PT97111A - Processo para a obtencao de plantas ou de orgaos de plantas transgenicas contendo quantidades intensificadas de fitase - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO DA PATENTE DE INVENÇÃO N.° 97111 REQUERENTE: GIST-BROCADES N.V., holandesa, industrial e ccmercial, com sede em Vfateringseweg 1, ΡΛ. Booc 1, 2600 M Delft, Pafses Baixos e de M3GEH International N.V., holandesa, industrial e comercial, com sede em Eins-teinveg, 97,2333 CB LEIDEN, Países Baixos. EPÍGRAFE: "PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE PLANTAS TRAN9GÊNICAS CONTENDO QUANTIDADES INTENSIFICADAS DE FITASE" INVENTORES: Jan Pen, Andreas Hodierna, Peter Christiaan Sijmons, Krijn Rietveld, Teunis Comei is Venperd e Albert J.J. van Ooyen

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883. Países Baixos de 23 de Março de 1990 e em 21 de Setenfcro de 1990, sob os nímeros de série 498,561 e 586, 765 INP1. MOO. 113 R f 16732 » r

Descrição referente à patente, de invenção de GIST—BRUCADES N.V., holandesa, industrial e comercial, corn sede ern Wateringseweg 1, P.O. Box 1, 2600 MA Delft, Paises Baixos e de MOGEN International N.V., holandesa, industrial e comercial, com sede em Einsteinweg, 97, 2333 CB I...EIDEN, Paises Baixos (invento-res: Jan Pen, Andreas Hoekerna, Peter Christiaan Sijrnons, Krijn Rietveld, Teunis Cornelis Verwoerd e Albert J.J. van Ooyen residentes na Holanda), para "PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE PLANTAS OU DE ORGÃOS DE PLANTAS TRANSGÊNICAS CONTENDO QUANTIDADES INTENSIFICADAS DE FITASE" DESÇRI£Sg ,Q§.ÍÍ1PL!.......da......Invenção à produção da fitase A presente invenção· refere-se de fitase em plantas transgénicas e á utilização assim produzida em processos industriais. £n.guadramento.....Geral.....da... Invenção 0 fósforo é urn elemento essencial para o desenvolvimento de todos os organismos. Na produção animal, a al irnentaç:ão deve ser suplementada corn fósforo inorgânico a fim de se obter urn bom comportamento de crescimento de animais rnonogástricos (por exemplo, porcos, aves de capoeira e • peixes). - 1 -

Em contraste, não é preciso adicionar fosfato inorgânico aos alimentos ruminantes. Os microorganis-mos presentes no rurnen produzem enzimas que catalizam a transformação de fitato ( mio-inositol-hexaquis-fosfato) corn obtenção de inositol e de fosfato inorgânico. 0 fitato acorre coma fonte de armazenagem de fósforo em praticamente todas as substâncias alimentares derivadas de? plantas (para uma revisão do assunto, veja-se “Phytic acid, chemistry and applications", Ed. Graf, Pilatus Press, Minneapolis, MN, Estados Unidos da América (1986)). 0 fitato constitui 1 a 3% de todas as nozes, cereais, legumes, sementes oleosas, esporos e pólen. Os sais complexos de ácido fítico sao designados fitina. 0 ácido fitico é considerado um factor antinutricional porque actua como agente quelante de substâncisa minerais tais como cálcio, zinco, magnésio» ferro , e pode também reagir corno proteínas, diminuindo desta forma a biodisponibilidade de proteínas e de sais minerais n u tr ic ion a 1 me n te i rn p o r t a n te s . 0 fósforo dos fitatos passa através do canal gastrintestinal dos animais monogâstricos e é excretado como dejector. Embora alguma hidrólise do fitato possa ocorrer no cólon, o fósforo inorgânico assim libertado não tem valor nutritivo visto que o fósforo inorgânico é absorvido apenas no intestino delgado. Como consequência, uma quantidade significativa de fósforo nutricionalmente? importante nao é utilizada pelos animais monogâstricos, nao obstante a sua presença nos alimentos. A excreção do fósforo do fitato através dos dejectos tem outras consequências. A produção animal intensiva tem aumentado enormemente durante as últimas décadas. Consequentemente, a quantidade de esterco produzido aumentou correspondentemente e tem provocado problemas ambientais ern várias partes do mundo. Isto deve-se em parte à acumulação de

fosfato proveniente dos dejectos ern aguas superficiais, que provocou a eutrofização.

As enzirnas produzidas por rnicroorganisrnos que catalisam a transformação de fitato em inositol e fósforo inorgânico sao geralrnente designadas como fitases. Os rnicroorganisrnos que produzem fitases compreendem bactérias tais como Bacillus subtilis (V.K. Paver e V.J. Jagannatban (1982), J. Bacteriol. 151. 1102) e Pseudornonas (D.J. Cosgrove (1970), Austral. J. Biol. Sei. 23, 1207); leveduras tais corno Saccha-romyces cerevisiae (N.R. Nayini e P. Markakis (1984), Lebens-rnittel Wissenschaft und Technologie 17, 24) ; e fungos tais como Aspergillus terreus (K. Yarnada, Y. Minoda e S. Yarnamoto (1986), Agric. Biol. Chern. 32, 1275). Conhecem-se várias outras espécies de Aspergillus que produzem fitases, das quais a fitase produzida por ______ficuum se verificou possuir um dos inais elevados níveis de actividade especifica, assim como ter melhor termoestabilidade do que as fitases produzidas por outros rnicroorganisrnos (Van Garçom e col. (1.9 91) , P e d i d o d e P a t e n t e E u r op e i a 89202436.5, Pu bl i c a ç ã cr N ú -mero 0 420 358, depositado em 27 de Setembro de 1989).

As fitases estão também enclogenamente presentes em muitas espécies de plantas (veja-se f-.A. Loweus (1990), "Plant Biology" , Volume 9: "Inossitol rnetabolisrn in plants” (Ed. D.J. Mor ré, W.F. Boss, F.A. Loweus) 13), K.S. Gellatly e D.D. Lefebvre (1990), Plant Physiology (suplemento), 93, resumo 562) mencionam o isolamento e a caracterização de um clone de oADN de fitase obtido a partir de tubérculos de batata- D.M. Gibson e col. e A.A. Christen e col. (1988), J. Cell Bichem. 12C, resumo L.407 e L.402, respectiva-rnente) , mencionam a síntese de fitase? endógena durante a germinação de sementes de soja. No entanto, as fitases de plantas sao normalmente produzidas ern quantidades insuficientes para a sua aplicação ern processos industriais, per se. 3

A ideia de adicionar fitases microbianas aos alimentos de animais rnonogástricôs foi Já anteriorrnente descrita (J.H. Ware, L. Bluff e T.R. Shieh (1967), Patente de Invenção Norte-Americana Numero 3 297 548; T.S. Nelson., I.R. Shieh, R.J. Wodzinski e J.H. Ware (1971), J. Nutritíon 101, 1289). Hoje em dia, no entanto, a aplicação deste conceito não tem sido cornercialrnente possivel devido ao elevado custo de prod-ução de enzimas microbianas (Y.W. l-lan (1989), Animal Feed Sei. and Technol. 24, 345). Por razoes de ordem económica, o fósforo inorgânico é ainda adicionado aos alimentos de animais rnonogás tricas.

As fitases têm também outras utilizações industriais. Corno exemplos dessas utilizações, cita-se o processo industrial de produção de amido a partir de cereais tais corno o milho e trigo. Os produtos residuais, que compreendem, por exemplo, glúten de milho, obtidos a partir do processo da rnoagern em húmido, são vendidos corno alimentos para animais. Durante o processo de maceração, a fitase pode ser suplementada. As condições (T~50°C e pH=5,5) são ideais para as fitases de fungos (veja—se, por exemplo, o Pedido de Patente buropeia 0 321 004 de Alko Ltd.). Vantajosamente, os alimentos para arrimais derivados dos produtos residuais deste processo contêm fosfato ern vez de fitato. fambérn se concebeu que as fitases podem ser utilizadas no processamento de soja (veja—se Finase ^ ^ bnzymes toy ..Alko, urna brochura de informação sobre produtos publicada por Alko Ltd., Rajarnaki, Finlândia). A farinha de soja contém elevados níveis de fitato factor antinutricional que tornei este produto não apropriado para a aplicação corno alimento para crianças e ern alimentos para peixes, vitelos e outros ruminantes. A degradação enzirnática desta fonte valiosa de proteína melhora o valor nutritivo e comercial deste material. 4

A p0ssi.t3rili.dade de utilização de plantas transgénicas corno sistema de produção de proteínas valiosas foi também já proposta. São exemplos actuais a produção de interferao em tabaco (R.M. Goodman, V.C. Knaut, G-M- Houck e L. Cornai (1987), PCT/WG 87/00865), de encefalinas em tabaco,

Brasslca napus e Arabtdopsis____thaliana (J . Vandekerckhove, J. van Darnrne, M. van Li. j sebe t tens, J. Botterrnan, M. UeBlock , A. DeClerq, j. Leemans, M. van Montagu e Εΐ. Krebbers (1989), Bio/Technol. 7, 929), anticorpos ern tabaco (A. Hiatt, R. Caf ferkey e l<. Boedish (1990), Nature 342, 76) e de albumina de soro humano ern tabaco e em batata (P.C. Sijmons, B.M.M. Dekker, B. Schrarnrneijer, T.C. Verwoerd, P.J.M. van den Elzen e A. Hoekema (1990), Bio/Technol. E3, 217).

Na prática, a transformação de um número crescente de espécies de plantas, especialmente de espécies de dicotiledõneas (por exemplo, tabaco, batata, tornate, Petunia, Brassica) , tornou-se urna -maneira de proceder de rotina para os trabalhadores peritos no assunto (H. Klee, R. Horsch e S. Rogors (1.987), Annu. Rev.. Plant Physiol. 38, 46?; C.S. Gasser e R.T. Fraley (1989), Science 244. 1293). Estratégias para a expressão de genes estranhos em plantas tornaram-se bern estabelecidas (Grasser e Fraley, supra) . Identificaram—se sequências de regulação de genes de plantas que sao utilizadas para a construção de genes quiméricos que podem ser funcionalmente expressos ern plantas e células vegetais.

