HU215164B - Eljárás fitáz kifejezésére transzgenikus növényekben, valamint eljárás ilyen növények előállítására és felhasználására - Google Patents

Eljárás fitáz kifejezésére transzgenikus növényekben, valamint eljárás ilyen növények előállítására és felhasználására Download PDF

Info

Publication number
HU215164B
HU215164B HU914086A HU408691A HU215164B HU 215164 B HU215164 B HU 215164B HU 914086 A HU914086 A HU 914086A HU 408691 A HU408691 A HU 408691A HU 215164 B HU215164 B HU 215164B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
phytase
plant
priority
expression
plants
Prior art date
Application number
HU914086A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT60780A (en
HU914086D0 (en
Inventor
Andreas Hoekema
Jan Pen
Krijn Rietveld
Peter Christian Sijmons
Teunis Cornelis Verwoerd
Albert J. J. Van Ooyen
Original Assignee
Gist-Brocades N.V.
Mogen International N.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gist-Brocades N.V., Mogen International N.V. filed Critical Gist-Brocades N.V.
Publication of HU914086D0 publication Critical patent/HU914086D0/hu
Publication of HUT60780A publication Critical patent/HUT60780A/hu
Publication of HU215164B publication Critical patent/HU215164B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03026—4-Phytase (3.1.3.26), i.e. 6-phytase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Fertilizers (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Hydroponics (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Cultivation Of Plants (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás fitáz kifejezésére transzgenikűsnövényekben vagy növényi szervekben, valamint eljárás ilyen növényekelőállítására. Növényeket őlyan DNS expressziós kőnstrűkció kaltranszfőrmálnak, amely kőnstrűkciók egy mikrőbiális eredetű fitáztkódőló gént tartalmaznak őlyan szabályőzó szekvenciák mögé építve,amelyek képesek a fitáz kifejeződését vezérelni kőnstitűtíven és/vagyszövetspecifikűsan. A találmány szerint előállítőtt transzgenikűsnövények vagy növényi szervek különböző ipari főlyamatőkbanalkalmazhatók, akár közvetlenül, példáűl állati tápőkban, akárközvetve, az expresszált fitáz extrahálva és szükség eseténfelhasználás előtt tisztítva. ŕ

Description

ilyen növények előállítására és felhasználására
KIVONAT
A találmány tárgya eljárás fitáz kifejezésére transzgenikus növényekben vagy növényi szervekben, valamint eljárás ilyen növények előállítására. Növényeket olyan DNS expressziós konstrukciókkal transzformáinak, amely konstrukciók egy mikrobiális eredetű fitázt kódoló gént tartalmaznak olyan szabályozó szekvenciák mögé építve, amelyek képesek a fitáz kifejeződését vezérelni konstitutíven és/vagy szövetspecifíkusan.
A találmány szerint előállított transzgenikus növények vagy növényi szervek különböző ipari folyamatokban alkalmazhatók, akár közvetlenül, például állati tápokban, akár közvetve, az expresszált fitázt extrahálva és szükség esetén felhasználás előtt tisztítva.
A leírás terjedelme 24 oldal (ezen belül 10 lap ábra)
HU 215 164 B
HU 215 164 Β
A találmány tárgya eljárás fitáz előállítására transzgenikus növényekben, eljárás ilyen növények előállítására, valamint az így előállított fitáz felhasználására ipari folyamatokban.
A foszfor minden szervezet növekedéséhez nélkülözhetetlen elem. Az állatállomány tartása során a tápot ki kell egészíteni szervetlen foszforral, hogy jó növekedési teljesítményt kapjunk az egygyomrú állatoknál (például sertések, csirkék, halak).
Ezzel ellentétben nincs szükség szervetlen foszfát hozzáadására a kérődző állatok tápjaihoz. A bendőben jelenlevő mikroorganizmusok olyan enzimeket termelnek, amelyek katalizálják a fítát (mio-inozit-hexakiszfoszfát) inozittá és szervetlen foszfáttá alakulását.
A fitát tartalék-foszforforrásként jelentkezik majdnem az összes, növényből származó tápban [a téma részletes összefoglalása: Phytic acid, chemistry and applications, E. Gráf (ed)., Pilátus Press; Minneapolis, MN, USA, (1986)]. Az összes dió, lisztes magvak, gumók, olajos magvak, spórák és pollenek 1-3%-a fitát. A fitinsav komplex sóit fitinnek nevezik. A fitinsavat káros tápkomponensnek tartják, mivel kelátot képez az ásványi anyagokkal, például a kalciummal, magnéziummal, cinkkel, vassal, és képes a fehérjékkel is reagálni, ezzel csökkentve a fehérjék és a táplálkozási szempontjából fontos ásványi anyagok biológiai hozzáférhetőségét.
