KR101914580B1 - 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 포함하는 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 예방, 개선 또는 치료용 의약 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 포함하는 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 예방, 개선 또는 치료용 의약 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 줄기세포의 컨디션드 배지 분말이 뇌경색 개선에 탁월한 효과가 있어 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 예방, 개선 또는 치료에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 비침습적이고 약제학적 효과가 높은 비강을 통한 새로운 약물 전달법을 제공하는 효과가 있다.

Description

줄기세포 컨디션드 배지 분말을 포함하는 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 예방, 개선 또는 치료용 의약 조성물{Composition for preventing, improving or treating cranial nerve or spinal nerve related disease comprising conditioned medium powder from stem cells}

본 발명은 줄기세포의 무혈청 배양액을 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 개선에 사용하는 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 포함하는 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 예방, 개선 또는 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.

뇌경색은 미국에서 사망률 3위인 질환이며 뇌경색 후 생존한 사람들은 대부분 회복이 불가능한 신경학적 후유증을 안고 평생을 살아가야 한다. 현재 미국 FDA에서 유일하게 승인된 혈전용해제인 recombinant tissue plasminogen activator(rt-PA)는 뇌경색이 발생한지 3시간 이내에 투여되어야 효과가 있으며 실제 성공률은 30%에 불과하며 뇌출혈 등 합병증 발생 위험이 커 실제 환자 중에 약제를 사용할 수 있는 대상은 극히 제한적이다. 이러한 현실을 바탕으로 최근까지 뇌경색 치료를 위한 새로운 치료법이 개발 중이며 그 중 가장 각광받고 있는 분야가 바로 세포치료제이다.

세포치료제로 사용할 수 있는 세포종류는 다양하지만 크게 배아줄기세포와 성체줄기세포로 나뉜다. 배아줄기세포는 인체의 어떤 세포로도 분화되며 그 원시성으로 인해 좋은 효과가 예상되나 인간의 배아를 사용해야하므로 도덕적 및 윤리적 문제가 있는 큰 단점이 있고, 성체줄기세포는 대표적으로 골수줄기세포, 지방줄기세포, 제대혈줄기세포 등이 있으며 환자 자신의 세포를 이용할 수 있는 장점이 있는 반면 분화에 제한이 있고, 체외에서 증식시켜야 하는 단점이 있다. 하지만 윤리적, 도덕적 제한이 없어 현재까지 임상적 응용의 가능성이 큰 세포치료제로 각광받고 있다.

성체줄기세포의 일종인 치아줄기세포는 치아의 일부분인 치수의 신경 및 혈관주변에 존재하는 중간엽 줄기세포로, 최근 본 발명자는 이 줄기세포를 치아로부터 분리하여 다량으로 증식시키는 방법을 개발하였다. 또한 생체외 실험에서 증식 등의 분화능이 다른 성체줄기세포와 유사하면서 각종 단백질을 분비하는 능력 또한 탁월함이 보고되었다. 특히 치아의 치수줄기세포를 배양한 배지(이하 conditioned media, CM) 에는 치수줄기세포가 분비하는 다양한 단백질이 존재함을 밝혔으며 이중 신경보호물질과 신생혈관재생에 탁월한 혈관 내피세포성장인자 (VEGF)가 다량 함유되어 있음이 알려졌다. 이러한 물질들은 허혈성 뇌질환을 비롯한 각종 허혈성 질환에 탁월한 효능이 기대된다.

한편 줄기세포 치료제를 투여하는 방법에는 크게 병변내 직접이식과 전신적 투여방법이 있습니다. 병변내 직접이식은 줄기세포를 병변에 직접 이식하여 줄기세포의 손실을 막을 수 있으며 병변에 직접 작용하게 하는 장점이 있으나 침습적 방법으로 뇌경색 치료 시 전신마취가 필요하며 뇌에 2차적 손상을 가할 위험성이 있다. 전신적 투여방법은 정맥 또는 동맥을 통하여 줄기세포를 이식하는 방법으로 직접이식보다 훨씬 비침습적인 장점이 있으나 병변에서 멀리 떨어져서 투여함으로 체내 다른 장기(폐, 비장, 간 등)의 모세혈관총에 줄기세포가 갇혀버려 줄기세포 손실이 불가피하며 뇌-혈관 장벽을 거쳐서 뇌로 이동하는 제한 점이 있어 그 효능에 대한 의문점이 많은 형편이다. 다행히 원격에서 줄기세포를 투여하여 뇌병변에 기대되는 세포가 존재하지 않더라도 신경개선효과가 뚜렷이 관찰되는 연구가 다수 보고 되고 있어 줄기세포가 손상된 신경세포로 직접 분화하지 않더라도 각종 영양인자의 파라크린(paracrine) 효과로 인해 신경기능개선이 이루어지는 이론이 점차 힘을 받고 있다.

따라서, 비침습적이고 효과적인 약물전달법이 요구되는 실정이다.

1. 미국 공개특허 제2003-0161818호, 2003.08.28

1. Developmental Brain Research, vol.152, pp. 189-197, 2004

본 발명의 목적은 줄기세포 배양액에서 얻은 컨디션드 배지 분말의 다양한 약제학적 효능을 검증함으로써 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 예방, 개선 또는 치료적 용도로 사용하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 컨디션드 배지 분말을 이용한 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 예방, 개선 또는 치료를 위한 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 컨디션드 배지 분말을 포함하고, 상기 컨디션드 배지 분말은 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하여 얻은 배양액을 동결 건조하여 얻은 것인 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 예방, 개선 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 의약 조성물을 함유하는 용기를 포함하는 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 예방, 개선 또는 치료에 사용하기 위한 비강투여용 키트를 제공한다.

