JP2013502234A - 実質的に純粋なヒト網膜前駆細胞培養物、前脳前駆細胞培養物、網膜色素上皮細胞培養物、及び、それらの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、以下の機関に授与された米国政府の支援を受けてなされた:国立眼研究所MSN116835。米国政府は、本発明において一定の権利を保有する。
1.移植:非限定的な例としては、治療細胞救援療法(therapeutic cell rescue therapy)におけるFPCの使用、および、以前に失われた視力を回復するために失われた細胞補充療法(replacement therapy)におけるRPC,RPE,FPC、又は、これらのいずれかから分化した細胞の使用を含む。この方法および培養物は、組織全体補充療法(whole tissue replacement therapy)に使用するため組織を開発するために使用することができる。
2.神経節細胞、桿体視細胞、錐体視細胞、RPE、前脳細胞、中脳細胞を含むすべての細胞の機能を保護し、強化する試薬(agent)のための薬剤スクリーニング(drug screening)
3.病態生理学を研究し、薬物スクリーニング又はそれらの幹細胞またはその誘導体を使用したカスタマイズした治療のために使用することができる、多能性細胞(特にiPSC)から網膜疾患モデルの生成
4.ヒト神経発達のユニークなモデル(これは、網膜発達、組織形成、および、シナプス形成などを含む様々なプロセスを研究するための有用なリソースとなり得る。)
我々は、以下に、明確(definitive)網膜細胞集団のヒトESCからの細胞運命発生(cell fate specification)及び成熟は、正常な網膜発達を強く連想させる順序及び時間コースを辿るということを検証する。また、網膜の分化は、内因性の発達性シグナル伝達経路を操作することによって変更することができることを証明する。さらに、我々は、株間に変動があり得るものの、発達中の網膜細胞型の同一のコホート(identical cohort)がヒトiPSCから生成され得ることを証明する。眼野(eye field)、RPE、神経網膜前駆細胞、光受容体前駆体および光受容体の形態学的特徴および/またはマーカーを発現する細胞集団は、ヒトESCを使用した結果から予測される時点でヒトiPSCから分化した細胞の培養物において観察された。
ヒトESCの維持(maintenance)
ヒトESC(H9株)を、DMEM/F12 (1:1) ((Gibco #11330-065)、20%ノックアウト血清代替物(Gibco #10828-028)、0.1mM β-メルカプトエタノール、1mM L-グルタミン(Gibco #25030-081)、1%MEM非必須アミノ酸(Gibco #11140-050)、及び、4ng/mL FGF2 (Invitrogen #13256-029)を含有する。)を含んだESCMにおいて照射したMEFのフィーダー層(feeder layer)上に広げた(拡張させた)。細胞は、毎5-6日に継代され(passage)、各継代において形態的に識別可能な分化した細胞を機械的に取り除いた(回収した)。
ヒトESCは、次のように分化された。
セクション(1)及び(2)「ヒトESCの分化」に前述したように、そして、図1Bに示すように、ヒトESCは、自由浮遊性(free-floating)ヒトESC凝集体(EBs)として分化され、かつ、培養皿への付着が促されて、神経上皮ロゼット形成を可能にした。分化16日後、ロゼットを含むコロニーを機械的に除去され、ニューロスフェアとして成長された(セクション(3)「網膜前駆細胞ニューロスフェア及び前脳前駆細胞ニューロスフェアの生成」参照)。
網膜発達の眼野ステージに相応する神経上皮ロゼットが持ち上げられ、ニューロスフェアに成長されたときに、免疫細胞化学(図5A)によって示されたように、分化30日目でMitfたんぱく質の非常に均一な発現が全てのスフェアの14.7 ± 2.1%以内で観察された。qPCR分析では、Mitfの遺伝子の発現が分化第16日目から37日目までに増加したことが更に明らかになった(図5B)。
