados incluem técnicas sem materiais deimplante, tais como o desbridamento, condroplastia por abrasão e/ou perfuraçãosubcondral ou microfratura, com o objetivo de estimular a formação ou para reparar otecido. Esse tecido compreende fibrocartilagens que reagem para o estímulo reparador.
Em particular, as fibrocartilagens possuem características mecânicas que são diferentesdaquelas da cartilagem hialina, em particular, com menor força de carga na articulação,assim essa técnica pode ser usada para condropatias moderadas ou em situaçõesclínicas severamente degenerativas onde nenhum outro tipo de tratamento é possível.Para mais perdas substanciais da substância cartilaginosa são usadas técnicasenvolvendo a implantação de material, tais como implantes pericondriais ou periostais,transplantes de mosaico de tecido osteocondal autólogo, transplantes de condrócitoautólogo, e até mesmo transplantes osteocondrais autólogos ou homólogos massivos nocaso de perda de osso e cartilagem da superfície articular.
O transplante condrócito autólogo é a terapia escolhida para otratamento de grande perda de tecido cartilaginoso.
Implantar condrócitos autólogos com o suporte de ácidohialurônico oferece uma forma simplificada de aplicar as células na falha, evitando o usode uma aba periosteal, cujo uso é obrigatório quando os condrócitos são colocados emsuspensão aquosa, permitindo que o procedimento seja realizado por artroscopia. Alémdisso, foi mostrado que o uso de estruturas de suporte tridimensionais ("plataformas")promove a manutenção do fenótipo de condrócito e a produção de matriz extracelular decartilagem em condições de cultura in vitro ou in vivo.Estruturas de suporte tridimensionais ("plataformas")
Entende-se por "plataforma" um suporte poroso etridimensional feito de material biocompatível e bioerodível no qual as células inicialmenteaderem e posteriormente crescem até formarem o tecido, de forma que sofrabiodegradação a uma taxa similar á do crescimento. Nos vários estudos realizados, umagrande quantidade de material foi identificada e permitiu que as principais característicasdos suportes mencionados acima fossem definidos [5].
1. Colágeno; é um componente natural de tecidos dos mamíferos e, quandopolimerizados em suportes tridimensionais, promove e sustenta a adesão celular in vitroao imitar, em suas camadas sobrepostas, o tecido original.
2. Fibrina; é a proteína básica envolvida no processo de formação do coágulo sangüíneo.Quando polimerizada em suportes tridimensionais, a fibrina promove a adesão celular invitro.3. Aginatos; são polissacarídeos derivados de algas marinhas. Eles formam soluções dehidrogel, têm a vantagem de permitir a distribuição uniforme de células em grãos efornecem suporte para seu crescimento tridimensional.
4. Ácido hialurônico ou hialurônio; é um sulfato glicosaminoglícano e constitui parte damatriz da cartílagem que suporta o implante de condrócito.
5. Ácido poliglicólico (PGA); é um suporte de polímero amplamente utilizado naengenharia reconstrutiva do tecido cartilaginoso.
6. Hidroxiapatita; é uma biocerâmica, quimicamente similar ao componente mineral doosso de mamíferos.
Tratamentos cirúrgicos
Até o momento, o objeto dos tratamentos cirúrgicos usadosfoi o de induzir o crescimento do tecido de reparo no local da falha através de técnicas decondroplastia/condroabrasão, com ou sem perfuração subcondral ou microfratura. Emtodos os casos, o tecido de reparo fibrocartilaginoso formado possui diferentescaracterísticas bioquímicas e bioelásticas daquelas cartilagens hialinas. O resultadoobtido através desses métodos é meramente um atraso no desenvolvimento do processoartrítico progressivo. Por esses motivos, foram feitas pesquisas para buscar soluçõesalternativas. Recentemente, inovações no campo de cultura celular têm permitido amanipulação ex vivo de células autólogas e seu uso para cirurgia reparadora, semmodificar seu fenótipo e funcionalidade nativa. Foi demonstrada a possibilidade detransplantar condrócitos humanos autólogos para a reconstrução de cartílagemdeteriorada seguida de trauma ou patologias repetidas, tais como osteocondritedissecante e condromalácia patelar. Os resultados obtidos mostraram a formação denova cartílagem com características totalmente similares à cartílagem hialina queexpressa o colágeno tipo II.
Uma das críticas direcionadas ao método descrito acima serefere ao método de implantação in situ dos condrócitos através da injeção sob um discode periósteo. Esse processo levantou dúvidas quanto ao fato de que a reconstrução dacartilagem pode ser introduzida por células mesenquimais periósteas e não peloscondrócitos autólogos injetados. Estudos feitos em animais com células cartilaginosasclassificadas confirmaram que o crescimento do tecido também é atribuído às célulastransplantadas.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
O objeto da presente invenção é o descobrimento de umasolução válida e efetiva para o estímulo do crescimento do tecido cartilaginoso e amelhora na viabilidade da cartilagem da articulação, mesmo em locais comprometidos,pela indução da regeneração de condrócitos existentes e pela diferenciação de células-tronco pluripotentes nativas e não nativas nos condrócitos.De acordo com a presente invenção, esse objeto éalcançado pela solução especificamente alegadas nas reivindicações abaixo. Asreivindicações formam uma parte integral dos ensinos técnicos fornecidos nesteinstrumento juntamente com a invenção.
A invenção refere-se a um composto capaz de promover eestimular a diferenciação de células-tronco pluripotentes em condrócitos, bem como aproliferação dos próprios condrócitos ou o crescimento do tecido cartilaginoso que écapaz de melhorar a viabilidade da cartilagem produzida por ele.
A presente invenção se baseia na observação de estímuloproliferativo particular exercido por certos agentes proteolíticos em condrócitos e emcélulas-tronco pluripotentes. Essas observações levam à formulação de um compostopara uso in vitro como meio de cultura, ou uso in vivo como composto farmacêutico que écapaz de induzir a diferenciação de células-tronco pluripotentes em tecido cartilaginoso,de estimular o crescimento do tecido cartilaginoso e de melhorar a viabilidade do tecidocartilaginoso e da cartilagem da articulação. Os condrócitos comprometidos ganhamviabilidade e depositam ativamente a matriz, mesmo após 3 meses de cultura in vitro. Opresente estudo confirma a eficácia de um procedimento de cultura para condrócitosautólogos. Os resultados histológicos in vitro obtidos após 6 meses de cultura com o meiode cultura da presente invenção confirmam a formação de cartilagem hialinamorfologicamente comparável à cartilagem não danificada in vivo, com característicashistológicas funcionais ótimas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Puramente como forma de exemplo não limitante, ainvenção não será descrita em detalhes com referência a certas configuraçõesparticularmente de preferência.
O diferente meio de cultura (por exemplo, C-BASE e C-BASE PLUS ilustrado nas tabelas 1 e 2) e o composto farmacêutico (por exemplo, C-BASE INFUS, ilustrado na tabela 4) da invenção mostraram-se efetivos ao induzir adiferenciação para um fenótipo de condrócito que funcione normalmente em célulasmesenquimais derivadas de medula óssea e, em células isoladas de fluido sinovial emembranas, bem como induzir a diferenciação para um fenótipo de condrócito quefuncione normalmente em monócitos pluripotentes isolados do sangue periférico e emlinhas de células monocitóides. Para esse fim, foram utilizados a linha celular monocitóidePSC-THP1 (número de acesso ICLC PD N0 05005; depositada em 18 de outubro de2005; descrito no pedido de patente Italiana T02005A000819), que tem fenótipo decélula-tronco pluripotente, e PSC-THP1-CHONDROCYTE-LIKE (número de acesso ICLCPD N0 06001; depositada em 21 de março de 2006), que tem um fenótipo de condrócitoestavelmente induzido.Todas as amostras de biópsia do tecido cartilaginosoresponderam positivamente ao uso do meio de cultura da presente invenção,permanecendo viáveis, depositando matriz e mostrando uma distribuição ordenada etridimensional durante 1 mês de cultura in vitro. Deve ser observado que após 1 mês de cultura in vitro esses tecidos foram congelados a -80°C (10% DMSO + 50% soro + 40%meio de cultura) e então foram normalmente descongelados e reativados em cultura pormais 1 mês, verificando novamente a funcionalidade histológica normal.
A viabilidade dos condrócitos atróficos pareceusignificativamente aprimorada após 15 dias de tratamento. Sem desejarem se limitar anenhuma teoria específica quanto a esse assunto, os presentes inventores acreditam queos resultados obtidos com o meio de cultura da presente invenção demonstraram que oestado da atrofia da cartilagem que ocorre em processos degenerativos é recuperável.
Mais detalhadamente, o composto da presente invençãocontém, em combinação, pelo menos uma enzima proteolítica, um açúcar, uma vitamina, um fator de vitamina, um aminoácido, um nucleotídeo e um nucleosídeo, em umtransportador ou diluente fisiologicamente aceitável. O composto pode adicionalmenteconter como fator estimulante de crescimento um ingrediente parassimpaticolítico (depreferência escopolamina) e/ou um corticosteróide (de preferência uma dexametasona)e/ou outros ingredientes posteriormente descritos em detalhes neste documento.
O composto da presente invenção pode estar na forma deum meio de cultura ou de um composto farmacêutico. O composto da invençãodemonstrou evidência do excelente crescimento e desenvolvimento do tecidocartilaginoso com características in vitro histo-funcionais normais. Isso é demonstradopela cultura de biópsias de tecido cartilaginoso e de condrócitos; pela indução de um fenótipo de condrócito que funcione normalmente nos monócitos isolados do sangueperiférico e em linhas de células monocitóides (de preferência linhas THP-1, maspreferencialmente linha celular PSC-THP1 (ICLC PD N0 05005 depositada em 18 deoutubro de 2005) que tenha um fenótipo de célula-tronco pluripotente, e maispreferencialmente a linha celular PSC-THP1-CHONDROCYTE-LIKE (ICLC PD N0 06001depositada em 21 de março de 2006) que tenha um fenótipo de condrócito estavelmenteinduzido), bem como pela indução de um fenótipo de condrócito que funcionenormalmente em células mesenquimais derivadas de medula óssea e em célulasisoladas de fluido sinovial e membranas.
