PT97111B - Processo para a obtencao de plantas ou de orgaos de plantas transgenicas contendo quantidades intensificadas de fitase - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 97111

REQUERENTE: GIST-BROCADES N.V., holandesa, industrial e canereial, can sede em Uateringseweg 1, ΡΌ. Booc 1, 2600 MA Delft, Países Baixos e de M3GEN International N.V., holandesa, industrial e comercial, com sede em Einsteinweg, 97,2333 CB LEIDEN, Países Baixos.

EPÍGRAFE: "PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE PLANTAS TRANSGENICAS

OCNTENDO QUANTIDADES INTENSIFICADAS DE FITASE"

INVENTORES: Jan Pen, Andreas Hoefcenn, Peter Christiaan Sijmons,

Krijn Rietveld, Teunis Comei is Venfoerd e Albert J.J. van Ooyen

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Países Baixos de 23 de Março de 1990 e em 21 de Setenbro de 1990, sob os números de série 498,561 e 586, 765

INPI. MOD. 113 R f 18732

Descriç:So r eferente à patente, de invenção de GIST-BROCADES N.V., holandesa, industrial e comercial, com sede em Wateringseweg 1, P.O. Box 1, 2600 MA Delft, Paises Baixos e de MCGEN International N.V., holandesa, industrial e comercial, oorn sede em Einsteinweg, 97, 2333 GB L.EIDEN, Paises Baixos (inventores: Jan Pen, Andreas Hoekerna, Peter Ghristiaan Sijrnons, Krijr> Rietveld, Teunis Cornelis Verwoerd e Alhert J.J. van Ooyen residentes na Holanda), para "PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE PLANTAS 00 DE ORGÃOS DE PLANTAS TRANSGÊNICAS CONTENDO QUANTIDADES; INTENSIFICADAS DE FITASE"

DESCRIÇÃO

Campo cia Invenção

A presente invenção refere-se à produção de fitase em plantas transgénicas e à utilização da fitase assim produzida ern processos industriais.

En q u a d r a rn en to G e r a .1.....da Invenção fósforo e urn elemento essencial para o desenvolvimento de todos os organismos. Na produção animal, a alimentação deve ser suplementada com fósforo inorgânico a firn de se obter urn born comportamento de crescimento de animais monogástricos (por exernplo, porcos, aves de capoeira e peixes).

1. -

Em contraste, nao é preciso adicionar fosfato inorgânico aos alimentos ruminantes. Os mi.croorgani.s-mos presentes no rurnen produzem enzimas gue catalizarn a transformação de fitato (rnio-inositol-hexaquis-fosfato) com obtenção de inositol e de fosfato inorgânico.

fitato ocorre como fonte de armazenagem de fósforo em praticamente todas as substâncias alimentares derivadas de plantas (para uma revisão do assunto, veja-se "Phytic acid, chemistry and applications", Ed- Graf, Pilatus Press, Minneapolis, MN, Estados Unidos da America (1986))- 0 fitato constitui 1 a 3% de todas as nozes, cereais, legumes, sementes oleosas, esporos e pólen. Os sais complexos de ãcido fitico sao designados fitina. 0 ácido fitico é considerado um factor antinutricional porque actua como agente quelante de substâncisa minerais tais como cálcio, zinco, magnésio, fer.....

ro, e pode também reagir corno proteínas, diminuindo desta forma a biodisponibilidade de proteínas e de sais minerais nutricionalmente importantes.

U fósforo dos fita tos passa através do canal gastrintestinal dos animais rnonogástricos e é excretado oomo dejeotor. Embora alguma hidrólise do fitato possa ocorrer no cólon, o fósforo inorgânico assim libertado não tem valor nutritivo visto que o fósforo inorgânico é absorvido apenas no intestino delgado. Corno consequência, urna quantidade significativa de fósforo nutricionalmente importante não é utilizada pelos animais rnonogástricos, não obstante a sua presença nos alimentos.

A excreção do fósforo do fitato através dos dejectos tern outras consequências. A produção anirnal intensiva tern aumentado enormemente durante as ultimas décadas. Consequentemente, a quantidade de esterco produzido aumentou correspondentemente e tem provocado problemas ambientais ern várias partes do mundo. Isto deve-se em parte à acumulação de

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fosfato proveniente dos dejectos em aguas superficiais, que provocou a eutrofizaçao.

As enzimas produzidas por microorganismos que catalisam a transformação de fitato em inositol e fósforo inorgânico são geralmente designadas como fitases. Os microorganismos que produzem fitases compreendem bactérias tais corno F3aci 11 us subtili.s (V.K. Paver e V.J. Jagannatban (1982), J. Baoteriol. 151, 1102) e Pseudomonas (D.J. Cosgrove (1970), Austral. J. Biol - Sei. 23, 1207) ; levedur as tais como Saççhaç; romycescerevisiae (N.R. Nayini e P. Markakis (1984), Lebensrnittel Wissenschaft und Technol ogi e 17, 24) ; e fungos tais corno Aspergillusterreus (K. Yarnada, Y. Minoda e S. Yamamoto (1986), Agrio. Biol. Chern. 32, 1275). Conhecem-se varias outras espécies de Aspergillus que produzem fitases, das quais a fitase produzida por Aspergillus f leuurn se verificou possuir urn dos mais elevados niveis de actividade especifica, assim corno ter melhor terrnoestabilidade do que as fitases produzidas por outros microorganismos (Van Cor corn e col. (1991), Pedido de Patente Europeia 89202436.5, Publicação Número 0 420 358, depositado em 27 de Setembro de 1989).

As fitases estão tarnbérn endogenamente presentes ern muitas espécies de plantas (veja—se E.A. Loweus (1990), '‘Plant Biology" , Volume 9; "Inossitol rnetabolisrn in plants" (Ed. I.j. J . Morre, W. F.. Boss, E.A. Loweus) 13), K.S. Cellatly e D.D. Eefebvre (1990), Plant Physiology (suplemento), 93, resumo 562) mencionam o isolamento e a caracterização de um clone de cADN de fitase obtido a partir de tubérculos de batata. D.M. Gibson e col. e A.A. Christen e col. (.1988), J. Cell Bichern. 12C, resumo L..407 e L402, respectivamente), mencionam a sintese de fitase endógena durante a germinação de sementes de soja. No entanto, as fitases de plantas sao norrnalrnente produzidas ern quantidades insuficientes para a sua aplicação em processos industriais, per se.

A ideia de adicionar fitases microbianas aos alimentos de anirnais monogástricos foi já anteriormente descrita (J.H. Ware, L.... Bluff e T. R. Shieh (1967), Patente de Invenção Norte-Americana Número 3 297 548; Γ-S. Nelson, I.R. Shieh, R.J. Wodzinski e J.H, Ware (1971), J. Nutrition 101, 1289). Hoje em dia, no entanto, a aplicação deste conceito nao tem sido cornercialrnente possivel devido ao elevado custo de produção de enzimas microbianas (Y.W. Han (1989), Animal Feed Sei. and Technol. 24, 345). Por razoes de ordem económica, o fósforo inorgânico ê ainda adicionado aos alimentos de animais monogástricos.

As fitases têm também outras utilizações industriais. Como exemplos dessas utilizações, cita-se o processo industrial de produção de amido a partir de cereais tais corno o milho e trigo. Os produtos residuais, que compreendem, por exernplo, glúten de milho, obtidos a partir do pro......

cesso da rnoagern em húmido, sao vendidos corno alimentos para animais. Durante o processo de maceração, a fitase pode ser suplementada. As condições (T~50°C e pH=5,5) são ideais para as fitases de fungos (veja-se, por exernplo, o Pedido de Patente Europeia 0 321 004 de Alko Ltd.). Vantajosamente, os alimentos para anirnais derivados dos produtos residuais deste processo contêm fosfato ern vez de fitato.

Tarnbém se concebeu que as fitases podem ser utilizadas no processamento de soja (veja-se Finase* Enzymes by Alko, urna brochura de informação sobre produtos publicada por Alko Ltd., Rajarnaki, Finlândia). A farinha de soja contém elevados niveis de fitato factor antinutricional que torna este produto não apropriado para a aplicação corno alimento para crianças e ern alimentos para peixes, vitelos e outrcs ruminantes. A degradação enzimática desta fonte valiosa de protéina melhora o valor nutritivo e comercial deste materi al..

A possibilidade de utilização de plantas transgénicas corno sistema de produção de proteínas valiosas foi tarnbérn jâ proposta. Sao exemplos actuais a produção de interferão em tabaco (R.M. Goodman., V.G. Knauf, G.M. Houck e L- Cornai (1987), PCT/WO 87/00865) , de encefalinas ern tabaco,

Brassica napus e Arabidopsis____tbaliana (J. Vandekerckhove, J.

van Darnrne, M. van Lijsebettens, J. Botterman. M. DeBlock , A. DeCIerq, j. Leernans, 1*1. van Hontagu e Ei. Krebbers (1989), Bio/Technol- 7, 929), anticorpos ern tabaco (A. Hiatt, R. Cafferkey e l<. Boedish (1990), Nature 342, 76) e de albumina de soro hurnano ern tabaco e ern batata (P. C. Sijmons, B. 1*1.1*1. Dekker, B_ Schrarnrnei jer, T.C. Verwoerd, P.J.M. van den Elzen e A. Hoekerna (1990), Bio/Technol.. 8, 217).

Na prática, a transf ormaçao de ura nurnero crescente de espécies de plantas, especialmente de espécies de dicotiledoneas (por exernplo, tabaco, batata, tornate, Petunia, Brassica) , tornou-se urna maneira de proceder de rotina para os trabalhadores peritos no assunto (FI. Klee, R. Horsch e S. Rogers (1987), Annu. Rev.. Plant Physiol. 38, 467; G.S. Gasser e R.T. Fraley (1989), Science .244, 1293). Estratégias para a expressão de genes estranhos em plantas tornaram-se bern estabelecidas (Grasser e Fraley, supra) . Identificaram-se sequências de regulação de genes de plantas que sao utilizadas para a construção de genes quiméricos que podem ser funcionalmente expressos era plantas e células vegetais.

Para a introdução de construçSes de genes nas plantas, ha à disposição diversas tecnologias, tais como t r a n s f or rn a ç a o c o m Agro b a c t e r i u rn t u rn ef a ol. e n s o u A .___rhizogenes.