網膜発達の眼野段階に相応する神経上皮ロゼットが、上述のようにRDMにおける接着培養物として維持されして維持されるときに、多角形、色素細胞の異なるパッチが最初にヒトESCの分化の約30日目に観察された。免疫細胞化学によって示すように、これらの細胞は、RPEに関連した密接結合(タイトジャンクション)蛋白質ZO-1を発現しながらも転写因子Mitfの発現を維持した。分化の40日目で、FACS分析では、すべて接着細胞の25%がMitfを発現し、すべての細胞の77%はPax6を発現したことが明らかになった(図6C)。RT-PCR分析では、時間の経過でもこの細胞集団においてPax6の発現が維持され、かつ、より成熟したRPE関連マーカー、例えば、RPE65およびbestrophinが取得されたことが明らかになった(図6D)。
ヒトESC由来網膜前駆体細胞ニューロスフェアが長時間維持された後、ニューロスフェアは、感光体の表現型に向かって成熟した。分化の3ヶ月(合計)で、無色素性(無着色)神経網膜RPCニューロスフェアは、複数の網膜細胞種類、主に光受容体前駆体(例えば、Crx+)または光受容体類細胞(例えば、オプシン+およびリカバリン+)、及び、HuC/Dを発現し長いβΙΙΙチューブ+プロセスを有する網膜神経節細胞を生成した。
免疫細胞化学によって示すように、分化の80日の時点で、全てのニューロスフェアの19.4±す3.1%はCRX+光受容体前駆体を含んでいた(図7A)。これらのコロニー内に、全ての細胞の63.0±7.6%がCRXを発現した。さらに、CRX+細胞の大部分は、光受容体特異的タンパク質リカバリンを発現し(図7B)、そして、錐体光受容体特異的タンパク質オプシンを発現した(図7C)。
ヒトiPSCから網膜細胞型(種)の段階的誘導の可能性を知るために、我々は、4つの異なるヒトiPS細胞株に対し、上記のヒトESCの分化プロトコルを適用した。以前のレポート(Yu, J.、et al., 2007)と一致して、分化10日目においてPax6+神経外胚葉細胞(neuroectodermal cell)を生成するこれらの細胞株の能力においてかなりのばらつきが見られた。その有効性(efficiency)は、総細胞集団の約5〜56%であった。
我々は、Pax6+/RX+細胞の産生が非常に効率的であることを検証した(全ての細胞の95%がこれらの必須転写因子を共発現する)。この有効性(効率性)は、おそらく部分的には内因性BMP及びWntシグナル伝達からの影響が相対的に欠如したことによるが、それは、両方の経路が神経発生(neural specification)を拮抗することが知られているからである(Glinka, A., et al., 1998; Lamb, T.M., et al., 1993)。。 。)この理論を支持して、ヒトESC培養物において、分化後まもなく、BMP及びWntアンタゴニスト(それぞれNoggin及びDkk−1)の発現の増加が観察された。分化中のヒトESCの組換えBMP4及びWnt3aへの早期(初期)暴露は、Pax6及びRxの発現だけでなく、その後の神経上皮ロゼットの形成をも排除した。
導入
これまでの研究では、網膜の系統に向かって分化するhPSCs(hESC及びhiPSCの両方を含むヒト多能性幹細胞)の能力を検証した。しかし、これらの網膜細胞は、しばしば不明又は非網膜系細胞の混合集団内に発見される。。この特徴は、網膜内に網膜細胞型を同定するために通常用いられる特徴がしばしば中央神経系を通して共有されているため、網膜発達につながる細胞運命決定の研究を複雑化してきた。これらの細胞がhESC又はhiPSCのような多能性細胞源から得られた時に(誘導されたときに)、これらの特徴の発現だけでは、決定的な網膜の性質としてこれらを同定するには十分でない。したがって、網膜の発達、及び、それにかかわる異常を適切に研究するために、多能性網膜前駆細胞を同定し、かつ、豊富にする(即ち、濃縮する)ことが求められる。
眼胞様細胞(optic vesicle-like cell)細胞の同定、特徴付け、及び、単離