Alternativamente, o composto da invenção é um composto como definido acima, mas desprovido de qualquer enzima proteolítica ou fator decrescimento e que deve ser administrado para um local patológico caracterizado pelapresença de células pró-inflamatórias que produzem enzimas. Como mencionado acima,as enzimas proteolíticas produzidas in situ pelas células pró-inflamatórias ajudadas peloscomponentes do composto administrado são capazes de exercer um estímulo deproliferação nos condrócitos e em células-tronco pluripotentes. O composto, de acordocom essa configuração alternativa, serve para ser utilizado como dispositivo médico. Atabela 3 mostra um composto de acordo com essa configuração, designado como C-BASE-INFUS-MD.
As funções exercidas pelo composto da presente invençãosão principalmente as seguintes:
- O composto na forma de meio de cultura C-BASE possui as características e acapacidade de estimular o crescimento do tecido cartilaginoso através da ação direta emcondrócitos com a recuperação de tecidos atróficos. Todas as biópsias de tecidocartilaginoso atrófico tratadas in vitro aparecem revigoradas e mostram uma deposiçãoda matriz ativa que estava previamente ausente. A solução C-BASE tem uso terapêuticona forma do seu composto específico para infiltrações (C-BASE-INFUS) em artroscopiaou infusão intra-articular, permitindo a restauração da cartilagem moderadamentecomprometida.
- O composto farmacêutico C-BASE-INFUS, o dispositivo médico C-BASE-INFUS-MD e omeio de cultura C-BASE PLUS1 variantes da solução C-BASE, melhoram a diferenciaçãode células-tronco pluripotentes em condrócitos e em tecido cartilaginoso com funçãohistológica.
- De acordo com a presente invenção, o meio de cultura e o composto farmacêuticopodem ser vantajosamente usados com esponjas de fibrina, membranas de colágeno,suportes de ácido hialurônico ou qualquer suporte previamente descrito.
- De acordo com a presente invenção, suspensões de células-tronco pluripotentesinduzidas para diferenciar entre condrócitos pelo uso do meio de cultura podem serusadas em relação a transplantes assistidos artroscopicamente.
A natureza inovadora dessa pesquisa é expressa em ummeio de cultura, em um composto farmacêutico e no método relativo a este documentoonde nutrientes (ex. glicose, ácido hialurônico, aminoácidos, vitaminas) e certos fatoresde crescimento e um agente proteolítico (ex. papaína e/ou enzimas proteolíticasendógenas) foram usados pela primeira vez juntamente com os fatores de crescimento,corticosteróides e/ou parasimpaticolíticos para a recuperação de condrócitos atróficos e aindução de células-tronco pluripotentes em condrócitos.
À luz do que foi dito anteriormente, o método, meio decultura e composto farmacêutico da presente invenção podem ser usados de formavantajosa, por exemplo, em ortopedia, reumatologia, otorrinolaringologia, cirurgia buco-facial, odontostomatologia, cardiologia, dermatologia, cirurgia reconstrutiva e estética.
MATERIAIS E MÉTODOS
O meio de cultura e o composto farmacêutico da presenteinvenção foram preparados usando, dentre outros, as substâncias listadas abaixo:
1. Aminoácidos:
Metionina1 cistina, N-acetilcisteína, cisteína, glicina, leucina, isoleucina, prolina,glutamina, arginina, ácido glutâmico, histidina, histidina-HCI, Iisina1 lisina-HCI,fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina, sal tirosina dissódio, valina, prolina,hidroxiprolina, uma solução contendo todos os aminoácidos não essenciais.
2. Peptídeos
Glutationa1 colágeno, elastina, extrato de trigo, polipeptídeos para os quais as funçõestróficas são atribuídas.
3. Vitaminas
Ácido retinóico, ácido ascórbico, ácido pantotênico, pantotenato de cálcio, piridoxina,piridoxina-HCI, ácido fólico, niacinamida, riboflavina, cobalamina, ácido para-aminobenzóico e biotina.
4. Fatores de vitamina:
Inositol1 mioinositol, cloreto de colina, ácido pirúvico, piruvato de sódio, putrecina eputrescina-HCI.
5. Fatores de crescimento:
TGF-B (fator de crescimento transformador Beta), LIF (fator inibidor de leucemia), ITS(insulina-transferina-selênio), insulina, M-CSF (fator estimulante de colônia demacrófago), IL-2 (interleucina-2), PMA (forbol-12-miristato-13-acetato), soro autólogo,corticosteróides (por exemplo, dexametasona), parassimpaticóliticos (por exemplo,escopolamina), glucágon.
6. Sais:
Gluconato de cálcio, fosfato de cálcio, bicarbonato de sódio, cloreto de cálcio, cloreto demagnésio, sulfato de magnésio, cloreto de potássio, fosfato de potássio, cloreto de sódio,nitrato de cálcio, cloreto de zinco, nitrato férrico, piruvato de sódio, pantotenato de cálcio,sal dissódio tirosina.
7. Enzimas proteolíticas:
Papaína, colagenase (preferencialmente tipo Ia, tipo II, tipo IV), serratiopeptidase,heparanase, DNAse1 elastase, bromelaína, bradiquinase, peptidase Clostridium, enzimasexpressas por Lactobacillus acidophilus, enzimas expressas pelo tipo Aspergillus,proteases, aliinase, fibrinolisina.
8. Mucopolissacarídeos:
Ácido hialurônico, sulfatos de condroitina.
9. Açúcares, derivados do álcool e suas combinações:
Glicose, sacarose, glucanos, mananos, glucomananos, fucose, frutose, sulfatosheparanos, pectinas, amidos, alcoóis derivados deles.
10. Soluções de cultura de célula:RPMI 1640 (meio de cultura celular), DMEM-LG (meio de cultura celular), FBS (sorobovino fetal para cultura celular), F12 (solução de cultura celular contendo uma fontecompleta de aminoácido), solução de HANK (solução de cultura celular contendobicarbonato de sódio).
11. Hemoderivados
Soro autólogo preparado do sangue periférico de doadores e recebedores de tecido,célula e meio de cultura.
MEIO DE CULTURA e COMPOSTO FARMACÊUTICO
O meio de cultura da presente invenção para uso in vitro e ocomposto farmacêutico ou dispositivo médico para uso in vivo foram preparados usandosubstâncias nas quantidades indicadas nas tabelas 1 a 4.
Para todas as formulações listadas abaixo, as substânciasforam pesadas, conforme exigido pela fórmula, para fornecer 1 litro da solução final.
Tabela 1. Meio de cultura C-BASE
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Tabela 3. Composto farmacêutico C-BASE-INFUS-MD
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Tabela 4. Composto farmacêutico C-BASE-INFU <table>table see original document page 15</column></row><table><table>table see original document page 16</column></row><table>
Composto farmacêutico C-BASE-1NFUS: protocolo de operação.
Para evitar choque anafilático após terapia de infusão intra-articular, antes da administração de C-BASE-INFUS, tratamento profilático com anti-histamínicos e/ou cortisonas, como, por exemplo, difenilhidramina, antagonistas dereceptor de histamina tipo I, cetirizina, loratadina, fexofenadina, fosfato dissódico debetametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, pode ser administrado.Culturas de célulaIsolamento de condrócitos de tecido cartilaginoso e reconstrução de tecido nativo in vitro
Amostras de cartilagem e sangue periférico da mesmapatente são tratados ainda frescos (em 2 horas de explante). O sangue periférico de trêstubos, com anticoagulante EDTA, é centrifugado a 160 g por 10 minutos em temperaturaambiente. O sobrenadante é removido e armazenado em alíquotas de 1 ml_ (armazenadoa - 20°C).
As biópsias de cartilagem, removidas usando fórceps estéril(em álcool e depois inflamado), são colocadas em placas de 100mm de diâmetro (Falcon,Becton Dickinson Labware Europe, Milão, Itália) e 10 ml_ de meio RPMI 1640 nãosuplementado (Life Technologies, Grand lsland, NY) é adicionado. Com a ajuda defórceps estéril (em álcool e depois queimado) e tesouras, as amostras são cortadas empequenos pedaços e lavadas nas placas duas vezes. As amostras são transferidas parauma placa de 100mm de diâmetro (Falcon, Beeton Diekinson Labware Europe, Milão,Itália), onde é preparado 10 ml_ de meio RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island,NY), 200 μΙ_ gentamicina e 1 mg/mL de colagenase. Todas as amostras foram incubadaspor 2 horas em uma incubadora Heraeus controlada termostaticamente a temperatura de37°C em uma atmosfera contendo um fluxo constante de 5% CO2 (v/v em ar). Após aincubação, 4 mL de FBS (Soro Bovino Fetal) foram adicionados às amostras para acabarcom a atividade de colagenase. As partes não dissolvidas e toda a solução, com ascélulas em suspensão, foram coletadas e centrifugadas a 160g por 10 minutos emtemperatura ambiente. O grânulo é suspenso novamente em meio RPMI 1640 nãosuplementado (Life Technologies, Grand Island, NY) e lavado duas vezes porcentrifugação a 160g por 10 minutos em temperatura ambiente. Os grânulos sãosuspensos novamente em 5 mL de meio DMEM-LG (Gibco, Grand Island, NY),suplementados com solução F12 (10% do volume final), soro do paciente (2% do volumefinal) e FBS (10% do volume final) suplementado com 10 mL de solução C-BASE. Ascélulas foram cultivadas por 15 dias em frascos de 75cm2 colocados em uma incubadoracom 5% de CO2 em temperatura de 37°C. Após 2 dias de incubação, o meio é substituídocom 15 mL de solução C-BASE. Quando as células alcançarem 80% de confluência, elassão separadas por tripsina-EDTA (5 minutos em temperatura de 37°C); no término daincubação, 5 mL de FBS puro e 5 mL de meio DMEM-LG não suplementado (Gibco;Grand Island, NY), são adicionados; as células separadas em suspensão são colhidas,lavadas duas vezes por centrifugação a 160g por 7 minutos a 37°C em meio DMEM-LGnão suplementado (Gibco; Grand Island, NY) sozinhas. As células contidas no grânuloassim obtidas são suspensas novamente em solução C-BASE a concentração de 1x106.
