JP7311433B2 - 幹細胞を培養し、増殖させ、分化させるための方法及び材料 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年2月23日に出願された米国特許出願第62/634,580号、及び2017年6月5日に出願された米国特許出願第62/515,286号に基づく優先権を主張する。これら先の出願の開示は、本出願の開示の一部と見なされ、その全体が本出願に組み込まれる。
本書類は、誘導多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell、iPSC)及び網膜色素上皮に関する。例えば、本書類は、幹細胞(例えばiPSC)を培養し、増殖させ、分化させるための方法及び材料に関する。本書類はまた、幹細胞(例えばiPSC)から網膜色素上皮を作製するための方法及び材料に関する。
iPSCベースの再生医療の標的疾患の一例は、黄斑変性である。黄斑変性は網膜色素上皮(RPE)の障害である。ベストロフィノパチー(bestrophinopathy)を含む遺伝性黄斑変性は、RPE機能に関与するタンパク質変異により生じる。ベストロフィノパチー、最も一般的にはベスト病、はBest1遺伝子の変異に起因し、光受容器を支えるその役割においてRPE機能障害を引き起こし、最終的に光受容器の死をもたらす。有病率は過去に、16,000~21,500人に1人と報告されている(Dalvin等, Ophthalmic Genet., Epub:1-5 (2016))。遺伝的に引き起こされる黄斑変性は稀であるが、加齢黄斑変性(AMD)は、先進国において失明の主な原因である。2050年には、500万件を占めると推定されている。AMDは、RPE機能に直接影響する免疫及び血管機能のより複雑な疾患である。
第2の移植片に隣接して、好ましくは最初の切開部又はカニューレを通して配置され得る。第3の移植片を固定し滑らないようにするためにレーザーツールが使用され得る。本セクションでは、3個のRPE移植片を移植することが記載されるが、治療される部位をカバーするために任意の適切な数が使用され得る。例えば、1、2、3、4、5、6又はそれ以上の本明細書で提供されるRPE単層/フィブリン移植片が、治療される単一の眼内に移植され得る。概して、このモジュラータイリングアプローチ(modular tiling approach)は、臨床医が患者の必要に応じて移植片を個別化することを可能とすることができ、広範な部位に拡張可能であり、網膜の任意の領域に適用可能であり、必要な切開の数を低減させる。
<化学製品>
フィブリノゲンは3種の供給源から入手した: EvicelとしてEthiconから(60 mg/mL)、TisseelとしてBaxterから(95 mg/mL)、研究グレードの材料としてSigma-Aldrich(57 mg/mL)及びMillipore(44 mg/mL)から。最終的な使用濃度は、PBSを用いて0~1mg/mLの濃度範囲に形成した。
他に記載のようにマトリゲル被覆プレートを陽性対照として利用した(Johnson等, Investig. Opthalmology Vis. Sci., 56:4619 (2015))。ストックのフィブリノゲンをPBS中に希釈することにより様々な濃度のフィブリノゲンを調製し、様々な大きさのウェル上にプレーティングし4~37℃に1~24時間置いた。続いてPBSで洗浄した後、細胞を様々な濃度(0.1×106~1×106細胞/cm2)でプレーティングし、5% CO2下、37℃でインキュベートした。接着及び生存能力について経時的に細胞を観察した。
継代1又は2の部分的に分化したiPSC-RPEをLAgen Laboratories LLC (Rochester, MN)から取得した。最初の分化過程は、変更を加えながら他に記載のように行った(Johnson等, Investig. Opthalmology Vis. Sci., 56:4619 (2015))。最初にコラゲナーゼで消化することによりプレートから細胞を解離させ、次いでaccumaxで細胞懸濁液を作製し、フィブリノゲン又はマトリゲルで被覆した組織培養ポリスチレン(TCPS)又はポリカーボネート上に様々な濃度(0.1×106~1×106細胞/cm2)で再度プレーティングした。細胞は他に記載のように分化培地と共に培養した(Johnson等, Investig. Opthalmology Vis. Sci., 56:4619 (2015))。
プレーティングした細胞の明視野画像を撮り、分化過程中様々な時点で細胞の形態を評価した。2週間の培養後、様々な時点におけるウェスタンブロット解析及びELISAによる成長因子分泌によって、RPE細胞の完全な分化を評価した。