Para a introdução de construções de genes nas plantas, hã â disposição diversas tecnologias, tais como t r a n s f or rn a ç a o c o rn Agro b a c t e r ::L u rn t u 1 n ef a cl. e n s o u A . rhizogenes. Usando esta estratégia, explorou-se uma larga variedade de tecidos vegetais, sendo a escolha largamente dependente da espécie vegetal e da sua possibilidade de ser levada ao contacto com a cultura de tecidos. Os exemplos que obtiveram êxito são a transformação de protoplastas, rnicrosporos ou pólen e partes retiradas de plantas tais corno folhas, talos, 5

raízes, hipocõtilos g cótilos. Alérn disso, os métodos para a introdução directa de ADN em protoplastas e em células ou tecidos vegetais são tambérn utilizados, tais corno micro-inJec-çao, electroporação, bombardeamento de partículas e absorção directa de ADN (Gasser e Fraley, supra)-

As proteínas podem ser produzidas em plantas utilizando uma larga variedade de sistemas de expressão. Por exemplo, a utilização de urn promotor constitutivo tal corno o promotor 35S de vírus de mosaico da couve-flor (CaMV) (H. Guilley, R.K. Dudley, G. Jonard, E. Balazs e K..E. Richards (1982), Cell 30. 763) tem corno resultado a acumulação da proteína expressada ern todos os orgãos da planta transgénica. Corno variante, podem usar-se promotores de genes que codificam proteínas que são expressas de urna maneira muito especifica do tecido e especifica da fase de desenvolvimento do tecido (T.J.V. Higgins (1984), Annu. Rev. Plant Physiol. 35, 191; Μ.A. Shotwell e B.A. Larkins (1989), in The Biochernistry of Plants, Vol. 15 (Academic Press, San Diego, Ed. P.K. Sturnpf e E.E. Conn), 297), isto é, os genes são expressos apenas no tecido pretendido e apenas durante a fase de desenvolvimento pretendida. É conveniente que o procedimento económico para a produção de fitase .seja um beneficio significativo para, entre outras, a indústria de alimentos para animais. Urn processo rnais económico para a produção de fitase seria a u-tilização de técnicas de ADN recornbinante para produzir plantas transgénicas ou orgãos de plantas; transgénicas capazes de expressarem fitase, que poderiam por sua vez ser adicionados tal e qual, por exemplo, ao alimento para animais ou aos produtos alimentares para consumo directo dos animais;. Como variante, a fitase expressa nestas plantas; transgénicas ou orgãos de plantas transgénicas poderia ser extraída e, caso assim se pretendesse, purificada para a aplicação desejada. 6

Sumário da invencão A presente invenção refere-se á expressão de fitas© ern plantas transgénicas ou ern orgaos de plantas transgénicas e aos métodos para a produção dessa® plantas. Isso consegue-se por introdução na planta de um construto de expressão que compreende urna sequência de? ADN que codifica urna proteina com ac ti vi da de da fitase.

As construções de expressão de ADN proporcionadas pela presente invenção para a transformação de plantas estão sob o controlo de sequências de regulação capazes de dirigir a expressão de fitase. Estas sequências de regulação podem também incluir sequências capazes de dirigir a transcrição ern plantas ou constitutivamente ou especifica— mente no estágio de desenvolvimento e/ou no tecido, dependendo da utilização da planta ou das suas partes.

As plantas transgénicas e os orgãos vegetais transgénicos proporcionados pela presente invenção podem ser utilizados nurna larga variedade de processos industriais ou directamente, por exemplo, na alimentação de animais ou na produção de alimentos para animais ou, como variante, a fitase? expressa pode ser extraída ou, caso assim se pretenda, pur ifica da antes da a ρ1i ca çao.

Breve descrição das Figuras A Figura 1 representa a estratégia para a clonação de cADN de fitase. A Figura 2 representa a sequência de nu— cleòtidos da região transcrita do fragmento de cADN de fitase e da sequência de arninoácidos derivados da proteina da fitase; o inicio da proteína de fitase madura é indicado corno posição "+1"- 7

A Figura 3 representa um vector binário, PM0G23. A Figura 4 representa oligonucleótidos duplos usados na clonaçao. A Figura 5 representa o plasmxdio pM0G29; e o plasrnidio pl.)C1.8 que contém uma cassete de expressão para expressão constitutiva ern plantas e uma sequencia que codi— fica um péptido de sinal ern tabaco. A Figura 6 representa os efeitos resultantes da adição de sementes moídas contendo fitase sobre a libertação de fósforo inorgânico de fitato. A Figura 7 representa a relação da resposta corri a dose de fitase de Aspergillus num modelo de digestão In vitro. A Figura 8 representa a relação dose-res-posta de fitase de Aspergillus e de fitase contida em sementes de tabaco num modelo de digestão in vitro.

Descrição Por men or 1. z a da.....da......Invenção

De acordo com a presente invenção, obtêm..... se plantas transgénicas ou orgaos de plantas transgénicas ern que se produz fitase. Isto consegue-se por introduçao na planta de urn construto de expressão que compreende uma sequência de ADM que codifica uma proteína tendo actividade de fitase. A presente invenção proporciona construções de expressão de ADN para a transforrnaçao estável de plantas com um gene que codifica urna fitase. fcstas constru-

çoes compreendem urna sequência de ADN que codifica uma fitase que è operavelmente ligada a sequências de regulação capazes de dirigir a expressão de> fitase. Estas sequências de regulação podern tarnbém incluir sequências capazes de dirigir a transcrição ern plantas ou construtivamente ou especificarnente no estágio de desenvolvimento e/ou do tecido, dependendo da utilização da planta ou das suas partes.

As construções de expressão proporcionadas pela presente invenção podern ser inseridas num vector, preferivelmente urn plasmídio, usado na transformação mediada por bactérias da planta hospedeira seleccionada. A construção de expressão é então preferivelmente integrada no genorna da planta hospedeira.

Dentro do contexto da presente invenção, o termo fitase abrange urna família de enzimas que catalisam as reacçoes que envolvem a libertação de fósforo inorgânico e de vários tosfatos de mio—inositol. Pretende—se que abranja todas as proteínas com aatividade de fitase. A sequência de ADN que codifica a fitase pode ser obtida a partir de uma variedade de fontes, tais corno fontes microbianas, vegetais ou animais. Preferivelmente, a sequência de ADN é obtida de urna fonte microbiana tal como o fungo filamentoso Aspergillus. As sequências mais preferidas de ADN são obtidas a partir de Aspergillus ficuurn. A. niger, A. awamori e A. nidulans. A clonação de um gene ou de urn cADN que codifica urna proteína de fitase pode conseguir-se utilizando vários rnétodos. Urn método consiste na purificação da proteína da fitase, na subsequente determinação da extremidade N e de diversas sequências de arninoácidos internas e na escolha de • urna biblioteca genórna ou de cADN do organismo que produz a 9 - fitase, utilizando amostras de oligonucleótidos baseadas nas s e q u ê n c i a s d o s a rn i η o á c i do s .

Se se conhece pelo menos urna sequencia parcial do gene, esta informação pode ser utilizada para clonar o correspondente cAON, usando, por exemplei, a reacção de cadeia depolirnerase (PCR) ( "PCR Technology: Principies and Aplications for DNA Amplification“ (1989), Ed. H.A. E h r 1 i c h , S t o c l< t ο η P r e s s , Mo v a I o r q ue) . É evidente para os peritos no assunto que o gene de fitase clonado acima descrito pode ser utilizado em experiências de hibridizaçao heterõlo9a» dirigidas para o isolamento de; genes que codificam fitase a partir de outros rn i o r o o r ga n i s rn o s .

De acordo corn outro aspecto, o gene de fitase clonado acirna descrito pode ser utilizado como material de partida para a construção de fitases de "segunda geração" são fitases, alteradas por técnicas de rnutagénese (por exemplo, rnutagénese dirigida para o sitio), que têm propriedades que as tornam diferentes das fitases de tipo natural ou das f itases recornbinantes, tais corno as produzidas de acordo corn a presente invenção. Por exemplo, a temperatura óptima ou o pH óptimo, a actividade especifica ou a afinidade do substrato podem ser alterados de rnodo a rnelhor se adaptarem a aplicação num processo definido. 0 isolamento da fitase que codifica cADN permite a construção de construções de expressão capazes de dirigirem a produção de fitase na planta hospedeira escolhida por intermédio da aplicação de técnicas de ADN recornbinante, tais corno troca de elementos de regulação como, por exemplo, promotores, sinais de segregação ou suas c o rn b i n a ç Ó e s. - 10

A fitase pode ser produzida constitutiva— mente em plantas transgénicas durante todas as fases de desenvolvimento. Dependendo da utilização da planta ou dos or~ gãos desta, as enzimas podem ser expressadas de urna maneira especifica do estágio de desenvolvimento, por exernpio, durante a formação de tubérculos ou durante o desenvolvimento dos frutos. Também dependendo da utilização, as enzimas podem ser expressas especificamente no tecido, por exemplo, em orgaos de plantas tais como frutos, tubérculos, folhas ou sementes.

As plantas transgénicas, como se define no contexto da presente invenção, incluem plantas (assim como partes e células das referidas plantas) e a sua progénie que foram geneticamente modificadas utilizando técnicas de ADN recornbinante para provocar ou aumentar a produtção de uma ti— tase na planta desejada ou no orgao desejado.

No contexto da presente invenção, a expressão "quantidade aumentada de fitase" refere-se especiti-carnente a uma quantidade estatisticamente significativa de tecido da planta que, em média, contém uma quantidade estatisticamente significativamente maior de fitase em comparação corn a quantidade média de fitase de enzima encontrada numa quantidade igual de tecido de planta não modificado.

Dentro do contexto da presente invenç:ão, as plantas a escolher, mas não se limitando a estas, incluem plantas que produzem flores comestíveis, tais como couve-flor (Brassica oleracea), alcachofra (Cynara____scolvmus), frutos tais como rnaçâ (por exernpio, Malus dornesticus) , foanana (por exemplo. Musa........acuminata), bagas (tais como groselha, por exernpio, Ribes rubrurn) , cerejas (tal corno cereja-dos— passarinhos, por exernpio, Prunus avium) , pepino (por exernpio, Cucu— rnls sativus) , uvas (por exernpio, Vitis....... vinifera) . lirnão (Ci- trus llrnon) , melão (Cucurnis melo) , nozes ( tais corno noz de 11

ncigu0±r a, por exeπιρIo , Jug 1.ans regia ; arn0ndoirn , Ar§c:_t.iis......hy.P£2i:. goaçi) , laranja (por exernpXo, Ci.trus______) » pessegu (por exemplo, Prunus pérsica) , pera (por exemplo, Pyra comniunis) , ameixa (por exernplo, Prunus jdPj^sjtáLça) , morango (por exemplo·, f- r a g a r i a rn o s c: h a t a) , tomate (por exernplo, Lycopersicon escu- lenturn) , folhas, tais corno alfafa (por exernplo, Medicago sativa) , couves (por exemplo, Brassioa o1er a ce a), endivias (por exernplo, Çijçhoreum _endiyia) , alho—porro (por exernplo, Allljjrn pcirriirn) , alface (pior exemplo, Irf1^tllí-il.....satdya) , espinafre (pior exemplo, Spinacia oleraceae), tabaco (por exemplo, Nicotiana tabacurn) , raízes, tais corno araruta (por exemplo, Maranta arundinacea) , beterraba (por exemplo, Beta vulgaris) , cenoura (pior exemplo, Daucus carota) , mandioca (pior exemplo, Manihcrb escu lenta) , nabo (por exernplo, Brassica....... rapa) , rabanete (por exernplo, Rapl'ianus sativus) , inhame (por exernplo, Jli^scorea esculenta), batata-doce (Ipomoea batatas) e sementes, tais corno feijão (por exemplo, Phaseolus vulgaris) , ervilha (pior exemplo. Pisum savitum) , soja (pior exemplo, tàlycina_______max), trigo (por exemplo, Tr 1.1icum aes11.vurn) , cevada (pior exemplo, Hordeum vulgare) , milho (pior exemplo, Zea mays) , arroz (pior exemplo, Oriza sativa), colza (Brassica________napus), sorgo (Pani- cum L.), girassol (Helianthus annus), aveia (Avena sativa). tubérculos, tais corno rábano (pior exernplo, Brassica oleraceae) , batata (pior exemplo, Solanurn tuberosurn) 0 semelhantes. A escolha da planta é pirincipalmente determinada pela utilização pire tendida da planta ou das suas partes e pela possibilidade de transformar essa espécie.