본 발명은 줄기세포의 컨디션드 배지 분말이 뇌경색 개선에 탁월한 효과가 있어 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 예방, 개선 또는 치료에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 비침습적이고 약제학적 효과가 높은 비강을 통한 새로운 약물 전달법을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 줄기세포 컨디션드 배지 분말의 뇌경색 개선 효과 검증을 위한 MCAo 실험 디자인을 도시화한 것이다.
도 2는 본 발명의 줄기세포 컨디션드 배지 분말의 뇌경색 개선 효과 검증을 위한 MCAo 모델에 대한 도면으로, (a)는 뇌에서 MCA를 막았을 때 혈관이 막히는 것을 표시한 것이고, suture가 들어가는 경로를 표시한 것이며, (b)는 suture를 넣는 위치와 혈관 진행 경로를 보여주는 그림이다.
도 3은 뇌조직을 절단하기 전 뇌경색 유도 정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 처리하기 전후의 뇌경색 부피 측정 결과를 나타낸 MRI 사진도이다.
도 5는 image J 프로그램을 이용하여 도 4의 MRI 사진에서 뇌경색이 나타난 부분을 확인하고 픽셀을 구한 결과이다.
도 6은 본 발명의 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 처리한 뇌경색 동물모델에서 TTC 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 도 6의 TTC 염색 결과를 image J 프로그램을 이용하여 뇌경색이 일어난 부분의 크기를 측정한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 처리한 뇌경색 동물모델의 EBST 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 처리한 뇌경색 동물모델의 스텝 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 처리한 뇌경색 동물모델의 몸무게를 측정한 결과이다.
도 11은 방사선이 조사된 뇌피질 신경세포에 본 발명의 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 처리한 후 세포사멸 정도를 나타낸 것이다.
도 12는 뇌피질 신경세포에 방사선을 조사한 후 본 발명의 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 처리한 후 세포의 변화를 나타낸 것이다.
도 13은 방사선이 조사된 뇌피질 신경세포에 본 발명의 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 처리한 후 세포를 이용한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명자들은 어린이의 유치(젖니)의 치수에서 유래한 줄기세포를 배양 과정에서 얻은 컨디션드 배지를 농축, 동결건조하여 분말 형태로 제조한 뒤, 뇌경색 모델에서 신경기능 개선 효과가 있는지를 실험하였다. 이를 위해, 뇌경색 동물실(suture)을 통하여 백서에 뇌경색을 유발시킨 뒤 비강을 통하여 컨디션드 배지 분말을 용해하여 일정기간 일정량을 투여하고 4주간 관찰한바 뇌경색 면적이 감소하고 탁월한 신경기능 개선효과를 확인하였다. 이를 통해 뇌경색 동물 모델(백서)에 다양한 종류의 실험물질을 전달하였다. 예컨대,

A 분말은 치수 유래 줄기세포를 기본배지인 DMEM에 10% 우혈청을 첨가하여 배양한 후 컨플루언시가 70-80%가 되었을 때 무혈청 DMEM에서 배양한 후 얻은 컨디션드 배지를 동결 건조한 것이고,

B 분말은 치수 유래 줄기세포를 기본배지인 alphaMEM에 10% 우혈청, 성장인자 및 아스코르비산을 첨가하여 배양한 후 컨플루언시가 70-80%가 되었을 때 무혈청 alphaMEM에서 배양한 후 얻은 컨디션드 배지를 동결 건조한 것이며,

C 분말은 치수 유래 줄기세포를 기본배지인 alphaMEM에 10% 우혈청, 성장인자 및 아스코르비산을 첨가하여 배양한 후, 컨플루언시가 70-80%가 되었을 때 무혈청 alphaMEM에 10% NSCM 분말(B 분말)을 첨가하여 배양한 후 얻은 컨디션드 배지를 동결 건조한 것이다.

백서에서 뇌경색 모델을 유도한 후 상기 A, B, C 분말을 비강 점막을 통하여 뇌신경에 전달될 수 있도록 하였다.

EBST(elevated body swing test), 스텝 테스트(step test), 기타 무게 측정 등을 실시하여 movement test를 실시하고, 결과 분석은 RI 촬영, TTC 염색을 이용하여 뇌경색 전후 경색부피(infarction volume)를 image J 프로그램을 이용하여 확인하였다.

인 비트로 실험은 뇌피질 신경세포(brain cortical neuron)을 사용하여 방사선 조사를 통해 뇌손상을 유발하여 세포사멸단계에 이르게 한 후 A, B, C 분말을 처리하여 사진 분석, 세포 수 측정 및 웨스턴 블랏을 통한 정량분석을 실시하였다(도 1 참조).

그 결과, 뇌경색 모델에서 MRI 및 TTC 염색을 통해 유치(젖니) 치수 줄기세포 컨디션드 배지 분말은 뇌경색 개선에 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었고, 신경학적 테스트(neurobehavior test)에서 신경학적 행동이 나아지는 것을 알 수 있었으며, 뇌세포에서도 동일한 효과를 나타내었다.

또한, 직접 주입, I.P., I.V.가 아닌 비강을 통하여 처리하는 방법이 훨씬 비침습적이며 효과가 더 좋음을 알 수 있었다.