1週間0.1~0.5μg/mLのフィブリノゲンで被覆したプレート上で培養した細胞はプレートに接着しなかったか、又は十分に付着しなかった(図1及び図2)。1週間1μg/mLのフィブリノゲンで被覆したプレート上で培養した一部の細胞は付着したが、単層形成は不十分であった(図3)。1週間5~15μg/mLのフィブリノゲンで被覆したプレート上で培養した細胞は、パッチ状の単層の形成をもたらした(図4~6)。1週間25μg/mL以上のフィブリノゲンで被覆したプレート上で培養した細胞は、コンフルエントな単層を形成した(図7~10)。図7~10に示す単層は、陽性対照を用いて得た単層(図11)と類似していた。図12も参照されたい。
貪食アッセイは、他に記載のように行った(Marmorstein等, Sci. Rep., 8:4487 (2018))。iPSC-RPEを様々なフィブリノゲンの供給源:evicel及び2つの別個の寒冷沈殿物(Aneg及びBpos)上で生育させた。マトリゲル被覆を陽性対照として使用した。evicel(Evi)上で培養したRPEは、マトリゲルと同様の総OS結合を示したが、Aneg及びBposは総OS結合の約2倍の増大を示した(図23)。結合すると、Aneg(67%)及びBpos(57%)は、MG(55%)と同様の内在化比率を示したが、Evi(14%)はMGより有意に低かった(p=0.009)。
様々な被覆試薬上で生育したRPEについて、RPE65、CRALBP及びBEST1発現のウェスタンブロット比較を行った(図24)。フィブリノゲンベースの基質は、内部βアクチンシグナルに対し標準化した場合、マトリゲル対照に比べ、RPE65及びBest1の発現の増大を示した。CRALBPはすべての群間で相違を示さなかった。
ヒトフィブリノゲン(例えばEvicel、60mg/mL)を、DPBSを用いて100μg/mLに希釈する。2mLを6ウェルプレートのウェル上にプレーティングする。プレートを4℃で一晩インキュベートする。フィブリノゲン溶液を吸引し、プレートをDPBSで3回洗浄する。ヒトの部分的に分化したiPSC-RPE(継代2)を、1×106細胞/cm2の濃度でウェル上にプレーティングする。細胞を、接着させるために37℃、5% CO2で一晩インキュベートする。細胞は、他に記載のように分化培地中にプレーティングする(Johnson等, Investig. Opthalmology Vis. Sci., 56:4619 (2015))。培地交換は1日置きに約8週まで行う。分析又は使用のために、細胞を回収し調製する。
ヒトフィブリノゲンで組織培養プラスチック製品を被覆するための、及び3Dヒトフィブリンハイドロゲルを製造するための、再生産可能な品質管理された製品を開発するために、以下を行った。製品を、iPSC培養を維持する能力を有するか否か、及び様々な細胞種、例えばRPE、内皮、及び心筋細胞にiPSCを分化させるのに使用される能力を有するか否かについて、評価した。
<細胞>
CLR-0001-BIOTR iPSC株を継代10~20で用いた(Johnson等, Investig. Opthalmology Vis. Sci., 56:4619 (2015); 及びMarmorstein等 Sci. Rep., 8:4487 (2018))。追加の株、WiCell由来のCLR-0004もまた使用した(Johnson等, Investig. Opthalmology Vis. Sci., 56:4619 (2015))。mTESR (Stem Cell Technologies)をiPSC成長のために用い、mRESLR (Stem Cell Technologies)を用いて継代のために細胞を解離させた。継代はiPSCクラスターについて行い、多能性及び増幅を維持するために約20~40%コンフルエンシーの密度で再度プレーティングした。
フィブリノゲンを、エタノール沈殿(Dietrich等, Tissue Eng. Part C Methods., 19:216-226 (2013))及び寒冷沈殿(Sparrow等, Methods Mol. Biol. Clifton NJ., 728:259-265 (2011))を含む標準的な方法を用いて抽出した。沈殿後、フィブリノゲンを様々なモル濃度のTris-HCL、TBS、PBS及びクエン酸塩緩衝食塩水中で再構成した。試料を滅菌濾過し、多数回の凍結融解を防ぐためにストック溶液として分注した。市販のフィブリノゲン(Evicel;Ethicon)もまた、比較のために用いた。