Condrócitos
Amostras e controles são testados para verificar a presençade condrócitos ativos que produzem cartilagem nos dias 7, 10, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 dacultura, usando o método colorimétrico com Azul alciano descrito a seguir.Isolamento de monócitos de sangue periférico
Após retirar 40 mL de sangue periférico (seis tubos EDTAde 7 mL), a população de linfomonócitos é preparada da seguinte maneira: todo o sangueé dividido em duas partes de 20 mL e cada parte é colocada gota a gota em camadas em25 mL de Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) em tubos de 50mL (Lab-Tek, Nunc, Kamstrup, Dinamarca). O preparado é centrifugado mais uma vez a1800 rpm por 25 minutos e o sobrenadante é removido deixando 1 cm, e o aneltransparente de monócitos que se forma após a centrifugação é coletado. O aneltransparente obtido é diluído em 10 mL de RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island,NY1 EUA) e centrifugado a 1300 rpm por 10 minutos. O sobrenadante é removido e orestante é lavado duas vezes por centrifugação a 1000 rpm por 10 minutos, e finalmente,o grânulo é suspenso novamente em 10 mL de RPMI 1640 com 10% FBS (Soro BovinoFetal). As células obtidas são contadas por uma câmara de Burker para a obtenção dasuspensão final de 5x105 células/mL. Nesse ponto, as células são colocadas em célulasde Petri, em placas de 100 mm de diâmetro (Falcon, Becton Dickinson, Labware Europe,Milão, Itália). As amostras são incubadas por 30 minutos a 37° com 5% de CO2. O temponecessário para que os monócitos obtidos juntem-se à placa é de trinta minutos. Ascélulas não são deixadas por longos períodos de tempo a fim de evitar que os linfócitostambém se juntem à placa. As células foram lavadas, novamente suspensas e cultivadas,como abaixo descrito em detalhes.
Linha celular monocitóide e monócitos isolados do sangue periférico
As células foram lavadas 3 vezes por centrifugação a 160 gpor 10 minutos em temperatura ambiente em meio RPMI 1640 (Life Technologies, GrandIsland, NY, EUA), e suspensas novamente em placas de 15 cm (lâminas de câmara Laò-Tek, Nunc, Kamstrup, Dinamarca), em uma concentração final de 1x106 células/mL emmeio composto da seguinte forma:
100 unidades/mL de penicilina
100 Mg/mL estreptomicina
160 mg/L gentamicina (Schering-Plough, Milão, Itália)
2 mM L-glutamina (Life Technologies; meio de crescimento)
50 ng/mL M-CSF (fator de estímulo de colônia de macrófago, Peprotech Inc., NJ1 EUA)
1000 unidades/mL LIF (fator inibidor de leucemia, Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA)
1000 unidades/mL IL-2 (recombinante humano interleucina 2)
3 nM forbol-13-miristato-13-acetato (PMA, Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA).
As substâncias, pesadas conforme exigido para ocomposto, foram diluídas em composto C-BASE1 para formar 1 litro da solução final.
Dois tipos de controle foram preparados: um controlenegativo (1) de células não tratadas e um controle de células tratadas com LIF (fator anti-leucêmico, fator inibidor de leucemia), com M-CSF (fator estimulante de colônia demacrófago, Peprotech Inc., NJ, EUA) (2), com PMA (3 nM forbol-12-miristato-13-acetato,Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) e com IL-2 (recombinante humano interleucina-2); conforme descrito em detalhes a seguir, e no pedido de patente italiana T02005A000819.
1. As células de controle foram lavadas 3 vezes por centrifugação a 160 g por 10 minutosem temperatura ambiente em meio RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Islandl NY,EUA) e suspensas em placas de 15 cm (lâminas de câmara Lab-Tek, Nunc, Lamstrup,Dinamarca) em uma concentração final de 1x10® células/mL em meio RPMI 1640 suplementado com:
10 % FBS (Celbiol Milão, Itália)
100 unidades/mL penicilina
100 pg/mL estreptomicina
160 mg/L gentamicina (Schering-Plough, Milão, Itália)
2 mM L-glutamína (Life Technologies; meio de crescimento).
2. As células foram lavadas 3 vezes por centrifugação a 160 g por 10 minutos emtemperatura ambiente em meio RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Islandl NY, EUA) esuspensas em placas de 15 cm (lâminas de câmara Lab-Tek, Nunc, Lamstrup,Dinamarca) em uma concentração final de 1x106 células/mL em meio RPMI 1640 suplementado com:
10 % FBS (Celbio, Milão, Itália)
100 unidades/mL penicilina
100 pg/mL estreptomicina
160 mg/L gentamicina (Schering-Plough, Milão, Itália)
2 mM L-glutamina (Life Technologies', meio de crescimento).
50 ng/mL M-CSF (fator estimulante de colônia de macrófago, Peprotech Inc., NJ1 EUA)1000 unidades/mL LIF (fator de inibição de leucemia, Santa Cruz Biotechnology, CA,EUA)
1000 unidades/mL IL-2 (recombinante humano interleucina 2)
3 nM forbol-120miristato-13-acetato (PMA, Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA)
Todas as amostras foram incubadas por 15 dias em umaincubadora Heraeus controlada termostaticamente em temperatura de 37°C em umaatmosfera contendo um fluxo constante de 5% de CO2 (v/v no ar). Em todas as amostras,o meio foi regularmente trocado a cada 7 dias, deixando 20% do meio a fim de nãoremover todas as citoquinas essenciais cultivadas produzidas pelas células.
Amostras de todas as células do estudo foram lavadas trêsvezes por centrifugação a 160g por 10 minutos a 37 0C e sujeitas à análisecitofluorométrica (Epics Profile II, Coulter, Hialeath, FL, EUA) após classificação com osseguintes anticorpos monoclonais de rato anti-humanos (Mabs) conjugados para R-ficoeritrina (PE) ou Fluoresceína isotiocianato (FITC): CD14 anti-humano (Santa CruzBiotechnology, CA1 EUA), CD34 anti-humano (Santa Cruz Biotechnology, CA1 EUA),CD45 anti-humano (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), c-Kit anti-humano (Santa Cruz
Biotechnology, CA1 EUA) e c-Met anti-humano (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA).Quando testados por citofluorimetria celular (FACS), as células são significativamentepositivas para todos os marcadores da expressão de célula-tronco (CD14, CD34, CD45,c-Kit, c-Met).
Após o período de incubação, as células parecem estar emestado de semi-adesão/suspensão, com morfologias mixas oval e de fibroblastóide. Ascélulas cultivadas usando 2% de lidocaína (Sigma Aldrich, Milão, Itália) em PBS [3, 4]foram lavadas 3 vezes por centrifugação a 160 g por 10 minutos a 37°C em RPMI 1640(Life Technologies, Grand lsland, NY) e foram incubadas por um segundo tempo deacordo com a descrição a seguir.
Os controles tratados destinados a permanecer comocélulas-tronco pluripotentes não diferenciadas (ex. PSC-THP1, ICLC PD N0 05005, feitosem 18 de outubro de 2005) foram suspensos em uma concentração final de 1x105 célulaspor mL em 6 microplacas (lâminas da câmara do Lab-Tek, Nunc, Lamstrup, Dinamarca)em 0,5ml_ por poço da solução final composta por meio RPMI 1640 suplementado com:
10% FBS (Celbio, Milão, Itália)
100 unidades/mL de penicilina
100 pg/mL estreptomicina
160 mg/L gentamicina (Schering-Plough, Milão, Itália)
mM L-glutamina (Life Technologies-, meio de crescimento)50 ng/mL M-CSF (fator estimulante de colônia de macrófago, Peprotech Inc., NJ, EUA)1000 unidades/mL LIF (fator de inibição de leucemia, Santa Cruz Biotechnology, CA,EUA)
1000 unidades/mL IL-2 (recombinante humano interleucina 2)
3 nM forbol-12-miristato-13-acetato (PMA, Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA)
As células foram incubadas por 15 dias em uma incubadoraHeraeus termostaticamente controlada a temperatura de 37°C em uma atmosferacontendo um fluxo constante de 5% de CO2 (v/v em ar) com 0,25 mL de meio substituídoa cada 7 dias.
As amostras de célula de monócito e monocitóidedestinadas para serem estimuladas para a especialização do tipo de condrócito foramsuspensas novamente em tubos de 50 mL (Lab-Tek, Nunc, Kamstrup, Dinamarca) a umaconcentração final de 2x10® células por mL em uma solução final composta da seguintemaneira:100 unidades/mL de penicilina
100 pg/mL estreptomicina
160 mg/L gentamicina (Schering-Plough, Milão, Itália)
2 mM L-glutamina (Life Technologies-, meio de crescimento)
50 ng/mL M-CSF (fator estimulante de colônia de macrófago, Peprotech Inc., NJ1 EUA)
1000 unidades/mL LIF (fator de inibição de leucemia, Santa Cruz Biotechnology, CA1 EUA)
1000 unidades/mL IL-2 (recombinante humano interleucina 2)
3 nM forbol-12-miristato-13-acetato (PMA1 Santa Cruz Biotechnology, CA1 EUA)
As substâncias, pesadas conforme exigido para ocomposto, foram diluídas em composto C-BASE-PLUS, para formar 1 litro da solução final.
As células foram incubadas por 15 dias em uma incubadoraHeraeus termostaticamente controlada a temperatura de 37°C em uma atmosferacontendo um fluxo constante de 5% de CO2 (v/v em ar) com 2 mL de meio substituído acada 7 dias (linha celular PSC-THP1 -CHONDROCITE-LIKE, linha celular do tipocondrócito com número de acesso ICLC PD N0 06001).
Em particular, células PSC-THP-1 tratadas por 15 dias comsolução C-BASE PLUS (PSCTHP-1-CHONDROCYTE-LIKE, linha celular do tipocondrócito, com número de acesso ICLC PD N0 06001, feita em 21 de março de 2006,derivada de linha de célula-tronco monocitóide PSC-THP-1, com número de acesso ICLCPD N0 05005, feito em 18 de outubro de 2005). Deve-se notar que as células induzidaspara diferenciar o fenótipo de condrócito depositam a matriz e ficam manchadas com oAzul alciano.