Estão disponíveis diversas técnicas para a introdução da construção de expressão que contérn a sequência de AON que codifica a fitase nas plantas que se pretendem transformar. Essas técnicas incluem, mas não se limitam, a transformação de protoplasta utilizando o rnétodo do cálcio/ /polietilenoglicol, electroporaçao e rnicro-in jecção ou bom- 12 ^.nasaura——— rU°% itUKsaaotiíU»' (I. Potrykus (1990), bardearnento corn partículas (revestidas) Bio/Technol. 8, 535).

Alèrn destes métodos de transtormaçáo de AON chamados directos, os sistemas de transformaçao que envolvem vectores estão largamente disponíveis, tais como vec-tores de vírus (por exemplo, do vírus de mosaico da couve --flor (CaMV) e os outros vectores bacterianos (por exemplo, do género A g r o ta a c t e r 1. um) (Potrykus, supra) . Depois da selec-Ção e/ou da escolha, os protoplastas, células ou partes da planta que foram transformados podem ser regenerados corn a obtenção de plantas completas utilizando métodos conhecidos na técnica (R.B. Horsch, J.E. Fry, N.L. Hoftmann, D. Eichboltz, S.G. Rogers e R.T. Fraley (1985), Science 227, 1229). A escolha das técnicas de transformação e/ou de regeneração nao é critica para a presente invenção.

Para plantas dicotiledóneas, uma forma de realização preferida da presente invenção utiliza o principio do sistema do vector binário (A. Hoekerna, P.R. Hirsch, P.J.J. Hooykaas e R.A. Schilperoort (1983), Nature 303, 179; R.A.

Schilperoort, A. Hoekerna e P.J.J. Hooykaas (1984), Pedido de Patente de Invenção Europeia Numero 0 120 51.6) , no qual se utilizam estirpes de Aqrobacteriurn que contêm um plasrnidio vir com os genes da virulência e urn plasrnidio compatível que contém a construção do gene a ser transferido. Este vector pode replicar-se tanto ern E........coli como ern Agrobacteriurn e deriva do vector binário Binl9 (14- Bevan (1984), Nucl. Acids Res. 12. 871.1), que é alterado ern pormenores que não sao relevantes para a presente invenção. Os vectores binários tal como são utilizados nestes exemplos contêm entre as sequências da extremidade da esquerda e da extremidade da direita do T--ADN urn gene ΝΡΊΊΙ idêntico que codifica a resistência a ca— narnricina (Bevan, supra) e urn sitio de clonação múltiplo para • clonar nos construtos dos genes pretendidos. 13

A transformação e a regeneração das culturas de rnonocotiledóneas não é urna maneira de proceder usual. No entanto, os recentes progressos científicos mostram que, ern principio, as rnonocotiledóneas podem ser obrigadas a sofrer transformação e que plantas transgénicas férteis podem ser regeneradas a partir de células transformadas. 0 desenvolvimento de sistemas de cultura de tecido reprodutível para estas culturas, em conjunto com os métodos poderosos para introdução de material genético em células vegetais, facilitou a transformação. Presentemente, os métodos de escolha para a transformação de rnonocotilidõneas são o bombardeamento com microprojécteis de células extraídas de plantas ou em suspensão e a absorção directa de AON ou a electroporação de prato— plastas. Por exemplo, plantas de arroz transgénicas foram obtidas com êxito utilizando o gene bacteriano hph, que codifica a resistência à higrornicina, como marcador de selecçao. 0 gene foi introduzido por electroporação (K. Shirnarnoto, R. Terada, T- Izawa e H. Fujimoto (1989), Nature 338, 274). Plantas de milho transgénicas foram obtidas introduzindo o gene de Streptoroyces hygroscopicus bar que codifica fosfino-tricina-aeetiltransferase (uma enzima que inactiva o herbicida fosfinotricina) em células embriogénicas de uma cultura de suspensão de milho por bombardeamento com micropartículas (W.J. Gordon-Kamm, T.M. Spencer, M.L. Man gano, T.R. Adarns, R.J. Oaines, W.G. Start, J.V. 0’Brien, S.A. Charnbers, W.R. Adarns Jr, N.G. Willets, Γ. Eí. Rice, C.J. Mackey, R.W. Krueger, A.P. Kausch e P.G.. Lernaux (1990), The Plant Ge 11 2, 603). A introdução de material genético em protoplastas aleu-rónicos de outras culturas rnonocotiledóneas, tais corno trigo e cevada, foi já referida (B„ Lee, K. Murdoeh, J. Topping, M. Kreis e M.G.K. Janes (1989), Plant Mol. Biol. 13, 21). Regeneraram-se plantas de trigo a partir de culturas ern suspensão embriogénicas escolhendo apenas os tecidos do caule ernbrigé-nico compacto envelhecido e nodular para o estabelecimento das culturas ern suspensão ernbriogénica (V. Vasil, F. Redway e I.K. Vasil (1990), Bio/Technol. 8, 429). A combinação com os 14

sis ternas de transtonnaçao parei essas culturas permite a aplicação da presente invenção as plantas rnonocotiledóneas. Estes rnétudus podern também ser aplicados para a transformação e para a regeneração de plantas dicotiledõneas. A expressão do construto de fitase envolve pormenores tais como transcrição do gene por polimerases vegetais, translação de rnARN, etc. , que são conhecidos dos peritos na técnica de recornbinaçao de AON. Só os pormenores relevantes para a compreensão apropriada da presente invenção serão referidos em seguida_

Ma presente invenção, pode usar—se sequências de regulação que se sabe ou se descobriu que provocam a expressão de fitase. A escolha das sequências de regulação utilizadas depende da cultura que se pretende atingir e/ou do orgao que interessa atingir. Essas sequências reguladoras podem obter-se a partir de plantas ou de vírus de plantas ou podern ser sintetizadas quimicamente. Essas sequências de regulação são promotores activos na direcçao da transcrição em plantas ou constitutivas ou específicos do estagio de desenvolvimento e/ou do tecido, dependendo da utilização da planta ou das suas partes. E:.stes promotores incluem, mas não se limitam, a eles, promotores que apresentam expressão constitutiva , tais corno o promotor 35S de vírus do mosaico- da couve-flor (CaMV) (Guilley e col. (1982), Ce 11 30, 783), os promotores da expressão especificas das folhas, tais corno o promotor do gene de sub—unidade de pequenas dimensões de ri— bul-ose bisfosfato carboxiluse (Coruzzi e col. (1984), EMBQ J. 3, 1671.) , os da expressão especifica em raízes corno o promotor do gene da glutamina sintetase (Tingey e col. (1987), EMBQ J. 6, 3565), os para a expressão especifica ern sementes, tais corno o promotor da cruciferina A de Brassica na pus (Ryan o col. (1989), Nuci.. Acids Res. 17, 3584), os da expressão especifica ern tubérculos corno o promotor da patatina da classe I da batata (Rocha—Sosa e col. (1989), EMBQ J. 8, 23; 15

Wenzler e col. (1.989) , PXant pressão especifica ern frutos r o nase ( P G) d o t o rn a t e ( B i r d

MoX. bioX. 12, 41) ou os da ex corno o promotor de poligalactu e col. (1988), PXant Mol. Biol

Outras sequências reguladoras, tais corno sequências terrninadoras e sinais de poliadenilação, incluem qualquer sequência que funcione corno tal ern plantas, cuja escolha esteja dentro do nível de conhecimentos dos peritos no assunto. Urn exernplo dessas sequências é a região de flanquea-rnento 3’ do gene de nopalina sintetase (nos) de Agrobacteriurn turnef aciens ( M .. Bevan , supra) .

As sequências de regulação podem também incluir sequências de reforço, tais corno as que se encontram no promotor 35S de CaMV e as sequências de estabilização de rnARN, tais corno a sequência Xider do vírus de mosaico da alfafa (A1MV) RNA4 (F.T. Brederode, E.C. Koper-Zwarthoff e J.F. Boi (1980), Nucl. Acids Res. 8, 2213) ou quaisquer outras sequências que funcionem de maneira semelhante. A fitasse deve ser expressa num ambiente que permita a estabilidade da proteína expressa. A escolha dos compartimentos celulares, tais como citosol, retículo en— doplásrnico, vacuolos, corpo de proteína ou espaço periplásrni-co pode ser utilizada de acordo com a presente invenção para criar esse ambiente estável, dependendo dos parâmetros biofísicos da fitase. Esses parâmetros incluem - mas não se limitam a ·· o pH óptimo, a sensibilidade a proteases ou a sensibilidade à molaridade do compartimento preferido.

Para se conseguir a expressão no citoplasma da célula, a enzima expressada deve não conter urn pép-tido de sinal secretõrio nem qualquer outra sequencia pretendida como alvo. Para a expressão ern cloroplastas e ern rnito™ c ô n d r i. o s , a e n z i. rn a e x p r e s s a d a d e v e c o n t e r u rn a s s i. rn c h a rn a d o 16 péptido especi+ico de trânsito para importação para dentro desses organelos. Conhecem-se sequências que; actuam corno alvo que podern ser ligadas à enzima de interesse a fim de se conseguir este efeito (Srneekens e cal. (1990), T.I.B.S. 15, pagina 79; van den Broeck e col. (1995), Nature 313, 358; Schreider e col. (1985) EMBO J. 4, 25). Se se pretende conseguir actividade da enzirna nos vacúolos, tem de estar presente um peptielo de sinal secretõrio, assim corno urna sequência de indicação corno alvo especifico que dirige a enzirna para esses vacúolos ( Γague e col. (1988), Plant Phys.. 86, 506). 0 rnesrno è também verdadeiro para os corpos proteinicos nas sementes. A sequência de ADM que codifica a enzirna de interesse deve ser modificada de tal maneira que a enzima possa exercer a sua acç:âo na localização pretendida dentro da célula.