様々な供給源から得たフィブリノゲンストック溶液を37℃で解凍し、各緩衝液中で使用濃度に希釈した。EvicelはPBS中に希釈した。0.3125 mL/cm2表面積のプレーティング密度を用いた。プレートは、使用の前最低でも2時間、37℃でインキュベートした。インキュベーション後、iPSCをプレーティングする前にPBSで3回プレートを洗浄した。
様々な被覆された表面上で培養する細胞は、フローサイトメトリーを行う前少なくとも48時間培養した。細胞を、最大5分間37℃でTrypLE (Life Technologies)を用いて解離させ、4分間800gで遠心分離し、PBS中に再懸濁して非染色対照のために2本のチューブに分け、再度遠心分離した。製造業者のプロトコルに従って、PerFix-nc (Beckman Coulter)中に細胞を固定した。染色する細胞は、透過処理試薬(permeabilizing reagent)、1:10 Alexa 488 抗ヒトNanog (BD)、1:10 Alex 647 抗-OCT 3/4 (BD)、1:10 PE 抗-SSEA4 (BD)、及び1:10 PerCP-Cy5.5 抗ヒトTRA1-60 (BD)から成る染色溶液と混合した。ランする前に細胞スラリーが沈殿できるようにすることによって、細胞塊を除去した。4つのチャンネルを用いてGallios (Beckman Coulter)上で試料をランした。合計1000個の細胞が計数され、発現の確認に必要となる二重陽性細胞を有していた。
アクターゼ(Accutase)(Innovative Cell Tech; San Diego, CA)を用いて各々の被覆材料を有する60mmプレートから各々の被覆材料を有する6ウェルプレート(Ecto)又は24ウェルプレート(Endo, Meso)上にiPSCを継代した。製造業者のプロトコルに従ってSTEMdiff神経誘導培地(Neural Induction Medium)(Stem Cell Tech)を用いて外胚葉分化を行った。0日目の培地にのみY-27632(RND Systems)を添加した。9日間の培養後、アクターゼを用いて6ウェルプレートから細胞を継代し、24ウェルプレート上に再度プレーティングした。おおよそ70%コンフルエントとなるまで神経誘導培地を用い、分化を完了させた。製造業者のプロトコルに従ってSTEMdiff胚体内胚葉(Definitive Endoderm)キット(Stem Cell Tech)を用いて内胚葉分化を行った。5日後、4%PFA中で細胞を固定した。製造業者のプロトコルに従ってStemDiff中胚葉誘導培地を用いて中胚葉分化を行った。5日後、4%PFA中で細胞を固定した。
固定したiPSCを、多能性マーカーについて染色し、培養基質間のクローン間変動(clonal variation)を評価した。固定した細胞を、室温で30分間、0.2% Triton-X 100 (Sigma-Aldrich)中で透過処理した後、ブロッキング溶液(DAKO)中でインキュベートした。室温で1時間、以下の一次抗体の組み合わせのうちの1つと共に各ウェルをインキュベートした:(A) 1:200ウサギ抗Oct 3/4 (Abcam)及び1:100マウス抗SSea4 (Abcam)又は(B) 1:100ウサギ抗Nanog (Cell Signaling)及び1:100マウス抗Tra1-60 (Abcam)。ウェルを洗浄液(DAKO)で3回洗浄した。その後、2次抗体混合物を室温で30分間インキュベートした:1:200抗ウサギAlexa 594及び1:300抗マウスAlexa488。ウェルを再度洗浄し、DAPIで5分間染色し、Cytation 5イメージャー(BioTek)を用いて画像化した。
フィブリンゲルを他に記載のように作製した(Gandhi等, Acta Biomater., 67:134-146 (2018))。簡潔に説明すると、30mg/mLのフィブリノゲン及び100U/mLのトロンビン(最終濃度)の混合物を12ウェルプレートのウェル中で混合し、特注のパラフィルム付きポリカーボネート型(polycarbonate mold with parafilm)を用いてウェル内でゲルを平らにした。ゲルを37℃で2時間完全に重合させた後、PBSで洗浄し、ゲル上にiPSCを播種した。
<フィブリン上のiPSC>
iPSCはフィブリンハイドロゲル上で成功裏に培養された。図30は、アプロチニンの補充なしで30mg/mLのフィブリノゲン及び100U/mLのトロンビンで作製したフィブリンハイドロゲル上で培養したiPSCコロニーを示す。iPSCコロニーは経時的に増殖した。より大量にプレーティングすると、iPSCはコンフルエントな単層を形成した。アプロチニンなしで、ゲル内に多数のひずみ線があり、iPSCにより及ぼされた機械的な力が示唆される。アプロチニンなしで、ゲルはコンフルエンシーに達した時に著しく分解されているようには見えなかった。