Além disso, as células foram colocadas em culturas detecido cartilaginoso trófico produzindo ativamente matriz anexa em fragmentos deesponja de fibrina (Dental Green S.r.l., Baxter, Turin, Itália). A sedimentação ocorreu aoadicionar 5 mL da solução descrita acima, contendo uma concentração final de 2x106células/mL, para placas de 60 mm de diâmetro (Falcon, Becton Dickinson LabwareEurope, Milão, Itália) previamente preparada com tecido cartilaginoso incluso emfragmentos de esponja de fibrina (Dental Green S.r.l., Baxter, Turin, Itália).
As células foram incubadas por 15 dias em uma incubadoraHeraeus termostaticamente controlada a temperatura de 37°C em uma atmosferacontendo um fluxo constante de 5% de CO2 (v/v em ar) com 2 mL de meio de culturasubstituído a cada 7 dias. Estruturas tridimensionais de tecido cartilaginoso foram visíveisno final do período de 15 dias. Células induzidas para diferenciar o fenótipo decondrócito, pareceram estar organizadas tridimensionalmente, e depositaram ativamentea matriz que ficou manchada com Azul alciano.Isolamento e cultura de células-tronco mesenquimais pluripotentes
Células-tronco mesenquimais pluripotentes (MSCs, células-tronco mesenquimais) foram extraídas de amostras de medula óssea (BM) obtida dacabeça femoral (tecido esponjoso e medula óssea) durante a cirurgia de substituiçãocompleta de quadril. As células nucleadas foram separadas através de um gradiente dedensidade (Ficoll-Paque, Amersham) e suspensas novamente em meio Eagle de baixaglicose modificado por Dulbecco (DMEM-LG, Gibco, Grand Island, NY1 EUA)suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS, Sigma), 10 U/mL de penicilina G, e 40Mg/mL de gentamicina. Após 24 horas na cultura, o meio, juntamente com as células em suspensão, foi removido por aspiração e um novo meio foi adicionado nas célulasaderidas. As células foram cultivadas em frascos de 75 cm2 em uma incubadora com 5%de CO2 em temperatura de 37°C. Quando as células alcançam 80% de confluência, elassão separadas usando tripsina-EDTA (5 minutos de incubação a 37°C seguido pelaadição de 5mL de FBS puro e 5mL de meio DMEM-LG não suplementado (Gibco; GrandIsland, NY), e as células separadas na suspensão são cultivadas); lavadas duas vezespor centrifugação a 160 g por 7 minutos a 37°C em meio DMEM-LG não suplementado(Gibco; Grand Island, NY1 EUA) sozinho. As células nos grânulos assim obtidas sãosuspensas novamente a uma concentração de 1x106 em meio DMEM-LG fresco (Gibco;Grand Island, NY, EUA) suplementadas com 10% de soro bovino fetal (FBS, Sigma), 10U/mL penicilina G e 40 Mg/mL gentamicina. As células são colocadas novamente após adiluição de 1:4 (para uma concentração final de 2,5x104). Neste estudo, as células foramusadas após a terceira passagem em cultura contínua.
As amostras MSC, obtidas conforme descrito acima,destinadas para serem estimuladas para especialização do tipo condrócito foram cultivadas em placas de 60 mm de diâmetro (Falcon, Becton Dickinson Labware Europe,Milão, Itália) por 15 dias em 2 mL do meio de cultura original (descrito acima), 8mL deuma solução final composta da seguinte maneira:
DMEM-LG (Gibco; Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS,Sigma), 10 U/mL penicilina G, e 40 Mg/mL gentamicina, as substâncias pesadas conformeexigido pelo composto foram diluídas em composto C-BASE PLUS para formar 1 litro dasolução final.
As células foram incubadas em placas de 60 mm dediâmetro (Falcon, Becton Dickinson Labware Europe, Milão, Itália) com fragmentos decartilagem humana (tirados do mesmo doador da medula óssea para os MSCs) efragmentos de esponja de fibrina (Dental Green S.r.l., Baxter, Turin, Itália).
Os controles destinados a permanecerem como células-tronco pluripotentes não diferenciadas foram cultivados por 15 dias em placas de 60 mmde diâmetro (Falcon, Becton Dickinson Labware Europe, Milão, Itália) em 10 mL do meiode cultura original
(meio DMEM-LG fresco, Gibco; Grand lsland, NY1 EUA)suplementado com 10% de soro bovino fetal, Sigma, 10 U/mL de penicilina G, e 40 μg/mLgentamicina.
Todas as células foram incubadas por 15 dias em umaincubadora Heraeus termostaticamente controlada a temperatura de 37°C em umaatmosfera contendo um fluxo constante de 5% de CO2 (v/v em ar) com 2 mL de meiosubstituído a cada 7 dias.
Isolamento e cultura de células sinoviais
As células sinoviais (SynCs) foram obtidas de pacientesdurante a retirada e curetagem da membrana sinovial dentro da cavidade da articulaçãofêmur-tibial. Seções de tecido sinovial fresco foram separados em colagenase (1 mg/mLpor mL de meio, Sigma) por duas horas a 37°C. O grânulo, lavado duas vezes emDMEM-LG (Gibco. Grand lsland, NY, EUA), sem qualquer suplemento, por centrifugaçãoa 160 g por 10 minutos e então suspenso novamente em meio Eagle de baixa glicosemodificado por Dulbecco ([DMEM-LG], Gibco, Grand Island, NY, EUA) suplementadocom 10% de soro bovino fetal ([FBS], Sigma), 10 U/mL de penicilina G, e 40 Mg/mL degentamicina foi finalmente colocado em frascos de 75 cm2 e incubado em 5% de CO2 emtemperatura de 37°C. Após 24 horas, o meio, juntamente com as células em suspensãofoi aspirado e, o meio fresco (DMEM-LG, Gibco; Grand lsland, NY1 EUA, suplementadocom 10% FBS, Sigma, 10 U/mL penicilina G, e 40 pg/mL gentamicina) foi adicionado paraas células aderidas. As células foram cultivadas em frascos de 75 cm2 em umaincubadora com 5% de CO2 a temperatura de 37°C. Quando as células alcançaram 80%de confluência foram separadas usando tripsina-EDTA (incubação de 5 minutos a 37°Cseguida da adição de 5mL de FBS puro e 5 mL de meio DMEM-LG não suplementado(Gibco; Grand lsland, NY), e as células separadas em suspensão são colhidas), lavadasduas vezes por centrifugação a 160 g por 7 minutos a 37°C em meio DMEM-LG nãosuplementado (Gibco; Grand lsland, NY, EUA). As células nos grânulos obtidos assimsão suspensas novamente a uma concentração de 1x106 in meio DMEM-LG fresco(Gibco; Grand lsland, NY, EUA) suplementadas com 10% de soro bovino fetal ([FBS]Sigma), 10 U/mL penicilina G, e 40 Mg/mL gentamicina. As células são recolocadas apósdiluição 1:4 (concentração final de 2,5x104). Neste estudo, as células foram usadasdepois da segunda passagem na cultura contínua.
As amostras SynC, obtidas conforme descritoanteriormente, destinadas para serem estimuladas para especialização de condrócitos,foram cultivadas em placas de 60 mm de diâmetro (Falcon, Becton Dickinson LabwareEurope, Milão, Itália) por 15 dias em 2 mL do meio de cultura original (descrito acima), 8mL de uma solução final composta da seguinte maneira:DMEM-LG (Gibco; Grand lsland, NY) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS1Sigma), 10 U/mL penicilina G1 e 40 yg/mL gentamicina, as substâncias pesadas conformeexigido pelo composto foram diluídas em composto C-BASE PLUS para formar 1 litro dasolução final.
As células foram incubadas em placas de 60 mm dediâmetro (Falcon, Becton Dickinson Labware, Milão, Itália) com fragmentos de cartilagemhumana (obtidos do mesmo doador dos SynCs) e fragmentos de esponja de fibrina(Dental Green S.r.l., Baxter, Turin, Itália).
Os controles destinados a permanecerem como células-tronco pluripotentes não diferenciadas foram cultivados por 15 dias em placas de 60 mmde diâmetro (Faleon, Beeton Diekinson Labware, Milão, Itália) em 10 mL de meio decultura original (DMEM-LG fresco, Gibeo, Grand lsland, NY, EUA suplementados com10% de soro bovino fetal, Sigma, 10 U/mL penicilina G, e 40yg/mL gentamicina).
As células foram incubadas por 15 dias em uma incubadoraHeraeus termostaticamente controlada a temperatura de 37°C em uma atmosferacontendo um fluxo constante de 5% de CO2 (v/v em ar) com 2 mL de meio de culturasubstituído a cada 7 dias.
Suspensões de células preliminares
Após a incubação e estímulo para assumir o fenótipo de condrócito, como descrito acima, as suspensões de células foram obtidas de todas asamostras do estudo.
Todas as amostras das linhas de células monocitóide e osmonócitos de sangue periférico semi-aderidos foram incubados por 5-8 minutos com 2%de lidocaína (Sigma Aldrieh, Milão, Itália) em PBS ao medir com pipeta a suspensão nopoço, e a solução assim obtida foi coletada, como descrito nas referências [3, 4], Ascélulas foram lavadas três vezes por centrifugação a 160 g por 10 minutos a 37°C comRPMI 1640 não suplementado (Life Technologies, Grand /sland, NY).
No término da incubação descrita acima, o MSC confluentee as células SynCs são separadas usando tripsina-EDTA (5 minutos a 37°C; seguido pelaadição de 5 mL de FBS puro e as células separadas em suspensão cultivada), lavadasduas vezes por centrifugação a 160 g por 7 minutos a 37°C em meio DMEM-LG nãosuplementado (Gibeo; Grand lsland, NY).