Para se conseguir a expressão extracelu-lar da fitase, a construção de expressão de acordo corn a presente invenção utiliza urna sequência de sinal secretório. Muito ernbora as sequências de sinal que são homologas (naturais) á espécie hospedeira vegetal, sejam as preferidas, pode tarnbérn usar-se sequências de sinal heterólogas, isto é, as que são originadas por outras espécies vegetais ou são de? origem microbiana. Estas sequências de sinal sao conhecidas pelos peritos no assunto.

As sequências de? sinal apropriadas que podern ser utilizadas dentro do contexto da presente invenção são descritas por P. Walter e G. Blobel (1986), Biochern. Soc. Syrnp 47. 183; G. von Heijne (1986), J. Mol. Biol. 189, 239; e P.C. Sijrnons, R . Μ.M_ Dekker, B. Schrarnrnei jer, T.C.. Verwoerd, P.J-M. van den Elzen e A. Hoekerna (1990), Bio/Technol- 8, 217.

Todas as partes das construções relevantes de AON (promotores, sequências reguladoras, sequências de secreção, sequências estabilizadoras, sequências que actuam 17 corno alvo ou

sequenciag terminais) de acordo com a presente invenção podern ser modificadas, caso assim se pretenda, para afectar as sUas caracteristicas de controlo utilizando rnéto-dus conhecidos pelos peritos no assunto.

Assinale-se que as plantas que contém fi-tase obtidas por intermédio da presente invenção podem ser usadas para se obterem plantas ou orgãos de plantas ainda com rnaxs elevados níveis de fitase. Por exemplo, pode ser possível obter essas plantas ou orgãos de plantas utilizando as técnicas de variação somoclonais ou pelas técnicas de cultura cruzada.. Essas técnicas são bem conhecidas pelos peritos no assunto.

De acordo com urna forma de realização da presente invenção, prepara-se urn cADN de dupla faixa que co~ d.i! -i.oa a f itase a partir de rnARN isolado de Asperqxllus ficu-..y!.í! - A construção de AON fica colocada sob o controlo regulador do gene que codifica a proteína de armazenagem 12S da cruciferina proveniente de Brassica napus. A construção é seguidamente subclonada num vector binário tal corno pM0G23 (na estirpe DHSalfa de E.coli K—12, depositada no Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holanda, ern 29 de Janeiro de 1990, sob o nurnero de acesso CBS 102.90). Este vector é introduzido ern A,a02fc!.ã'itfãtiiy.rí’......que contém urn pias— mi de o li desarmado. As células bacterianas que contêm esta construção são co -cultivadas com tecido de tabaco ou plantas da espécie Brassica e as células transformadas das plantas sao escolhidas por meios nutritivos contendo antibióticos e induzidas a regenerar-se em plantas diferenciadas com esses rneios. As plantas resultantes produzem sementes que contêm e expressam a construção de ADN.

De acordo corri urna outra forma de realização da presente invenção, a construção de ADN que codifica fitase é colocada sob o controlo de sequências de regulação - 18

do promotor 35S do vírus de mosaico da couve-flor (CaMV) A construção é depois subclonada num vector binário. Este vec— tor é ern seguida intriduzido em Agrobacter i i nn turnef aciens , que contém urn plasrnidio Ti desarmado. As células de bactérias que contêm esta construção são cocultivadas com tecidos de tabaco ou de plantas da espécie Brassica e as células das plantas transformadas são seleccionadas por meios nutritivos que contêm antibióticos e induzidas a regenerar-se em plantas diferenciadas nesses meios. As plantas resultantes contêm e expressam a construção de ADN constitutivamente. A actividade de fitase pode ser medida por rneio de um certo número de ensaios, cuja escolha não é critica na presente invenção. Por exemplo, a actividade da enzima fitase do tecido de plantas transgénicas pode ser ensaiada por meio durn ensaio ELISA, rnanchamento de Western ou ensaios directos com enzimas usando técnicas colorimétricas ou ensaios corn geles naturais. A planta ou orgão da planta que contém f itase, tal como são produzidas por meio da presente? inven ção ,podem ser utilizados numa variedade de -processos industriais que necessitam da acção de urna fitase.

As plantas ou os orgãos de plantas que contêm fitase produzidos de acordo corn a presente; i.nvençáo podem ser utilizados ern processos industriais que necessitem da acção de urna fitase. São exemplos destas aplicações os aditivos de alimentos para não ruminantes, o processamento de soja ou a produção de inositol ou de fosfatos de inositol a partir de fitato. Empregam—se tarnbém ern outros processos industriais que utilizam substratos que contêm fitato, tais corno a indústria do arnido e as indústrias de fermentação, corno por exemplo, a indústria da cerveja. A quelaçao de icies metálicos pelo fitato pode; fazer corn que estes compostos rni- 19 - nerais πaο sejam rnos. A hidrólise

disponíveis para a produção de rnicroorganis enzirnãtica de fitato evita estes problemas. A fitase produzida ern plantas pode também ser utilizada num processo para a mace raça'o de milho ou de espigas de sorgo. 0 tecido da planta pode ser rnorido antes de adicionado ao milho de maceração. A fitase libertada do tecido da planta pode actuar sobre fitina que se encontra presente ern muitas preparações à base de milho. A degradação da fitina na maceração do milho é benéfica para o aumento do valor comercial do liquido de maceração do milho, que é usado como alimento para animais ou como nutriente em fermentações microbianas. Além disso, a degradação da fitina pode evitar problemas relacionados com a acumulação de depósitos em filtros, tubagem, vasos de reacçao, etc. durante a concentração, transporte e armazenagem do liquido de maceração do milho (í. Vaara e col. (1989), Pedido de Patente-? Europeia Número 0 321 004). A acçao da fitase pode também acelerar o processo de maceração e os processos de separação envolvidos no processamento por via húmida do milho.

As plantas ou os orgaos de plantas podem ser utilizados directamente, isto é, sem posterior processamento ou primeiramente ser processados por meio dos processos convencionais, tais como moagem até à consistência pretendida a n t e s da a p 1 i o a c a o ..

Corno variante, a fitase pode ser extraida da planta ou dos orgaos das plantas e, caso assim se pretenda, ser purificada antes da utilização usando métodos de ex-Lracçao convencionais e técnicas de purificação correntes. A produção de fitases ern plantas que são curnpativeis com a aplicação pretendida proporciona resultados convenientes e reduz os custos da produção ern compara cão com . a das fitases microbianas, a fim de permitir a sua aplicação 20

económica, por exemplo, ern alimentos piara animais, que even — tualmente origina urna proporção de -preço/compor Lamento in.......vi — vo competitivo com o fosfato inar9ânico. Lorno beneficio posterior , o teor de fósforo dos excrementos é consideravelmente diminuído_

Apr(M(-·“| f·.’ que a ap.1.xc*açao de fitases , disponíveis a preço competitivo com o fosfato inorgânico, aumenta o grau de liberdade da industriei de produção de alimentos compostos de maneira a originar urn alimento de elevada qualidade. Por exemplo, quando o alimento è suplementado corri: fitase, a adição de fosfato inorgânico pode ser omitida e os teores dos vários materiais quer contern ti ta to podem ser aumentados .

Os exemplos seguintes são apresentados para fornecer aos peritos no assunto urna descrição completa e indicações da maneira como fazer e utilizar a presente? invenção e não ser destinam a limitar o âmbito daquilo que os inventores consideram como o âmbito da sua invenção.

Realizaram-se esforços no sentido de garantir o rigor ern relação aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperaturas, pH, etc.), mas são possíveis erros e desvios experimentais. A não ser que se indique outra unidade, a temperatura é expressa ern graus centígrados e a pressão utilizada é a pressão atmosférica ou próxima da pressão atmosférica.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Isolamento de......Poli A+ ARN a partir de Aspergiu Us f i cuurn

Faz-se desenvolver A. ficuurn estirpe NRRL . 3135 ern meio que contém 22,72 grarnas/litro de farinha de mi- , -Lho (arnilase tratada a pH 7 a 85°C durante quinze minutos), 21

grarna/1. itro de KC1, 0,142 grama/.litro de MgSG,^ - ^^2^ e ^ rniligramas/litro de FeSO^ - 7H2() ·· Depois de seis dias, recolhe-se a cultura de rnicélio.

Congela-se o rnicélio seco (0,5 grama) corn azoto liquido e mói—se. Subsequentemente, o material é homogeneizado com um hornogeneizador Ultra Turrax (velocidade ma— xirna, durante; um minuto) a 0°C ern LiCl 3 M e; ureia 6 M e mantém-se durante; a noite a 4°C, como é descrito por Auttray e; Rougeon (1980), Eur. J.. Biochern. 107, 303. Obtém-se ο Λ RN celular total depois da centrifugação a 16 000 X g, que; é ern seguida de duas extracçoes sucessivas corn fenol : clorofòrrni— co álcool iso-amxlxco (50 : 48 : 2). Precipita-se o ARN corn etanol e redxssolve-se ern 1 rnl de; Tris-HCl 10 rnM (pH 7,4), 0,5% de SDS. Para a selecção do poli A+, aquece--se a amostra total de ARN durante cinco minutos a 65 °C, ajusta—se a Na Cl. 0,5 M e aplica-se subsequentemente a urna coluna com oli— go( dT) -celulose. Depois de diversas lavagens corn uma solução que contém Tris 10 rnilirnolar, pH 7,0, EDI Λ 1 rnM e NaCl 0,1 rnM, colecta-se o poli A ^ ARN por eluição com Tris 10 rnilirno-lar a pH 7,0 e; com ED I A 1 rnilirnolar -