A fitát foszfor keresztülhalad az egyszerű gyomrú állatok emésztőrendszerén, és a trágyába kiválasztódik. Jóllehet a fitát bizonyos mértékben hidrolizál a gyomorban, az így felszabadult szervetlen foszfátnak nincsen tápértéke, mivel a szervetlen foszfát csak a vékonybélben szívódik fel. Ennek az a következménye, hogy a tápérték szempontjából fontos foszfát jelentős mennyiségét nem hasznosítják az egyszerű gyomrú állatok, annak ellenére, hogy megtalálható a tápban.
A fitát foszfor trágyába való ürítésének további következményei is vannak. Az intenzív állattartás hatalmas mértékben megnövekedett az elmúlt évtizedben. Ennek az a következménye, hogy a keletkező trágya mennyisége is megnőtt, és a világ különböző részein környezeti problémákat okozott. A trágyából származó foszfát akkumulálódása a felszíni vizekben okozza részben az eutrofizációt.
A mikroorganizmusok által termelt enzimek, amelyek a fitát inozitra és szervetlen foszfátra való átalakulását okozzák, széles körben fitáz néven ismertek. A fitáztermelő mikroorganizmusok közé tartoznak a baktériumok, például a Bacillus subtilis [V. K. Paver and V. J. Jagannathan, J. Bacteriol., 151, 1102 (1982)], és a Pseudomonas [D. J. Cosgrove, Austral J. Bioi. Sci., 23, 1207 (1970)]; élesztők, például a Saccharornyces cerevisiae [N. R. Nayini and P. Markakis, Lebensmittel Wissenschaft und Technologie, 17, 24 (1984)]; valamint a gombák, például az Aspergillus terreus [K. Yamada, Y. Minoda and S. Yamamoto, Agric. Bioi. Chem., 32, 1275 (1986)]. Különböző más Aspergillus fajokról ismert, hogy fitázt termelnek, ezek közül az Aspergillus ficuum által termelt fitázról megállapították, hogy a legmagasabb specifikus aktivitással rendelkezik, valamint a hőstabilitása jobb, mint a más mikroorganizmusok által termelt fitázoké [van Gorcom et al., 89202436.5 számú Európai szabadalmi bejelentés, publikációs száma 0420358, 1989. szeptember 27.].
A fitázok számos növényfajban jelen vannak [lásd Loewus, F. A., In: Plánt Biology, 9: „Inositol metabolism in plants” (eds. D. J. Morré, W. F. Boss, F. A. Loewus) 13]. Gellatly, K. S. and Lefebvre, D. D., Plánt Physiology (supplement), 93, abstract 562) említik a burgonyagumókból izolált és jellemzett fitáz cDNS kiónt. Gibson, D. M. et al., és Christen, A. A. et al., (J. Cell Biochem,, 12C, L407-es, illetve L402-es absztraktok) említik az endogén fitáz szintézisét a szójabab magvak csírázása során. A növényi fitázok azonban rendszerint nem termelődnek elegendő mennyiségben ahhoz, hogy az ipari folyamatokban felhasználhatók legyenek.
Azt az elképzelést, hogy mikróbiális fitázt kell adni az egyszerű gyomrú állatok táplálékához, már korábban leírták [Ware, J. H., Bluff, L. and Shieh, T. R., 3 297 548 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Nelson, T. S., Shieh, T. R., Wodzinski, R. J. and Ware, J. H., J. Nutrition 101, 1289 (1971)]. A mai napig azonban ezt az elképzelést nem lehetett kereskedelmileg kiaknázni, mivel a mikróbiális enzimek előállítási költsége magas [Y. W. Han, Animal Feed Sci. and Technoi., 24, 345 (1989]. Gazdasági okok miatt a szervetlen foszfort tovább adagolják az egyszerű gyomrú állatok táplálékához.
A fitázok egyéb ipari felhasználását is megtalálták. Egy ilyen alkalmazás például egy olyan ipari eljárás, amely során a keményítőt lisztes magvakból, például kukoricából és búzából állítják elő. A melléktermékeket, amelyek például a kukorica glutánt tartalmazzák egy ilyen nedves őrlési eljárásból, állati tápláléknak adják el. Az áztatási eljárás során fitázt adhatunk a rendszerhez. A körülmények (T=50 °C, pH=5,5) ideálisak a gomba fitázok számára (lásd például a 0 321 004 számú, az Alko Ltd. cégnek megadott Európai szabadalmi bejelentést). Előnyösen, az említett eljárás melléktermékeiből származó állati tápanyagok fitát helyett foszfátot fognak tartalmazni.
Az a vélemény is kialakult, hogy a fitázokat a szójafeldolgozásban is lehet alkalmazni (lásd Finase TM enzimek, Alko, az Alko Ltd. által kiadott termékinformációs brosúra, Rajamaki, Finnország). A szójaliszt nagy mennyiséget tartalmaz a táplálkozás szempontjából káros fitátból, ami ezt a fehérjeforrást alkalmatlanná teszi arra, hogy csecsemők táplálására, halak, boijak, és egyéb nem kérődző állatok etetésére használják. Ennek az értékes fehéijének az enzimes javítása megnöveli ennek az anyagnak a tápértékét, valamint a kereskedelmi értékét.