様々なフィブリノゲン調製物の質的純度を決定するために、SDS-PAGEゲルをランし、クマシーブルーで染色した。各々のフィブリノゲン調製物はiPSCを培養するのに成功した。レーン9及び10は、プラスミノーゲン、フォン・ヴィレブランド因子、及びフィブロネクチンを除去した陽性対照の寒冷沈殿させたフィブリノゲンを表す(図32)。フィブリノゲンは3つのバンド、α(67kDa)、β(54kDa)及びγ(47kDa)として特徴的に現れる(図32)。すべての実験試料は、同様のフィブリノゲンの特徴的なプロファイルを示した。レーン2及び3は、エタノール沈殿させたフィブリノゲン調製物(EPF1)を表す(図32)。これは260kDa、150kDa及び120kDa付近に複数のバンドを含む。フィブロネクチンは血漿沈殿物の一般的な成分であり、260kDa付近のバンドとして見いだされる。レーン4及び5は、市販の寒冷沈殿させたフィブロネクチン(Evicel, EVI)を表す(図32)。レーン6及び7は、エタノール沈殿させたフィブリノゲンの第2の異なる調製物(EPF2)のためのものである(図32)。この試料はフィブロネクチン濃度がはるかに低いように見えた。これはまた、100μg/mLでiPSCを成功裏にプレーティングすることができた試料であった。最後に、レーン9は寒冷沈殿させたフィブリノゲン(CPF1)を表す(図32)。
iPSCを、フィブリノゲンの様々な調製物上で培養した。EPF2を用いると、最も低い濃度で、iPSC接着が成功した。例えば、図39は、EPF2条件を用いて100μg/mLのフィブリノゲンで被覆したプレートに接着したiPSCを示す。700μg/mLのフィブリノゲン濃度は同様の接着を示した。
分化の前に、フィブリノゲン被覆したプレート上でiPSC単層を生成する能力を決定した。図40は、iPSCは、フィブリノゲン上で培養した場合、geltrex陽性対照と比べてコンフルエントな単層を形成することができたことを示す。
フィブリノゲン上でiPSCを培養する能力が細胞株に固有ではないことを実証するために、他に記載の市販のiPSC細胞株(WISCi004-A-1)(Srikanth等, Cell Rep., 12:1414-1429 (2015);及びZeng等, PloS One, 5:e11853 (2010))を用いた。WISCi004-A-1は、フィブリノゲン被覆したプレート上で培養した場合、成功裏に多能性を維持した。免疫蛍光は、Oct4、SSea4、Nanog及びTra1-60の陽性染色を明らかにした(図34)。さらに、iPSCは3生殖系列系統に分化した。フィブリノゲン上で培養したWISCi004-A-1株では、内胚葉分化は73.9±8.6%のiPSCで達成され、中胚葉は42.2±3.9%のiPSCで達成され、外胚葉は56.7±8.2%のiPSCで達成された(図35)。
<iPSC-EC分化>
CLR-0001-BIOTR iPSC株を継代10~15で用いた。6ウェルプレートを1mg/mLフィブリノゲン試薬で2mL/ウェルを用いて被覆し、使用前に37℃で2時間インキュベートした。他に記載のようにiPSC-EC分化を行った(Orlova等, Nat. Protoc., 9:1514-1531 (2014))。簡潔に説明すると、iPSCコロニーを直径0.5~1mmの断片に分割し、細胞あたり5~8コロニーをプレーティングした。iPSCを2日間mTeSR1培地と共に培養し、その後中胚葉誘導培地(25ng/mL アクチビンA(RND Systems)、30ng/mL BMP4(Miltenyi Biotec)、50ng/mL VEGF(RND Systems)、及び1.5μM CHIR(RND Systems)を補充したBPEL(Orlova等, Nat. Protoc., 9:1514-1531 (2014))ベース)と交換した。2日後、培地を血管特異的培地(50ng/mL VEGF及び10μM SB431542(RND Systems)を補充したBPELベース)と交換した。4日後、血管特異的培地を補給し、さらに2日後に再度補給した。
iPSC-ECを、継代4まで継代及び生育した。培地を吸引した後、iPSC-ECをPBS中で洗浄し、室温で5分間TrypLEを用いて解離させた。細胞をEGM2培地中に再懸濁し、10分間300gで遠心分離した。細胞を100μg/mLフィブリノゲンで被覆したT25フラスコ又は100μg/mLフィブリノゲンで被覆した4チャンバー培養スライド(BD)上に1×104細胞/cm2で再度プレーティングした。2日毎に培地を交換し、再継代前6日目まで細胞を生育した。