Exemplo 2

Preparação......e......Clonação......de um cAPN......que......Codifica Fitase

Para a síntese de urna primeira parte; do cADN, dissolvem-se 5 rnicrograrnas de poli Af ARN, isolado de acordo corn o Exemplo 1, ern 16,5 rnicrolitros de H^O e adicionam-se os seguintes componentes: 2,5 rnicrolitros de urn tampão que contém Tris-HCl 50mM pH 7,6, MgCls 6 rnM, 2 rnicrolitros de KC1 1 M, 5 rnicrolitros de DDT 0,1 M, 0,5 microlitro de oli-g°( d I ) 12-18^ ’ ^ rn9/rn.L) , 5 rnicrolitros de mistura de dNTP 8 rnM, 5 rnicrolitros de BSA (1 rng/rnl) e 2,5 rnicrolitros de; Moloney MI..V transcriptase inversa (200 U/microlitro) . Incuba-—se a rnistura durante trinta minutos a 3 <?°C g? interrompe—se a reacçao por adição de 10 rnicrolitros de EDTA 0,2 molar e 50 22

rnicKOli.tros de H2O. Efectua—se urna exlracçao usando 110 mi— crolitros de clorofórmio e, depois de centrifugação durante cinco minutos, adicionam—se ao sobrenadante NH^Ac 5 M e 440 microlitros de etanol absoluto (~20°C). Realiza-se a precipitação numa solução de gelo/etanol durante trinta minutos. Depois da centrifugação (dez minutos a 0°C), lava-se a pelete de cADN/rnARN com 70¾ de gelo/etanol frio. Seca—se a peleie e dissolve-se em 20 microlitros de HgO. 0 isolamento do cADN que codifica a fita-se realiza-se com a reacção ern cadeia de? polimerase (POR) ern dois fragmentos. Combinam-se os dois fragmentos utilizando o sitio Barri Hl existente no interior do gene para criar um cADN de comprimento total. A estratégia para a realização da clo~ nação do cADN de fitase está representada na Figura 1. U segmento parcial do gene da fitase (van borcomrn e col.. , supra) revela a presença de? urn sitio de? BarnHI a a próxima da rnen te 800 pares de bascas do coda o de iniciação. A sequência de? nucleóticJos ern volta deste sitio BarnHI, assim corno a sequência de nucleótidos que precede o codao de iniciação e a sequência de nucleótidos depois do codão de interrupção do gene da fitase são utilizadas para conceber oligo— nucleótidos para a PCR. A reacçao de cadeia de polimerase realiza-se de acordo com o fornecedor de Taq-polimerase (Cetus), usando 1,5 microlitros da solução que? contém o produto da reacção da primeira síntese e 0,5 rnicrograrna de cada um dos oligonucieutidos. A ampliação realiza-se num amplificador de ADN da 1 irrna Perkin tlrner/Uetus. Depois de vinte e cinco ci— v' MI.U IU vI..JO Cl cios de dois minutos a 94°G, tos a 72°C, desproteiniza-se a mistura reaccional por subse quentes extracçoes com fenol e clo-rofõrrnio. 0 ADN é pre cipitado, redissolvido num tampão que contém Tris 10 rnM, p 23

7, e ΕΙΠΑ 0,1 rnM, e é subsequentemente digerido corn enzimas de restrição apropriadas.

Para a amplificação do fragmento que codifica a parte da extremidade N da proteína, usam-se os seguintes dois oligonucleótidos:

Oligo 1: '5’ GGGTAGAATTCAAAAATGGGCGTCTCTGCTGTTCTA 3’ OILido 2: 5’ AGTGACGAATTCGTGCTGGTGGAGATGGTGTCG 3’ 0 fragmento amplificado é digerido com EcoRI e donado no sitio de EcoRI de pTZIBR (adquirido à firma Pharmacia) .. U rnapearnento do sitio de restrição e o se— quenciamento de nucleôtidos demonstra a autenticidade do fragmento. 0 plasrnidio resultante é designado pGB925.

Para a amplificação do segundo fragmento, utilizam-se os seguintes dois oligonucleótidos:

Oligo 3: 5’ GAGCACCAAGCTGAAGGATCC 3’

Oligo 4: 5’ A AACIGCAGGCGTTGAG TG TG A T Ϊ G ϊT TAAAGGG 3’ r r a grne n t o a rnp 1 x f χ c: a d o !á§í!)Hl e PstI e subsequentemente clonado de maneira a obter-se pTZIBR, que foi digerido com BarnHI e PstI. 0 rnapearnento do d.L.j.u de restrição e o sequenciarnento dos nucleôtidos mostra que foi isolado o fragmento oorreoto. U plasrnidio resultante é chamado pGB92G.. A f lin de isolar urn cADN de comprimento completo, digere-se PGB925 com EcoRI e BarnHI e isola-se o tragmento que contém o AON que codifica a fitase. Este fragmento é clonado no plasrnidio pGB926, que foi digerido corn fecoRJ. e BarnHI, resultando o plasrnidio PGB927. 0 plasrnidio pbB92 ? contern um cADN de comprimento completo que codifica 1 xtase, corn o tamanho aproximado de 1,8 kbp. A sequência da 24

região do cADN que codifica a proteína de fitase e a sequência dos arninoácidos derivados da proteína de fita se estão representados na Figura 2.

Exemplo.....3

Construção do Vector Binário oMDPOP

Nesti do vector depositada Janeiro de exemplo, descreve-se a construção binário pM0G23 (na estirpe E-ccrli K-12 DHSalfa, no Centraal Bureau voor Schimmel-cultures ern 29 de 1930, sob o numero de acesso 102. 0 vector binário pM0G23 (Figura 2) é urn derivado do vector Binl9 (M. Bevan, supra). Para se obter pMUb23, o vector B:in.!.9 é rnodofiçado de acordo corn urna maneira não essencial para a presente invenção, usando técnicas familiares aos peritos na técnica da biologia molecular.

Ern primeiro lugar, as posiçcies do rebordo esquerdo (LB) e do rebordo direito (RB) são desligadas com a referencia ao gene .1.1 de neornicina fosfotransferase (gene? NP III). Ern segundo ..Lugar, inverte—se a orientação do gene NPTII, originando a transcrição na direcção de L...B. Finalmente, substitui—se o poli—ligador de Binl.9 por um poli -—ligador corn os seguintes sitios de reconhecimento de enzimas de restrição: EcçiRI, JKnjpI, Sinal, BarnHI, Xbal, Saci, Xhol e HindiII. :xern pio......4 kl£?D.§.£.é‘"í......djo......çABN_ de Fita se de Aspergillus ficuurn nurna .L;.9D.£try£ác)......cie......Expressão Constitutiva ern Plantas U gene de fitase de Aspergillus_______ficuurn é a da p Lado e clonado nurna construção de expressão para a expressão constitutiva a Jusante do promotor do vírus de mosaico da couve—flor 35S. A construção de expressão contém tarnbèrn a informação de codificação para urna sequência de pép— tidos de sinal de origern vegetal 25

0 cADM da fitase ê clonado na construção de expressão como está presente no plasrnidio pMGU29 (descrito em a))- Sub seque nternen te, a construção completa é intriduzida no vector binário pM0623 e transferida para a estirpe LBA4404 de Agrobacteriurn turnef aciens . a) ConstrLição do Vector de Expressão......pMC)G29 A construção de expressão do RUK1 (Baul-cornbe e col.. (1986), Nature 321, 446) é clonada como um fragmento de EcoRI/HindiII ern pUC18. Esta construção contém o promotor 35S do vírus de mosaico da couve-flor (CaMV) num fragmento EcoRI/BarnHI e o terrninador da transcrição de no-palina sintetase (nos) num fragmento de B a rn ΗI / H i n d III- 0 fragmento promotor consiste na sequência desde -800 até +1 do promotor CaMV 35S. A posição +1, que é incluída-, é o sitio de iniciação da transcrição (tíuilley e col., supra). A sequência a montante do sitio de Ncol na posição -512 é suprimida e este sitio é transformado num sitio EcoRI. Isto faz-se cortando a construção de expressão presente no pUC18 corn Ncol, preenchimento nas extremidades de cordão único corn polirnerase de Klenov e ligação de urn ligador EcoRI. o plasrnidio resultante é cortado corn EcoRI, resultando na supressão do fragmento EcoRI que transporta as sequências do promotor 35S a montante do sitio original de Ncol - 0 fragmento B a rn Hl /Hindi 1.1 que? contém o terrninador nos é subs-tituido por urn fragmento de ADN sintético (oligonucleótido duplo A, Figura 4) que contém a sequência lider de ARN4 do vírus de mosaico da alfalfa (A1MV) (Brederode e col., supra). Isto faz—se por clivagem corn BarnHI, seguida de clivagem corn HindiII e ligação do fragmento de ADN sintético. 0 sítio de BarnHI e três nucleótidos a montante são suprimidos por mutagénese dirigida ao sítio. No plasrnidio resultante, o fragmento de BamHI/HindlII que contém a sequência terrninadora nos é reintroduzido. o gene que codifica beta-glucoronidase (proveniente do plasrnidio pRAJ 275; R. A. Jefferson (1987), Plant Mol. Biol. Repórter 5, 387) foi 26

ligado corno urn fragmento NcoI/BamHI, resultando o plasrnidio PM0G14. A partir da literatura, sabe-se que a duplicação da sequência entre --343 e -90 aumenta a actividade do promotor 35S (R.. Kay, A. Chan, M.. Dayly e J. McPherson (1987), Science 236, 1299). Para se obter urn fragmento promotor com urna sequência dupla, chamado reforçador, realizam---se as seguintes operações, conhecidas pelos peritos no assunto.. A partir do plasrnidio pMGG14, isola·-se o fragmento reforçador num fragmento de ACCI/EcoRI e subsequentemente

insensibiliza-se a extremidade com poli merase de Klenov. O fragmento obtido ê introduzido ern pM0G14 cortado com EcoRI e insesibiliza~se a extremidade de tal maneira que o rebordo entre os sities de EcoRI e Accl de extremidade insensibilizada gerem urn novo sítio de EcoRI. 0 plasrnidio resultante (pMOGlB) contém o promotor 35S com urna sequência dupla reforçadora, a sequência líder de ARN4 de AI MV e o terrninador nos numa construção de expressão ainda presente num fragmento de EcoRI /Hindi II. Finalrnente, o fragmento de NcoI/BamHI que codifica beta -glucoronidase é substituído por urn fragmento B de AON sintético (Figura 4), derivado do cADN de P ROEU 2 (E3. J.. G.. Cornelissen, R. A. M. Hooft van Hui jsdui jnen e J. F.