또한, 상기 A, B, C 컨디션드 배지 분말에 있어서 A 보다는 C가, C 보다는 B 분말이 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 기능 개선에 효과가 뚜렷하였다. 상기 C 분말은 줄기세포의 무혈청 배지에서 배양 시 B 분말을 첨가한 것으로, B 분말의 첨가에 따른 배지 내 기아 상태가 어느 정도 상쇄되는 환경이 제공되어 성장인자, 사이토카인 등의 유효성분이 배지 내로 B 분말에 비해 적게 나온 것으로 생각된다. 따라서, 뇌경색 모델에서 개선 효과가 B 분말에 비해 낮은 것으로 생각된다.

따라서, 본 발명은 컨디션드 배지 분말을 포함하고, 상기 컨디션드 배지 분말은 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하여 얻은 배양액을 동결 건조하여 얻은 것인 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 예방, 개선 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.

본 발명의 컨디션드 배지 분말은 줄기세포를 적정한 배지 및 조건에서 배양한 후 유효성분을 포함한 컨디션드 배지(무혈청 배지 배양액)를 동결 건조하여 사용하는 것을 특징으로 한다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 컨디션드 배지 분말은 줄기세포의 무혈청 배지 배양액인 컨디션드 배지 분말 내에 유효성분을 다량 함유함으로써 상기 분말이 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 예방, 개선 또는 치료에 뛰어난 효과를 갖도록 할 수 있다.

상기 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환은 뇌경색, 뇌졸중, 뇌염증성 질환, 뇌내상, 뇌외상, 알츠하이머병, 파킨슨병, 우울증, 간질, 다발성경화증 또는 조증 등 일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 컨디션드 배지 분말의 제조방법은 보다 구체적으로 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하여 얻은 배양액 즉, 컨디션드 배지를 동결 건조하여 얻을 수 있다.

본 명세서에서, "컨디션드 배지(conditioned medium)"란 줄기세포를 세포분열 최성기인 대수성장기에 도달했을 때 무혈청 배지로 교환한 후 배양액만 수거한 배지를 말한다. 이는 분열중인 줄기세포로부터 배지 내에서 추출되어 나오는 미지의 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine)을 이용하는 것을 말한다. 일 구체예에 따르면 상기 컨디션드 배지는 치수 유래 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양한 후 치수 유래 중간엽 줄기세포를 제거한 용액을 포함하는 것으로서, 치수 유래 중간엽 줄기세포에서 유래한 성장인자, 사이토카인 등의 물질이 풍부하게 함유되어 있을 수 있다.

상기 줄기세포는 인간의 배낭, 태반, 제대, 제대혈, 피부, 말초혈액, 골수, 지방, 근육, 간, 신경조직, 골막, 태아막, 활액막, 활액, 양막, 반월상연골, 전십자 인대, 관절 연골세포, 유치, 혈관주위세포, 지주골, 슬개골하 지방괴, 비장 및 흉선을 포함한 간엽 줄기세포가 존재하는 조직으로부터 분리 및/또는 배양된 간엽 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 줄기세포는 다음의 특성을 나타내는 치수 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있다:

(a) CD90, CD105, CD44 및 CD73 에 대하여 모두 양성의 면역학적 특징을 나타내고, (b) 세포 배양 접시에 부착되어 성장하며, 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내며, (c) 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서, "중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)"라 함은 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등을 만드는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등에도 존재하며, 이들로부터 수득할 수 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 중간엽 줄기세포는 치수 유래의 중간엽 줄기세포를 의미한다.

본 발명에서 "분화(differentiation)"란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 다능성 중간엽 줄기세포는 계통이 한정된 전구세포(예컨대, 중배엽성 세포)로 분화한 후, 다른 형태의 전구세포로 더 분화될 수 있고(예컨대, 골모세포 등), 그 뒤 특정 조직(예컨대, 뼈 등)에서 특징적인 역할을 수행하는 말기 분화세포(예컨대, 지방세포, 골세포, 연골세포 등)로 분화될 수 있다.

또한, 상기 무혈청 배지는 혈청을 포함하지 않는 초기단계 세포배양을 위한 배지로서 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지라면 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), aMEM(alpha Minimal essential Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute medium) 등을 사용할 수 있다.

상기 무혈청 배지는 상기 배지에 성장인자 또는 사이토카인을 더 포함할 수 있다.

상기 성장인자로 IGF, bFGF, TGF, HGF, EGF, VEGF 또는 PDGF 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 사이토카인으로 IL-1, IL-4, IL-6, IFN-γ, IL-10 또는 IL-17 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 컨디션드 배지는 세포를 25 내지 40 ℃에서 1 내지 3일간 무혈청 배지에서 배양하여 제조할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

일 구체예에 따르면, 줄기세포를 이용하여 컨디션드 배지를 제조하는 단계는

분리된 유치(젖니), 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸 유래의 세포를 혈청 함유 배지에서 계대배양하여 치수 유래의 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계; 및

상기 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 중간엽 줄기세포는 유치(젖니), 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸 내에 존재하는 세포 중에서 정제과정을 거쳐 수득할 수 있으며, 각 조직의 특성에 따라 줄기세포를 추출하는 과정은 공지의 방법을 사용할 수 있는 당업자의 주지의 사실이며, 현재는 인간 유래의 중간엽 줄기세포를 연구용 목적으로 사용 가능한 세포주를 판매하고 있어 쉽고 용이하게 중간엽 줄기세포를 얻을 수 있다.

중간엽 줄기세포의 배양 과정과 관련하여 필수적으로 포함되는 과정들은 문헌들을 통해 공개되어 있으며, 세포배양에 앞서 공지의 방법을 통해 공급원으로부터 추출한 생검 즉, 유치(젖니), 치수, 치주인대, 치조골, 치근단 또는 잇몸 등은 일반적인 항생제를 포함한 세척배지를 이용한 반복적인 세척과정을 통해 후속배양에서의 오염 가능성을 최소한으로 감소시킬 수 있다.