固定したiPSC-ECを内皮マーカーについて染色した。100μg/mLフィブリノゲンで被覆した4ウェル培養スライド上で培養したiPSC-ECを、5分間氷冷したメタノールで固定した。メタノールをPBSで3回洗い流した。固定した細胞を、ブロッキング溶液(PBS中の6%正常ヤギ血清、0.3% トリトン-X(triton-X)100(Sigma-Aldrich))を用いて室温で45分間、ブロッキングした。以下の一次抗体のうちの1つと共に4℃で一晩、細胞をインキュベートした:(A) 10μg/mL 抗CD31(BBA7, RND Systems)又は(B) 10μg/mL FITC標識UEA-レクチン(Vector Labs)。ウェルをPBSで3回洗浄した。その後、CD31染色のみについて、0.3% TX-PBS中の10μg/mLのFITC-抗マウス二次抗体を、細胞と共に室温で1時間インキュベートした。ウェルを再度洗浄し、スライドに蛍光色素を滴下し(fluromount)、カバースリップした。蛍光顕微鏡(Nikon)を用いてスライドをイメージ化した。
<iPSC-EC培養>
iPSC-ECは以前、他に記載のように分化させた(Orlova等, Nat. Protoc., 9:1514-1531 (2014))。このプロトコルは、iPSCのECへの分化を開始するためにマトリゲル被覆された6ウェルプレートを用いた。成功裏に精製し、マトリゲル上で培養した後、iPSC-ECをフィブリノゲン被覆したプレート上にTrypLEを用いて継代した。iPSC-ECは、フィブリノゲン被覆したプレートに成功裏に付着し、典型的な紡錘形状の表現型で出現した(図36)。
本発明は、その詳細な説明と関連して記載されてきたが、上記の説明は例示することを目的としており、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定することを目的とするものではないことは理解すべきである。他の態様、利点、及び改変は添付の特許請求の範囲内にある。
本発明は以下の態様も提供する。
[1] 網膜色素上皮単層を作製するための方法であって、フィブリノゲンで被覆された表面を有する容器中で幹細胞を培養することを含み、前記表面は3μg/mLを超えるフィブリノゲンで被覆されたものであり、前記細胞が前記フィブリノゲンと接触し、前記細胞が前記網膜色素上皮単層を形成する、方法。
[2] 前記幹細胞が誘導多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell)である、[1]に記載の方法。
[3] 前記幹細胞がヒト誘導多能性幹細胞である、[1]又は[2]に記載の方法。
[4] 前記容器が培養皿である、[1]~[3]のいずれか1項に記載の方法。
[5] 前記容器が培養フラスコである、[1]~[4]のいずれか1項に記載の方法。
[6] 前記表面が、ポリスチレン、ポリカーボネート、混合セルロース、PTFE、PDMS、PET、ガラス、ポリ-L-リジン被覆、又はその組み合わせを含む、[1]~[5]のいずれか1項に記載の方法。
[7] 前記フィブリノゲンがヒトフィブリノゲンである、[1]~[6]のいずれか1項に記載の方法。
[8] 前記表面が、約3~約250μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[1]~[7]のいずれか1項に記載の方法。
[9] 前記表面が、約15~約250μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[1]~[8]のいずれか1項に記載の方法。
[10] 前記表面が、約25~約250μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[1]~[9]のいずれか1項に記載の方法。
[11] 前記表面が、約50~約250μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[1]~[10]のいずれか1項に記載の方法。
[12] 前記表面が、約75~約250μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[1]~[11]のいずれか1項に記載の方法。
[13] 前記表面が、約1~約48時間、前記フィブリノゲンで被覆されたものである、[1]~[12]のいずれか1項に記載の方法。
[14] 前記細胞を約7~約90日間培養して前記網膜色素上皮単層を形成することを含む、[1]~[13]のいずれか1項に記載の方法。
[15] ゼノフリーである、[1]~[14]のいずれか1項に記載の方法。
[16] 網膜色素上皮単層を含む網膜移植片であって、前記網膜色素上皮単層が、[1]~[15]のいずれか1項に記載の方法に従って製造されたものである、網膜移植片。