Usando esta estratégia, explorou-se uma larga variedade de tecidos vegetais, sendo a escolha largamente dependente da espécie vegetal e da sua possibilidade de ser levada ao contacto com a cultura de tecidos. Os exemplos que obtiveram êxito sao a transf orrnação de protoplastas, rnicrosporos ou pólen e partes retiradas de plantas tais como folhas, talos,

raízes, hipocótilos e cótilos. Além disso, os métodos para a introduç:ão directa de ADN ern protoplastas e em células ou te cidos vegetais sao tarnbém utilizados, tais corno rnicro-injecção , electroporação, bombardeamento de partículas e absorção directa de ADN (l 51 cl S t·;? e Fraley, supra)-

As proteínas podern ser produzidas ern plantas utilizando uma larga variedade de sistemas de expressão. Por exemplo, a utilização de urn promotor constitutivo , tal corno o promotor 353 de virus de mosaico da couve-tlor (CaMV) (H. Guilley, P.K. Dudley, G. Jonard, E. Balazs e K.. E. Richards (1982), Cell 30, 763) tem corno resultado a acumula — çao da proteína expressada ern todos os orgãos da planta transgénioa. Corno variante, podern usar-se promotores de genes que codificam proteínas que são expressas de urna maneira muito especifica do tecido e específica da fase de desenvolvimento do tecido (T.J.V. Higgins (1984), Annu. Rev. Plant

Physiol.. 35, 181; 1*1.A. Shotwell e B.A. Larkins (1889), in The Biochemistry of Plants, Vol. 15 (Academic Press, San Diego, Ed. P.K. Sturnpf e E.E. Conn), 297), isto é, os genes sao expressos apenas no tecido pretendido e apenas durante a fase d e d e s e η v o .1 v i men t o pr e ten di d a .

E conveniente que o procedimento económico para a produção de fitase . seja um benefício significativo para, entre outras, a indústria de alimentos para animais. IJrn processo mais económico para a produção de fitase seria a u~ tilização de técnicas de ADN recombinante para produzir plantas transgénicas ou orgãos de plantas transgénicas capazes de expressarem fitase, que poderiam por sua vez ser adicionados tal e qual, por exemplo, ao alimento para animais ou aos produtos alimentares para consumo direc to dos animais. Gomo va riante, a fitase expressa nestas plantas transgénicas ou or gaos de plantas transgénicas poderia ser extraída e, caso as sim se pretendesse, purificada para a aplicação desejada.

Sumário da inyen£ao

A presente invenção refere-se à expressão de fitase em plantas transgénicas ou em orgãos de plantas transgénicas e aos métodos para a produção dessas plantas. Isso consegue-se por introdução na planta de um construto de expressão que compreende urna sequência de ADN gue codifica urna proteína corn actividade da fitase.

As construções de expressão de ADN proporcionadas pela presente invenção para a transforrnação de plantas estão sob o controlo de sequências de regulação capazes de dirigir a expressão de fitase.. Estas sequências de regulação podem também incluir sequências capazes de dirigir a transcrição em plantas ou constitutivamente ou especificarnente no estagio de desenvolvimento e/ou no tecido, dependendo da utilização da planta ou das suas partes.

As plantas transgénicas e os orgãos vegetais transgénicos proporcionados pela presente invenção podem ser utilizados numa larga variedade de processos industriais o u d i. r e c t a rn e nte, ρ o r ex e rn ρ 1 o , n a a I. i. rn e n t a ç ã o d e a n im a is o u n a produção de alimentos para animais ou, corno variante, a fitase expressa pode ser extraída ou, caso assim se pretenda, ρ u r i f içada antes da a ρ I. i caça o .

Ilrevedescrição.....das Figuras

A Figura 1 representa a estratégia para a clonação de cADN de fitase.

A Figura 2 representa a sequência de nucleotidos da região transcrita do fragmento de cADN de fitase e da sequência de aminoácidos derivados da proteína da fitase; o inicio da proteína de fitase madura é indicado corno posição "-ι-l" .

pM0G23A Figura 4 representa oligonucleótidos duplos usados na clonação.

A Figura 5 representa o plasrnidio pM0G29; e o plasrnidio pUC18 que contém uma cassete de expressão para expressão constitutiva ern plantas e urna sequência que codifica urn péptido de sinal ern tabaco.

A Figura 6 representa os efeitos resultantes da adiçao de sementes rnoidas contendo fitase sobre a libertação de fósforo inorgânico de fitato.

A Figura 7 representa a relaçao da res.....

posta com a dose de fitase de Aspergillus nurn modelo de di.....

g e s t a o invitro.

A Figura 8 representa a relaçao dose-resposta de fitase de Aspergillus e de Fitase contida ern sementes de tabaco nurn modelo de digestão in vitro.

Descrição Por rnen ori zada da Invenção

De acordo com a presente invenção, obtêm.....

se plantas transgénicas ou orgaos de plantas transgénicas ern que se produz fitase. Isto consegue-se por introdução na planta de um construto de expressão que compreende urna sequência de ADN que codifica uma proteina tendo actividade de fitase.

A presente invenção proporciona construções de expressão de ADN para a transf orrnação estável de? plantas corri um gene que? codifica uma fitase. Estas constru-

ções compreendem urna sequência de ADN que codifica urna fitase que é operavelrnente ligada ti sequências de regulação capazes de dirigir a expressão de fitase. Estas sequências de regulação podem também incluir sequências capazes de dirigir a transcrição em plantas ou construtivamente ou especificamente no estagio de desenvolvimento e/ou do tecido, dependendo da utilização da planta ou das suas partes.

As construções de expressão proporcionadas pela presente invenção podem ser inseridas num vector, preferivelmente urn plasmidio, usado na transf ormação mediada por bactérias· da planta hospedeira seleccionada. A construção de expressão é então preferivelmente integrada no genoma da planta hospedeira.

Dentro do contexto da presente invenção, o termo fitase abrange uma família de enzimas que catalisam as reacções que envolvem a libertação de fósforo inorgânico e de vários fosfatos de mio-inositol. Pretende-se que abranja todas as proteínas com actividade de fitase.

A sequência de ADN que codifica a fitase pode ser obtida a partir de uma variedade de fontes, tais corno fontes microbianas, vegetais ou animais. Preferivelmente, a sequência de ADN é obtida dt? uma fonte microbiana tal como o fungo filamentoso AsRgj<aillus.. As sequências mais preferidas de ADN são obtidas a partir de Aspergillus___ficuum, A.

n iger', A . awamori e A . nidulans.

A clonação de um gene ou de um cADN que codifica uma proteína de fitase pode conseguir-se utilizando vários métodos. Um método consiste na purificação da protéina da fitase, na subsequente determinação da extremidade N e de diversas sequências de aminoácidos internas e na escolha de uma biblioteca genórnica ou de cADN do organismo que produz a

fitase, utilizando amostras de oligonucleõtidos baseadas nas s o q u ê n c i. a s d o s a rn i η o á c i do s .

Se se conhece pelo menos uma sequência parcial do gene, esta informação pode ser utilizada para clonar o correspondente oADN, usando, por exemplo, a reacçao de cadeia de polimerase (PCR) ("PCR Technology: Principies and Aplications for DNA Amplification" (1.989), Eíd.. H.A. ΙΞ h r 1 i. c h , S t o o l< t ο η P r e s s , No v a I o r q ue) .

È evidente para os peritos no assunto que o gene de fitase cionado acima descrito pode ser utilizado em experiências de hibridização heterôloga, dirigidas para o isolamento de genes que codificam fitase a partir de outros rn:i.. o r o o r ga n i s rn o s .

De? acordo oorn outro aspecto, o gene de fitase cionado acima descrito pode ser utilizado como material de partida para a construção de fitases de "segunda geração" sao fitases, alteradas por técnicas de mutagênese (por exemplo, mutagênese dirigida para o sitio), que têm propriedades que as tornam diferentes das fitases de tipo natural ou das fitases recombinantes, tais corno as produzidas de acordo oorn a presente invenção. Por exemplo, a temperatura óptirna ou o pH óptimo, a actividade especif ica ou a afinidade do substrato podem ser alterados de rnodo a rnelbor se adapta.....

rern â aplicação nurn processo definido.

isolamento da fitase que codifica cADN permite a construção de construções de expressão capazes de dirigirem a produção de fitase na planta hospedeira escolhida por intermédio da aplicação de técnicas de ADN recombinante, tais corno troca de elementos de regulação corno, por exemplo, promotores, sinais de segregação ou suas combinações.

A fitase pode ser produzida constitutivamente em plantas transgénicas durante todas as fases de desenvolvimento. Dependendo da utilização da planta ou dos orgãos desta, as enzimas podem ser expressadas de urna maneira especifica do estágio de desenvolvimento, por exemplo, durante a -formação de tubérculos ou durante o desenvolvimento dos frutos. Também dependendo da utilização, as enzimas podem ser expressas especificamente no tecido, por exemplo, em orgãos de plantas tais corno frutos, tubérculos, folhas ou sementes.

As plantas transgénicas, como se define no contexto da presente invenção, incluem plantas (assim como partes e células das referidas plantas) e a sua progénie que foram geneticamente modificadas utilizando técnicas de ADN recombinante para provocar ou aumentar a produção de urna fita se na planta desejada ou no orgão desejado.

Mo contexto da presente invenção, a expressão "quantidade aumentada de fitase" refere-se especif i···carnente a urna quantidade estatisticamente significativa de tecido da planta que, ern média, contém urna quantidade estatisticamente signif icativamente maior de fitase ern comparação com a quantidade média de fitase de enzima encontrada nurna quantidade igual de tecido de planta não modificado.

Dentro do contexto da presente invenção, as plantas a escolher, roas não se limitando a estas, incluem plantas que produzem flores comestíveis, tais como couve-flor (Brassicaoleracea), alcachofra (Cynarascolymus), frutos tais corno maçã (por exemplo, M a lu s d o rn es t ic us ) , faanana (por exemplo, Musa _S.ourninata) , bagas ( tais corno groselha, por exemplo, Rihes rubrum) , cerejas (tal corno cereja-dos-passarinhos, por exemplo. Pruri us avium) , pepino (por exemplo, Cu cu missativus), uvas (por exemplo, Vitis________vinifera), limão (Citrus lirnon ) , rnelão (tj u c u rn i s me lo) , nozes (tais corno noz de

nogueira, por exemplo, Juglans regia; amendoim, Arachis hypogeae), laranja (por exemplo, Citrus______maxima), pêssego (por exempla , Pj^unus_permça) , pera ( por exemplo , Py.ra____communis) , ameixa (por exemplo, Prun us domestica), morango (por exemplo, ’ torna te (por exemplo, ©sc-Sír lenturn) , folhas, tais corno alfafa (por exemplo, Medi.cago sativa), couves (por exemplo, Brassica oleracea ), endívias (por exemplo, C 1. c ho r eu rn en d i. v 1 a) , alho-porro (por exernplo, Aliiurn por rum) , alface (por exernplo, Lactuca sativa) , espinafre (por exernplo, Sfiinaeis^^ , tabaco (por exernplo, Nicotiana .tahacurn) , raízes, tais corno araruta (por exernplo, Macanta arundinacea), beterraba (por exemplo, Beta vulgaris), cenoura (por exernplo, Pau cus caro ta) , mandioca (por exernplo, Manihot esoulenta) , nabo (por exernplo, Srassica rapa) , rabanete (por exempl-o, Raphanus sativus) , inhame (por exernplo, Dioscorea esçulenta) , batata-doce (Jjaomoe;a batatas) e sementes, tais corno feijão (por exernplo, Phaseoius vulgaris) , ervilha (por e x e rn ρ lo, P i s u rn savitum) , soja (por exemplo, Glycina max) , trigo (por exemplo, Tr1.11,cum aestivurn) , cevada (por exempl.o, Hordeurn vulgare) , milho (por exernplo, Zea mays) , arroz (por exernplo, Oriza sativa) , colza (Brassioa_________napus) , sorgo (Panlpurn L-), girassol ( He 1 i a n t h u s a η n u s) , aveia ( A v e n a sa t 1. v a) , tubérculos, tais corno rábano (por exernplo, Brassi.ca o 1 erace-ae), batata (por exernplo, Solanur^^^^ e semelhantes.