Annak a lehetőségét vizsgáljuk, hogy értékes fehérjék előállítására transzgenikus növények használhatók-e. A pillanatnyilag ismert példák az interferon előállítása dohányban [Goodman, R. M., Knauf, V. C., Houck, C. M. and Comai, L., PCT/WO 87/00865 (1987)], enkefalinok előállítása dohányban (Brassica napus és Arabidopsis thaliana) [Vandekerchkove, J., Van Danimé, J., Van
HU 215 164 Β
Lijsebettens, M., Botterman, J., Deblock, M., DeClerq, A., Leemans, J., Van Montagu, M. and Krebbers, E., Bio/Technol., 7, 929 (1989)], antitestek előállítása dohányban [Hiatt, A., Cafferkey, R. and Boedish, K., Natúré, 342, 76 (1990)], valamint humán szérum-albumin előállítása dohányban és burgonyában [Sijmons P. C., Dekker, Β. Μ. M., Schrammeijer, B., Verwoerd, T. C., van den Elzen, P. J. M. and Hoekema, A., Bio/Technol., 8, 217 (1990)].
A gyakorlatban egyre növekvő számú növényfaj transzformációja, főleg a kétszikű fajoké (például a dohány, burgonya, paradicsom, Petúnia, Brassica) rutin eljárássá vált a szakterületen jártas szakemberek számára [Klee, H., Horsch, R. and Rogers, S., Annu. Rév. Plánt Physiol., 38, 467, (1987); Gasser, C. S. and Fraley, R. T., Science, 244, 1293 (1989)]. Az idegen gének növényekben való expressziójának stratégiája jól megalapozottá vált [Gasser, C. S. and Fraley, R. T., Science, 244, 1293 (1989)]. Növényi gének szabályozó szekvenciáit azonosították, amelyeket felhasználtak olyan kiméra gének készítésére, amelyeket expresszálni lehet növényekben és növényi sejtekben.
A gén-konstrukciók növényekbe való bevezetéséhez számos technológia ismert, például az Agrobacterium tumefacienssel vagy Agrobacterium rhizogenes-szel való transzformáció. Ezt a stratégiát alkalmazva számos növényi szövetet használtak fel, a választás nagymértékben függött a növényfajtól és szövettenyészetben való elérhetőségétől. A sikeres példák közé tartoznak a protoplasztok, mikrospórák vagy pollenek, valamint az explantumok, úgymint a levelek, szárak, gyökerek, hipokotilok és kotilok transzformációi. Emellett használják a DNS direkt bejuttatási módszerét protoplasztokba és növényi sejtekbe vagy szövetekbe, például a mikroinjektálást, elektroporációt, részecske bombázást és közvetlen DNS-felvételt [Gasser, C. S. and Fraley, R. T., Science, 244, 1293 (1989)].
Fehérjéket a növényi magvakban számos különböző expressziós rendszerrel elő lehet állítani. Például, egy konstitutív promoter, úgymint a karfiol mozaikvírus (CaMV) [Guilley, H., Dudley, R. K., Jonard, Balazs, E. and Richards, K. E„ Cell, 30, 763 (1982)] 35S promotere azt eredményezi, hogy az expresszált fehéije felhalmozódik a magvakban, többek között a transzgenikus növényekben. Egy másik módszer szerint szövet-specifikus és állapot-specifikus módon expresszálódó fehérjék génjeinek promotereit használhatjuk [Higgins, T. J. V., Annu. Rév. Plánt Physiol., 35, 191 (1984); Shotwell, M. A. and Larkins, B. A., In: The Biochemistry of plants, 75, (Academic Press, San Diego: Stumpf, P. K. and Conn, Ε. E., eds), 297 (1989)], azaz a gének csak a kiválasztott szövetben expresszálódnak, és csak a kiválasztott fejlődési állapotban.
Az nyilvánvaló, hogy a fitáz gazdaságos ipari méretű előállítása jelentős előnyt jelentene, többek között az állati tápokat készítő iparágnak. Ezért a találmány célja eljárás kidolgozása a fitáz gazdaságosabb előállítására rekombináns DNS technikák alkalmazásával olyan transzgenikus növények vagy növényi szervek előállítására, amelyek a fitázt megnövelt mennyiségben képesek kifejezni, és amelyeket azután úgy, ahogy vannak, hozzá lehet adni az állatok táplálékához vagy tápjához, abból a célból, hogy az állatok közvetlenül elfogyasszák. Egy másik módszer szerint a találmány szerint előállított transzgenikus növényekben vagy növényi szervekben expresszálódott fitázt ki lehet extrahálni, és ha szükséges, akkor a kívánt alkalmazás céljára tisztítani lehet.
A találmány tárgya eljárás megnövekedett mennyiségű fitázt tartalmazó transzgenikus növények vagy növényi szervek előállítására, melynek során egy növényi gazdaszervezetet olyan expressziós konstrukcióval transzformálunk, amely egy fitázt kódoló, mikrobiális forrásból származó DNS-szekvenciát tartalmaz a fitáz növényben való expresszióját vezérlő szabályozó szekvenciákhoz működőképesen kapcsolva, majd a transzformáit növényt a fitázt kódoló DNS-szekvencia kifejeződését biztosító körülmények között növesztjük. Az expressziós konstrukció olyan szabályozó szekvenciákat tartalmaz, amelyek konstitutíven és/vagy szövetspecifikus módon irányítják a fitáz expresszióját a növényekben, a növénytől vagy annak részétől függő módon.