As células obtidas dos grânulos das amostras e doscontroles correspondentes foram suspensas novamente em tubos de 15 mL (lâminas dacâmara do Lab-Tek, Nune, Kamstrup, Dinamarca), em uma concentração final de 5x105células/mL para subseqüente análise fenotípica (Western Blotting, imunofluorescênciadireta e FACS)
Western BlottingO western blotting emprega, em primeiro lugar, eletroforesedesnaturada (SDS-PAGE) para separar as diversas proteínas de acordo com a massamolecular, cancelando as cargas nos aminoácidos que podem influenciar a migração. Asamostras de células, suspensas em um tampão de Iise (1% SDS1 30 mM Tris pH 6,8, 5%glicerol) para o qual os inibidores de protease (Coquetel Inibidor de Protease,Calbiochem, San Diego, CA, EUA) foram adicionados por 30 minutos a 4°C. Os Iisatosassim obtidos foram centrifugados a 12.000 rpm por 20 minutos a 4°C e ossobrenadantes foram coletados; as concentrações de proteína das amostras forammedidas usando o método Bio-Rad (exame Benchmark Plus, Bio-Rad). Antes daeletroforese, as amostras foram fervidas por 5 minutos na presença de beta-mercaptoetanol e azul de bromofenol. As amostras foram sujeitas à eletroforese em umgel de 12% (SDS-PAGE) e então transferidas em uma membrana de PVDF (Perkin ElmerInc.). As membranas foram saturadas com metanol em temperatura ambiente esubseqüentemente incubadas do dia para a noite a 4°C, com os seguintes anticorposprimários diluídos a 1:500 em PBS com 5% de leite em pó desnatado: anti-CD 34 (SantaCruz Biotechnology, CA, EUA), anti-CD 14 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-CD44 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-CD 45 (Santa Cruz Biotechnology, CA,EUA), anti-CD 71 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-CD 90 (Santa CruzBiotechnology, CA, EUA), anti-CD 29 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-CD 105(Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-CD 117/c-KIT (Santa Cruz Biotechnology, CA,EUA), anti-endoglina (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-colágeno tipo Il (SantaCruz Biotechnology, CA, EUA), anti-agrecano (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-THY-1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA). Após cinco lavagens, as membranas foramincubadas com os anticorpos secundários correspondentes (1:1000) conjugados para aperoxidase de rábano silvestre (HRP, SantaCruz Biotechnologies Inc., Santa Cruz, CA,EUA) para 1 hora em temperatura ambiente. As faixas correspondentes foram reveladasusando líquido quimiluminescente (solução Super Signal Western Pico, PierceBiotechnology Inc., Reockford, IL, EUA) e capturados usando filme fotográfico.
Norma de imunofluorescência
As células em suspensão foram incubadas com 0,2 mMMitoTracker Red por 10 minutos a 37°C. Após três lavagens por centrifugação a 160 gpor 10 minutos em temperatura ambiente em PBS (pH 7,4), os grânulos das célulasforam suspensos novamente em uma solução fixadora de 4% de paraformaldeído emRPMI 1640 a pH de 7,4, 1 hora em temperatura ambiente. Após três lavagens em PBS,as células foram suspensas novamente em uma solução de PBS e 0,1% Triton por 1 horaa 4°C. Após três lavagens em PBS, as células foram colocadas em coberturas de lâminase o líquido pôde evaporar no ar. As células foram bloqueadas com 20% de soro de cabranormal por 1 hora e incubadas com os seguintes anticorpos monoclonais anti-humanosconjugados R-ficoeritrina (PE) ou Fluoresceina-Isotiocianato (FITC) por 30 minutos; anti-CD 34 (Santa Cruz Biotechnology, CA1 EUA), anti-CD 14 (Santa Cruz Biotechnology, CA,EUA), anti-CD 44 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-CD 45 (Santa CruzBiotechnology, CA, EUA), anti-CD 71 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-CD 90(Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-CD 29 (Santa Cruz Biotechnology, CA1 EUA),anti-CD 105 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-CD 117/c-KIT (Santa CruzBiotechnology, CA, EUA), anti-endoglina (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-colágeno tipo Il (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-agrecano (Santa CruzBiotechnology, CA, EUA), anti-THY-1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA). Controles específicos com os isotipos correspondentes foram desenvolvidos para cada anticorpomonoclonal (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA). Os núcleos ficaram manchadosusando a solução de Hoechst (diluição de 1:1000). As tiras de cobertura, colocadas naslâminas foram examinadas por microscópio leve [1, 2] usando moviol.
Biópsias e soluções de protótipo
Todas as amostras (biópsias de tecido cartilaginoso) foramlavadas três vezes em solução salina isotônica contendo antibióticos (100 unidades/mLde penicilina + 100pg/mL estreptomicina + 160 mg/L gentamicina) por 10 minutos emtemperatura ambiente.
As amostras da biópsia foram então dissecadas em trêspartes (dois controles e uma amostra a ser tratada, para cada paciente) e suspensas emsolução 1 χ C-BASE em placas de 15 cm (lâminas da câmara da Lab-Tek, Nunc,Kamstrup, Dinamarca).
Dois tipos de controle foram preparados: um controlenegativo (1) tratado com solução salina isotônica e antibióticos somente (como descrito acima), e um controle negativo (2) tratado com meio de cultura celular:
1. As amostra de biópsia de controle foram suspensas em solução salina isotônica emplacas de 15 cm (lâminas da câmara da Lab-Tek, Nunc, Kamstrup, Dinamarca).
2. As amostras de biópsia de controle foram então colocadas em placas de 15 cm(lâminas da câmara da Lab-Tek, Nunc, Kamstrup, Dinamarca) em meio RPMI 1640suplementadas com:
10% FBS (Celbio, Milão, Itália)
100 unidades/mL penicilina
100 unidades/mL estreptomicina
160 mg/L gentamicina (Schering-Plough, Milão, Itália)
2 mM L-glutamina (Life Technologies-, meio de crescimento)
Todas as amostras foram incubadas em uma incubadoraHeraeus termostaticamente controlada a temperatura de 37 0C em uma atmosferacontendo um fluxo constante de 5% de CO2 (v/v em ar).Todos os tecidos da biópsia usados na cultura constituempossíveis suportes de co-condicionamento para o crescimento tridimensional dasamostras das células em estudo.Norma de coloração da matriz da cartilagem
Após três lavagens por 10 minutos em temperaturaambiente em PBS (pH 7,4), as amostras foram suspensas novamente por uma hora emtemperatura ambiente em uma solução de fixação, contendo 4% de paraformaldeído emRPMI 1640 a pH 7,4. As amostras foram tratadas com coloração de azul alciano. Essacoloração é constituída por um grupo de tintas polivalentes básicas solúveis em água. Acor azul ocorre devido à presença do cobre na molécula. Uma solução de coloração deazul alciano a 1% v/v em PBS (pH 7,4) é adicionada a uma solução de 3% de ácidoacético (pH 2,5). Após a incubação por 2 horas em temperatura ambiente, esse compostofica com uma coloração indelével ao se ligar aos mucopolissacarídeos e glicoproteínasdo ácido sulfonado e carboxilatado (presentes na matriz). Controles específicos forampreparados para cada amostra. Todas as amostras foram lavadas 3 vezes com PBS (pH7,4) por 5 minutos em temperatura ambiente e então observadas no microscópio.Observou-se que nos condrócitos, a substância mucóide da matriz (proteoglicanos,mucopolissacarídeos, colágeno (tipos 10 e 2)) ficou com coloração azul [5].
RESULTADOS
Coloração da matriz da cartilagem usando o método colorimétrico do azul alciano
- Esponja de fibrina com condrócitos obtidos de tecido de biópsia e re-estabelecidos invitro, tratados com solução C-BASE-INFUS por 7 dias. Observou-se que os condrócitosdepositam a matriz e ficaram visivelmente coloridos pelo azul alciano, crescendo emcamadas sobrepostas e em três dimensões.
- Esponja de fibrina com condrócitos obtidos de tecido de biópsia e re-estabelecidos invitro, tratados com solução C-BASE por 15 dias. Observou-se que os condrócitosdepositaram matriz e ficaram visivelmente coloridos pelo azul alciano, crescendo emcamadas sobrepostas e em três dimensões.
- Controles de monócito de sangue periférico não tratados (meio RPMI 1640, 10% FBS,100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 160 mg/L de gentamicina, 2mM L-glutamina). Não foi observada coloração pelo azul alciano
- Monócitos de controle não tratados de células-tronco pluripotentes de sangue periférico(CD14+, CD34+) (meio RPMI 1640, suplementado com 10% FBS, como descrito nopedido de patente Italiana No T02005A000819, e contendo 1000 unidades/mL LIF, 50ng/mL M-CSF e 3 nM forbol-12-miristato-13-acetato, PMA). Não foi observada coloraçãopelo azul alciano.
- Tecido cartilaginoso em co-cultura com monócitos de células-tronco pluripotentes desangue periférico tratado por 15 dias com solução C-BASE. Foi observado como ascélulas, que foram induzidas à diferenciação para o fenótipo de condrócito, depositammatriz e ficam visivelmente coloridas pelo azul alciano e, crescem em camadassobrepostas e em três dimensões.
- Monócitos de células-tronco pluripotentes de sangue periférico tratados por 15 dias comsolução C-BASE PLUS. Deve-se notar que as células que foram induzidas paradiferenciar o fenótipo condrócito depositam matriz e ficam coloridas com o azul alciano
- Controles de célula THP-1 (linha celular monocitóide) não tratadas (meio RPMI 1640,10% FBS1 100 unidades/mL penicilina, 100 pg/mL estreptomicina, 160 mg/L gentamicina,2 mM L-glutamina). Não foi observada coloração pelo azul alciano
- Células PSC-THP1 (linha celular-tronco monocitóide, com número de acesso ICLC PDN0 05005, feito em 18 de outubro de 2005) (meio RPMI 1640, suplementado com 10%FBS1 como descrito no pedido de patente Italiano N0 T02005A000819, e contendo 1000unidades/mL LIF, 50 ng/mL M-CSF e 3 nM forbol-12-miristato-13-acetato, PMA). Não foiobservada coloração pelo azul alciano
- Tecido cartilaginoso em co-cultura com células PSC-THP-1 tratadas por 15 dias comsolução C-BASE. Observou-se como as células, que foram induzidas para diferenciar ofenótipo de condrócito, depositam matriz e ficam visivelmente coloridas pelo azul alciano,e crescem em camadas sobrepostas e em três dimensões.