A escolha da planta é principalmente determinada pela utilização pretendida da planta ou das suas partes e pela possibilidade de transformar essa espécie.

Estão disponíveis diversas técnicas para a introdução da construção de expressão que oontérn a sequência de ADN que codifica a fitase nas plantas que se pretendem transformar. Essas técnicas incluern, mas não se limitam, a transforrnação de protoplasta utilizando o rnétodo do cálcio/ /polietilenoglicol, electroporação e rnicro-injecçào ou bom12

bardearnento corn particulas (revestidas) (I. Potrykus (1998), B i. o / T e oh η o1. 8, 535) .

Alérn destes métodos de transformação de ADN chamados directos, os sistemas de transformação que envolvem vectores estão largamente disponíveis, tais como vectores de virus (por exemplo, do virus de mosaico da couve— -flor (CaMV) e os outros vectores bacterianos (por exernplo, do género Agrobacterium) (Potrykus, supra). Depois da selecçao e/ou da escolha, os protoplastas, células ou partes da planta que foram transformados podern ser regenerados corn a obtenção de plantas completas utilizando métodos conhecidos na técnica (R.B. Horsch, J.E. Fry, N.L. Hoffmann, D. Eichholtz, S-G. Rogers e R. T. Fraley (.1985), Science .227, 1229). A escolha das técnicas de transforrnaçao e/ou de regeneração nao é critica para a presente invenção.

Para plantas diootiledóneas, uma forma de realização preferida da presente invenção utiliza o principio do sistema do vector binário (A. Hoekerna, P.R. Hirsch, P. J. J. Hooykaas e R.A. Schilperoort (1983), Nature 383, 179; R.A.

Schilperoort, A. Hoekerna e P. J. J.. Hooykaas (1984), Pedido de Patente de Invenção Europeia Numero 0 120 516), no gual se utilizam estirpes de Agrobacteriurn que contêm urn plasrnidio vir corn os genes da virulência e um plasrnidio compatível que contém a construção do gene a ser transferido. Este vector pode replicar-se tanto ern E. coli corno ern __Aj3E_9.h.9.P.Íi®EÍ.y.[ⁿ deriva do vector binário Binl9 (M. Bevan (1984), Nucl. Acids Res. 12 , 871.1), que é alterado ern pormenores que não sao relevantes para a presente invenção. Os vectores binários tal corno são utilizados nestes exemplos con têm entre as sequências da extremidade da esquerda e da extremidade da direita do T--ADN um gene NPTII idêntico que codifica a resistência a canarnicina (Bevan, supra) e um sitio de olonação múltiplo para clonar nos construtos dos genes pretendidos.

& transformação e a regeneração das culturas de mon-ocotiledóneas não é uma maneira de proceder usual. No entanto, os recentes progressos científicos rnostrarn que, ern principio, as rnonocotiledóneas podem ser obrigadas a sofrer transf orrnação e que plantas transgénicas férteis podem ser regeneradas a partir de células transformadas. 0 desenvolvimento de sistemas de cultura de tecido reprodutível para estas culturas, em conjunto com os métodos poderosos para introdução de material genético em células vegetais, facilitou a transformação. Presentemente, os métodos de escolha para a transf orrnação de rnonocotilidóneas sao o bombardeamento com microprojécteis de células extraídas de plantas ou em suspensão e a absorção directa de ADN ou a electroporação de proto— piastas. Por exemplo, plantas de arroz transgénicas foram obtidas com êxito utilizando o gene bactériano hph, que codifica a resistência à bigromicina, como marcador de selecção. 0 gene foi introduzido por electroporação (K. Shirnamoto, R. Terada, T. Izawa e I I.. Fujimoto (1989), Nature 938, 274). Plantas de milho transgénicas foram obtidas introduzindo o gene de S E, r e io t o rn y c e shy g r o s c ο ρ 1 c u s b a r que codifica f osf ino.....

tricina-acetiltransferase (uma enzima que inactiva o herbicida fosfinotricina) em células embriogénicas de uma cultura de suspensão de milho por bombardeamento com micropartículas (W.J. Gordon-Karnm, T.M. Spencer, M. L.... Mangano, I.R. Adarns,

Start, J.V. O’Brien, S.A. Chambers, W.R.

Wi.ll.ets, T.E). Rice, C.J. Mackey, R.W.

Krueger, A.. P. Kausch e P. G.. Lernaux (1890), The Plant Cell 2, 803). A introdução de material genético em protoplastas aleurónicos de outras culturas rnonocotiledóneas, tais como trigo e cevada, foi jã referida (B. Lee, K. Murdoch, J. Topping, 1*1. Kr eis e 1*1. G.K. Jones (1989), Plant Mol. Biol. .13, 21). Reg Cinerar a rn-se plantas de trigo a partir de culturas em suspensão embriogénicas escolhendo apenas os tecidos do caule embrigénico compacto envelhecido e nodular para o estabelecimento das culturas em suspensão ernbriogénica (V. Vasil, F. Redway e Ϊ.Κ. Vasil (1990), Bio/Technol. 8, 429). A combinação com os

R.. J.. Daines, W.G. Adarns Jr .. , N . G .

sistemas de transf orrnação parei essas culturas permite a aplica çao da presente invenção às plantas monocotiledóneas- tstes métodos podem também ser aplicados para a transformação e para a regeneração de plantas dicotiledóneas.

A expressão do construto de fitase envolve pormenores tais como transcrição do gene por polimerases vegetais, 'translação de mARN, etc., que sao conhecidos dos peritos na técnica de recombinação de ADN. Só os pormenores relevantes para a compreensão apropriada da presente invenção serão referidos em seguida.

Na presente invenção, pode usar--se sequências de regulação que se sabe ou se descobriu que provocam a expressão de fitase. A escolha das sequências de regulação utilizadas depende da cultura que se pretende atingir e/ou do orgão que interessa atingir. Essas sequências reguladoras podem obter-se a partir de plantas ou de virus de plantas ou podem ser sintetizadas quimicamente. Essas sequências de regulação são promotores activos na direcção da transcrição em plantas ou constitutivos ou específicos do estagio de desenvolvimento e/ou do tecido, dependendo da utilização da planta ou das suas partes. Estes promotores incluem, mas não se limitam, a eles, promotores que apresentam expressão constitutiva , tais corno o promotor 35S de virus dc mosaico da couve-flor (CaMV) (Guilley e col. (1982), Cell .30, 763), os promotores da expressão especificas das folhas, tais como o promotor do gene de sub—unidade de pequenas dimensões de ri.— buiose bisfosfato carboxilase (Coruzzi e col. (1984), EM80 J. 3 , 1671) , os der expressão especifica em raizes como o promotor do gene da glutamina sintetase (Tingey e col- (1987), EMBO J. 6, 3565), os para a expressão especifica em sementes, tais corno o promotor da cruci ferina A de Brassica na pus (Ryan e col. (1989) , Nucl. Acids Res. .17, 3584) , os da expressão especifica ern tubérculos corno o promotor dei patatina da classe I da batata (Rocha-Sosa e col. (1989), EM8D J. 8, 23;

Wenzler e col. (1989), Plant Mol. biol. 12, 41) ou os da expressão especifica ern frutos como o promotor de poligalacturonase (PG) do tomate (Bird e col. (1998), Plant Mol. Biol.

11, 851).

Outras sequências reguladoras, tais como sequências terminadoras e sinais de poliadenilação, Incluem qualquer sequência que funcione corno tal em plantas, cuja escolha esteja dentro do nível de conhecimentos dos peritos no assunto. Um exemplo dessas sequências é a região de flanquearnento 3’ do gene de nopalina sintetase (nos) de Agrobacter.1 um turnef aciens ( M . Bevan, supra) .

As sequências de regulação podem também incluir sequências de reforço, tais como as que se encontram no promotor 353 de CaMV e as sequências de estabilização de rnARN, tais como a sequência lider do virus de mosaico da al.....

f a f a (A1Μ V) R N A 4 ( F . 1. F3 r e d e r o d e , E . C . K ο ρ e r · - Z. wart h o f f e J . F .

Boi (1980), Nucl. Acids Res. 8, 2213) ou quaisquer outras se.....

quências que funcionem de maneira semelhante.

A fitase deve ser expressa nurn ambiente que permita a estabilidade da proteína expressa. A escolha dos compartimentos celulares, tais corno citosol, retículo endoplásrnico, vacúolos, corpo de proteína ou espaço periplásmico pode ser utilizada de acordo corn a presente invenção para criar esse ambiente estável, dependendo dos parâmetros biofísicos da fitase. Esses parâmetros incluern - ruas não se limitam a — o pH óptimo, a sensibilidade a proteases ou a sensibilidade á rnolaridade do compartimento preferido.

Para se conseguir a expressão no citoplasma da célula, a enzima expressada deve não conter urn péptido de sinal secretório nern qualquer outra sequência pretendi. da corno alvo. Para a expressão ern cloroplastas e ern rnitoc ô n d r i o s , a e n z i. rn a e x p r e s s a d a d e v e c: o n t e r u rn a s s i. rn c h a rn a d o

péptido específico de trânsito para importação para dentro desses or gane los. Conhecem-se sequências que actuarn corno alvo que podern ser ligadas â enzirna de interesse a firn de se conseguir este efeito (Srneekens e col. (1990), I .I.B.S. 15, página 73; van den Broeck e col. (1935), Nature 31.3, 358; Schreider e col. (1985) EMBO J. 4, 25). Se se pretende conseguir actividade da enzirna nos vacúolos, tern de estar presente urn péptido de sinal secretório, assirn corno urna sequência de indicação corno alvo especifico que dirige a enzima para esses vacúolos (Ta gue e col. (1988), Plant Phys. 86, 506). 0 rnesrno é tambérn verdadeiro para os corpos proteinioos nas sementes. A sequência de ADN que codifica a enzirna de interesse deve ser modificada de tal maneira que a enzirna possa exercer a sua acção na localização pretendida dentro da célula.