[17] 眼の状態を治療するための方法であって、網膜色素上皮単層を含む網膜移植片を哺乳動物の眼に移植することを含み、前記網膜色素上皮単層が、[1]~[15]のいずれか1項に記載の方法に従って作製されたものである、方法。
[18] 前記眼の状態が黄斑変性である、[17]に記載の方法。
[19] 前記哺乳動物がヒトである、[17]又は[18]に記載の方法。
[20] 培養下で幹細胞を維持するための方法であって、フィブリノゲンで被覆された表面を有する容器中で前記幹細胞を培養することを含み、前記表面は250μg/mLを超えるフィブリノゲンで被覆されたものであり、前記幹細胞が前記フィブリノゲンと接触し、前記幹細胞が少なくとも1回の継代後、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉由来の細胞に分化する能力を維持する、方法。
[21] 前記幹細胞が誘導多能性幹細胞である、[20]に記載の方法。
[22] 前記幹細胞がヒト誘導多能性幹細胞である、[20]又は[21]に記載の方法。
[23] 前記容器が培養皿である、[20]~[22]のいずれか1項に記載の方法。
[24] 前記容器が培養フラスコである、[20]~[23]のいずれか1項に記載の方法。
[25] 前記表面が、ポリスチレン、ポリカーボネート、混合セルロース、PTFE、PDMS、PET、ガラス、ポリ-L-リジン被覆、又はその組み合わせを含む、[20]~[24]のいずれか1項に記載の方法。
[26] 前記フィブリノゲンがヒトフィブリノゲンである、[20]~[25]のいずれか1項に記載の方法。
[27] 前記表面が、約250~約5000μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[20]~[26]のいずれか1項に記載の方法。
[28] 前記表面が、約300~約900μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[20]~[27]のいずれか1項に記載の方法。
[29] 前記表面が、約350~約750μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[20]~[28]のいずれか1項に記載の方法。
[30] 前記表面が、約400~約600μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[20]~[29]のいずれか1項に記載の方法。
[31] 前記表面が、約450~約550μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[20]~[30]のいずれか1項に記載の方法。
[32] 前記表面が、約1~約48時間、前記フィブリノゲンで被覆されたものである、[20]~[31]のいずれか1項に記載の方法。
[33] 約2日~約90日間、前記細胞を培養することを含む、[20]~[32]のいずれか1項に記載の方法。
[34] ゼノフリーである、[20]~[33]のいずれか1項に記載の方法。
[35] 培養下で幹細胞を維持するための方法であって、フィブリノゲンで被覆された表面を有する容器中で前記幹細胞を培養することを含み、前記表面は3μg/mLを超えるフィブリノゲンで被覆されたものであり、前記幹細胞が前記フィブリノゲンと接触し、前記幹細胞が少なくとも1回の継代後、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉由来の細胞に分化する能力を維持する、方法。
[36] 前記幹細胞が誘導多能性幹細胞である、[35]に記載の方法。
[37] 前記幹細胞がヒト誘導多能性幹細胞である、[35]又は[36]に記載の方法。
[38] 前記容器が培養皿である、[35]~[37]のいずれか1項に記載の方法。
[39] 前記容器が培養フラスコである、[35]~[38]のいずれか1項に記載の方法。
[40] 前記表面が、ポリスチレン、ポリカーボネート、混合セルロース、PTFE、PDMS、PET、ガラス、ポリ-L-リジン被覆、又はその組み合わせを含む、[35]~[39]のいずれか1項に記載の方法。
[41] 前記フィブリノゲンがヒトフィブリノゲンである、[35]~[40]のいずれか1項に記載の方法。
[42] 前記表面が、約100~約5000μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[35]~[41]のいずれか1項に記載の方法。
[43] 前記表面が、約300~約900μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[35]~[42]のいずれか1項に記載の方法。