A találmány továbbá a fenti expressziós konstrukció előállítására is vonatkozik, amely abban áll, hogy a fitázt kódoló DNS-szekvenciát működőképesen hozzákapcsoljuk egy olyan szabályozó szekvenciához, amely képes a fitáz konstitutív vagy szövetspecifikus expresszióját egy növényi gazdaszervezetben irányítani.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy vektor előállítására szolgáló eljárás, melynek során az ilyen expreszsziós konstrukciót egy alkalmas vektorba inszertáljuk.
A találmány továbbá a fenti vektorral transzformált baktériumtörzs előállítására is vonatkozik.
A találmány tárgyát képezi egy fitáz előállítására szolgáló eljárás is, amely abban áll, hogy (i) egy növényi gazdaszervezetet egy olyan expressziós konstmkcióval transzformálunk, amely a mikrobiális eredetű, fitázt kódoló DNS-szekvenciát olyan szabályozó szekvenciákhoz kapcsolva tartalmazza, amely képes a növényi gazdában megnövekedett mennyiségű fitáz expresszióját vezérelni, majd a transzformáit növényt a fitázt kódoló DNS-szekvencia expresszióját a növényi szövetben biztosító körülmények között növesztjük; és (ii) a fitázt a transzgenikus növényi szövetből extraháljuk.
A találmány szerint előállított transzgenikus növények vagy növényi szervek, valamint az expresszált fitáz számos ipari folyamatban alkalmazhatók, például állati táplálékban vagy tápokban az állatok növekedésének elősegítésére; vagy a fitát inozittá és szervetlen foszfáttá való átalakítására és ezáltal a fitát szintjének csökkentésére az állati trágyában. Az erre szolgáló eljárások és tápkészítmények előállítása is a találmány tárgyát képezik.
Az ábrák ismertetése:
1. ábra: A fitáz cDNS klónozásának stratégiája.
2. ábra: A fitáz cDNS fragmens transzlálódó régiójának nukleotid szekvenciája, valamint az ebből származtatott fitáz fehérje aminosav
HU 215 164 Β sorrendje; az érett fitáz fehérje kezdetét +1 jelzi.
3. ábra: A pMOG23 bináris vektor.
4. ábra: A klónozásnál alkalmazott szintetikus oligonukleotid duplexek.
5. ábra: A pMOG29 plazmid. A pUC18 plazmid, amely egy expressziós kazettát tartalmaz növényekben való konstitutív expresszió céljából, valamint egy dohány szignál-peptidet.
6. ábra: A fitázt tartalmazó őrölt magvak hozzáadásának hatása a szerves foszfor fitátból való felszabadulására.
7. ábra: Az Aspergillus fitáz dózis-hatás összefüggése egy in vitro emésztési modellben.
8. ábra: Az Aspergillus fitáz és dohánymagban található fitáz dózis-hatás összefüggése egy in vitro emésztési modellben.
A találmány szerint olyan transzgenikus növényeket vagy növényi szerveket állítunk elő, amelyek fitázt termelnek. Ezt úgy érjük el, hogy a növénybe egy fitáz aktivitással rendelkező fehérjét kódoló DNS szekvenciát juttatunk be.
A találmány szerint olyan DNS expressziós konstrukciókat állítunk elő, amelyek képesek egy fitázt kódoló génnel stabilan transzformálni egy növényt. Ezek a konstrukciók tartalmaznak egy fitázt kódoló DNS szekvenciát, amelyet működőképesen olyan szabályozó szekvenciákhoz kapcsolunk, amelyek képesek a fitáz expresszióját szabályozni. Ezek a szabályozó szekvenciák tartalmazhatnak olyan szekvenciákat is, amelyek a transzkripciót a növényekben vagy konstitutíven, és/vagy szövetspecifikus módon vezérlik, a növénytől vagy annak kiválasztott részétől függően.
A találmány szerinti expressziós konstrukciók beépíthetők egy vektorba, előnyösen egy plazmidba, amelyet a kiválasztott növényi gazdaszervezet baktériumok által közvetített transzformálására használunk. Az expressziós konstrukciót ezután előnyösen integráljuk a növényi gazdaszervezet genomjába.
A találmány szövegében a „fitáz” kifejezés alatt olyan enzimcsaládot értünk, amelynek tagjai katalizálják a szervetlen foszfor felszabadulását különböző mioinozit-foszfátokból. Nyilvánvaló, hogy az összes, fitáz aktivitással rendelkező fehérjét ide értjük.