Para se conseguir a expressão extraoelu— lar da fitase, a construção de expressão de acordo com a presente invenção utiliza urna sequência de sinal secretório. Muito ernbora as sequências de sinal que são homólogas (naturais) â espécie Hospedeira vegetal, sejam as preferidas, pode também usar-se sequências de sinal heterólogas, isto é, as que sao originadas por outras espécies vegetais ou são de origern microbiana. Eis tas sequências de sinal são conhecidas pelos peritos no assunto.

As sequências de sinal apropriadas que podern ser utilizadas dentro do contexto da presente invenção são descritas por P. Walter e G.. Blobel (1.986), Bioohern. Soc. Syrnp .47, 1.83; G. von Heijne (1986), J. Mol. Biol. 189, 239; e P. C.. S i j rn o n s , Β .. Μ . M .. D e k k e r , B. S o hr a rn rn e i j e r , T . C. Ver woer d, P.J.M. van den Elzen e A. Hoekerna (1.990), Bio/Technol. 8,

21.7.

Todas as partes das construções relevantes de ADN (promotores, sequências reguladoras, sequências de secreção, s e q u ê n o i. a s e s t a b 1.1 i z a d o r a s , s e q u ê n c i a s q u e actua rn

1.7 'ΤΤΛκί-»‘•**^«i»2canK2n rmpf '

_ *^· .......

corno alvo ou sequências terminais) de acordo corn a prose?nte?

invenção podern se?r modificadas, caso assirn se pretenda, para afectar as suas caracteristicas de controlo utilizando métodos conhecidos peles peritos no assunto.

Assinale-se que? as plantas que? cont ern fita st? obtidas por intermédio da presente invenção podern ser usadas parar se obterem plantas ou orgáos de? plantas ainda corn mais elevados niveis de? fitase. Por exernplo, podo ser possível obter essas plantas ou orgaos de plantas utilizando as técnicas de variação somoclonais ou pelas técnicas de cultura cruzada.. Essas técnicas sao bern conhecidas pelos peritos no assunto.

De? acordo corn urna forma de realização da presente? invenção, prepara.....se urn cADN de? dupla faixa que? co.....

dif ica a fitase a partir de rnARN isolado de Aspergillusf icuurn. A construção de? ADN fica colocada sob o controlo regulador do gene que? codifica a protéina de armazenagem 12S da cruciferina proveniente de Brassicanapus. A construção é seguidarnente subclonada nurn vector binário tal corno pl*IOG23 (na estirpe DHSalfa de E.coli K-12, depositada no Centraal Bureau voor Schirnrnelcultures, Baarn, Holanda, ern 29 de? Janeiro de 1990, sob o nurnero de? acesso CBS 102.90). Este vector é introduzido ern Agrobacterlurntumefaciens que cont ern urn plasrnideo Ti desarmado. As células bacterianas que contêm esta construção são co.....cultivadas corn tecido de tabaco ou plantas da espécie Brassica e as células transformadas das plantas sao escolhidas por meios nutritivos contendo antibióticos e induzidas a regenerar-se ern plantas diferenciadas corn esses rneios. As plantas resultantes produzem sementes que contêrn e e χ ρ r e s s a rn a c o n s t r uç ao d e ADN.

De acorda corn urna outra forrna de realização da presente invenção, a construção de ADN que codifica fitase é colocada sob o controlo de sequências de regulação

do promotor 35S de vírus de mosaico da couve-flor (CaMV). A construção é depois subclonada num vector binário. Este vector é em seguida intriduzido em Agrobacterium tumefaciens, que contém um plasrnidio Ti desarmado. As células de bactérias que contêm esta construção são cocultivadas corn tecidos de tabaco eu de plantas da espécie ÊLâssiça e as células das plantas transformadas sao seleccionadas por meios nutritivos que contêrn antibióticos e induzidas a regenerar-se ern plantas diferenciadas nesses meios. As plantas resultantes contêm e expressam a construção de A DM cons ti tu ti varri en te .

A actividade de fitase pode ser rnedida por meio de urn certo nurnero de ensaios, cuja escolha nao é critica na presente invenção. Por exemplo, a actividade da enzima fitase do tecido de plantas transgénicas pode ser ensaiada por meio dum ensaio ELISA, rnancharnento de Western ou ensaies di rec tos corn enzimas usando técnicas color imé tricas ou ensaios com geles naturais.

A planta ou orgao da planta que contêrn fitase, tal. corno sao produzidas por meio da presente invenção, pod ern ser utilizados nurna variedade de- -processos industriais que necessitam da acção de uma fitase.

As plantas ou os orgaos de plantas que contêrn fitase produzidos de acordo com a presente invenção podern ser utilizados em processos industriais que necessitem da acçao de urna fitase. Sao exemplos destas aplicações os aditivos de alimentos para não ruminantes, o processamento de soja ou a produção de inositol ou de fosfatos de inositol a partir de fitato. Emprega rn-se tarnbérn ern outros processos industriais que utilizam substratos que contêrn fitato, tais como a industria do arnido e as indústrias de fermentação, como por exemplo, a indústria da cerveja. A queiação de ides metálicos pelo fitato pode fazer corn que estes compostos rni- 19

nerais nao sejam disponíveis para a produção de rnicroorganis rnos . A hidrólise enzimática de fitato evita estes problemas.

A fitase produzida ern plantas pode tarnbérn ser utilizada num processo para a maceração dc: milho ou de espigas de sorgo. 0 tecido da planta pode ser rnoido antes de adicionado ao milho de maceração» A fitase libertada do tecido da planta pode actuar sobre fitina gue? se? encontrei presente em muitas preparações à base de milho. A degradação da fitina na maceração do milho e benéfica para o aumento do valor comercial do .'.liquido de maceração do milho, que é usado corno alimento para animais ou como nutriente em fermentações microbianas.. Além disso, a degradação da fitina pode evitar problemas relacionados com a acumulação de depósitos em filtros, tubagem, vasos de reacçao, etc:. durante a concentração, transporte e armazenagem do liquido de? maceração do milho ( T Vaara e col. (1989), Pedido de Patente? Europeia Número

321 004) . A acção da fitase pode tarnbérn acelerar o processo de maceração e os processos de separação envolvidos no processamento por via húmida do milho.

As plantas ou os orgãos de? plantas podem ser utilizados directamente, isto é, sem posterior processamento ou prime? iram ente? ser processados por rneio dos processos convencionais, tais corno rnoagem até à consistência pretendida an tes da aplicação..

Corno variante, a fitase? pode ser extraída da planta ou dos orgãos das plantas e, caso assim se? pretenda, ser purificada antes da utilização usando rné?todos de extracção convencionais e técnicas de purificação correntes.

A produção de fitases e?rn plantas gue? são compatíveis com a aplicação pretendida proporciona resultados convenientes e? reduz os custos da produção ern comparação com a das fitases microbianas, a fim de? permitir a sua aplicação

económica, por exernplo, ern alimentos para animais , que eventualmente origina urna proporção de preço/coinportarnento in vi.-·· vo competitivo com o fosfato inorgânico. Como benefício posterior , o teor de fósforo dos excrementos é consideravelmente diminuído.

Aprecia-se que a aplicaçao de fitases, disponíveis a preço competitivo corn o fosfato inorgânico, au.....

menta o grau de liberdade da industriei de produção de alimentos compostos de maneira a originar um alimento de elevada qualidade. Por exemplo, quando o alimento é suplementado corn fitase, a adição de fosfato inorgânico pode ser omitida e os teores dos vãrios materiais que contêm fitato podem ser aumentados.

Os exemplos seguintes sao apresentados para fornecer aos peritos no assunto uma descrição completa e indicações da maneira como fazer e utilizar a presente invenção e nao se destinam a limitar o âmbito daquilo que os inventores consideram como o âmbito da sua invenção.

Realizaram-se esforços no sentido de garantir o rigor em relação aos numeros utilizados (por exemplo, quantidades, temperaturas, pH, etc.), rnas são possíveis erros e desvios experimentais. A não ser que se indique outra unidade, a temperatura é expressa em graus centígrados e a pressão utilizada é a pressão atmosférica ou próxima da pressão atmosférica.

EXEMPLOS

Exemplo1 .-..'-i-.P.slE.tr.i.E. de & ρρο ^r gi 11 us f i o u u rn

Faz-se desenvolver A. ficuum estirpe NRRL 3135 em meio que contém 22,72 grarnas/litro de farinha de milho (arnilase tratada a pH 7 a 85°C durante quinze rninutos) ,

9,36 g r a rn a s /1 i. t r o de g 1 u c o s e, 2,9 gr a rn a s /1 :.i. t r o de K N 0 3, 0,14 2 grarna /litro dt;? KC1, 0,142 grama/li tro de MgSO^-TH^O e 56,6 rn i. 1. i gra rn a s /1 i t r o d e F e S O4 - 7 63 0 . D e ρ o i s de s e i s d i as, r e o o 1 h e se a cultura de rnicélio .

Congela-se? o rnicélio seco (0,5 grarna) com azoto liquido e? mói-se.. Subsequentemente , o material e homogeneizado ’ com urn homogeneizador Ultra Turrax (velocidade máxima, durante? um minuto) a 0°C em I....ÍCI. 3 M e? ureia Ei M e mantém-se durante? a noite a 4°C, corno é descrito por Au ff r ay e Rougeon (1980), Eur. J .. Biochern. ..1.0.7, 303. Obtérn-se o ARN celular total depois da centrifugação a 16 000 X g, que? é ern seguida de duas extracçoes sucessivas com fenol : olorof õrrni— co álcool iso--a rn ílico (50 ; 48 : 2). Precipita-se? o ARN corn etanol e redissolve-se ern 1 ml de Tris-HCl 10 rnM (pH 7,4), 0,5% de SDS. Para a selecção do poli A⁺, aquece-se a amostra total de? ARN durante cinco minutos a 65°C, ajusta—se a NaCl 0,5 1*1 e? aplica—se-? subsequen temente a urna coluna corn oli — g o ( d T) - c e 1 u .1 ose. D e? po i s d e d i v e r s a s 1 a v a g e n s co rn u rn a s o 1 u ç: ã o que contem Tris 10 rnilirnolar, pH 7,0, EDTA 1 rnM e NaCl 0,1 rnM, colecta--se o poli A⁺ ARN por eluição corn Tris 10 rnilimolar a pH 7,0 e? corn EDTA 1. rnilirnolar.