網膜発達の初期の段階において、眼胞が確立される。原始的な前脳の外転(evagination)として形成されたので、眼胞細胞は、初期の前方神経上皮と多くの特徴を共有するだけでなく、いくつか重要な違いをも有している。前述した実施例1において、我々は、網膜前駆細胞及び前脳前駆細胞の両方を含む細胞集団に向かってESC及びhiPSC含むhPSCsを分化する能力を検証した。これらの培養物におけるChx10陽性網膜前駆細胞が個々のニューロスフェアに分化する一方で、他のニューロスフェアは完全にOtx2陽性前脳前駆細胞となるように見えたのが興味深い。
神経網膜は、イベントの正確な順序で、かつ、予測された体うコースにしたがって、発達することが知られている。多能性幹細胞から個々の網膜細胞型への分化に関する研究がなかなか進まないのは、網膜内のいくつかの細胞型を同定するために使用するマーカーの多くが他の中枢神経系で発現されるからである。その理由から、典型的に多くの網膜細胞型(種)を明確に同定することはできない。
視覚系の発達を研究する能力を越えて、ここに記載した研究によって、ヒトの疾患をモデル化するためにhiPSCを使用することが可能になる。旋回萎縮(gyrate atrophy)は、神経網膜細胞の二次的な喪失をもたらす、RPEに特異的に影響を与える視覚系の異常である。この異常は、オルニチンアミノトランスフェラーゼ(OAT)をコードする遺伝子の欠損(欠如)を特徴とする。この病気を研究するとともに薬理学的スクリーニングのためのその適合性を実証するための、独自のヒトRPE系システムを開発するという目的下で、、我々は、旋回萎縮症患者由来の皮膚線維芽細胞からhiPSC株を確立した。これらの細胞は、調べた多能性関連遺伝子のすべてを表現し、これらの細胞は、マウスモデルで奇形腫(teratomas)を形成できることが確認された。
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(以下の各文献は、その全体として、参考までに本明細書に組み込まれる。)
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Claims (35)
- ヒト神経上皮系細胞の実施的に純粋な培養物であって、
(a)ヒト網膜前駆細胞、ヒト前脳前駆細胞、及び、ヒト網膜色素上皮細胞からなる群から選択された1以上のヒト神経上皮系細胞と、
(b)前記ヒト神経上皮系細胞の生存能力を維持するために必要な培地と、
を含み、前記選択された1以上のヒト神経上皮系細胞が、前記培養物に存在する細胞の90%以上を占める、培養物。 - 前記選択された神経上皮系細胞が、前記培養物に存在する細胞の95%以上を占める、請求項1に記載の培養物。
- 前記ヒト神経上皮系細胞が、胚幹細胞に由来する、請求項2に記載の培養物。
- 前記ヒト神経上皮系細胞が、ヒト網膜前駆細胞又はヒト前脳前駆細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の培養物。
- 前記ヒト網膜上皮系細胞が、ニューロスフェアの形態である、請求項1〜4に記載の何れか一項に記載の培養物。
- 前記ニューロスフェアが、前記培養物に懸濁されているが、表面に付着していない状態で維持されている、請求項5に記載の培養物。
- 前記ニューロスフェアが、表面上にプレートされた状態で維持されている、請求項5に記載の培養物。
- 前記ヒト網膜系細胞が、Chx10-陽性ヒト網膜前駆細胞である、請求項4に記載の培養物。
- 前記ヒト網膜系細胞が、Otx2-陽性ヒト前脳前駆細胞である、請求項4に記載の培養物。
- 前記培養物が、無血清培養物である、請求項1〜9にいずれか一項に記載の培養物。
- 前記ヒト神経上皮系細胞が、非胎児細胞由来に由来する、請求項1に記載の培養物。
- 前記ヒト神経上皮系細胞が、胚幹細胞、又は、誘導多能性幹細胞に由来する、請求項1に記載の培養物。
- 前記ヒト神経上皮系細胞が、ヒト誘導多能性幹細胞に由来するヒト網膜色素上皮細胞である、請求項1に記載の培養物。
- 前駆細胞型によって神経上皮系細胞を分離する方法であって、
(a)少なくとも2つの異なる前駆細胞型のニューロスフェアが形成されるまでに、懸濁液において2以上の分離した、非胎児細胞由来のヒト神経上皮ロゼットを培養するステップと、