[44] 前記表面が、約100~約250μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[35]~[42]のいずれか1項に記載の方法。
[45] 前記表面が、約350~約750μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[35]~[42]のいずれか1項に記載の方法。
[46] 前記表面が、約400~約600μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[35]~[42]のいずれか1項に記載の方法。
[47] 前記表面が、約450~約550μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[35]~[42]のいずれか1項に記載の方法。
[48] 前記表面が、約1~約48時間、前記フィブリノゲンで被覆されたものである、[35]~[47]のいずれか1項に記載の方法。
[49] 約2日~約90日間、前記細胞を培養することを含む、[35]~[48]のいずれか1項に記載の方法。
[50] ゼノフリーである、[35]~[49]のいずれか1項に記載の方法。
[51] 前記幹細胞が内皮細胞を形成する、[20]~[50]のいずれか1項に記載の方法。
[52] 前記フィブリノゲンが自家的に(autologously)取得されたものである、[20]~[51]のいずれか1項に記載の方法。
[53] 培養下で幹細胞を維持するための方法であって、フィブリンハイドロゲルで被覆された表面を有する容器中で前記幹細胞を培養することを含み、前記フィブリンハイドロゲルは0.5mg/mLを超えるフィブリノゲンで形成されたものであり、前記幹細胞が前記フィブリンハイドロゲルと接触し、前記幹細胞が少なくとも1回の継代後、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉由来の細胞に分化する能力を維持する、方法。
[54] 前記幹細胞が誘導多能性幹細胞である、[53]に記載の方法。
[55] 前記幹細胞がヒト誘導多能性幹細胞である、[53]又は[54]に記載の方法。
[56] 前記容器が培養皿である、[53]~[55]のいずれか1項に記載の方法。
[57] 前記容器が培養フラスコである、[53]~[56]のいずれか1項に記載の方法。
[58] 前記表面が、ポリスチレン、ポリカーボネート、混合セルロース、PTFE、PDMS、PET、ガラス、ポリ-L-リジン被覆、又はその組み合わせを含む、[53]~[57]のいずれか1項に記載の方法。
[59] 前記フィブリノゲンがヒトフィブリノゲンである、[53]~[58]のいずれか1項に記載の方法。
[60] 前記フィブリンハイドロゲルが、約0.5mg/mL~約80mg/mLのフィブリノゲン濃度で形成される、[53]~[59]のいずれか1項に記載の方法。
[61] 前記フィブリンハイドロゲルが、約10mg/mL~約50mg/mLのフィブリノゲン濃度で形成される、[53]~[60]のいずれか1項に記載の方法。
[62] 前記フィブリンハイドロゲルが、約25mg/mL~約35mg/mLのフィブリノゲン濃度で形成される、[53]~[61]のいずれか1項に記載の方法。
[63] 前記フィブリンハイドロゲルが、0.5~500U/mLのトロンビンを用いて重合される、[53]~[62]のいずれか1項に記載の方法。
[64] 前記フィブリンハイドロゲルが、抗フィブリン溶解剤を含む、[53]~[63]のいずれか1項に記載の方法。
[65] 前記抗フィブリン溶解剤が、約0.5mg/mL~約50mg/mLの濃度のトラネキサム酸である、[64]に記載の方法。
[66] 前記抗フィブリン溶解剤が、約0.1U/mL~約40U/mLの濃度のアプロチニンである、[38]~[50]のいずれか1項に記載の方法。
[67] 内皮細胞を作製するための方法であって、フィブリノゲンで被覆された表面を有する容器中で幹細胞を培養することを含み、前記表面は3μg/mLを超えるフィブリノゲンで被覆されたものであり、前記幹細胞が前記フィブリノゲンと接触し、前記幹細胞が内皮細胞を形成する、方法。
[68] 前記幹細胞が、誘導多能性幹細胞である、[67]に記載の方法。
[69] 前記幹細胞が、ヒト誘導多能性幹細胞である、[67]又は[68]に記載の方法。
[70] 前記容器が培養皿である、[67]~[69]のいずれか1項に記載の方法。
[71] 前記容器が培養フラスコである、[67]~[70]のいずれか1項に記載の方法。