Exemplo 2

Preparaçao e Clonação de urn cADN que C o d i f 1 c a E1.1 a s e

Para a sintese de urna primeira parte do cADN, dissolvem-se 5 microgramas de? poli A⁺ ARN, isolado de acordo corn o Exemplo 1, ern 16,5 rnicrolitros de H3O e adicionamse os seguintes componentes: 2,5 rnicrolitros de urn tampão que contérn Tris-HCl 50rnM pH 7,6, MgClg 6 rnM, 2 rnicrolitros de KC1 1 1*1, 5 rnicrolitros de DDT 0,1 1*1, 0,5 rniorolitro de oligo( dl) | 2_ | q( 2,5 rng/rnl), 5 rnicrolitros de mistura de dNTP 8 rnM, 5 rnicrolitros de BSA (1 rng/rnl) e 2,5 rnicrolitros de Moloney l*ILV transcriptase inversa (200 IJ/microlitro) . Incuba-se a mistura durante trinta minutos a 37°C e interrompe-se a reacçao por adição de 10 rnicrolitros de EDTA 0,2 molar e 50

mi crolitros de HgO. Efectua-se urna extracção usando 1.1.0 microlitros de clorofórmio e, depois de centrifugação durante cinco rninutos, adicionam-se ao sobrenadante NH^Ac 5 M e 440 microlitros de etanol. absoluto (-20°C) . Realiza-se a precipita ção numa solução de gelo/etanol durante trinta minutos. Depois da centrifugação (dez minutos a 0°C), lava—se a pelete de cADN/rnARN oom 70% de gelo/etanol. frio. Seca-se a pelete e dissolve-se em 20 microlitros de E^C0 isolamento do oADN que codifica a fitase realiza-se com a reacção ern cadeia de polimerase (PCR) em dois fragmentos. Combinam—se os dois fragmentos utilizando o sitio BarnHI existente no interior do gene para criar um o ADN de comprimento total.. A estratégia para a realização da cio— nação do oADN de fitase estã representada na Figura 1.

segmento parcial do gene da fitase (van Gorcornrn e col.. , supra) revela a presença de um sitio de BamHI a aproximadamente 800 pares de bases do codao de iniciação. A sequência de nucleótidos em volta deste sitio BarnHI, assim como a sequência de nucleõtidos que precede o codao de iniciação e a sequência de nucleótidos depois do codão de interrupção do gene da fitase sao utilizadas para conceber oligonucleótidos para a PCR.

A reacçao de cadeia de polimerase realiza-se de acordo oom o fornecedor de Taq-polimerase (Cetus), usando 1., El microlitros da solução que contém o produto da reacção da primeira sin tese e 0,5 rniorograma de cada um dos oligonucleótidos. A ampliação realiza-se num amplificador de ADN da firrna Perkin Elrner/Cetus. Depois de vinte e cinco ciclos de dois rninutos a 94°C, dois minutos a 55 °C e três minutos a 72°C, desproteiniza-se a mistura reaccional por subsequentes extracções oom fenol. e cio-rof órrnio. C ADN é precipitado, redissolvido num tampao que contém Tris 10 rnM, pH

Ί, e EDI A 0,1 mM, & é subsequentemente digerido com enzimas de restrição apropriadas..

Para a amplificação do fragmento que codifica a parte da extremidade N da proteína, usam-se os se— g u i n t e s d o i s o 1 i g o n u c 1 e ò t i d os:

Oligo 1: '5’ GGGTAGAATTCAAAAATGGGCGTCTCTGCTGTTCTA 3’

Olido 2: 5’ AG1GAGGAATTGGTGGTGGI"GGAGATGGTGTCG 3’ fragmento amplificado é digerido com EcoRI e clonado no sitio de EcoRI de pT’Z.18R (adquirido â firma Pharmacia). 0 mapeamento do sitio de restrição e o sequenciamento de nucleõtidos demonstra a autenticidade do fragmento. 0 plasmidio resultante é designado pGB925.

Para a amplificação do segundo fragmento, utilizam-se os seguintes dois oligonucleótidos:

Oligo 3: 5^υ GAGCACCAAGCTGAAGGATCC 3’

Oligo 4; 5’ AAACIGGAGGCGTTGAGTGTGATÍGITTAAAGGG 3’ fragmento amplificado é digerido com BamHI e PstI e subsequen ternen te clonado de maneira a obter-se pTZlBR, que foi digerido corn BamHI. e PstI. 0 mapeamento do sitio de restrição e o sequenciamento dos nucleótidos mostra que foi isolado o fragmento correcto. 0 plasmidio resultante é cb amado pGB928 ..

comprimento isola-se o . Este fragdigerido com D plasmidio gue codifica sequência da

A fim de isolar um cADN de completo, digere-se pGB925 corn EcoRI e Barnlll e fragmento que contem o ADN que codifica a fitase mento é clonado no plasmidio pGB926, que foi EcoRI e BarnHI, resultando o plasmidio pGB927. pGB927 contern urn cADN de comprimento completo fitase, com o tamanho aproximado de 1,8 l<bp. A

região do oADN que codifica a protéina de fitase e a sequência dos aminoácidos derivados da proteina de fitase estão representados na Figura 2.

Exemplo.....3

Con str u ç- a o d o____Vector Binário pW0G23

N e s t e e x e rn p l-o , d e s c r e v e - s e a co n s t r u ç a o do vector binário pl*IOG23 (na estirpe E.. coli K-12 DHSalfa, depositada no Centraal Bureau voor Schirnmel-cultures ern 29 de Janeiro de 1990, sot) o número de acesso 102.90).

vector binário pM0G23 (Figura 2) é urn derivado do vector Bin.’.l..9 (M. Be van, sujarei). Para se obter pl*IOG23, o vector Bi.nl9 é rnodofiçado de acordo corn uma maneira nao essencial paria a presente invenção, usando técnicas familiares aos peritos na técnica da biologia molecular.

Em primeiro lugar, as posições do rebordo esquerdo (LB) e do rebordo direito (RB) sao desligadas oom a referência ao gene II de neornicina f osf o transf era se (gene NPTII).. Fm segundo lugar, inverte-se a orientação do gene NPTII, originando a transcrição na direcção de L..B. Finalrnente, substi tui.-sei o poli-liga dor de Binl9 por um poli- liga dor oom os seguintes si tios de reconhecimento de? enzimas de restrição: EcoRI, Knpl, Srnal, EI a rn Eli, Xbal, Saci, Xbo I e HindIII.

Exemplo4 cisoâsiâsid~9..9.Ô..Q.bL...d.®Ιΐϋ 9..®.®.d.®^spe raãJLius f 1.99999.9.99 .Ç99.9.tF.9..99.9.d.9(2*999999.9.(1999.(:. Í.Í9l(QÍ.Y.Q.9.9E.(-.9.9..6.9.9 gene de fitase de; Aspergi, llusfiouum é adaptado e cionado numa construção de; expressão para a expressão constitutiva a jusante: do promotor do virus de; mosaico da couve-flor 35S. A construção de expressão contém também a informação de; codificação para uma sequência de; péptidos de; sinal de; origem vegetai.

cADN da fitase é cionado na construção de expressão o o ino esta presente no plasrnidio pM0G29 (descrito em a)). Subsequentemente, a construção completa é intriduzidei no vector binário pM0G23 e transferida para a estirpe .LBA4404 deí Agrobacteriurn tumefaciens .

a) C°^nstrUção do____Vector de Expressão pM0G29

A construção de expressão do ROKl (Bauloornbe e col.. (1996), Nature 321, 446) é clonada corno urn fragmento de EcoRI/HindiII ern pUCIS. Esta construção contém o promotor 35S do virus de mo sai o o da o ouve-flor ( CaMV) nurn fragmento EcoRI/BarnHI e o terrninador da transcrição de nopalina sintetase (nos) num fragmento de B a rn Η Ϊ. / H i n d 111. 0 fragmento promotor consiste na sequência desde —800 até 4-1 do promotor CaMV 35S. A posição +1, que é incluida·, é o sitio de iniciação da transcrição (Guilley e col.., supra) .. A sequência a montante do sitio de Ncol na posição -512. é suprimida e este sitio é transf orrnado nurn sitio EcoRI - Isto faz-se cortando a construção de expressão presente no plJC18 corn Ncol, preenchimento nas extremidades de cordão unico corn polimerase de Klenov e ligação de urn ligador EcoRI.. o plasrnidio resultante é cortado corn EcoRI, resultando na supressão do fragmento EcoRI que transporta as sequências do promotor 35S a montante do sitio original de Ncol. 0 fragmento 8 a rn ΗI / H1 n d 1I1 que oontérn o terrninador nos é subs.....tituido por urn fragmento de ADN sintético (oligonucleotido duplo A, Figura 4) que contém a sequência líder de ARN4 do virus de rnosaioo da alfalfa (A.I.MV) (Brederode e col., sugra). Isto faz—se por clivagem corn BarnHI, seguida de clivagem corn Hindi11 e ligação do fragmento de ADN sintético. D sitio de BarnHI e três nuc leó tidos a montante são suprimidos por mutagênese dirigida ao sitio. No ρ 1 asrnidio r esu 11an te , o f ragrnen to de BamΗI/Hind111 que ε:on térn a sequência terrninadora nos é reintroduzido. o gene que codif i o a beta - g I. u c: o r on i d a s ε; ( ρ r o v e n i e? nte do ρ 1 a s rn i d i ο ρ R A J 2 7 5; R. A. Jefferson (1987), Plant Mol. Biol. Repórter 5, 387) foi

ligado corno urn fragmento NcoI/BamHI, resultando o plasrnidio pM0G14.

A partir da literatura, sabe-se que a duplicação da sequência entre -343 e -90 aumenta a actividade do promotor 35 S ( R .. Kay, A . Chan , M .. Dayiy e J . McPherson (1987), Science 239, 1299). Parei se obter urn fragmento promotor corn urna sequência dupla, chamado ref orça dor, realizam-se as seguintes operações, conhecidas pelos peritos no assunto. A partir do plasrnidio pM0G14, isola-se o fragmento reforçador nurn fragmento de ACCI/EcoRI e suhsequenternente insensibiliza-se a extremidade corn poli.....rnerase de Klenov. 0 fragmento obtido é introduzido ern pM0G14 cortado corn EcoRI e insesihiliza~se a extremidade de tal. maneira que o rebordo entre os sitios de EcoRI e Accl de extremidade insensibilizada gerem urn novo sítio de EcoRI .. 0 plasrnidio resultante (pM0G18) contêrn o promotor 35S corn urna sequência dupla ref orça dor a, a sequência líder de ARN 4 de Aí MV e o terrninador nos numa construção de expressão ainda presente nurn fragmento de EcoRI/Hindi II. Finalrnente, o fragmento de NcoI/BarnHl que codifica beta-glucoronidase ê substituido por urn fragmento B de ADN sintético (Figura 4), derivado do cADN de PROB 1.2 (B. J .. C.. Cornelissen, R. A. M. I looft van Huijsduijnen e J. E.