혈청을 포함한 초기단계 세포배양을 위한 배지는 중간엽 줄기세포와 같은 세포형을 유지하고 보관하는데 적합한 목적의 배지인 것이 좋다. 본 발명에서는 일반적으로 세포배양에 사용하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), aMEM(alpha Minimal essential Medium)을 사용하고, 세포배양에 통상적으로 사용되는 혈청을 포함한다.

혈청은 0.1 내지 20％의 우태아혈청(FBS)을 첨가하는 것이 좋고, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가하는 것이 좋다.

항생제로는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 폰지존(fungizone) 등의 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있다. 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있다.

필요에 따라 글루타민 등의 산화영양소와 소듐 피루베이트 등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.

초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90 내지 95％, 온도 25 내지 40℃, 5 내지 10％ CO₂ 배양기에서 배양하고, 5 내지 10％ CO₂ 배양 시에는 최종농도가 0.17 내지 0.22 중량％가 되게 소듐 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해줄 수 있다.

초기배양 단계 동안 조직단편은 배양 용기 바닥에 부착된 상태를 유지시키는 게 바람직하며, 세포 배양의 표준 기술에 따른 트립신-EDTA 처리로 인한 짧은 자극으로 성장을 촉진할 수 있다.

누적집단배증시간(doubling time)은 플라스크 내 배양중인 세포가 70 내지 80％ 합류(confluence) 때까지 유지하고 바람직하게는 75％ 합류시기에 세포를 채취하여 계대배양을 한다.

상기 단계 배양된 치수 유래의 줄기세포를 무혈청 배지에서 25 내지 40 ℃에서 1 내지 3일간 배양하여 컨디션드 배지를 제조한다.

상기 컨디션드 배지를 6 내지 10 시간 동안 동결 건조하여 본 발명의 컨디션드 배지 분말을 얻을 수 있다.

본 발명의 컨디션드 배지 분말은 유효성분이 고농축으로 존재할 수 있으며, 예컨대, Decorin, MCP-1, DKK-3, TIMP-2, Angiogenin, Follistatin, Osteoprotegerin, betaIG-H3, MMP-10, MMP-7, LYVE-1, XEDAR, IL-22, RANK, IGFBP-6, Axl, FLRG, NRG1-beta1, PAI-1, Ferritin, Galectin-7, Resistin, Bate2 M, TSLP, VEGF-C, CD40, sTNT R1, IL-6, TRAIL R2, Osteopontin, TIMP-1, Growth Hormon, Thromboppoietin, CXCL-16, DPPIV, HVEM, IL-17B, IL-3, bFGF, IFN-γ, TGF, HGF 또는 PDGF 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 예방, 개선 또는 치료용 의약 조성물은 줄기세포가 분비하는 활성 단백질 복합물을 함유함으로써 줄기세포를 사용할 때 나타날 수 있는 면역학적 문제점, 안전성에 대한 문제점, 제제학적 문제점, 개체 편차를 최소화 할 수 있다. 또한 인체 내 세포 주입으로 인하여 발생할 수 있는 부작용을 근본적으로 방지할 수 있다.

본 발명의 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 예방, 개선 또는 치료용 의약 조성물은 투여를 위해 필요한 제제의 형태에 따라 다양한 형태의 약제학적으로 허용되는 담체와 친밀히 혼합될 수 있다.

상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제,향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 의약 조성물은 바람직하게는 단위 투여량 형태일 수 있으며, 의사의 판단에 따라 투여량을 조절하여 사용할 수 있도록 희석하여 사용하는 것이 가능한 형태를 취할 수 있다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 비강 주사를 위한 것이다. 그러나 본 발명의 구체예에서, 상기 조성물은 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해서도 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물을 주사용 제제로 제제화하기 위해 사용되는 주사용 완충액 및 기타 보조제 성분은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 조성물에 대한 주사용 제제는 주사용 완충액 외에, 예를 들어 용해보조제, pH 조정제, 현탁제 등의 기타 보조제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 주사용 완충액은 생리식염수 등을 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 의약 조성물을 함유하는 용기를 포함하는 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 예방, 개선 또는 치료에 사용하기 위한 비강투여용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 비강투여용 키트는 주사용 완충액을 함유하는 용기를 추가로 포함할 수 있다.

비강의 점막은 후각신경세포와 연결되어 있고 후각신경세포는 뇌에서 직접 지시하는 바 비강을 통하여 본 발명의 의약 조성물을 투여하는 방법은 비침습적이면서도 뇌병변으로 약물을 보다 많이 투여할 수 있고, 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 치료적 효과가 높은 특징이 있다. 이는 기존의 직접 주입, I.P 또는 I.V. 투여방법에 비해 훨씬 비침습적이고 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 치료적 효과가 높은 특징이 있다.

상기 키트에서 사용되는 용기는 예컨대, 본 발명의 의약 조성물을 담고 있고 밀봉가능한 유리 또는 플라스틱 용기일 수 있다. 본 발명의 의약 조성물을 담기 위한 것이면 족할 뿐 특별한 형태를 요구하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 함유하는 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환의 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 의약 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다.