- Células PSC-THP-1 tratadas por 15 dias com solução C-BASE PLUS (PSCTHP-1-CHONDROCYTE-LIKE, linha celular do tipo condrócito, com número de acesso ICLC PDN0 06001, derivadas da linha celular-tronco monocitóide PSC-THP-1, com número deacesso ICLC PD N0 05005, feito em 18 de outubro de 2005). Deve-se notar que ascélulas que foram induzidas para diferenciar o fenótipo de condrócito depositam matriz eficam coloridas pelo azul alciano
- Tecido cartilaginoso in co-cultura com células MSC (células-tronco mesenquimais)tratadas por 15 dias com solução C-BASE e esponja de fibrina. Observa-se como ascélulas, que foram induzidas para diferenciar o fenótipo de condrócito, depositam matriz eficam visivelmente coloridas pelo azul alciano, e crescem em camadas sobrepostas e emtrês dimensões.
- Células de controle MSC não tratadas (DMEM-LG, Gibco, Grand Island, NY1 EUA),suplementadas com 10% soro bovino fetal, 10 U/mL penicilina G1 e 40 pg/mLgentamicina). Não foi observada coloração pelo azul alciano.
- Células MSC tratadas por 15 dias com solução C-BASE PLUS. Observa-se como ascélulas, que foram induzidas para diferenciar o fenótipo de condrócito, depositam matriz eficam claramente coloridas com o azul alciano, e crescem em camadas sobrepostas e emtrês dimensões.
- Tecido cartilaginoso em co-cultura com células SynC (células-tronco sinoviais) tratadaspor 15 dias com solução C-BASE e esponja de fibrina. Observa-se como as células, queforam induzidas para diferenciar o fenótipo de condrócito, depositam matriz e ficamclaramente coloridas com o azul alciano, e crescem em camadas sobrepostas e em trêsdimensões.
- Células de controle SynC não tratadas (DMEM-LG1 Gibco, Grand Island, NY1 EUA),suplementadas com 10% soro bovino fetal, Sigma, 10 U/mL penicilina G, e 40 pg/mLgentamicina). Não foi observada coloração pelo azul alciano.
- Células SybC (células-tronco sinoviais) tratadas por 15 dias com solução C-BASEPLUS. Observa-se como as células, que foram induzidas para diferenciar o fenótipo decondrócito, depositam matriz e ficam claramente coloridas com o azul alciano, e crescem em camadas sobrepostas e em três dimensões.
Western blotting
As amostras ficaram sujeitas a análise de fenótipo porWestern blotting para os seguintes marcadores: anti-CD 34 (Santa Cruz Biotechnologies,CA1 EUA), anti-CD 14 (Santa Cruz Biotechnologies, CA, EUA), anti-CD 29 (Santa CruzBiotechnologies, CA, EUA), anti- CD 44 (Santa Cruz Biotechnologies, CA, EUA), anti-CD45 (Santa Cruz Biotechnologies, CA, EUA), anti-CD 71 (Santa Cruz Biotechnologies, CA,EUA), anti-CD 90 (Santa Cruz Biotechnologies, CA, EUA), anti-CD 105 (Santa CruzBiotechnologies, CA, EUA), anti-CD 117/c-KIT (Santa Cruz Biotechnologies, CA, EUA),anti-endoglina (Santa Cruz Biotechnologies, CA, EUA), anti-colágeno tipo Il (Santa Cruz Biotechnologies, CA, EUA), anti-agrecano (Santa Cruz Biotechnologies, CA, EUA), anti-THY-1 (Santa Cruz Biotechnologies, CA, EUA). Após cinco lavagens, as membranasforam incubadas com os anticorpos secundários correspondentes (1:1000) conjugadospara peroxidase de rábano silvestre (HRP, SantaCruz Biotechnologies Inc., Santa Cruz,CA, EUA) por 1 hora em temperatura ambiente, conforme relatado nas tabelas 4 a 10abaixo.
Protocolos de Imunofluorescência
As amostras ficaram sujeitas à análise fenotípica pelaimunofluorescência indireta e as técnicas de citofluorimetria celular (FACS) para osmarcadores anti-CD 34 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-CD 14 (Santa CruzBiotechnology, CA, EUA), anti-CD 44 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-CD 45(Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-CD 71 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA),anti-CD 90 (Santa Cruz Biotechnology, CA1 EUA), anti-CD 29 (Santa Cruz Biotechnology,CA, EUA), anti-CD 105 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-CD 117/c-LIT (SantaCruz Biotechnology, CA, EUA), anti-endoglina (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-colágeno tipo Il (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), anti-agrecano (Santa CruzBiotechnology, CA, EUA), anti-THY-1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA), conjugadoscom R-ficoeritrina (PE) ou Fluoresceína Isotiocianato (FITC) por 30 minutos. Para cadaanticorpo monoclonal, foram preparados controles específicos com o tipo relevante deisótipo (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA).Caracterização do THP-1 versus PSC-THP1
Os resultados referentes à expressão de CD34, CD14,CD45, CD90, CD117/c-KIT e c-MET foram expressos através de uma escala quantitativa,conforme mostrado abaixo:Tabela 4
<table>table see original document page 30</column></row><table>
Legenda:
----- = ausência de qualquer fluorescência
+ = 1-5 células fluorescentes por campo óptico++ = 6-10 células fluorescentes por campo óptico+++ = 10-20 células fluorescentes por campo óptico++++ = 20-50 células fluorescentes por campo óptico+++++ >50 células fluorescentes por campo óptico
Caracterização de células-tronco pluripotentes monocíticas do sangue periférico (MONO-PSC)
Os resultados referentes à expressão de CD34, CD14,CD45, CD90, CD117/c-KIT e c-MET foram expressos através de uma escala quantitativa,conforme mostrado abaixo:Tabela 5
<table>table see original document page 30</column></row><table>
Legenda:
— = ausência de qualquer fluorescência
+ =1-5 células fluorescentes por campo óptico
++ = 6-10 células fluorescentes por campo óptico
+++ = 10-20 células fluorescentes por campo óptico++++ = 20-50 células fluorescentes por campo óptico+++++ >50 células fluorescentes por campo ópticoCaracterização de células-tronco Mesenquimais (MSC)
Os resultados referentes à expressão de CD34, CD14,CD45, CD29, CD117/c-KIT, CD71, CD90 e CD105 foram expressos através de umaescala quantitativa, conforme mostrado abaixo:
Tabela 6
<table>table see original document page 31</column></row><table>
Legenda:
<table>table see original document page 31</column></row><table>
Caracterização de Células Sinoviais (SYN)
Os resultados referentes à expressão de CD34, CD14, CD45, CD29, CD117/c-KIT,CD71, CD90 e CD105 foram expressos através de uma escala quantitativa, conformemostrado abaixo:
Tabela 7
<table>table see original document page 31</column></row><table>Legenda:
----- = ausência de qualquer fluorescência
+ =1-5 células fluorescentes por campo óptico++ = 6-10 células fluorescentes por campo óptico+++ = 10-20 células fluorescentes por campo óptico++++ = 20-50 células fluorescentes por campo óptico+++++ >50 células fluorescentes por campo óptico
Caracterização de células do tipo condrócito de biópsias de tecido cartilaginoso(condrócitos)
Os resultados referentes à expressão de CD34, CD14,CD45, CD29, CD117/C-KIT, CD71, colágeno tipo Il e agrecano foram expressos atravésde uma escala quantitativa, conforme mostrado abaixo:Tabela 8
<table>table see original document page 32</column></row><table>
Legenda:
— = ausência de qualquer fluorescência+ =1-5 células fluorescentes por campo óptico++ = 6-10 células fluorescentes por campo óptico+++ = 10-20 células fluorescentes por campo óptico++++ = 20-50 células fluorescentes por campo óptico+++++ >50 células fluorescentes por campo óptico
Caracterização da linha celular de condrócito PSCTHP-1-CHONDROCYTE-LIKEderivada de PSC-THP1
Os resultados referentes à expressão de CD34, CD14,CD45, CD29, CD117/C-KIT, CD71, CD90 colágeno tipo Il e agrecano foram expressosatravés de uma escala quantitativa, conforme mostrado abaixo:Tabela 9
<table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table>
Legenda:
----- = ausência de qualquer fluorescência
+ =1-5 células fluorescentes por campo óptico
++ = 6-10 células fluorescentes por campo óptico
+++ = 10-20 células fluorescentes por campo óptico
++++ = 20-50 células fluorescentes por campo óptico
+++++ >50 células fluorescentes por campo óptico
Caracterização das células tratadas verso os controles não tratados
Os resultados referentes à expressão de colágeno tipo Il e
agrecano foram expressos através de uma escala quantitativa, conforme mostrado
abaixo:
Tabela 10
<table>table see original document page 33</column></row><table>
Legenda:
= ausência de qualquer banda-/+ = pequena presença de uma banda+ = banda fina presente++ = banda média presente+++ = banda larga presente++++ = banda alta presente+++++ = banda abundante presente
É claro que, sem prejuízo ao princípio da invenção, osdetalhes da implementação e as configurações podem variar muito com relação ao quefoi descrito e ilustrado neste documento puramente através de exemplo, sem, apesardisso, partir do escopo da presente invenção conforme definido nas reivindicaçõesabaixo.
C-BASE-INFUS - ESTUDO CLÍNICO NO CÃOProtocolo
1. InscriçãoVinte casos (cães de raça pura, diferentes tamanhos, peso, sexo e idade)
2. Critério de inclusãoAlterações na articulação.
3. Procedimento clínicoPara todos os cães examinados, os procedimentos abaixo serão adotados.
4. Método
A quantidade de solução inoculada é igual à quantidade de líquido sinovial aspirado eanalisado.
a. Hora Zero
- Coletar informações sobre o histórico de doenças e fazer um exame contendo testehematoquímico completo, incluindo Iactases para avaliar a oxidação metabólica;
- Raio-x da articulação;
- ROM (abrangência do movimento);
- Artroscopia exploratória;
- Exclusão de qualquer curetagem intra-articular;
- Artrocentese com aspiração e exame morfocitológico e bioquímico do líquido sinovial;
- Exame histológico de uma amostra da cartilagem da articulação;
- Inoculação intra-articular de uma quantia do líquido testado para uma quantia do líquidosinovial aspirado.