Boi (1986), Nature 321, 531). Este fragmento B codifica a se.....

quência do péptido de sinal PR—S de PR—protéina a partir de Sarnsun NN de tabaco. Cria-se urn sitio Sphl no péptido de sinal que codifica a sequência de ADN modificando urn nucleótido.. Esta modificação não altera a sequência de aminoácidos do péptido de sinal. PR-S codificado. 0 plasrnidio resultante é chamado pM0G29 (Figura 5).

b) Clonação......do Cene de Fitase deAsperg 11.1.us ficuurn nurn

.................VectorBinário oligonucleõtido duplex C (Figura 4) é cionado no plasrnidio ρ MO629, digerido corn Sphl e BarnHl, obtendo-se como resultado o plasrnidio pMOG407. 0 oligonucle.... 27 -

o tido duplo contérn a informação de codificação para os dois aminoãcidos finais do péptido de sinal de PR—S, seguidos dos primeiros seis aminoãcidos da fitase madura..

plasrnidio pGB927, gue contérn o cADN de fitase de comprimento completo, é digerido corn Xhql (parcialmente) e PstI .. 0 fragmento de Xhol/PstI , gue compreende as sequências de ADN gue codificam a fitase madura a partir do arnoni ácido 6 em diante, é clonado no plasrnidio pMOG407 linearizado corn ΧΙίοΙ e PstI, obtendo.....se como resultado o plasrnidio pM0G417_ A construção completa, gue contérn o gene de fitase quimérico, é inserida corno urn fragmento EcoRI/ /HindI I I. no vector binário p 1*1 DG23 linearizado com EcoRI e HindIII . 0 plasrnidio binário resultante pM0G413 é mobilizado num ajustamento t ripar entérico corn a estirpe RK2013 de E. coli K-12 (que contém o plasmidiopRK2013 (G. Dit ta, S. Stanfield, D. Corbin e D.. R. Heiinski (1980), proc.. Natl. Aoad. Sei. IJSA 77 , 7347) na estirpe LBA4404 de Agro b a c te r i u rn t u rn e f a o i en s , que contém o plasrnidio corn os genes de virulência necessárias á transferência de T-ADN para a planta.

Exernplo 5

Expressão Transien te do.....Gene de Pita se Quimérico ern

Pro to ρ 1 a s t a s de Tabaco

Protoplastas de tabaco são transforrnados corn plasrnidio ADN que transporta o gene quimérico da fitase sob regulação do promotor 35S CaMV constitutivo. Depois de setenta e duas horas, os protoplastas tratados são ensaiados relativamente á expressão transiente do gene de fitase introduzido usando o ensaio de actividade da fitase.

Ds protoplastas sao preparados a partir de plantas de tabaco corn urn a dois rneses de idade desenvolvidos axenicarnen te (Nicotiana tabacurn SRI). A maneira de proceder completa é descrita por K. W. Rodenburg, M. J. A. DeGroot, R. A. Schilperoort e P. J. J. Hooykaas (1989), Plant

Μ ο ..1.. Biol.. 13 , 711). Para sofrer ei transf orrnação, um número de 5 x 10'-’ protoplastas é electroporado corn 40 rniorograrnas de/ ADN do plasrnidio pM0G417 . Depois da elec tr opor a çao , os protoplastas são ressuspensos ern 3 rnl de meio K3G. Para realizar o ensaio da actividade de fitase, os protoplastas são separados por centrifugação e dia lisa rn-se 3 rnl de? sobrenadante-; durante a noite um excesso de água. 0 produto dialisado é liofilizado e; ressuspenso ern 300 rniorolitros de acetato de sódio 25 mM, pH 5,5. 0 ensaio prossegue-; então corno se descreve; pormenorizadamente no Exemplo 10, com a única excepção de;, ern vez de tarnpao de glicina-HCL 250 rnM de pH 2,5, se; utilizar urn taro pão de acetato de; sódio 25 rnM de pH 5,5.

Nestas experiências, urna unidade de fitase; (PTIJ) é definida corno 1 rnicrornole de fosfato libertado de; urna solução 1,5 rnM de fi.tato de sódio por minuto, a 37°C, a pH 5,5.

Nos protoplastas não tratados, nao se; encontra actividade; deteotãvel. Os protoplastas electroporados corn o plasrnidio pM0G417 possuem urna actividade de; 0,2b PTU por rniligrarna de; protéina no sobrenadante.

Exemplob

......tptiável......de urn Gene jde Fitase Quirnériça ern Plantas de......TabacosobρControlodoPromotorCaMV353 tabaco é transf orrnado por cocultivação de tecido de; plantas corn a estirpe LBA4404 de; A g r ob a c t, e r 1 u rn tumefaciens que; contém o vector binário pM0G413 corn o gene de fitase; quimérico sob a regulação do promotor CaMV 353. A transf orrnação realiza-se; por cocultivação de; discos de; folhas de tabaco (Niootiana_ tabacurn 3 RI) de acordo corn Horsch e col., supra. As plantas transgénicas sao regeneradas a partir de rebentos que sao desenvolvidos ern rneio de selecção (100 mg/litro de canamicina), enraizados e transferidos parei terreno. As plantas de; tenra idade são ensaiadas relativamente ã &5,«3SE3»=„

sua a c t i νí.da de Ν Ρ Γ11. ( r es i s t ê n c i a vidas até â maturidade g i n a r e m s e rn e n t e s .

â canamicina), desenvole deixadas autopo.linizcirern--se e oriPara os ensaios da actividade de fitase das folhas das plantas trasgénicas, corta-se um segmento com cerca de 5 milimetros de diâmetro de uma folha nova de cada planta e homogeneiza-se ern 300 microlitros de tampão de acetato de? sódio 25 rnM, a pH 5,5. Seguidamente, realizam--se os ensaios de fitase como se descreveu para os ensaios transientes. Ern trinta e duas plantas de tabaco independentemente t r a n s f o r rn adas e e n s a i a d as, o b ser ν o u - s e u rn a a c t i v i d ade rn â x i rn a de 2 PTU/rng de protéina solúvel, total existente nos extractos. Isto corresponde a 1,7% da proteína solúvel. total. Nas sementes destas plantas de tabaco transf orrnadas, observou—se urn nivel rnãximo de expressão de fitase igual a 0,4% da proteína da semente total solúvel. Não se observou actividade de fitase em plantas nao transf orrnadas.

Seleccionaram-se duas linhas de plantas transgènicas, 413,25 e 413.32, corn base nos seus elevados niveis de expressão de fitase.

Exemplo7

Clonação de o ADN de......Fitase de A s ρ e r g i 11 u s fiou urn nu rua

Const r uçao de Expressão Especifica da Sernente

Constrói—se urna construção de expressão de maneira que se obtenha a expressão especifica de sementes, usando sequências de cruciferina do gene de proteína de armazenagem de Brassica napus 12S (cruA; Ryan e col., supra). Estas sequências podern ser substituídas pelas dos genes especif icos de sementes semelhantes para se conseguir a rnesrna finalidade que se pretende corno objectivo da presente invenção.

de expressão. Finalmente, a construção completa ê introduzida ern Agro b a c t e r i u rn tumefaciens , que ê usado para a transformação .

Em todas as transformações de E..coli deste Exemplo, utilizou-se a estirpe DHSalfa de E. coli K--12.

a) ConstruçãodoConstrutodeExpressão

Para a construção do construto de expressão para expressão especifica de sementes, as sequências promotora e terminadora do gene de cruciferina A (cruA) de Brassicanaguscv. Jet Neuf são sintetizadas usando a tecnologia de PCR oorn ADN genórnioo i solado (I.. J. Mettler (1987), Plant Mol. Biol. Rep. 5, 346) corno modelo. Este gene apresenta expressão especifica de semente e as suas sequências de codificação e de flaqueamento foram determinadas (Ryan e col., supra).

S i n t e t i z a v a rn — s e d o i s c o n J u n t o s d e o 1 i g o— nucleótidos. Urn deles destina-se a permitir a amplificação da região de flaqueamento de cruA 5’ e parte do péptido de sinal que codifica a sequência corno um fragmento de EcoRI/Ncol:

’ GTTtIGGAATTCGGGI 1 CCGG 3 ’ e 5’ AACTG ί Ί GAGCIGl AGAGCG 3 " .

outro conjunto serve para a amplificação da sequência de flanquearnento 3’ como urn fragmento de BglII/Hindi11:

5’ ClTAAGATCTlACCCAGIGA 3’ e 5' CGGAGAAGCTTGCATCTCGT 3’.

Os oligonucleótidos são construídos de rna neira a conterem si tios de restrição apropriados nas suas expremidades para permitir a ligação directa da construção de

ΪΠΣΞ£χ?ϊ;

expressão depois da digestão dos fragmentos corn as enzirnas de restrição.

D fragmento 5’ do gene de cruA, que inclui cinquenta e quatro nucleótidos da sequência que codifica o péptido de sinal, é clonado de madeira a obter-se o vector pM0G445 (oligonucleótido duplex E; Figura 4), clonado corn o vector pUClG, linearizado com SstI e EcoRI e cortado corn EcoRI e Ncol, obten do-se corno resultado o vector pl*10G424. 0 oligonucleótido sintético duplex D (Figura 4), que cornpreeende os tripletos finais de codif icação 5 para a sequência de sinal de cruciferina de Brassicanapus, a sequência que codifica os aminoãcidos 1.-6 de fitase madura e um sitio de clonação múltiplo, é clonado no vector pl*IOG424 cortado corn NcoI e Ncol e HindiII . 0 vector resul tante é designado pJ*IOG425. 0 fragmento PGR de cruA 3’ é clonado corno urn fragmento Bgl. I1/Hindi 1I ern pl*IOG425 digerido com Bgl. 11 e HindiII , obtendo-se corno resultado pM0G426.

b) Glpnação do Gene de Fitase...jdeAs^ergillus f icuujm no .VectorBinário plasrnidio pGB92'7, que contêrn a se quê n.....

eia de codificação de comprimento completo de fitase de Aspergillus ficuum, é digerido corn Xhol (parcialmente) e corn PstI. 0 fragmento Xhol/PstI, que compreende as sequências de ADN que codificam fitase rnadura desde o aminoácido 6 ern diante, é clonado no vector pM0G426, cortado corn Xhol e PstI. A partir do vector resultante pM0G428, insere-se a construção inteira que contém o gene de fitase quimérico corno urn fragmento de EcoRI/HindiII no vector binário pMGG23 linearizado com EcoRI e HindiII. D vector binário resultante pM(JG429 é mobilizado, nurn ajustamento triparêntico com a estirpe RK2013 de E_~..çoli K--12 (que contêrn o pias rni dio pRK20X3) (Ditta e col., supra) obten do-sea estirpe LBA4404 de Agr o b a c t eriu rn (Hoekema e col., 1993, supra ) , que contêrn o ρ 1 a s rn i d i o com t r a n s f e r e n c i a

a de Ϊ-ADN para a planta.