Boi (1986), Mature 321, 531). Este fragmento B codifica a se..... quência do péptido de sinal PR--S de PR-proteina a partir de Samsun NN de tabaco. Cria-se um sitio Sphl no péptido de sinal que codifica a sequência de ADN modificando um nucleõ-tido.. Esta modificação não altera a sequência de arninoácidos do péptido de sinal PR-S codificado.. U plasrnidio resultante é chamado pMQG29 (Figura 5). b) Clonação do Gene de Fitase de Aspergi 11 us ficuurn nurn .................VectorElinárlo 0 ο I. i 9 o n u c 1 e 61 i d o duplex C (Figura 4) é clonado no plasrnidio pM0G29, digerido com Sphl e BarnHI. ob tendo-se como resultado o plasrnidio pMOG407 - 0 oligonucle - 27

õtido duplo contém a informação de codificação para os dois aminoàcidos finais do péptido de sinal de PR—3, seguidos dos primeiros seis aminoàcidos da fitase madura. 0 plasmidio pGB927, que contém o cAL)N de fitase de comprimento completo, é digerido com Xhol (parcialmente) e PstI .. G fragmento de Xhcrl/Pstl , que compreende as sequências de AON que codificam a fitase rnadura a partir do amoniãcido G em diante, é clonado no plasrnidio pMUG407 linearizado com Xhol e PstI, obtendo.....se como resultado o plasmidio pM0G417. A construção completa, que contérn o gene de fitase quimérico, é inserida como um fragmento EcoRI/ /HindiII no vector binário pMQG23 linearizado com EcoRI e Hindi.II. 0 plasmidio binário resultante pM0G413 é mobilizado num ajustamento triparervtérico com a estirpe RK2013 de E.coli l<~-12 (que contém o plasmidiopRK2013 (G. Ditta, S.. Stanfield, D. Corbin e D.. R. Helinski (1980), proc.. Natl. Acad. Sei. USA 77 , '7347) na estirpe L8A4404 de Agrobacteriurn turnef aciens , que contém o plasmidio com os genes de virulência necessárias à transferência de T-ADN para a planta.

Exemple^.....5

Expressão Transiente do Gene de FitaseQuiméricoem

Protoρ1astas de Tabaco

Protoplastas de tabaco são transformados com plasmidio ADN que transporta o gene quimérico da fitase sob regulação do promotor 35S CaMV constitutivo. Depois de setenta e duas horas, os protoplastas tratados são ensaiados relativamente à expressão transiente do gene de fitase in— troduzido usando o ensaio de actividade da fitase.

Os protoplastas são preparados a partir de plantas de tabaco com urn a dois meses de idade desenvolvidos axenicamente (.y.Í.lÍ.I.LEri..é.Da,..„......t..flba.':-urn SR1) . A maneira de proceder completa é descrita por K. W_ Rodenburg, M. J. A. DeGroot, R- A. Schilperoort e P. J. J. Hooykaas (1989), Plarit 28

Mol. Biol. 13, 711). Para sofrer a transformação, urn numero de 5 x 105 protoplastas é electroporado com 40 rnicrograrnas de? AON do plasrnidio plvIOG417. Depois da electroporaçao, os pro-toplastas são ressuspensos ern 3 ml de meio K3G. Para realizar o ensaio da act,ividade de fitase, os protoplastas sao separados por centrifugação e dialisam--se 3 mi de sobrenadante durante a noite urn excesso de água. 0 produto dialisado e liofilizado e ressuspenso em 300 rnicrolitros de acetato de sódio 25 rnM, pH 5,5.. 0 ensaio prossegue então como se descreve pormenorizadarnente no Exemplo 10, com a única excepçáo de, em vez de tampão de glicina -HCL 250 rnM de pH 2,5, se utilizar um tampão de acetato de sódio 25 rnM de pH 5,5.

Nestas experiências, urna unidade de fi-tase (PTI.J) é definida corno 1. rnieromole de fosfato libertado de uma solução 1,5 rnM de fi.tato de sódio por minuto, a 37°C, a pH 5,5.

Nos protoplastas não tratados, não se encontra actividade detectável. Os protoplastas electroporados com o plasrnidio pMQG417 possuem urna actividade de 0,26 PTU por miligrama de proteína no sobrenadante.

Exemplo 6

Expressão Estável de urn Gene.....de......Fitase......Quimérica......em......Plantas

de Tabaco sob o Controlo......do Promotor.......CaMV.....35S 0 tabaco é transformado por cocultivação de tecido de plantas com a estirpe LBA4404 de Aarobacterium turnefaciens que contém o vector binário pMGG413 com o gene de fitase quimérico sob a regulação do promotor CaMV 35S. A transformação realiza-se por cocultivação de discos de folhas de tabaco (Nicotiana tabacurn SRI) de acordo corn Horsch e col., supra. As plantas transgénicas são regeneradas a partir de rebentos que são desenvolvidos em rneio de selecçlo (100 mg/litro de canarnicina) , enraizados e transferidos para terreno. As plantas de tenra idade são ensaiadas relativamente à 29

ΏΚλα»ι sua actividade ΝΡΤΙ.Ι (resistência à canarnicina) , desenvolvidas até a maturidade e deixadas autopolinizarem-se e originarem sementes.

Para os ensaios da actividade de fitase das folhas das plantas trasgénicas, corta-se um segmento com cerca de 5 rnilirnetros de diâmetro de uma folha nova de cada planta e homogeneiza-se em 300 microlitros de tampão de acetato de sódio 25 rnM, a pH 5,5. Seguidamente, realizam-se os ensaios de fitase como se descreveu para os ensaios transientes. Em trinta e duas plantas de tabaco independentemen·te transf orrnadas e ensaiadas , observou—se urna . actividade rnaxima de 2 PTU/mg de proteína solúvel total existente nos extrac-tos. Isto corresponde a 1,7% da proteína solúvel total. Nas sementes destas plantas de tabaco transf orrnadas, observou-se um nivel rnáximo de expressão de fitase igual a 0,4% da proteína da semente total solúvel. Não se observou actividade de fitase em plantas não transformadas.

Seleccionaram-se duas linhas de plantas transgénicas, 413.25 e 413.32, com base nos seus elevados níveis de expressão de fitase.

Exemplo7

Clonação de cADN de Fitase de Aspergillus.....ficuurn numa

Con struca o de Expressão Especifica......da Semente

Constrói-se uma construção de expressão de maneira que se obtenha a expressão especifica de semente©, usando sequências de; crucxferina do gene de proteína de armazenagem de Firas si ca napus 12S (cruA; Ryan e col. , supra) . Estas sequências podern ser substituídas pelas dos genes específicos de sementes semelhantes para se conseguir a mesma finalidade que se pretende como objectivo da presente invençao. 30

de expressão. Finalmente, a construção completa é introduzida em Aarobacterium turnefaciens - que é usado para a transformação .

Em todas as transformações de E.coli deste Exemplo, utilizou-se a estirpe DHSalfa de E. coii K---..1..2. a) Construção do Construto de Expressão

Para a construção do construto de expressão para expressão especifica de sementes, as sequências promotora e terrninadora do gene de cruciferina A (cruA) de Brassica napus cv.. Jet Neuf são sintetizadas usando a tecnologia de PCR corn AON genõrnico isolado (I. J. Mettler (1987), Plant Mol. Biol. Rep. 5, 346) corno modelo. Este gene apresenta expressão especifica de semente e as suas sequências de codificação e de flaquearnento foram determinadas (Ryan e col., supra).

Sintetizaram-se dois conjuntos de oligo— nucleótidos. Um deles destina-se a permitir a amplificação da região de flaquearnento de cruA 5’ e parte do péptido de sinal que codifica a sequência como um fragmento de EcoRI/Ncol: 5’· GTTCGGAATTCGGGTTCCGG 3’ e 5’ AACTGΓΊGAGCTGTAGAGCC 3’. 0 outro conjunto serve para a amplificação da sequência de flanqueamento 3’ como um fragmento de BglII/HindiII: 5’ CTTAAGATCTTACCCAGTGA 3’ e 5’ CGGAGAAGCTTGCATCTCGT 3*.

Os oligonucleòtidos são construídos de maneira a conterem sitios de restrição apropriados nas suas exprernidades para permitir a ligação directa da construção de 31 -

expressão depois da digestão dos fragmentos com as enzimas de restrição. D fragmento 5’ do gene de cruA, que inclui cinquenta e quatro núcleotidos da sequência que codifica o péptido de sinal, é clonado de madeira a obter-se o vector pM0G445 (oligonucleótido duplex t.; Eigura 4), clonado com o vector pUC18, linearizado com SstI e EcoRl e cortado com EcoRl e Ncol, obtendo-se como resultado o vector P-MGG424. 0 oligonucleótido sintético duplex D (Figura 4), que compreeende os tripletos finais de codificação 5 para a sequência de sinal de cruciferina de Brassica...........napus, a sequência que codifica os aminoácidos 1-6 de fitase madura e um sitio de clonaçao múltiplo, é clonado no vector pMQG424 cortado com NcoI e Ncol e HindIII. 0 vector resultante é designado pM0G425. 0 fragmento PCR de cruA 3’ é clonado corno um fragmento BglII/HindIII ern pM0G425 digerido com Bglll e HindIII, obtendo-se como resultado pM0G426. b) Ulonaçào......do......Gene......de......f- itase de Asperglllus ficuum no Vec- tor......Binário 0 plasrnidio pGB927, que contém a se quê n..... cia de codificação de comprimento completo de fitase de

Aspergillus ficuum, é digerido com Xhol (parcialmente) e com PstI_ U fragmento XhoJ/Pstl, que compreende as sequências de ADN que codificam fitase madura desde o arninoàcido 6 em diante, é clonado no vector pM0G426, cortado corn Xhol e PstI. A partir do vector resultante pl406428, insere—se a construção inteira que contém o gene de fitase quimérico corno urn fragmento de EcoRI/HindIII no vector binário pMGG23 linearizado corn EcoRl e HindIII. U vector binário resultante PMUG429 é mobilizado, num ajustamento triparêntico com a estirpe RK20..L3 de E.-ilpli K—12 (que contém o plasrnidio pRK20U) (Ditta e col. , liupra), obtendo—sea estirpe L..BA4404 de A^rgbacterxum (Hoekerna e col. , 1883, supra) , que contém o 32 p I a s rn i d i o com t, r a n s f e r ê nc i a

a de T-ADN para a planta.

Exemplo 8

Expressão......Específica nas Sementes Estável de Fitase em

Sementes de Tabaco sjob_ o_ Controlod§ _um ProrncloK de

Cruciferina A estirpe LBA4404 de Agrobacteriurn, contendo o vector binário pM0G429 com o cADN de fitase sob o controlo do promotor de cruciferina, é utilizada para experiências de transformaçao. A transformação do tabaco (Nlcotiana tabacum SR1) realiza-se utilizando a cocultivaçao de discos de folha de acordo com a maneira de» proceder de Horsch e col. supra. As plantas transgénicas são regeneradas a partir de rebentos que se desenvolvern ern rneio de selecção (100 ing/1 de canamicina) . As plantas de tenra idade são ensaiadas relativamente à actividade de NPTII (resistência ã canamicina) desenvolvidas até à maturação e deixadas autopolinizarern-se e originarem sementes. As sementes de transforrnantes individuais são reunidas e parte da amostra de sementes é ensaiada relativarnente a presença de fitase. A partir de clones com os maiores níveis de expressão, em comparação corn sementes de controlo não transf orrnadas, as sementes restantes são germinadas ern canamicina (200 rng/li-tro) . A partir dos dados obtidos; corn as sementes S2 resultantes, selecionam—se as sementes homozigóticas relativamente a NPTII (portanto, também- relativamente à fitase) e são utilizadas para a propagação em massa de plantas capazes de produzirem as; quantidades máximas; de fitasse. Estas podem então ser usadas-ϊ para, por exemplo, experiências de digestão.