본 발명에 기술된 뇌신경 또는 척수신경 관련 질환 치료방법은 상기 기술된 의약 조성물을 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 투여량은 증상의 경중도, 환자의 나이, 체중 등에 따라 조성물의 투여량을 결정할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물의 투여량은, 비강투여형 제형인 경우 성인 기준으로 0.1∼100 ㎎/kg의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있으며, 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1일당 1.0 내지 3.0 mL의 양으로 1일 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 의약 조성물은 바람직하게는 1회 투여 시 0.5 내지 2mL의 주사용 완충액 중에서 혼합하여 용해시켜 사용할 수 있다. 바람직하게는, 별도의 바이알에 담긴 주사용 완충액에 용해시켜 사용할 수 있도록 본 발명의 의약 조성물, 기타 보조 성분은 따로 밀봉 포장되어 제공될 수 있으며, 투여 전 의사가 환자의 증상에 따라 투여량을 결정하여 투여량만큼 용해시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 쉽게 결정될 수 있으며, 사용되는 특정 활성 성분, 투여의 방식, 제제의 효과 및 질환 상태의 발전에 따라 변화할 수 있을 것이다. 또한, 환자의 나이, 체중, 식이 및 투여의 시간을 포함한 치료받는 환자 개개인의 인자들에 따라 적절한 치료적 수준에 따른 투여량 조절이 필요할 것이다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 유치 치수 줄기세포의 수득

어린이 유치(젖니)의 치수 줄기세포는 치아 발치 시 공여되는 치아에서 분리하였다. 치아에서 치수를 회수한 다음 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로써 암포테리신 B가 보충된 a-MEM배지 10mL에 콜라게네이즈(3mg/mL) 및 디스페이즈(4mg/mL)를 첨가하여 치수에 처리하여 약 90%의 습도 및 약 37℃ 온도 조건하에서 5% CO₂ 배양기에서 한 시간 반응 시켰다. 반응이 끝난 조직을 70㎛의 스트레이너에 통과시켜서 세포를 수득하였다.

실험에 사용될 컨디션드 배지 분말을 제조하기 위해,

NSCM-DMEM(A 분말)은 상기에서 얻은 치수 유래 줄기세포를 기본배지인 DMEM, 10% 우혈청에서 배양한 후 컨플루언시가 70-80%가 되었을 때 DMEM에서 48시간 배양 후 얻은 컨디션디 배지를 8시간 동안 동결 건조하여 컨디션드 배지 분말을 얻었다.

NSCM-alphaMEM(B 분말)은 상기에서 얻은 치수 유래 줄기세포를 기본배지인 alphaMEM에 10ng의 bFGF, 50㎍의 아스코르비산, 10% 우혈청이 첨가된 배지에서 배양한 후 컨플루언시가 70-80%가 되었을 때 상기 배지에서 우혈청을 뺀 무혈청 배지에서 48시간 배양 후 얻은 컨디션드 배지를 8시간 동안 동결 건조하여 컨디션드 배지 분말을 얻었다.

NSCM-CM(C 분말)은 상기에서 얻은 치수 유래 줄기세포를 기본배지인 alphaMEM에 10ng의 bFGF, 50㎍의 아스코르비산, 10% 우혈청이 첨가된 배지에서 배양한 후 컨플루언시가 70-80%가 되었을 때 상기 배지에서 우혈청을 뺀 무혈청 배지에 10% NSCM 컨디션드 배지 분말(B 분말)을 첨가하여 48시간 배양 후 얻은 컨디션드 배지를 8시간 동안 동결 건조하여 컨디션드 배지 분말을 얻었다.

치수 줄기세포의 배양은 약 90%의 습도 및 약 37℃ 온도 조건 하에서 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

치수 줄기세포의 무혈청 배지에서 배양 시 줄기세포 유혈청 배양액을 제거한 플라스크를 인산완충용액으로 세척하고 0.25% Trypsin-EDTA(GIBCO)로 세포를 떨어뜨린 후 세포 부유액을 원심분리 한 다음, 세포수 측정과 생존능을 검사하였다.

계대배양에 사용한 배지는 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 또는 항진균제로써 암포테리신B가 보충된 a-MEM 배지였다.

무혈청 배지에서 배양한 줄기세포의 컨플루언시가 약 70∼80%가 되었을 때 파이펫을 사용하여 배양된 배양물로부터 배양액을 제거한 후, 인산완충용액으로 2회 세척하였다.

<실험예 1> 뇌경색 모델에서 컨디션드 배지 분말의 약제학적 효능 검사(MCAo)

300-320g의 랫트를 주문하여 동물 사육실에서 1주일 정도 안정을 하고, 몸무게를 측정하여 320g 에 맞추어서 MCAo 수술을 실시하였다.

흡기 마취를 시행한 후 목 부위의 정중선을 따라 2cm 정도 절개를 하고, 왼쪽 총경동맥, 외경동맥, 내경동맥 그리고 후교동 동맥을 미주신경이 손상되지 않도록 조심하면서 노출시킨 후, 먼저 총경동맥과 외경동맥 그리고 후교동 동맥의 말단부위를 관찰하고 내경동맥의 말단부위는 micro clip으로 결찰한 후, 외경동맥의 혈관벽에 가위를 이용하여 작은 구멍을 만들었다. 4-0 silk suture를 clip을 제거시키면서 작은 구멍을 낸 외경동맥으로부터 내경동맥을 통하여 중뇌동맥을 막을때까지 천천히 밀어 넣었다. 수술은 두 가지로 나뉘게 되는데, 하나는 일반적인 MCAo 수술로, suture를 넣었다가 60-90분 뒤 빼내서 뇌경색 모델을 만드는 것과 suture를 넣어서 고정시켜 뇌경색 모델을 만드는 것이다(본 발명의 pMCAo 모델). 일반적인 MCAo 모델보다는 염증의 크기가 크고 확실하게 된다는 점이 장점이지만 단점으로 실험군이 잘 죽을 수도 있다는 단점이 있어 pMCAo 수술인 suture를 넣어서 실험을 하였고, 각 실험군의 개체수를 늘려서 실험을 하여 평균적으로 그 효과를 확인하였다.