A fitázt kódoló DNS szekvenciát számos különböző forrásból előállíthatjuk, azaz mikrobiális, növényi vagy állati forrásból. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott DNS szekvenciát mikrobiális forrásból állítjuk elő, például az Aspergillus fonalas gombából. A legelőnyösebb DNS szekvenciákat Aspergillus ficuum-ból, Aspergillus niger-ből, Aspergillus awamori-ból és Aspergillus nidulans-ból állítjuk elő.
Egy fitáz fehérjét kódoló gén vagy cDNS klónozását különböző módszerekkel végezhetjük. Az egyik módszer a fitáz fehérje tisztítása, ezt követi az N-terminális, valamint számos belső aminosavszekvencia meghatározása, és a fitázt termelő szervezet egy genomiális vagy cDNS könyvtárának átvizsgálása, az aminosav szekvencián alapuló próba alkalmazásával.
Ha a gén szekvenciájának csak egy része is ismert, akkor ezt az információt felhasználhatjuk a megfelelő cDNS klónozására, például a polimeráz láncreakció (PCR) alkalmazásával [PCR Technology: Principles and Applications fór DNA Amplifícation, (1989), H. A. Ehrlich, ed., Stockton Press, New York].
Az nyilvánvaló a szakterületen jártas szakember számára, hogy az előzőekben ismertetett klónozott fitáz gént használhatjuk heterológ hibridizálási kísérletekben, amelyek célja a fitázt kódoló gének izolálása más mikroorganizmusokból.
Egy másik szempont, hogy a fentiekben ismertetett, klónozott fitáz gént felhasználhatjuk úgynevezett „második generációs” fitáz gének előállításánál kiindulási anyagként. A „második generációs” fitázok olyan fitázok, amelyeket mutagenezis technikákkal megváltoztattunk (például helyspecifikus mutagenezissel), és tulajdonságaik eltérnek a vad típusú fitázokétól, vagy rekombináns fitázok, például amelyeket találmányunk szerint állítunk elő. Megváltoztathatjuk például a hőmérséklet vagy pH-optimumot, a specifikus aktivitást vagy a szubsztrát affinitást úgy, hogy jobban illeszkedjen egy meghatározott eljárásban való alkalmazáshoz.
A fitázt kódoló cDNS izolálása lehetővé teszi olyan expressziós konstrukció készítését, amely képes a fitáz termelését irányítani a kiválasztott növényi gazdaszervezetben rekombináns DNS technikák alkalmazásával, például a szabályozó elemek, úgymint a promoterek, szekréciós jelek vagy ezek kombinációinak cseréjével.
A fitázt konstitutíven elő lehet állítani a transzgenikus növényekben mindegyik fejlődési állapotban. A használt növénytől vagy növényi szervtől függően az enzimeket fejlődési állapot-függő módon expresszálhatjuk, például a gumóképződés során, vagy a gyümölcs fejlődése során. Emellett, a felhasználástól függően, az enzimeket szövetspecifikusan is expresszálhatjuk, például növényi szervekben, például gyümölcsben, gumókban, levelekben vagy magvakban.
A transzgenikus növények közé, amint azt a találmány szövegében meghatároztuk, azok a növények (valamint az említett növények részei és sejtjei) és utódaik tartoznak, amelyeket genetikailag módosítottunk rekombináns DNS technikák alkalmazásával, hogy a kiválasztott növényben vagy növényi szervben a fitáz expresszióját okozzuk vagy megnöveljük.
A találmányi leírás szövegében a „megnövekedett mennyiségű fitáz” specifikusan egy statisztikusan szignifikáns mennyiségű növényi szövetre vonatkozik, amely átlagban statisztikusan szignifikáns módon nagyobb mennyiségű fitáz enzimet tartalmaz, mint a nemmódosított növényi szövet azonos mennyisége.
A találmányi leírás szövegében a kiválasztható növények közé tartoznak, de nem korlátozzuk magunkat ezekre, az ehető virágokat tartalmazó termények, például a karfiol (Brassica oleracea), az articsóka (Cynara Scolymus), gyümölcsök, például az alma (Malus, például domesticus), banán (Musa, például acuminata), bogyósok (úgymint a ribizli, Ribes, például a rubrum), a cseresznyék (például az édes cseresznye, Prunus például avium), uborka (Cucumis, például sativus), szőlő
HU 215 164 Β (Vitis, például vinifera), citrom (Citrus limon), dinnye (Cucumis meló), diók (úgymint a dió, Juglans, például a regia; a foldimorogyó, Arachis hypogeae), narancs (Citrus, például maxima), barack (Prunus, például persica), körte (Pyra, például Communis), szilva (Prunus, például domestica), eper (Fragaria, például moschata), paradicsom (Lycoperrsicon, például esculentum), levelek, úgymint a lucerna (Medicago, például sativa), káposztafélék (például a Brassica oleracea), cikória (cichoreum, például endivia), póréhagyma (Album, például porrum), saláta (Lactuca, például sativa), spenót (Spinacia, például oleraceae), dohány (Nicotiana, például tabacum), gyökerek, úgymint a nyílgyökér (Maranta, például arundinacea), répák (Béta, például vulgáris), sárgarépa (Daucus, például carota), kasszava (Manihot, például esculenta), tarlórépa (Brassica, például rapa), retek (Raphanus, például sativus), jam (Doscorea, például esculenta), édesburgonya (Ipomoea batatas) és magvak, úgymint babok (Phaseolus, például vulgáris), borsó (Pisum, például sativum) szójabab (Glycin, például max), búza (Triticum, például aestivum), árpa (Hordeum, például max), kukorica (Zea, például mays), rizs (Oryza, például sativa), repcemag (Brassica napus), köles (Panicum L.), napraforgó (Helianthus annus), zabok (Avena sativa), gumók, úgymint a karalábé (Brassica, például oleraceae), burgonya (Solanum, például tuberosum) és a hasonlók.