Para determinar a actividade de fitasse que se encontra nas sementes transgénicas, torna-se urna amostra com cerca de 50 rng de sementes e homogeneíza—se num almofariz arrefecido corn gelo ern 1 rnl de tampão de» acetato de sódio 25 rnM a pH 5,5. Depois de centrifugação, o liquido 33

sobrenadante é ensaiado corno se descreveu relativarnente aos ensaias transientes. Em cinquenta e cinco plantas de tabaco independentemente transformadas, observou-se um nível de expressão máximo de fitase igual a 0,15% da proteína total solúvel existente nas sementes. A actividade de fitase não foi detectada em caul.es, raizes e folhas das plantas transgénicas. Não se detectou actividade de fitase em plantas não t ransf orrna d a s .

Exemplo9 '1 rans f o r ma c ã o de Colza

Isleste exemplo, descreve-se a transformação de colza por cocultivação de tecido da planta corn Aqrobacteriurn turnefaci.ens (contendo um vector binário corn o gene de fitase quimérico. As plantas transgénicas podem ser escolhidas com base na resistência a antibióticos. As plantas transgénicas podem ser ensaiadas relativarnente á actividade de fitase. As que exprimem maiores quantidades podem ser analisadas rnais cuidadosamente e utilizadas ern experiências posteriores.

Mobiliza—se a mesma construção de fitase quimérica nurn vector binário (pM0G429) na estirpe LBA4404 de Agrobacteriurn t-urnef aciens. de acordo corn urna maneira semelhante à que se descreveu no exemplo 7. Esta estirpe pode ser utilizada para transformar colza (Brassica......napus cv.Westar).

Para esta finalidade, pré-condicionarn—se segmentos de rebentos corn as superfici.es esterlizadas retirados de plantas corn cinco a seis semanas de idade, precisamente entes da floração, durante vinte e quatro horas, com meio MS (Fry e col. (1987), Plant Cell Reports 6, 321) corn 1 rng/litro de BAP e, em seguida, cocultivarn-se durante quarenta e oito horas com Agrobacteriurn em placas frescas com o mesmo meio. As plântulas transgénicas sao regeneradas a partir de rebentos que se desenvolveram no meio de selecção (500 rng/litro de 34

descreveu rio Exemplo 8 para o tabaco carbenicilina, 40 analizadas corno se

Exernplo 10

Ensaio de A c tiv i. d a de de Ei ta se

Moeu-se urna quantidade de material de plantas transgénicas que contêm no local aproximadarnente 0,25 PTU (PTU = unidades de actividade de fitase.. Urna unidade de actividade de fitase é definida corno a quantidade de enzima que liberta fósforo inorgânico de fita to de sodio 1,5 rnM com a velocidade de 1 micromole/minuto a 37°C e a pH 2,5). Como variante, esta quantidade de fitase pode ser extraída do material da planta.

Incubou—se o material da planta moído num volume total de 50 ml de tampão de glicina/HCL 250 rnM, pH 2,5, contendo 0,86 grama de fitato de sódio.. HHpO. Muito embora o Aspergillus segregue fitase a urn pH óptimo de 2,5, assim como a 5,5, escolhe-se urn pH menor para excluir a actividade de fitase originada pela planta. A mistura resultante é incubada durante quinze e sesenta minutos a 37°C„ Interrompe-se a reacção por adição de 5 rnl do material incubado a 5 ml de TCA a 10% (ácido tricloroacético) .. Em seguida, adiciona.....se à solução de enzima com a reacção interrompida 10 ml de reagente indicador (3,66 gramas de l-eCI.^ - 7142U em 50 rnl de solução de molibdato de arnónio (2,5 gramas de (NH4 ) M07G24-41-^0 e 8 rnl de concentrado, diluída até 250 rnl com água desrninera 7 izada) Mede-se a intensidade da cor azul. espectrofotometricamente a 700 nrn.

Presente a 0 teor de fosfato inorgânico 7-0 serve como ensaio em branco. - 35 -

da

As detenuinaÇ'365 são indicativas quantidade de fosfato libertada relativamente a urna curva de ca librada o de fosfato no intervalo de 0 1 mM.

Exemplo......11

Incubação......dje Ma ter ia 1 de p la n ta de Micotiana Tabacurn Moldo corn Alimentos

Numa experiência típica, incuba-se 0,25 grama de farinha de soja extraída corn dissolvente com uma quantidade de material da planta Nicotiana_______tabacurn moído contendo aproximadarnente 0,25 RIU, como se descreveu acima, corn excepçao da adição de fitato de sódio. Neste caso, o agente de incubação adicionado consiste numa mistura de 410 ml de tampão e 90 ml de água desmineralizada. A libertação de fosfato a partir do fitato em farinha de soja extraída corn dissolvente está representada graficamente na Figura 6. Sern se adicionar material vegetal rnoido, não se observa qualquer actividade-

Numa experiência virtualmente idêntica, obtêm-se os mesmos resultados usando glúten de milho corno substrato. Us resultados obtidos corn as sementes transgénicas estão representados na Figura 6.

Na'o se observa actividade na ausência do material vegetal rnoido ou quando o material vegetal rnoido adicionado não contem actividade de fitase.

Exemplo 12 ÍDl§ÍÇLÍ.Q-.yitro de......Material Vegetal Transgénico Contendo

Fitaseem.....Condições gue......Imitam.....g......Tubo.....DÍeestivo._.de Aves de

Capoeira

Para determinar a aeficácia da fitase produzida no material de plantas de tabaco transgénicas, determina—se a actividade de fitase proveniente de Asger— 36

gÍl;Ly.§. nurn modelo que irnita as condições que se encontram no tubo digestivo das aves de capoeira.

Ern primeiro lugar, incuba-se uma amostra de alimentos para aves de capoeira correntes a 1 grarna/15 ml de agua durante sessenta minutos a 39°U, para simular as condições presentes no desenvolvimento dos animais. Subsequentemente, adicionam-se 5 ml de solução de pepsina (Merck; 5,28 gramas/litro, pH3,0 - ajustada com HUI), ajusta-se o pH a ph 3,0 corn HC1 e continua-se a incubação durante rnais noventa minutos à mesma temperatura para simular as condições existentes no estômago.

Durante o per iodo de incubação, retiram-- .....se amostras a fim de determinar a quantidade de fosfato libertada do fitato presente na alimentação. A acção da fitase proveniente de fungos é evidente na Figura 7. Aumentando a dosagem de fitase de 250 para 1000 P fU/quilograrna de alimento, obtem-se como resultado urn aumento de libertação de fosfato da amostra de alimento.

Quando se adiciona uma amostra de material de plantas de tabaco transgénicas ou semente ou folha ("linhas 413.25 e 413.32; depois da moagem em almofariz) em vez de fitase de fungos, observa-se uma libertação semelhante aumentada de fosfato (Figura 8) sernelhantemente aumentada.

Material de plantas de tabaco de controlo que não contérn fitase, foi tarnbérn ensaiado. Nao se observou "libertação de fosfato ern comparação com o controlo do ensaio ern branco. A comparação dos resultados obtidos corn 50 gramas de sementes de tabaco transgénico/quilograrna de al imento corn os obtidos corn 500 e 750 PTU/quilograrna de 37

Ή alimento indica que 1 grarna de sementes de tabaco b dP|'o-xirnadarnente igual a 12 PTU neste modelo de digestão de aves de capoeira efeotuado in vitro. A comparação com a amostra gue utiliza material de folhas indica que 1 grama (peso fresco) de material de folhas de tabaco contém aproximadarnente 25 PTU.

Exemplo.....13

Ensaiode animais

Rea 1 izarn se experiên cias corn f ran gos pa ra grelhar para mostrar a eficácia da fitase expressada em sementes de plantas, assim corno a ausência de qualquer efeito negativo das sementes de tabaco sobre os resultados zootécnicos.

Colhem—se sementes de tabaco que exprimem fitase e sementes de tabaco que servern de controlo. As sementes são moídas ern por coes de 100 gramas com urn peneiro (Retch-rnill ZM1) que tem poros de 500 rnicrórnetros, tendo o cuidado de conservar as sementes arrefecidas.

Pintos do sexo masculino com um dia de idade (Hybro) são alojados em gaiolas de bactérias para dois animais (0,45 rn^) .. A temperatura ambiente é igual a 32°C durante os primeiros dois dias e depois diminui-se de 4°C na primeira semana.Lm cada uma das semanas seguintes, diminui-se de 2°C a temperatura. Os pintos são criados em regime de urna hora de luz e três horas de escuridão.

As aves são vacinadas contra a doença de New Uastie com a idade de urn dia, usando a vacina Clone 30. Durante as experiencias, os pintos são alimentados com dietas experimentais de farinha à vontade. Medem-se as proporçoes de desenvolvimento e alimento/ganho durante os períodos experimentais. Mede-se a disponibilidade aparente do fosfato total durante urn Período de três dias, durante o qual se rnede 38

o consumo de alimento sob a forma de matéria seca entrada (~ se colectarn quantitativamente os excrementos. A disponibilidade aparente de fósforo e

Jp definida corno a diferença entre a quantidade entrada α fósforo e a excreção de fósforo com os excrementos.

Usam-se as seguintes dietas de controlo* sern adição de fitase:

Dietas Ca (%) P Total (¾) P de fil {%) 1 0,60 0,45 0,30 2 0,75 0,60 0,30 3 0,90 0,75 0,30 A dieta 1 (dieta de base), não se adiciona fosfato ao alimenta. As dietas 2 e 3 são suplementadas com cálcio e fósforo provenientes de uma mistura de fosfato dicálcico.anidrido e de fosfato de mono-amónio (proporção 5:1). Todas as dietas experimentais são obtidas por adições ã dieta de base (veja-se tabela 1). A dieta experimental 4 contém fitase de origem microbiana com uma concentração de 400 PfU/quilograma de alimento, preparada como foi descrito por Van Gorcorn e col.. , supra) . / A dieta experimentai 5 è semelhante á dieta 4, mas â mistura alimentar adicionaram-se sementes rnoidas de tabaco não trangénico, para se conseguir uma proporção final de 3 Kg/90 Kg de alimento. A dieta experimental 5 ® também semelhante ã dieta 4, mas adicionam-se 3 quilogramas de sementes . rnoidas de tabaco trangénico (linha 413.25) a urna mistura de - 39

90 quilogramas de alimento, para se obter urna concentração final de 400 PTIJ/quilograma de alirnent-o. A experiência realiza-se corn 176 pintos ern dezasseis gaiolas em bateria (onze pintos por gaiola corn bateria) até á idade de vinte e quatro dias.