Semanalmente e por três/quatro semanas, dependendo dagravidade do padrão inicial da doença, o exame sinovial foi realizado e a solução foiinjeção intra-articular.
b. Final do ciclo de tratamento
- Artrocentese com aspiração e exame morfocitológico e bioquímico do líquido sinovial;
- Exame histológico de uma amostra da cartilagem da articulação;
- Raio X da articulação;
- ROM (abrangência do movimento);
- lactacidemia;
- Exame clínico e relatório.ObservaçõesO exame citológico semanal do líquido sinovial permite omonitoramento contínuo da evolução da doença, através da recuperação ou não,vinculado à terapia usada. Nenhum corticóide ou FANS foram usados, a fim de evitar ainterferência com os resultados. O laboratório selecionado está autorizado pelo RegionePiemonte, AUT.G.R. de 10 de dezembro de 1990, n° 193-2412.
CONCLUSÕES
O produto designado como "C-BASE-INFUS" utilizado nosestudos clínicos realizados em 20 cães de diferentes raças e tamanhos mostrouexcelente tolerabilidade em todos os assuntos, sem efeito sistêmico aparente,independentemente da idade, tamanho, sexo e local da articulação. O ROM aumentouem 85% dos casos, enquanto que uma melhora clínica no andar foi observada em 87%dos casos. As dores no exame diminuíram em 80% dos casos. A viscosidade do líquidosinovial sempre diminuiu, resultando em aprimorada lubrificação da articulação, indicandouma clara modificação dos parâmetros físicos do micro-ambiente patológicos daarticulação. O próprio líquido sinovial mostrou um padrão de desenvolvimento positivo,com uma tendência dos valores do laboratório para a normalização. O Raio X mostrouuma diminuição ou estabilização de DJD (Doença de Articulação Degenerativa). Foimostrado que os proprietários dos 20 cães tratados ficaram satisfeitos com a inoculaçãointra-articular, que é relativamente fácil. Em nossa opinião, esse preparo aparentementecapaz de trazer o micro-ambiente extra-celular da articulação de volta a uma condiçãofisiológica, pode representar uma alternativa terapêutica inovadora e interessante válida.
Não se pode excluir o fato de que nos casos mais graves, o uso de FANS junto com oproduto "C-BASE-INFUS" pode ser considerado para combinar uma atividadefarmacológica analgésica com uma atividade de normalização da articulação, através deum prognóstico de melhora. Finalmente, reafirma-se que o uso do preparado "C-BASE-INFUS" não mostrou quaisquer sinais de intolerância, e mostrou boa tolerância em todosos cães tratados, sem qualquer efeito sistêmico aparente.
DISCUSSÃO
Os distúrbios da cartilagem da articulação podem afetarpessoas de qualquer idade, mas são especialmente importantes quando ocorrem empacientes jovens que levam uma vida ativa.
É sabido que, ao contrário do tecido ósseo que mostra fortecapacidade de regeneração, a cartilagem hialina que algumas vezes é considerada otecido nobre do aparelho músculo-esquelético, se caracteriza pela ausência de qualquersuporte hemático, linfático ou nervoso, essenciais para a reparação do tecido. Narealidade, somente as pequenas perdas da substância são preenchidas por tecidofibrocartilaginoso, enquanto que as grandes perdas raramente são preenchidas: lesõesprofundas (Outerbrige nível lll-IV) não têm cicatrização espontânea e a longo prazoprogridem em torno da degeneração da superfície da articulação.
O grande avanço no campo da biologia celular e dabiotecnologia conduziram nos últimos anos para o desenvolvimento de técnicas voltadaspara a recuperação in vitro de um micro-ambiente de tecido fisiológico.
Nosso estudo confirma a eficácia do procedimento pararegeneração in vitro e in vivo de micro-ambiente fisiológico no tratamento de lesões dacartilagem da articulação.
A recuperação de um micro-ambiente fisiológicorapidamente leva à reconstituição de uma matriz de cartilagem que funcionenormalmente. A atividade extracelular de soluções C-BASE, C-BASE PLUS e C-BASE-INFUS, juntamente com a recuperação de um micro-ambiente ótimo para as célulasresidentes, permite que as células funcionem de forma correta com a deposiçãofisiológica da matriz normal (cartilagem hialina) e uma recuperação funcional daarticulação tratada.
A aparência nas articulações tratadas de uma cartilagemhialina, comparada a uma cartilagem não danificada, indica uma atividade extracelular dasolução C-BASE-INFUS, que permite que as células residentes se restabeleçam para assuas atividades fisiológicas normais (deposição de matriz de cartilagem normal).
Por outro lado, a ausência de qualquer deposição decartilagem fibrosa nas articulações tratadas com soluções C-BASE, C-BASE PLUS e C-BASE-INFUS, que seriam uma resposta normal a um dano patológico, podem fornecerevidências contra a prevalência de uma atividade de reparação de tecido fibrosointracelular.
Os resultados histológicos in vitro e in vivo obtidos a curtoprazo (7 dias) e em dois meses de cultura com as soluções C-BASE, C-BASE PLUS e C-BASE-INFUS, confirmam a formação de cartilagem hialina morfológica ótima que persisteno tempo.
Os resultados obtidos parecem indicar que o C-BASE-INFUS deve ser considerado um excelente meio de cultura altamente eficiente ao mantera viabilidade das células cartilaginosas e ao reter sua funcionalidade fisiológica in vitro ein vivo.
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Claims (51)

1. Composto capaz de acelerar a diferenciação de células-tronco em células com um fenótipo condrocítico, caracterizado pela combinação de pelomenos um fator de crescimento, uma enzima proteolítica e uma de açúcar, umaminoácido, um fator vitamínico, uma vitamina, um nucleotídeo e um nucleosídeo, em umtransportador ou diluente fisiologicamente aceitável.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por pelo menos uma enzima proteolítica mencionada, é selecionado apartir da papaína, colagenase (de preferência do tipo IA, tipo II, tipo IV),serratiopeptidase, heparanase, DNAse, elastase, bromelaína, bradiquinase, peptidase[Clostridium], enzimas expressas por Lactobacillus acidophilus, enzimas expressas pelogênero Aspergillus, proteases, alinases e fibrinolisina.
3. Composto, de acordo com as reivindicações de 1 ou 2,caracterizado por pelo menos um fator de crescimento mencionado, é selecionado deTGF-B (fator de crescimento transformador Beta), LIF (fator inibidor de leucemia), ITS(insulina-transferrina-selênio), insulina, M-CSF (fator estimulante de colônia demacrófago), IL-2 (lnterleucina-2), PMA (forbol-12-miristato-13-acetato), soro autólogo,corticosteróides, parasimpaticolíticos e glucágon.
4. Composto, de acordo com quaisquer uma dasreivindicações de 1 a 3, caracterizado por pelo menos um aminoácido mencionado, éselecionado de metionina, cistina, N-acetilcisteína, cisteína, glicina, leucina, isoleucina,prolina, glutamina, arginina, ácido glutâmico, histidina, histidina-HCI-H20, lisina, Iisina-HCI, fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina, tirosina [sal dissódico], valina,prolina e hidroxiprolina.
5. Composto, de acordo com as reivindicações de 1 a 4,caracterizado por conter pelo menos um peptídeo, preferencialmente um oligopeptídeo emais preferencialmente um tripeptídeo.
6. Composto, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado por pelo menos um peptídeo, é selecionado de glutationa, colágeno,elastina e extrato de trigo.
7. Composto, de acordo com as reivindicações de 1 a 6,caracterizado por pelo menos um açúcar, é selecionado de um monossacarídeo, umpolissacarídeo, derivados do álcool ou de suas misturas.
8. Composto, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado por pelo menos um açúcar, é selecionado de glicose, sacarose, glucanos,mananos, glucomananos, fucose, frutose, sulfatos de heparano, pectinas e amidos.
9. Composto, de acordo com as reivindicações de 1 a 8, étambém caracterizado por conter pelo menos um mucopolissacarídeo.
10. Composto, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado por pelo menos um mucopolissacarídeo, é selecionado de ácidohialurônico e sulfatos de condroitina.
11. Composto, de acordo com as reivindicações de 1 a 10,caracterizado por pelo menos uma vitamina, é selecionado de ácido retinóico, retinol,ácido ascórbico, ácido pantotênico, pantotenato de cálcio, piridoxina, piridoxina-HCI,ácido fólico, niacinamida, riboflavina, cobalamina, ácido para-aminobenzóico e biotina.
12. Composto, de acordo com as reivindicações de 1 a 11,caracterizado por pelo menos um fator vitamínico, é selecionado de inositol, mioinositol,cloreto de colina, ácido pirúvico, piruvato de sódio, putrescina e putrescina-HCI.
13. Composto, de acordo com as reivindicações de 1 a 12,é caracterizado por pelo menos um sal.
14. Composto, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado por pelo menos um sal, é selecionado de gluconato de cálcio, fosfato decálcio, bicarbonato de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio,cloreto de potássio, fosfato de potássio, cloreto de sódio, nitrato de cálcio, cloreto dezinco, nitrato férrico, D-pantotenato de cálcio, piruvato de sódio e tirosina [sal dissódico].
15. Composto, de acordo com as reivindicações de 1 a 14,caracterizado por pelo menos uma enzima proteolítica, está presente em umaquantidade expressa em peso por volume com relação ao volume total, contendo entre 1ng/L e 2 g/L, de preferência entre 0,01 mg/L e 20,0 mg/L.
16. Composto, de acordo com as reivindicações de 1 a 15,caracterizado por pelo menos um aminoácido, está presente em uma quantidadeexpressa em porcentagem por volume com relação ao volume total do composto,contendo entre 0,001% e 40%, de preferência entre 0,01% e 20%.