A növényfaj megválasztását elsődlegesen a növény vagy növényi rész célzott felhasználása, valamint a növény transzformálhatósága határozza meg.
Számos technika ismert a számunkra fontos enzimet kódoló expressziós konstrukciót tartalmazó DNS szekvenciának a kiválasztott növénybe való bejuttatására. Ezek közé a technikák közé tartozik (anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat) a protoplasztok transzformálása a kalcium/polietilén-glikol módszerrel, az elektroporáció és mikroinjektálás, vagy a (borított) részecskékkel való bombázás [Potrykus, L Bio/Technol., 8, 535 (1990)].
Ezek mellett az úgynevezett közvetlen DNS-transzformációs módszerek mellett számos, vektorokon alapuló transzformációs rendszer is széles körben elterjedt, például a virális vektorokon [azaz a karfiol mozaik víruson (CaMV)] és bakteriális vektorokon (azaz az Agrobacterium fajba tartozó plazmidokon) alapuló transzformáció (Potrykus, 1990). A szelektálás és/vagy átvizsgálás után a transzformált protoplasztokat, sejteket és növényi részeket teljes növényekké regenerálhatjuk, a szakterületen ismert módszerek alkalmazásával [Horsch, R. B., Fry, J. E., Hoffmann, N. L., Eichholtz, D., Rogers, S. G. and Fraley, R. T., Science, 227, 1229 (1985)]. A transzformációs és/vagy regenerációs technikák megválasztása a jelen találmány szempontjából nem kritikus.
A kétszikűeknél a jelen találmány egy előnyös kiviteli alakja tartalmazza egy bináris vektorrendszer alkalmazását [(Hoekema, A., Hirsch, P. R., Hooykaas, P. J. J. and Schilperort, R. A., Natúré, 303, 179 (1983); Schilperoort, R. A. Hoekema, A. and Hooykaas, P. J. J.,
European Patent Application No. 0120516(1984)], amelyben olyan Agrobacterium törzseket alkalmazunk, amelyek a virulencia géneket tartalmazó vir plazmidot hordozzák, valamint egy kompatíbilis plazmidot, amely az átviendő gén-konstrukciót tartalmazza. Ez a vektor mind Escherichia coli-ban, mind Agrobacteriumban képes szaporodni, és a Binl9 bináris vektorból származik [Bevan, M. Nucl. Acids. Rés. 12, 8711 (1984)], amelyet a találmány szempontjából lényegtelen módon változtattunk meg. Az ebben a példában alkalmazott bináris vektorok a T-DNS baloldali és jobboldali határoló szekvenciái között egy kanamicin rezisztenciát kódoló azonos NPTII-gént tartalmaznak [Bevan, M. Nucl. Acids. Rés. 12, 8711 (1984)], valamint egy többszörös klónozó helyet, ahova a kívánt génkonstrukciókat klónozni lehet.
Az egyszikű növények transzformálása és regenerálása nem egy standard eljárás. Az újabb tudományos eredmények azonban azt mutatják, hogy elvileg az egyszikűek transzformálhatok, és a transzformált sejtekből transzgenikus növények regenerálhatok. Az ezen növényekre kidolgozott reprodukálható szövettenyésztő rendszerek fejlődése, a genetikai anyagnak a növényekbe való bejuttatására kidolgozott hatékony módszerek megkönnyítették a transzformációt. Jelenleg az egyszikűek transzformálására választható módszerek közé tartozik az explantumok vagy szuszpenziós sejtek mikroprojektil bombázása, valamint a protoplasztok közvetlen DNS felvétele vagy elektroporációja. Például transzgenikus rizsnövényeket sikeresen állítottak elő a bakteriális hph (higromicin rezisztenciát kódoló) gén szelekciós markerként való alkalmazásával. A gént elektroporációval juttaták be [Shimamoto, K., Terada, R., Izawa, T. Fujimoto, H., Natúré, 338, 274 (1989)]. Transzgenikus kukorica növényeket úgy állítottak elő, hogy a Streptomyces hygroscopicus bar génjét, amely foszfinotricin-acil-transzferázt kódol (ez az enzim inaktiválja a foszfinotricin nevű herbicidet) kukorica szuszpenziós tenyészet embriogén sejtjeibe juttatták be mikrorészecske bombázással [(Gordon-Kamm, W. J., Spencer, T. M., Mangano, M. L., Adams, T. R., Daines, R. J., Start, W. G., O’Brien, J. V., Chambers, S. A., Adams Jr., W. R., Willets, N. G., Rice, T. B., Mackey, C. J., Krueger, R. W., Kausch, A. P. and Lemaux, P. G., The Plánt Cell, 2, 603 (1990)]. A genetikai anyag bejuttatását más egyszikű növények, például búza és árpa aleuron protoplasztjaiba már közölték [Lee, B., Murdoch, K. Topping, J., Kreis, M. and Jones, M. G. K., Plánt Mól. Biok, 13, 21 (1989)]. A búzanövényeket embriogén szuszpenziós tenyészetből szelektálták, oly módon, hogy csak az idős kompakt és noduláris embriogén kallusszöveteket szelektálták az embriogén szuszpenziós tenyészet létrehozásához [Vasil, V., Readway, F. and Vasil, L K., Bio/Technol, 8, 429 (1990)]. Az ezekre az egyszikű növényekre kidolgozott transzformációs rendszereknek a kombinálása lehetővé teszi a jelen találmány alkalmazását egyszikű növényekre. Ezek a módszerek alkalmasak kétszikűek transzformálására és regenerálására is.