도 2는 MCAo 모델에 대한 그림으로 (a)는 뇌에서 MCA를 막았을 때 혈관이 막히는 것을 표시하였고, suture가 들어가는 경로를 표시한 것이며, (b)는 suture를 넣는 위치를 표시하고 동물을 눕혔을 때 혈관 어느 쪽으로 들어가는지를 확인할 수 있는 그림을 나타낸 것이다.

위와 같은 형식으로 suture를 넣고 suture 는 나일론에 실리콘으로 봉을 만들어서 파는 규격이 정해져 있는 것으로 하여 최대한 일관성을 가지게 실험을 하였다. sham 모델로는 MCAo 수술을 하지 않은 동물 모델 1마리, 대조군 모델은 MCAo 수술을 하고 실험물질을 투입하지 않은 실험군, A, B, C는 각각의 실험물질을 투여한 실험군, 그리고 실험물질을 PBS에 용해시켜 주입하므로 실험물질 대신 PBS만 처리한 군으로 하여 6개의 그룹으로 나누었다.

(컨디션드 배지 분말의 비강내 전달)

뇌경색 유도 후 48 내지 72 시간 정도의 안정화를 시키면서, 이때 동물의 상태를 확인하면서 보호하고, 72시간이 지난 후 신경학적 테스트 및 movement 테스트를 하고 난 다음 각 군별로 분말을 투입하였다. 분말을 투입할 때 흡기 마취를 아주 약하게 시킨 다음 뇌경색을 만든 쪽의 비강을 통하여 10㎕을 주사하고 다시 흡기마취를 시켜서 2분 뒤 주사하는 방식으로 투여를 하였다. 분말 투입은 매일 하여 10일 동안 하고, 투여방법은 비강를 통하여 헤밀턴 마이크로 시린지를 이용하여 10㎕씩 10번 나누어 투입하였다. movement 테스트는 1, 5, 10, 17, 24, 31, 38일로 7번 하게 되며 38일이 지난 후 뇌를 적출하여 슬라이스로 TTC 염색을 하여 염증의 변화를 알아보고 결과를 확인하였다.

(경색 부피 측정, infarction volume)

뇌허혈의 확인과 부피측정을 위하여 38일이 지난 동물들의 뇌에 PBS를 관류시킨 다음 뇌만 적출하였다. 적출시킨 뇌는 곧바로 rodent brain matrix에 고정을 시킨 후 2mm 두께로 관상 절단(coronal section)을 시행하여 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC. T-8887, Sigma chemical) 용액에 침지하여 37℃의 수조에서 30분 정도 침지하였다. 그 다음 10% 포르말린에 고정을 시키고, 조직을 크기 별로 슬라이드에 올려 스캐너를 이용하여 스캔하였다. 스캔한 그림을 image J 프로그램을 이용하여 뇌경색의 부피를 계산하였다.

두 번째 실험방법으로 pMACo 뇌경색 동물모델을 제작하여 하여 72시간 뒤 한국기초과학연구소 오창분소(KBSI)에서 동물용 MRI 9.4T를 이용하여 MRI을 T2 image를 찍었다. 이때에도 동물은 흡기 마취 상태에서 온도와 맥박을 확인하며 MRI를 찍었다. 그리고 각각의 실험물질을 정해진 프로토콜에 따라 투여한 후, 38일 경과 시 한번 더 MRI를 찍어서 뇌경색 부피를 확인하였다. 실험물질 투여 전후 촬영된 MRI 사진을 가지고 image J 프로그램을 이용하여 뇌경색이 일어난 뇌의 부피를 계산하였다.

(신경학적 행동 테스트, Neurobehavior test)

1. EBST

정상적인 실험동물의 경우는 꼬리를 잡고 지면에서 15cm 정도 들면 몸을 양쪽으로 비틀면서 머리를 들어 올라 오려고 하는 현상을 보이는데, 뇌허혈성 모델의 경우는 뇌허혈이 유발된 부분의 반대방향으로 꼬아서 올라오며(C-shped lateral bending of the body) 앞발이나 뒷발이 굴곡을 취하는 현상을 보였다. 이 현상을 보고 왼쪽과 오른쪽으로 나누어서 20번 중 몇 번이나 오른쪽이나 왼쪽으로 움직이는지를 관찰하여 그 차이를 보는 테스트이다.

2. 스텝 테스트(STEP test)

이 테스트는 정상군일 경우 꼬리를 잡고 앞발을 지면에 붙은 상태에서 양 옆으로 꼬리를 움직이게 되면 양 발을 같이 쓰면서 옆으로 걷는 현상을 보이게 되는데 뇌허혈 모델의 경우 뇌허혈이 유발된 반대부분의 발을 잘 쓰지 못하여 옆으로 움직일 때 잘 움직이지 못하고 끄는 현상을 보이게 된다. 이 현상을 보고 옆으로 움직일 때 20번의 발구름 중에 오른쪽 앞발과 왼쪽 앞발이 몇 번씩 움직이게 되는지를 관찰하여 그 차이를 보는 테스트이다.