17. Composto, de acordo com as reivindicações de 1 a 16,caracterizado por pelo menos um nucleotídeo ou nucleosídeo, está presente em umaquantidade expressa em porcentagem por volume com relação ao volume total docomposto, contendo entre 0,0001% e 20%, de preferência entre 0,01% e 2%.
18. Composto, de acordo com as reivindicações de 5 a 17,caracterizado por pelo menos um peptídeo, está presente em uma quantidade expressaem porcentagem por volume com relação ao volume total do composto, contendo entre-0,001% e 40%, de preferência entre 0,01% e 20%.
19. Composto, de acordo com qualquer reivindicação de 1 a-18, caracterizado por pelo menos um açúcar, está presente em uma quantidadeexpressa em porcentagem por volume com relação ao volume total do composto,contendo entre 0,001% e 40%, de preferência entre 0,01% e 20%.
20. Composto, de acordo com qualquer reivindicação de 9 a-19, caracterizado por pelo menos um mucopolissacarídeo, está presente em umaquantidade expressa em peso por volume com relação ao volume total do composto,contendo entre 0,01 mg/L e 5 g/L de preferência entre 0,1 mg/L e 200 mg/L.
21. Composto, de acordo com qualquer reivindicação de 1 a-20, caracterizado por pelo menos uma vitamina ou por pelo menos um fator vitamínico,está presente em uma quantidade expressa em porcentagem por volume com relação aovolume total do composto, contendo entre 0,0001% e 40%, de preferência entre 0,001%e 20%.
22. Composto, de acordo com qualquer reivindicação de 1 a-21, caracterizado por pelo menos um fator de crescimento, está presente em umaquantidade expressa em peso por volume com relação ao volume total do composto,contendo entre 1 ng/L e 2 g/L, de preferência entre 1 ug/L e 20 mg/L.
23. Composto, de acordo com qualquer reivindicação de 2 a-22, caracterizado por pelo menos um corticosteróide, está presente em uma quantidadeexpressa em porcentagem por volume com relação ao volume total do composto,contendo entre 0,0001% e 20%, de preferência entre 0,0001% e 1%.
24. Composto, de acordo com qualquer reivindicação de 13a 23, caracterizado por pelo menos um sal, está presente em uma quantidade expressaem peso por volume com relação ao volume total do composto, contendo entre 0,01 μg/Le 20 g/L , de preferência entre 10 pg/L e 10 g/L.
25. Composto, de acordo com as reivindicações de 1 a 24,caracterizado pelo fato que é um meio de cultura celular contendo uma solução decultura de célula como transportador ou diluente.
26. Composto, de acordo com as reivindicações de 1 a 24,caracterizado pelo fato que é um composto farmacêutico ou um dispositivo médico parauso humano ou veterinário contendo um transportador ou diluente farmaceuticamenteaceitável.
27. Uso de um composto, como definido nas reivindicaçõesde 1 a 24, caracterizado pelo fato que é para estímulo in vitro da diferenciação decélulas-tronco pluripotentes em células com um fenótipo condrocítico, e/ou arecomposição do trofismo original de condrócitos a partir de um tecido cartilaginoso.
28. Uso de um composto, como definido nas reivindicações-1 a 24, caracterizado pelo fato que é para preparo de um medicamento capaz deestimular a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células com um fenótipocondrocítico, e/ou a recomposição do trofismo original de condrócitos a partir de umtecido cartilaginoso.
29. Uso de um composto contendo em combinação pelomenos um açúcar, pelo menos um aminoácido e pelo menos um fator vitamínico ou umavitamina, em um veículo ou diluente fisiologicamente aceitável, caracterizado pelo fatoque é para o preparo de dispositivo médico capaz de estimular in situ a diferenciação decélulas-tronco pluripotentes em células com um fenótipo condrocítico, e/ou a recuperaçãodo trofismo original de condrócitos a partir de um tecido cartilaginoso, o propósito dessedispositivo sendo a administração para um local patológico onde células pró-inflamatóriasprodutoras de enzimas proteolíticas estejam presentes.
30. Método para a diferenciação in vitro de células-troncopluripotentes em células com um fenótipo condrocítico, caracterizado pelo fato quecontém os passos de:i) fornecer células-tronco pluripotentes;ii) fornecer um meio de cultura de acordo com a reivindicação 25;iii) fazer cultura dessas células-tronco pluripotentes no meio de cultura mencionado, a fimde obter células com fenótipo condrocítico.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado no referido meio de cultura, inclui pelo menos um fator estimulante decolônia de macrófago e um fator inibidor de leucemia.
32. Método, de acordo com as reivindicações de 30 ou 31,caracterizado no referido meio de cultura, inclui pelo menos uma interleucina, depreferência interleucina-2 ou interleucina-6.
33. Método, de acordo com as reivindicações de 30 a 32,caracterizado no referido meio de cultura, inclui pelo menos um antibiótico, depreferência gentamicina, penicilina ou estreptomicina.
34. Método, de acordo com qualquer reivindicação de 30 a-33, caracterizado no referido passo de cultura iii), é feito na presença de umaplataforma.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34,caracterizado na referida plataforma, é selecionado a partir da fibrina, colágeno,fragmentos de cartilagem, sais, ácido hialurônico, hialuronato, ácido poliglicólico,hidroxiapatita, carboxi metil celulose modificado com grupos de amido nas cadeiaspoliméricas.
36. Método, de acordo com qualquer reivindicação de 30 a-35, caracterizado nas referidas células-tronco pluripotentes, são células-troncopluripotentes (nativas ou não-nativas) de humano e/ou animal adulto de origemhematopoiética ou mesenquimal.
37. Método, de acordo com qualquer reivindicação de 30 a-35, caracterizado nas referidas células-tronco pluripotentes, é a linha celular PSC-THP1depositada em 18 de outubro de 2005 no Advanced Biotechnology Centre, Interlab CellLine Collection, Gênova, Itália, sob número de acesso ICLC PD No. 5005.
38. Linha celular derivada que tem fenótipo condrocíticoobtido pelo método de acordo com qualquer reivindicação de 30 a 37, caracterizado pelofato que é a linha celular PSC-THP1 -CHONDROCYTE-LIKE depositada em 21 de marçode 2006, no Advanced Biotechnology Centre, Interlab Cell Line Collection1 Gênova, Itália,sob número de acesso ICLC PD No. 06001.
39. Uso de células que podem ser obtidas pelo método deacordo com qualquer reivindicação de 30 a 37 no meio de cultura de acordo com areivindicação 25, caracterizado pelo fato que é para preparar um medicamento capaz deestimular a diferenciação in vivo de células-tronco pluripotentes em células que têm umfenótipo condrocítico e/ou a recuperação do trofismo original de condrócitos a partir deum tecido cartilaginoso.
40. Uso, de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato onde o meio de cultura contém matriz de condrócitos.
41. Uso, de acordo com as reivindicações 39 ou 40,caracterizado pelo fato onde o medicamento mencionado é capaz de ser administradopor infiltração endoarticular.
42. Método para produzir matriz de condrócitos contendo opasso de cultura de uma linha celular derivada caracterizado pelo fato que tem umfenótipo condrocítico de acordo com a reivindicação 38.
43. Método, de acordo com a reivindicação 42,caracterizado na referida linha celular derivada ,passa por cultura na presença de umfator de crescimento.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43,caracterizado no referido fator de crescimento, é usado em uma quantia expressa emporcentagem por peso com relação ao volume total do composto, contendo entre 0,01ng/L e 200 g/L, de preferência entre 1 ng/L e 200mg/L.
45. Kit de partes contendo pelo menos uma enzimaproteolítica, caracterizado pelo fato que pelo menos um fator de crescimento e pelomenos um açúcar, um aminoácido, um fator vitamínico, uma vitamina, um nucleotídeo eum nucleosídeo para uso simultâneo, seqüencial ou separado em terapia de regeneraçãode cartilagem
46. Kit de partes, de acordo com a reivindicação 45,caracterizada por pelo menos uma enzima proteolítica, é selecionado a partir dapapaína, serratiopeptidase colagenase (preferencialmente tipo IA, tipo II, tipo IV),heparanase, DNAse1 elastase, bromelaína, bradiquinase, peptidase Clostridium, enzimasexpressas por Lactobacillus acidophilus, enzimas expressas pelo tipo Aspergillus,proteases, alinases e fibrinolisina.
47. Kit de partes, de acordo com as reivindicações de 45 ou-46, caracterizada por pelo menos um aminoácido, é selecionado a partir da metionina,cistina, N-acetilcisteína, cisteína, glicina, leucina, isoleucina, prolina, glutamina, arginina,ácido glutâmico, histidina, histidina-HCI-H20, lisina, Iisina-HCI1 fenilalanina, serina,treonina, triptofano, tirosina, sal dissódico (tirosina), valina, prolina e hidroxiprolina.
48. Kit de partes, de acordo com as reivindicações de 45 a-47, caracterizado por pelo menos um fator de crescimento, é selecionado a partir dofator de crescimento transformador beta, fator inibidor de leucemia, fator de crescimentodo tipo insulina, insulina-transferrina-selênio, insulina, fator estimulante de colônia demacrófago, interleucina-2, forbol-12-miristato-13-acetato, soro autólogo.
49. Kit de partes, de acordo com as reivindicações de 45 a-48, caracterizado no referido fator de crescimento, está associado a um açúcar e/ou aum sal.
50. Kit de partes de acordo com a reivindicação 49,caracterizado no referido açúcar, é selecionado a partir da glicose, sacarose, glucanos,mananos, glucomananos, fucose, frutose, sulfatos de heparano, pectinas e amidos.
51. Kit de partes, de acordo com a reivindicação 49 ou 50,caracterizado no referido sal, é selecionado a partir de gluconato de cálcio, fosfato decálcio, bicarbonato de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio,cloreto de potássio, fosfato de potássio, cloreto de sódio, nitrato de cálcio, cloreto dezinco, nitrato férrico, pantotenato de cálcio, piruvato de sódio, sal dissódico (tirosina).
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