A fitáz konstrukciók növényekben való expressziója olyan részleteket is magában foglal, mint a gén transz5
HU 215 164 Β kripciója a növényi polimerázokkal, a mRNS transzlációja stb., amelyek a rekombináns DNS szakterületen jártas szakemberek számára ismertek. Az alábbiakban csak a találmány kellő szintű megértéséhez szükséges részleteket tárgyaljuk.
Azokat a szabályozó szekvenciákat használhatjuk a találmányban, amelyekről ismert, vagy úgy találták, hogy a fitáz expresszióját okozzák. A szabályozó szekvenciák megválasztása függ a megcélzott terménytől és/vagy a megcélzott szervtől. Ezeket a szabályozó szekvenciákat növényekből vagy növényi vírusokból állíthatjuk elő, vagy kémiailag szintetizálhatók. Ezek a szabályozó szekvenciák növényi transzkripció szabályozásában aktív promóterek, akár konstitutív, akár szövetspecifikus módon, a használt növénytől vagy növényi résztől függően. Ezek közé a promóterek közé tartoznak a konstitutíven expresszálódó gének promóterei, például a CaMV (karfiol mozaikvírus) 35S promótere [Guilley et al., Cell, 30, 763 (1982)], a levélspecifikus expresszió promóterei, például a biszfoszfát-karboxiláz kis alegység génjéé [Coruzzi et al., EMBO J., 3, 1671 (1984)], a gyökérspecifikus expresszió promóterei, például a glutamin-szintetáz gén promótere [Tingey et al., EMBO J., 6, 3565 (1987)], a magspecifikus expresszió promóterei, például a kruciferin A promoter Brassica napusból [Ryan et al., Nucl. Acids. Rés. 17, 3584 (1989)], a gumóspecifikus expresszió promóterei, például az I-es osztályú patatin promoter burgonyából [Rocha-Sosa et al., EMBO J., 8, 23 (1989); Wenzler et al., Plánt Mól. Bioi., 12, 41 (1989)], vagy a gyümölcsspecifikus expresszió promoterei, például a poligalakturonidáz (PG) promoter paradicsomból [Bírd et al., Plánt Mól. Bioi., 11, 651 (1988)].
A többi szabályozó szekvencia, úgymint a terminátor szekvencia és poliadenilezési szignál, beleértve minden, növényben így működő szekvenciát, a szakember számára ismert. A példák közé tartozik az Agrobacterium tumefaciens nopalin szintetáz génjének 3’ határoló régiója [Bevan, M., Nucl. Acids. Rés. 12, 8711 (1984)].
A szabályozó szekvenciák tartalmazhatnak enhanszer szekvenciákat is, például olyanokat is, amelyeket a CaMV 35S promoterében találtak, és mRNS stabilizáló szekvenciákat, amilyen például a lucerna mozaikvírus (A1MV) RN4 leader szekvenciája (Brederode et al., 1980), vagy bármely más, az említett módon működő szekvencia.
A fitázt olyan környezetben kell expresszálni, amely az expresszált fehéije optimális stabilitását biztosítja. A sejt-kompartment megválasztását, például azt, hogy legyen az a citoszol, endoplazmatikus retikulum, vakuólum, fehérjetest vagy periplazmatikus tér, használhatjuk a találmányban arra, hogy egy ilyen stabil környezetet hozzunk létre, a fitáz biofizikai paramétereitől függően. Az ilyen paraméterek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a pH optimum, a proteázokra való érzéketlenség vagy az előnyös kompartment molaritására való érzékenység.