Exemplo 8

Expressão Especifica nas Sementes Estável de Ext ase ern

Sementes de Tabaco sob o Contraio de urn Promotor de

Gruoxferina

A estirpe L.BA4404 de A g r o b a c t e r i urn , con tendo o vector binário pl*IOG429 corn o cADN de fitase sob o controlo do promotor de cruciferina, ê utilizada para experiências de transf orrnação. A transformação do tabaco ( N i co t i a n at a b a curn S R1) r ealiza-se u t i 1 x zand o a c o c u 11 i v a ç ã o de discos de folha de acordo corn a maneira de proceder de Horsch e col., si.ijc>ra. As plantas trans genicas sao regeneradas a partir de rebentos que se desenvolvem ern rneio de selecção (100 mg/1 de canamicina). As plantas de tenra idade são ensaiadas relativamentc; â actividade de NPTI1 (resistência â canamicina) ., desenvolvidas atê â maturação & deixadas autopolinizarem-se e originarem sementes. As sementes de transformantes individuais sao reunidas e parte da amostra de sementes é ensaiada relativamente a presença de fitase. A partir de clones com os maiores niveis de expressão, em comparação corn sementes de controlo não transformadas, as sementes restantes são germinadas ern canamicina (200 rng/litro) . A partir dos dados obtidos corn as sementes S2 resultantes, selecionam- se as sementes hornozi góticas relat i v a rn e nte a Ν Ρ1 11 ( ρ o r t a n t o , t a rn b é rn r e 1 a t i v a rn e n t e ã f x t a s e) e são utilizadas para a propagação ern massa de plantas capazes de produzirem as quantidades máximas de fitase. Estas podem então ser usadas para, por exemplo, experiências de digestão.

Para determinar a actividade de fitase que se encontra nas sementes transgénicas, torna—se urna arnostra corn cerca de 50 rng de sementes e homogeneíza.....se nurn almofariz arrefecido com gelo ern 1 rnl de tampão de acetato de sódio 25 mM a pH 5,5. Depois de centrifugação, o liquido sobrenadante é ensaiado o orno se descreveu relativamente aos ensaios transientes. Em cinquenta e cinco plantas de tabaco independen ternente transformadas, observou-se urn nivel de expressão máximo de fitase igual a 0,15% da proteina total solúvel existente nas sementes. A actividade de fitase nao foi detectada em caules, raizes e folhas das plantas transgénicas. Não se detectou actividade de fitase em plantas não transformadas.

Exemplo9

I"rans1" o r rn a tç á ode Colza

Neste exemplo, descreve—se a transformação de colza por cocultivação de tecido da planta com Agrobacteriurn turnefac 1 ens contendo um vector binário com o gene de fitase quimérico. As: plantas transgénicas podem ser esool.fiidas oom base na resistência a antibióticos. As plantas transgénicas podem ser ensaiadas relativamente á actividade de fitase. As que exprimem maiores quantidades podern ser analisadas mais cuidadosamente e utilizadas em experiências posteriores.

Mobiliza—se a mesma construção de fitase quimérica num vector binário (pM0G429) na estirpe LBA4404 de eriumtumef ac:iens, de acordo oom uma manei r a semelhante á que se descreveu no exemplo 7. Esta estirpe pode ser u t i 1 izada para trans f o r rn ar c o 1 z a (Brassicanap us c v. Westar ) . Para esta finalidade, pré-condicionam-se segmentos de rebentos ccm as superfícies esterlizadas retirados de plantas oom cinco a seis semanas de idade, precisamente entes da floração, durante vinte e quatro beras, oom meio MS (Ery e col. (1987), Plant Ce 1.1. Reports 6, 921) com 1 rng/litro de BAP e, em seguida, cocuitivam-se durante quarenta e oito horas com Agrobacterium em placas frescas com o mesmo meio. As plântulas transgénicas são regeneradas a partir de rebentos que se desenvolveram no meio de selecção (500 rng/litro de

carbenicilina, 40 mg/litro cie paromomicina) e sao depois analizadas como se descreveu no Exemplo 8 para o tabaco.

Exemplo10

EnsaiodeActividadedeEitase

Moeu-se uma quantidade de material de plantas transgénicas que contêm no local aproximadamente 0,25 Ρ TU (pyij - unidades de actividade de fitase. Uma unidade de actividade de fitase é definida como a quantidade de enzima que liberta fósforo inorgânico de fitato de sódio 1,5 rnM com a velocidade de 1 rnicrornole/minuto a 37 °C e a pH 2,5). Como variante, esta quantidade de fitase pode ser extraída do material, da planta.

Incubou-se o material da planta rnoido num volume total, de 50 ml. de tampao de glicina/HCL 250 rnM, pll

2,5, contendo 0,86 grama de fitato de sódio.. ΙΙΗ2Ο- Muito embora o Aspergi, llus segregue fitase a um pH óptimo de 2,5, assim como a 5,5, escolhe-se um pH menor para excluir a actividade de fitase originada pela planta.

A mistura resultante é incubada durante quinze e sesenta minutos a 37°C. Interrompe-se a reacçao por adição de 5 ml. do material. incubado a 5 ml de TCA a 10% (ácido tricloroacético) .. Em seguida, adiciona.....se â solução de enzima com a reacção interrompida 10 ml. de reagente indicador (3,66 gramas de FeSl^./H^O ern 50 rnl. de solução de molibdato de arnónio (2,5 gramas de (NH4) Μογί ^!24 ^e θ fni óe ^2^θ4 concentrado, diluida até 250 ml. com água desmineralizada). Mede-se a intensidade da cor azul, espectrofotornetricarnente a 700 nm.

teor de fosfato inorgânico presente a

Γ---0 serve como ensaio em branco.

As determinações sao indicativas da quantidade de? fosfato libertada relativamente a orna curva de calibração de fosfato no intervalo de 0 - 1 mM.

.Exemplo 11

Incubação de ..Material deplantado.....Nie:çítiana TabacumMqido cornAlimenteis

Numa experiência típica, incuba-se 0,25 grama de farinha de soja extraída com dissolvente com uma quantidade de material da planta .Niqqtianatabacum moido contendo aproximadamente 0,25 PTU, corno se? descreveu acima, corn excepção da adição de? fitato de? sodio. Neste caso, o agente de incubação adicionado consiste-? nu rna mistura de? 410 ml de tarnpão e 90 ml de ãgua desmineralizada.

A libertação de fosfato a partir do fitato ern farinha de? soja extraída corn dissolvente? esta representada graficamente? na Figura 6. Sern se adicionar material vegetal moído, não se observa qualquer actividade?.

Nurna experiência virtualmente idêntica, obtêm-se os mesmos resultados usando glúten de milho como substrato. Os resultados obtidos corn as sementes transgénicas e s t ã o r e p r e? s e n ta dos n a F i g u r a 6.

Nao se observa actividade na ausência do material vegetal rnoído ou quando o material vegetal moído adicionado não con tern actividade de fitase.

Exemplo12

Ensaio in vitrode Material Vegetai Transgénico Contendo

Fi tase, em Condiçoes que Imitam q Tubo Digestivo., de.....Aves de

Capoeira

Para determinar a aeficãcia da fitase produzida no material de:? plantas de tabaco transgénicas, determina-· se? a actividade? de? fitase proveniente? de Asper36

gillus nurn modelo que imita as condições que se encontram no tubo digestivo das aves de capoeira.

Em primeiro lugar, incuba-se uma amostra de alimentos para aves de capoeira correntes a 1 grama/15 ml de água durante sessenta minutos a 39°C, para simular as condições presentes no desenvolvimento dos animais. Subsequentemente, adicionam-se 5 ml de solução de pepsina (Merck; 5,28 grarnas/litro, pH3,0 -- ajustada com HC1) , ajustase o pH a ph 3,0 com HC1 e continua-se a incubação durante mais noventa minutos á mesma temperatura para simular as condiçoes existentes no estômago.

Durante o periodo de incubação, retiram—

.....se amostras a fim de determinar a quantidade de fosfato libertada do fitato presente na alimentação.

A acção da fitase proveniente de fungas é evidente na Figura 7. Aumentando a dosagem de fitase cie 250 para 1000 PTU/quilograrna de alimento, obtem-se como resultado um aumento de libertação de fosfata da amostra de alimento.

Quando se adiciona uma amostra de material de plantas de tabaco transgénicas ou semente ou folha (linhas 413.25 e 413.32; depois da moagem em almofariz) em vez de fitase de fungos, observa-se uma libertação semelhante aumentada de fosfato (Figura 8) semelhantemente aumentada.

Material de plantas de tabaco de controlo, que não contém fitase, foi também ensaiado. Não se observou libertação de fosfato em comparação com o controlo do ensaio em branco.

A comparação dos resultados obtidos com 50 gramas de sementes de tabaco transgénico/quilograma de alimento com os obtidos com 500 e 750 PTU/quilograrna de

alimento indica que 1 grarna de sementes de tabaco é aproximadamente igual a 1.2 PT(J neste modelo de digestão de aves de capoeira efectuado in vitro. A comparação corn a amostra que utiliza material de folhas indica que 1 grama (peso fresco) de material de folhas de tabaco contém aproximadamente 25

PTU.

Exemplo1.3

Ensaiode animais

Realizam......se experiências com frangos para grelhar para mostrar a eficácia da fitase expressada em sementes de plantas, assim como a ausência de qualquer efeito negativo das sementes de tabaco sobre os resultados zootécnicos.

Colhem—se sementes de tabaco que exprimem fitase e sementes de tabaco que servem de controlo. As sementes são moidas em porções de 100 gramas corn urn peneiro (Retch—mill ZM1) que tem poros de 500 micrómetros, tendo o cuidado de conservar as sementes arrefecidas.

Pintos do sexo masculino corn urn dia de idade (Hybro) são alojados em gaiolas de bactérias para dois animais (0,45 rn^) . A temperatura ambiente é igual a 32°C durante os primeiros dois dias e depois diminui-se de 4°C na primeira se ma na. Em cada urna das semanas seguintes, diminui......se de 2°C a temperatura. Cs pintos são criados ern regime de urna hora de luz e três horas de escuridão.