(b)前記ニューロスフェアの1以上の形態学的特徴を観察して、前記ニューロスフェアの前記前駆細胞型を同定するステップと、
(c)前記前駆細胞型によって前記ニューロスフェアを機械的に分離するステップと、
を含む、方法。 - 前記分離したヒト神経上皮ロゼットが、ヒト多能性細胞に由来する、請求項14に記載の方法。
- 前記ヒト多能性細胞が、胚幹細胞及び誘導多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記ヒト多能性細胞が、個体の体細胞を多能性に再プログラム化することによって得た誘導多能性幹細胞である、請求項16に記載の方法。
- 前記ヒト多能性細胞が、IMR90細胞を多能性に再プログラム化することによって得た誘導多能性幹細胞である、請求項16に記載の方法。
- 前記ヒト多能性細胞が、HI系細胞及びH9系細胞からなる群から選択される胚幹細胞である、請求項16に記載の方法。
- 前記前駆細胞型によって前記ニューロスフェアを機械的に分離するステップを、前記2以上の異なる前駆細胞型のニューロスフェアが互いに凝集し始める前に行う、請求項14〜19にいずれか一項に記載の方法。
- 前記異なる前駆細胞型が、網膜前駆細胞及び前脳前駆細胞である、請求項14〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 小胞性層状形態を有すると観察された前記ニューロスフェアが、網膜前駆細胞として同定され、かつ、均一な形態を有すると観察された前記ニューロスフェアが、前脳前駆細胞として同定される、請求項21に記載の方法。
- 前記ニューロスフェアの形態学的特徴を、明視野顕微鏡を使用して観察する、請求項22に記載の方法。
- 前記2以上の分離したヒト神経上皮ロゼットを培養するステップを、網膜分化培地において行う、請求項14〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記網膜前駆細胞ニューロスフェアを前記前脳前駆細胞ニューロスフェアから機械的に分離して、網膜前駆細胞ニューロスフェアの実質的に純粋な培養物を形成する、請求項21〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記網膜前駆細胞ニューロスフェアが光受容体、神経節細胞、及び、その他の神経網膜細胞型に分化するまでに、前記実質的に純粋な培養物において前記神経網膜前駆細胞ニューロスフェアを培養するステップを更に含む、請求項25に記載の方法。
- 網膜色素上皮細胞ニューロスフェアが形成されるまでに、網膜分化培地を用いて、前記実質的に純粋な培養物において前記網膜前駆細胞ニューロスフェアを培養するステップを更に含む、請求項25又は26に記載の方法。
- 前記分離したヒト神経上皮ロゼットが誘導多能性幹細胞に由来し、そして、前記網膜前駆細胞ニューロスフェアを培養するステップをアクチビン(Activin)の存在下で行う、請求項27に記載の方法。
- 前記誘導多能性幹細胞を、個体の体細胞を多能性に再プログラム化することによって得る、請求項28に記載の方法。
- 前記培養物から前記網膜色素上皮細胞ニューロスフェアを機械的に分離して、網膜色素上皮細胞の実質的に純粋な培養物を形成する、請求項28又は29に記載の方法。
- ラミニン被覆培養皿上に前記網膜色素上皮細胞ニューロスフェアを培養するステップを更に含む、請求項30に記載の方法。
- 前記網膜前駆細胞ニューロスフェアから前記前脳前駆細胞ニューロスフェアを分離して、前脳前駆細胞ニューロスフェアの実質的に純粋な培養物を形成する、請求項21〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項25に記載の方法によって生成された、網膜前駆細胞ニューロスフェアの実質的に純粋な培養物。
- 請求項32に記載の方法によって生成された、前脳前駆細胞ニューロスフェアの実質的に純粋な培養物。
- 請求項30によって生成された、網膜色素上皮細胞の実施的に純粋な培養物。
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