Us tratamentos (dietas) são repetidos duas vezes e são atribuídos ao acaso a cada animal das gaiolas..

Mede-se a disponibilidade do fósforo a partir de vinte e um a vinte e quatro dias de idade.

Us resultados relativamente à disponibilidade de fósforo e ao -desenvolvimento dos animais alimentados corn as dietas 4, 5 e 6 demonstram o efeito positivo da edição de fitase (Tabela 2). Λ comparação entre as dietas 4,5 e 6 demonstra tarnbérn que a inclusão de sementes de tabaco nu alimento é compatível com a acçao da fitase microbiana no canal, gastrointestinal de aninais de criação, tais corno pintos, e não apresenta quaisquer efeitos negativos sobre os resultados zootécnicos..

Lonquanto a presente invenção tenha sido dovícr.j.. ta corn relerencia a suas forrnas de realização es- 1-1' ' ' c’ u'·* Peritos no assunto sabern que são possíveis vária.., alterações e rnodificaçcíes sem afastamento do real espirito o do objectivo da presente invenção. Além disso, podem fazer ,.,e muitas "“odificações para se adaptarem a uma situação particulaK, material, plantas, sernen te , processo , ui-eraçao ou oPcraçues do processo, ao objectivo, espirito e finalidade da pKP„,c t ..· 1Pvençao„ Iodas estas modificações pretendem-se que ap iarn ino l ι ι ϊv-i· ...-. ... . . ,. .. jain x.i icj.uicfas no ambxto das reivindicações anexas. 40

TABELA 1

Composição da Dieta de Base......Usada et

Experiências com Pintos I. ngredien tes

Teor (g/kg) 280,0 200,0 80,0 350.0 58,5 5.0 15,0 1.0 1,0 ...........0..,¾ 1001,0 13,1 12,9 9,1 6,0 (6,0-6,6)1 4,5 (4,7--4,7)1 3,0 (3,1-3,!)1

Milho Amarelo

Sorgo (pequena teor de tanino) Farinha de semente de girassol (extraida corn dissolvente) Farinha de semente de soja (extraida corn dissolvente, 48,8% de proteínas)

Dleo de soja Vitaminas*

Sais minerais*

Calcário

Metionina sintética Cr2°3 ME (MJ/Kg)

Lisina

Metionina + cisina Cálcio Fósforo total F ósforo orgân :i.c:o fitico * Quantidade forneeida por quilograma de dieta: 12.000 UI de vitamina A: 2..000 UI de Vitamina l)g; 5 UI de vitamina E; 1,5 mg de vitamina K3; 1 mg de tiarnina: 5 mg de riboflavina; 1 rng de piridoxina; 30 mg de acido nicotinico; 7,5 rng de ácido D-pantoténico; 0,015 mg de vitamina B12; 0,5 rng de ácido fálico; 350 rng de cloreto de colina; 75 rng de etoxiquinq; 9,5 gramas de CaC03; 2,5 g de NaCl; 0,26 g de FeS04; 0,24 g de MnS04; 45 mg de CuS04; 60 mg de ZnS04: 105 mg <*> KI (mistura > ' () analisados para experiências 1 41 1 e 2, re spe c t i v a rn e n t e :Na Ji;a ca - Qao u Uimo a m Όo p • r·: y H- Ui

·' 1 c. w ! Qj Γ-; ; ;r Ό i ; > a : : a ; \ LO O O P «—- .a a . · ‘ !’T*· ® a a -·· Q i --- LO a -5 Si Ti

i ο ! Si ! i/i ! Si ! P a ú a '0 a Ti í Li. m p : i y i 0 c i ; i W P iii i ! y i 1j ΰ £ x i 0 i iii 0 i i P í 3i e Ό i ; c : T: iii S; • r-i : a ω 0- —4 0- Si i m = >_ : Γ· r- r- -- c- £ 0 i “ u y (•i : LO ~T LO C\ i y 0 i x Ό U· i i í_ -M i P a C i u U i c ã ' ! i m Oi v | Cl i 3 0 '· i i i3 c ·- ; i Cf' i p -ri i i í a Cl i .-· i ;··; i 1 -T-- ! ·-· ; q c ! i a·. 0"· 1> -0 O rO ; Pi y ! il! Ο! ; r· r·. S·· a·· =- ; s i Ό α ; LD -P iV\ íjj 0' ; i W i -”.r -í· iiii " LO i Õ u i 0 το i ti y 1 ··-! i ί Si ;,··. P i L : r-i 3 ;· CJ i .D i ϊ ο i ·« ; Si i C i T_1 1 0 i i a i α i 03 -0 -0 Lf^ ii; ·: i D i ui i £· r- c- -· r - ; P i « ! □ - U i ST <* 'l co O i C i a i -r· o:·-· 3 "Γ -C i a O; i i ; u i i h- i :i'i i ; P i Ti i ! ã. I 0; i 5 ! C Qi i j Si α i 0 ’·.·’ i i XI e 1 -ri i i 0 1 m i ! y _ i -ri Oi ! ; P i Ti Ό i ! c ; o: % i Q O i Oi 1 TJ i O ! i~ i Si ·:'» 'ΖΓ ~ i a i y c i ; α i m i a ! P i : ri 1 ; a i i ; l i LO T iO τ~· .....; ; u. CO i *·· = ; i - ··. v i C4 LO O·. 0 0 G i 1 T r ···. c: B kz - L Q; ! h- Ov j o U i : i U u U : Ω 42

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES - 15 - Processo para a obtenção de plantas ou de orgaos de plantas transgénicas contendo uma quantidade intensificada de urna fitase, caracterizado por se transformar uma planta hospedeira com um material construído de expressão contendo uma sequência de ADN que codifica a fitase opera-velrnenete ligada a sequências de regulação capazes de controlar a expressão da fitase na planta hospedeira e se cultivar a planta transformada em condições tendentes a expressar a sequência de ADN que codifica a fitase. ..... 2§ - Processo de acordo com a reivindicação 1,, caracterizado pelo facto de o material. construído de expressão ser capaz de controlar a expressão da fitase especifica do tecido. ... 3 a ... Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter a sequência de ADN que codifica a fitase a partir de uma fonte microbiana. - 5§ - Processo de acordo corri a reivindicação 4, caracterizado por se obter a sequência de ADN que codifica a fitase a partir de uma fonte constituída por um fungo filamentoso. 43 -

   - 6Ê - Processo de acordo corn a reivindicação 5, caracterizado por se obter a sequência de ADN due coditica a iitase a partir de Aspergi1 1us. - 7§ - Processo de acordo corn a reivindicação 6, caracterizado por se obter a sequência de ADN que codifica a iitase a partir de urna espécie de Aspergi 11.us escolhida do grupo que consiste ern jAsperg:Oius ficuurn, Asp.e.r9ÍiÍM®. lllOíir, Aspergillus.......awarnorl. e Aspergillusnidulans . - 8§ - Processo para a preparação durn material construído de expressão, caracterizado por se ligar operavelrnerrte urna sequência de ADN que codifica urna iitase com uma sequência de regulação que é capaz de controlar a expressão c o n s t i t u t i v a d a f i base .. ga .... Processo para a obtenção de urn vector de expressão, caracterizado pelo facto de este conter urn material construído de expressão de acordo com a reivindicação 8. - 10ã - Processo para a obtenção duma estirpe bacteriana, caracterizado pelo facto de esta conter um vector de acordo corn a reivindicação 9. - 11§ - Processo para a preparação durn material construído de expressão, caracterizado por se ligar upei-'aivelrnente urna sequericia de ADN a urna sequência de regulação capaz de controlar a expressão da iitase especifica do tecido. 44 -

   12® durn vector, um material ação 11 - caracte rizado c o n s t r u i d o d e Processo para a ubíençdu pelo facto de este conter expressão de acordo com a reivindic - 139 - Processo para a obtenção duma estirpe bacteriana , c a rac t e r 1 z a d o por se introduzir no seu con Junto , de genes num vector de acordo corn a reivindicação 1.2.. - 149 - Processo para a obtenção de uma plarvba transgénica ou de um orgao de planta transgènica, caracterizado pelo facto de a mencionada planta ou o citado orgao da planta conter um material construído de expressão que contém uma sequência de AON que codifica uma fitase operavelrnente ligada a sequências de regulação capazes de controlar a expressão da fitase na planta hospedeira, - 159 ··" Processo para a transformação de fitato um inositol e fosfato inorgânico, caracterizado por se aplicar a um substrato que contêm fitato uma fitase obtida pelo processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7.. ..... 169 a preparação de composições referidas composições, se !e acordo com qualquer das P r oc: e s s o p a r a a 1 i rn e n t a r e s , o a r a c t e r i z a d o p o r , incorporar uma fitase preparada reivindicações 1 a 7. - 17 - a 1 i rn e n t a r e s de Processo para acordo com a re a preparação de composições vindicação 16, caracterizado 45

   ροκ nas mencionadas composições, se incorporarem plantas transgénicas ou orgaos de? plantas transgénicas contendo fitase, obtidos pelo processo de? acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7. - 18§ - Processo para promover o crescimento de animais, caracterizado por se alimentar os citados animais com uma dieta que compreende um alimento de acordo c:orn a reivindicação 16 numa quantidade eficaz para promover o crescimento dos animais que? ingerem o referido alimento. - 19§ -- Processo para pr orn o ve?r a reduçrão dos niveis de teares de fitato no estrume produzido por animais, caracterizado pelo facto de se alimentar os animais com uma composição alimentar de acordo com a reivindicação 16, numa quantidade eficaz para transformar o fitato contido nos alimentos em inositol e fosfato inorgânico. - 20Ê - • Processo para a preparação de fitase, ca r acteriza d o por a) se transformar uma planta hospedeira por um material, construído de expressão que contêm uma sequência de AON que codifica ã fitase operavelrnente ligada a sequências de regulação capazes de controlar a expressão duma quantidade intensificada de fitase na planta hospedeira e se cultivar a planta transformada em condições tendentes a expressar a sequência de ADN que? codifica a fitase? nos tecidos da planta; e b) se extrair a fitase do tecido da ρ 1.anta transgénica. 46 . * A requerente reivindica a prioridade pedidos de patente norte.....americanos apresentados ern 23 Março de 1.390 e em 21 de Setembro de 1990, sob os numeros s é r i.e 498 , b 81 e b88,78b , r e s p ec t i v a rn e n t e . dos; de de Lisboa 22 de Março de 1991 0 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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