As aves sao vacinadas contra a doença de New Castle corn a idade de urn dia, usando a vacinei Clone 30. Durante as experiências, os pintos são alimentados corn dietas experimentais de farinha ã vontade. Med ern—se as proporções de desenvolvimento e alirnen to/ganho durante os períodos experimentais . Mede—se a disponibilidade aparente do fosfato total durante urn periodo de três dias, durante o qual se rnede o consumo de alimento sob

a forrna de matéria seca entrada e se colectam quan ti ta ti varnen te os excrementos.

A disponibilidade aparente de fósforo é definida como a diferença entre a quantidade entrada de fósforo e a excreção de fósforo corn os excrementos.

U s a rn - s e a s s e g u i n t e s d i e t a s d e c o n t rolo, sern adiçao de fitase:

Dietas

Ca w

P Total U)

P de fitato (%)

1	0,60	0,45
2	0,75	0,60
3	0,90	0,75

0,30 0,30 0,30

à dieta .1. (dieta de base) , nao se adiciona fosfato ao alimento. As dietas 2 e 3 sao suplementadas corn cálcio e fósforo provenientes de uma mistura de fosfato dicálc ico . anidrido e de fosfato de rnon o-amónio (proporção 5:1). Todas as dietas experimentais sao obtidas por adições a dieta de base (veja-se tabela 1).

A dieta experimental 4 contêrn fitase de origern microbiana corn urna concentração de 400 PTIJ/quilograrna de alimento, preparada corno foi descrito por Van Gorcorn e col.. , sujar a) .

/

A dieta experimental 5 é semelhante á dieta 4, rnas á rnistura alimentar adicionaram-se sementes rnoidas de tabaco não trangénico, para se conseguir urna proporção final de 3 Kg/90 Kg de alimento.

A dieta experimental 6 é tarnbérn semelhante â dieta 4, mas adicionarn-se 3 quilogramas de sementes rnoidas de tabaco trangénico (linha 413.25) a urna rnistura de

guilogramas de alimento, para se obter uma concentração final de 400 PllJ/quilograma de alimento.

A experiência realiza-se com 176 pintos em dezasseis gaiolas ern bateria (onze pintos por gaiola oom bateria) até à idade de vinte e quatro dias.

Os tratamentos (dietas) são repetidos duas vezes e sao atribuidos ao acaso a cada animal das gaiolas.

Mede.....se a disponibilidade do fósforo a partir de vinte e um a vinte e guatro dias de idade.

Os resultados relativamente â disponibilidade de fósforo e ao desenvolvimento dos animais alimentados oom as dietas 4,5 e 6 demonstram o efeito positivo da adição de fitase ( labela 2). A comparação entre as dietas 4,5 e 6 demonstra também que a inclusão de sementes de tabaco no alimento é compatível oom a acçao da fitase microbiana no canal gastrointestinal de aninais de criação, tais como pintos, e não apreseri ta quaisquer efeitos negativos sobre os resultados zootécnicos..

Conquanto a presente invenção tenha sido descrita oorn referência a suas forrnas de realização especificas , os peritos no assunto sabem gue são possíveis vãrias alterações e modificações sem afastamento do real espirito e do objectivo da presente invenção. Além disso, podem fazer-se rnuitas modificações para se adaptarem a uma s i t u a ç: ã o p ar t i c u 1 a r , m a t e r i a 1., ρ 1 a n t a s, s e m e n t e, p r o c e s s o , operação ou operações do processo, ao objectivo, espirito e finalidade da presente invenção. Iodas estas modificaçÕes pretendem.....se gue sejam incluidas no âmbito das reivindicações anexas.

TABELA 1

Composição da Dieta de Base Usada	e rn Ε xperi ên c 1 a s	corn Pintos
I n g r e d i e n t e s	Teor (g/kg)
Milho Amarelo	280,0
Sorgo (pequeno teor de tanino)	200,0
Farinha de semente de girassol
( e x t r a ida c o rn d i s s o 1 v e n t e)	80,0
Farinbei de sernente? de soja
( e x t r a i d a c o rn d i s s o 1 v e n t e , 4 8,8 %
de? proteínas)	350,0
Óleo de soja	58,5
Vitaminas*	5,0
Sa i s rn i n e? r a i s *	15,0
Calcário	1,0
M e t i o n i n a s i n t é t i c a	1,0
l>'2°3	0,5
	1001,0
ME (MJ/Kg)	::1..3, i
Lisina	12,9
Metionina + cisina	9,1
Cálcio	6,0	(6,0 -6,6)**
Fósforo total	4,5	(4,7-4,7)**
Fósforo orgânico fitico	3,0	(3,1-3,1)**

* Quantidade fornecida por quilograma de dieta: 12.000 UI de vitamina A; 2..000 UI de Vitamina Dq; 5 UI de vitamina E; 1,5 mg de vitamina K3; 1 mg de tiarnina: 5 mg de riboflavina; 1 mg de piridoxina; 30 mg de ácido nicotínico; 7,5 mg de ácido D-pantoténico; 0,015 mg de vitamina B12; 0,5 mg de ácido fólico; 350 mg de cloreto de colina; 75 mg de etoxiquinq.; 9,5 gramas de CaCGq; 2,5 g de NaCl; 0,26 g de EeSD^; 0,24 g de MnS04; 45 mg de 61.1SO4 ; 80 mg de ZnSO^; 105 mg de Kl (mistura).

( ) analizados parei experiências 1 e 2, respectivamente

ξ.ί..2.ί..ί:.2......da _j;~.......sobre......a Ds spon i !::' :i. 1da cie

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Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - 19 Processo para a obtenção de plantas ou de orgãos de plantas transgénicas contendo urna quantidade intensificada de urna fitase, caracterizado por se transformar urna planta hospedeira corn urn material construído de expressão contendo urna sequência de ADN que codifica a fitase opera— velrnenete ligada a sequências de regulação capazes de controlar a expressão da fitase na planta hospedeira e se cultivar a planta transf orrnada ern condições tendentes a expressar a sequência de ADN que codifica a fitase.

   c a r a c ter' i z a d o expressão ser especifica do

   ..... 29 Processo de acordo corn a reivindicação 1, pelo facto de o material construído de capaz de controlar a expressão da fitase tecido.

   ... 3 a ...

   Processo de acordo corn a reivindicação X, caracterizado por se obter a sequência de ADN que codifica a fitase a partir de urna fonte microbiana.

   - 59 Processo de acordo corn a reivindicação 4, caracterizado por se obter a sequência de ADN que codifica a fitase a partir de urna fonte constituída por urn fungo filamentoso.

   Processo de acordo coro a reivindicação 5, caracterizado por se obter a sequência de ADN que codifica a fitase a partir de Asρergi11us.

   - 7ã Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se obter a sequência de ADN gue codifica a fitase a partir de urna espécie de Aspergillus escolhida do grupo gue consiste ern Asper gillus fiou urn, Asper gillus niger,

   PDF 9Í 1.1 3VJ3[nor i ° Aspergillus nidu 1ans .

   - 8 a ....

   Processo para a preparaçao d urn material construído de expressão, caracterizado por se ligar operavelmente urna sequência de ADN que codifica urna fitase com uma sequência de regulação que ê capaz, de controlar a expressão c o n s t i t u t i va d a f i base ..

   ..... 93 ·.Processo para a obtenção de urn vector de expressão, caracterizado pelo facto de este conter urn material construído de expressão de acordo com a reiv i n d i c a ç a o 8 .

   ···· 103 Processo para a obtenção duma estirpe ba eter iana, caracterizado pelo facto de esta conter urn vector de acordo corn a reivindicação 9.

   - i. ::1..3 Processo para a preparação dum material construído de expressão, caracterizado por se ligar operalvelrnente uma sequência de ADN a urna sequência de regulação capaz de controlar a expressão da fitase especifica do teoido.

   as -

   Processo para a obtenção durn vector, caracterizado pelo facto de este conter urn material. construído de expressão de ac ordo corn a rei.vind: icação 11. .... 13$ ·· Processo parei a obtenção d urn a estirpe bacteriana, caracterizado por se i n t ro d u z i. r η o seu con Junto de genes nurn vector de acordo cotn a r ei v i. n d i. o a ç i ão 12.

   14$

   Processo transgénioa ou do um caracterizado polo facto de orgão da planta conter um para a obtenção de orgão de plantei a mencionada plantei rn a t e r i a 1 c o n s t r u i d o uma planta transgénioa, ou o citado de expressão urna fitase que contém uma sequência de ADN que codifica operavelrnente ligada a sequências de regulação capazes de controlar a expressão da fitase na planta hospedeira.

   - 15$ Processo para a transformação de fitato urn inositol e fosfato inorgânico, caracterizado por se aplicar a urn substrato que oontérn fitato uma fitase obtida pelo processo de acordo corn qualquer das reivindicações 1 a

   7.

   ..... 16$

   P r oo e s s ο ρ a r a a 3. i. rn e n t a r es , o a r a o t e r i z a d ο ρ o r , incorporar urna fitase preparada reivindicações 1 a 7.

   a preparaçao de composições referidas composiçoes, se de acordo corn qualquer das

   - 17 Processo para a preparaçao de alimentares, de acordo corn a reivindicação o o rn ρ o s i. ç Õ e s

   16, ca r acterizado por nas mencionadas composições, se incorporarem plantas transgénicas ou orgaos de plantas transgénicas contendo fitase, obtidos pelo processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7.

   -· 199 Processo para promover o crescimento de animais, caracterizado por se alimentar os citados animais corn uma dieta que compreende um alimento de acordo com a reivindicação 16 numa quantidade eficaz para promover o crescimento dos animais que ingerem o referido alimento.

   - 199 Processo para promover a redução dos níveis de teores de fitato no estrume produzido por animais, caracterizado pelo facto de se alimentar os animais com uma composição alimentar de acordo com a reivindicação 16, numa quantidade eficaz para transformar o fitato contido nos alimentos em inositol e fosfato inorgânico.

   209 Processo para a preparação de fitase, c a r a c t e r i z a d ο ρ o r

   a) se transformar uma planta hospedeira por um material construído de expressão que contêm urna sequência de ADM que codifica a fitase operavelmente ligada a sequências de regulação capazes de controlar a expressão durna quantidade intensif ica dei de fitase na planta hospedeira e se cultivar a planta transformada em condiçoes tendentes a expressar a sequência de ADN que codifica a fitase nos tecidos da planta; e

   b) se extrair a fitase do teoido da ρ 1 a n t a t r a n s g é n i c a .

   (\ requerente reivindica a prioridade dos pedidos de patente norte.....americanos apresentados em 23

   Março de 1990 e em 21 de Setembro de 1990, sob os numeros sé r i.e 499 , b 61 e b88,78b , r e s p e c t i v a rn e n t e .

   Lisboa 22 de Março de 1991.

   AGENTE OFICIAL DA PKOPBIEDADE INDUSTRIAL de de