(방사선 조사 손상 세포 모델을 이용한 인 비트로 연구)

치수 줄기세포 컨디션드 배지 분말이 세포 수준에서 어떠한 변화를 가지는지 알아보기 위해, 세포는 뇌피질 신경세포(cortical neuron)를 사용하였다. 뇌피질 신경세포를 씨딩(seedin)한 후 안정화를 시키고 세포 수를 파악한 다음 세포에 MCAo 와 같은 효과를 주기 위해 방사선 조사(3Gy)를 실시하였다. 그 이후 6시간 후 완충용액을 DMEM 그리고 치수줄기세포 컨디션드 배지 분말을 넣은 후 24시간 후 세포 사멸 개수 및 각 세포의 형태와 세포들에서 BCL-2의 발현을 보았다. BCL-2의 발현을 보는 것은 사멸이 일어난 후 분말 처리 효과를 보기 위해 하는 것이다. 뇌피질 신경세포 씨딩은 주문하여 사용하기에 주문한 회사(neuromix)의 프로토콜을 따랐다. 방사선 조사는 6-웰에서 일반적으로 전체적인 세포에 방사선이 골고루 퍼질 수 있도록 하여 실험하였다.

(웨스턴 블랏)

상기 세포(1×10⁴)를 50mL의 라이시스 버퍼(50mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% 디옥시콜산 소듐염, deoxicholic acid sodium, 1% Triton X-100)에 30분 동안 상온에서 인큐베이션 한 후, 소니케이터(sonicator)로 세포를 파쇄한 후, 원심분리(1,2000 g, 3분)한 후 상등액을 얻었다. 상등액을 IntRON protein assay kit으로 BCA 정량을 하였다. 앨리쿼트(Aliquots)된 단백질(50㎍)의 Bcl-2에 대한 웨스턴 블랏 분석은 12% SDS-PAGE 로 하였다. 이때 β-튜불린을 하우스 키핑 유전자(house keeping gene)로 비교 분석하였다. PDVF 멤브레인에 젤 트랜스퍼(gel transfer)를 한 후에, 5% 스킴밀크로 1시간 상온에서 블로킹하였다. 블로킹 후 각각 Bcl-2에 대한 토끼 다클론성 항체(1:1,000), β-튜불린에 대한 토끼 다클론성 항체(1:4000)에 대한 1차 항체를 4℃에서 오버나이트 동안 반응시켰다. 1차 항체를 붙인 후 TBST 1X로, 1 시간 세척하였다. 각각 Bcl-2 및 β-튜불린에 대한 토끼 IgG에 대한 염소 다클론성 2차 항체(Bcl-2의 경우 1:10,000, β-튜불린의 경우, 1:20,000)를 희석하여 반응시켰다. 이 후 1시간 TBST 1X로 세척 후 ECL+ 검출 키트를 사용하여 검출 반응 후 필름(Agfa)에 노출하여 현상하였다.

(Image J program protocol)

NIH의 프로그램을 Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA(Http://imageJ.nih.gov/ij 에서 다운받아 사용하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 뇌경색 모델에 분말을 처리한 후 38일째가 되어 테스트를 완료한 후 PBS로 퍼퓨전(perfusion)하여 뇌를 적출하여 보았을 때 뇌경색이 심하게 일어나게 되면 뇌의 한쪽이 무너져있는 모양을 볼 수 있었다. 즉, 뇌를 적출하였을 때 외부적으로 얼마나 큰 부위가 뇌경색이 일어났는지를 볼 수 있었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 한국기초과학연구소 동물MRI 9.4T를 이용하여 분말처리하기 전과 분말 처리 후 분말의 효과를 본 결과, 대조군과 비교하여 분말을 처리한 군이 뇌경색 범위(infarction volume, 흰색)이 탁월하게 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, image J 프로그램을 사용하여 뇌경색이 일어난 범위를 측정한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 무처리군에 비해 C 분말을 처리한 군에서 분명 뇌경색 범위가 줄어든 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, 각 실험동물에 대해 TTC 염색을 실시한 결과, sham 군은 뇌경색 동물군을 만들 때 suture를 넣지 않고 혈관은 묶지 않은 채 외관상의 수술만 한 모델이고, 대조군 모델은 MCAo 수술을 한 후 38일 동안 분말 치료를 하지 않고 실험한 모델이며, A, B, C실험군은 각각의 분말을 투여하여 효과를 나타낸 모델이고, PBS는 분말 대신 PBS만 주입한 후 실험한 동물로, sham은 당연히 MCAo 수술을 하지 않은 실험군 이기 때문에 염색이 진하게 되어있고, 하얀부분인 뇌경색이 일어난 부분이 없는 것을 확인할 수 있었으며, 대조군은 거의 반 정도의 염증이 있는 것을 확인할 수 있었다. A, B, C 실험군에서 염증이 줄어들거나 색깔이 강해지면서 다시 회복되는 것이 보였다.

상기 결과를 토대로 image J 프로그램을 이용하여 뇌경색이 일어난 부분의 크기를 확인한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, PBS(Vehicle)군 보다는 A, B, C분말을 투여한 군에서 좋은 결과를 보였고 그 중 B, C 분말에서 더 좋은 결과를 보였으며 특히 B 분말에서 그 효과가 탁월하게 나타났다.

다음으로, 상기 결과로부터 줄기세포 컨디션드 배지 분말이 뇌경색에 효과적임을 확인하였고, 신경학적 행동 테스트를 통해 신경학적 기능을 개선하는 지 확인하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 왼쪽의 그래프에서 17일째 분말 치료효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었고, 통계적 유의성으로 31일째와 38일째에서 B, C분말 처리군에서 통계적인 유의성을 가지는 것을 알 수 있었다.