[72] 前記表面が、ポリスチレン、ポリカーボネート、混合セルロース、PTFE、PDMS、PET、ガラス、ポリ-L-リジン被覆、又はその組み合わせを含む、[67]~[71]のいずれか1項に記載の方法。
[73] 前記フィブリノゲンがヒトフィブリノゲンである、[67]~[72]のいずれか1項に記載の方法。
[74] 前記表面が、約3~約250μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[67]~[73]のいずれか1項に記載の方法。
[75] 前記表面が、約15~約250μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[67]~[74]のいずれか1項に記載の方法。
[76] 前記表面が、約25~約250μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[67]~[75]のいずれか1項に記載の方法。
[77] 前記表面が、約50~約250μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[67]~[76]のいずれか1項に記載の方法。
[78] 前記表面が、約75~約250μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、[67]~[77]のいずれか1項に記載の方法。
[79] 前記表面が、約1~約48時間、前記フィブリノゲンで被覆されたものである、[67]~[78]のいずれか1項に記載の方法。
[80] 前記細胞を約7~約90日間培養して内皮細胞を形成することを含む、[67]~[79]のいずれか1項に記載の方法。
[81] 前記方法がゼノフリーである、[67]~[80]のいずれか1項に記載の方法。
Claims (12)
- 網膜色素上皮単層を作製するための方法であって、
フィブリノゲンで被覆された表面を有し、誘導多能性幹細胞を、前記網膜色素上皮単層を形成することができる網膜色素上皮細胞に分化させることができる培地を含む容器中で誘導多能性幹細胞を培養することを含み、
前記表面は約25~約250μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものであり、
前記誘導多能性幹細胞が前記フィブリノゲンと接触し、
前記誘導多能性幹細胞が前記容器中で前記網膜色素上皮細胞に分化し、
前記網膜色素上皮細胞が前記容器中で前記網膜色素上皮単層を形成し、
形成された前記網膜色素上皮単層が、フィブリノゲンと接触している網膜色素上皮細胞の6角形のパターン形成を含む、
方法。 - 前記培養が、0.1×106~1×106個の誘導多能性幹細胞/cm2を培養することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記誘導多能性幹細胞がヒト誘導多能性幹細胞である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記容器が培養皿である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記容器が培養フラスコである、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面が、ポリスチレン、ポリカーボネート、混合セルロース、PTFE、PDMS、PET、ガラス、ポリ-L-リジン被覆、又はその組み合わせを含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記フィブリノゲンがヒトフィブリノゲンである、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面が、約50~約250μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面が、約75~約250μg/mLのフィブリノゲンで被覆されたものである、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面が、約1~約48時間、前記フィブリノゲンで被覆されたものである、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞を約7~約90日間培養して前記網膜色素上皮単層を形成することを含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- ゼノフリーである、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
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