이로부터 알 수 있듯이, 신경학적 행동 테스트에서 EBST의 결과는 분말 처리가 끝나고 난 후 일주일이 지나면 효과가 나타난다는 것을 나타내고 있다.

각 실험군별 스텝 테스트 결과는 도 9에 나타내었으며, 24일째 확연하게 줄어드는 것을 알 수 있었다. 통계학적 유의성으로 24일째에 있어서 대조군에 비해 A, B, C 분말 처리군에서 확연하게 통계학적 유의성을 가지는 것을 알 수 있었다.

스텝 테스트에서도 분말 처리가 끝난 후 2주 후에 신경학적 행동 결과가 좋아지는 것을 알 수 있었다.

도 10은 각 실험군별로 몸무게를 조사한 것으로, 뇌경색 모델이 정상적으로 이루어져서 1일째가 되던 날부터 체중이 줄어드는 것을 확인 할 수 있었다. MCAo 수술을 하지 않은 모델인 sham 모델에서는 다른 군에서와 달리 체중이 줄어들지 않는 것으로 보아 MCAo 모델이 성공적으로 만들어짐을 알 수 있었다.

다음으로, 상기 MCAo 동물실험 결과에서 치수 줄기세포 유래 컨디션드 배지 분말의 효과를 확인한 후, 뇌세포에서도 이러한 효과가 나타나는지 인 비트로에서 확인하였다. 방사선 조사는 뇌경색과 비슷한 효과를 가질 수 있어 이러한 손상을 세포에 가한 후 하나는 DMEM이라는 세포의 완충용액만을 바꾸어 주고 하나는 분말을 처리하였고, 방사선을 조사하지 않은 것을 대조군으로 하였다.

도 11은 뇌피질 신경세포을 사용하여 방사선 조사 후 6시간이 지나 각 분말을 처리한 후 24시간 뒤 세포의 사멸 정도를 확인한 것으로, 대조군을 100%로 보았을 때 DMEM을 처리한 것과 C분말을 처리한 것에서 방사선 조사 후 세포의 수에서 차이가 남을 알 수 있었다.

상기 결과로부터 방사선 손상에 있어서 대조군과 비교하였을 때, 치수 줄기세포 컨디션드 배지 분말을 처리한 세포에서 세포가 사멸하지 않고 매우 효과가 좋아짐을 알 수 있었다.

뇌종양 환자중 특히 소아 뇌종양 환자의 경우 방사선 치료 시 기존 정상 세포의 사멸로 인지장애 등 각종 부작용을 야기하고 있어 본 발명의 분말은 이를 예방할 수 있을 것으로 생각된다.

도 12는 방사선 손상을 가하고 나서 각 분말을 처리한 후 세포의 변화를 나타낸 것으로, 세포의 수상돌기(dendrite)들이 방사선을 조사하고 나면 세포사멸단계로 진행되는데 분말을 처리하고 나면 세포사멸이 줄어들고, 수상돌기들이 매우 잘 뻗어있는 것을 볼 수 있었다. 검은색 화살표를 보면 DMEM을 처리한 세포들 보다 C분말을 처리한 세포들이 훨씬 세포들의 뭉쳐짐이나 수상돌기들이 깨끗하게 뻗어있음을 알 수 있다.

상기 효과의 정량적 분석을 위해 웨스턴 블랏을 실시하였다. Bcl2를 사용한 것은 항-세포사멸 효과를 보기 위한 것이다. 도 13에 나타난 바와 같이, 대조군은 당연히 세포사멸이 일어나지 않았기 때문에 Bcl2(25kD)가 많이 발현되지 않으나, 방사선 손상을 가한 후 DMEM 과 C분말을 처리한 군에서는 Bcl2 가 많이 발현되었다.

또한, C 분말을 처리한 군에서 수상돌기들이 훨씬 많이 나오는 것을 확인하고, image J 프로그램을 이용하여 그래프로 나타내면 도 13b와 같다.

결과적으로, 세포실험 결과도 동물실험과 같이 치수줄기세포를 이용한 분말을 처리한 군에서 뇌경색에 대한 치료적 효과가 높음을 알 수 있었으며, 이로부터 뇌의 세포사멸을 치료할 수 있을 것으로 생각된다.

Claims (10)

1. 컨디션드 배지 분말을 포함하고,
   상기 컨디션드 배지 분말은 치수 유래 줄기세포를 성장인자 및 아스코르비산이 첨가된 혈청 배지에서 배양한 다음 무혈청 배지에서 추가 배양하여 얻은 제1배양액을 동결 건조하여 얻거나,
   치수 유래 줄기세포를 성장인자 및 아스코르비산이 첨가된 혈청 배지에서 배양한 다음 상기 제1배양액이 첨가된 무혈청 배지에서 추가 배양하여 얻은 제2배양액을 동결 건조하여 얻은 것인, 뇌경색의 예방, 개선 또는 치료용 의약 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서,
   성장인자는 IGF, bFGF, TGF, HGF, EGF, VEGF 및 PDGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 뇌경색의 예방, 개선 또는 치료용 의약 조성물.
   
7. 삭제
8. 제1항에 있어서,
   배양은 25 내지 40 ℃에서 1 내지 3일간 실시하는, 뇌경색의 예방, 개선 또는 치료용 의약 조성물.
   
9. 제1항의 의약 조성물을 함유하는 용기를 포함하는 뇌경색의 예방, 개선 또는 치료에 사용하기 위한 비강투여용 키트.
   
10. 제9항에 있어서,
    주사용 완충액을 함유하는 용기를 더 포함하는, 뇌경색의 예방, 개선 또는 치료에 사용하기 위한 비강투여용 키트.
    

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