A sejt citoplazmájában való expresszió eléréséhez az expresszált enzim nem tartalmazhat szekréciós szignálpeptidet, vagy bármely más célszekvenciát. A kloroplasztokban vagy mitokondriumokban való expresszió céljából az expresszált enzimnek egy úgynevezett tranzit-peptidet kell tartalmaznia, hogy ezekbe a sejtszervekbe bejussanak. Azok a célszekvenciák, amelyeket hozzá lehet kapcsolni ezekhez, már ismertek [Smeekens et al., TIBS, 15, 73 (1990); van den Broeck et al., Natúré, 313, 358 (1985); Schreier et al., EMBO J., 4, 24 (1985)]. Ha az enzim aktivitására a vakuólumban van szükség, akkor egy szekréciós szignálnak is jelen kell lennie, valamint egy specifikus célzó szekvenciának, amely ezeket az enzimeket ezekbe a vakuólumokba irányítja [Tauge et al., Plánt Phys. 86, 506 (1988)]. Ugyanez igaz a magvakban levő fehérjetestekre is. A számunkra fontos enzimet kódoló DNS szekvenciát úgy kell módosítani, hogy az enzim a sejten belül a megfelelő helyen tudja kifejteni a hatását.
A fitáz extracelluláris expressziójának eléréséhez a találmány szerinti expressziós konstrukció egy szekréciós szignálszekvenciát használ. Jóllehet a növényfaj számára homológ (natív) szignálszekvenciák előnyösek, a heterológ szignálszekvenciák, azaz a más növényfajból származó vagy mikróbiális eredetűek is használhatók. Az ilyen szignálszekvenciák ismertek a szakterületen jártas szakemberek számára. A találmány szerinti eljárás során alkalmazható, megfelelő szignálszekvenciákat leírták már [Walter, P. and Blobel, G., Biochem. Soc. Symp., 47, 183 (1986); Von Heijne, G., J. Mól. Bioi., 189, 239 (1986); and Sijmons, P. C., Dekker, Β. Μ. M., Schrammeijerr, B., Verwoerd, T. C., van den Elzen, P. J. M. and Hoekema, A., Bio/Technol., 8, 217 (1990)].
A találmány szerinti megfelelő DNS konstrukciók minden elemét (promóterek, szekretáló, stabilizáló, célzó vagy terminációs szekvenciák) módosíthatjuk, ha szükséges, hogy befolyásoljuk a szabályozás jellegét, a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerrel.
A találmány szerint előállított fitáztartalmú növényeket felhasználhatjuk arra, hogy magasabb fitáztartalmú növényeket vagy növényi szerveket állítsunk elő. Lehetséges például, hogy szomaklonális variációs technikákkal vagy keresztezési technikákkal állítsunk elő ilyen növényeket. Egy szakember számára jól ismertek az ilyen technikák.
A találmány egy előnyös megvalósítási formája szerint egy kétszálú, fitázt kódoló kétszálú cDNS-t állítunk elő Aspergillus ficuum-ból izolált mRNS alapján (van Gorcon et al., 1991). A DNS konstrukciót a Brassica napus kruciferin nevű 12S tartalék fehérjére szabályozó szekvenciájának irányítása alá helyezzük. A konstrukciót ezután egy bináris vektorba, például a pMOG23-ba klónozzuk (Escherichia coli K-12 DH5a törzsben letétbe helyezve, Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, the Netherlands, 1990. január 29-én CBS 102.90 letéti szám alatt). Ezt a vektort bejuttatjuk Agrobacterium tumefaciensbe, amely egy gyengített Ti plazmidot tartalmaz. Az ezt a konstrukciót tartalmazó baktérium sejteket együtt tenyésztjük dohányból vagy Brassica növényekből származó szövetekkel, majd a transzformált növényeket antibiotikumokat tartalmazó
HU 215 164 Β táptalajon szelektáljuk, és arra indukáljuk, hogy az adott táptalajon differenciálódott növényekké regenerálódjanak. A keletkező növények olyan magvakat termelnek, amelyek tartalmazzák és expresszálják a DNS konstrukciót.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a fitázt kódoló DNS konstrukciót a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S promoteréből származó szabályozó szekvencia irányítása alá helyezzük. A konstrukciót ezután egy bináris vektorba szubklónozzuk. Ezt a vektort bejuttatjuk Agrobacterium tumefaciensbe, amely egy legyengített Ti plazmidot tartalmaz. Az ezt a konstrukciót tartalmazó baktériumsejteket együtt tenyésztjük dohányból vagy Brassica növényekből származó szövetekkel, majd a transzformált növényi sejteket antibiotikumokat tartalmazó táptalajon növesztjük, majd arra indukáljuk, hogy ezen a táptalajon differenciálódott növényekké regenerálódjanak. A kapott növények tartalmazzák és konstitutíven expresszálják a DNS konstrukciót.
A fitáz aktivitást számos különböző módszerrel megmérhetjük, ezek megválasztása nem kritikus a jelen találmány szempontjából. A transzgenikus növényi szövetek fitáz aktivitását megmérhetjük például ELISA módszerrel, Western biot módszenei, vagy közvetlen enzimmérési módszerrel, kolorimetriás technikák vagy natív gél vizsgálati módszerek alkalmazásával.
A fitázt tartalmazó növényt vagy növényi szervet, amint azt a jelen találmány szerint előállítottuk, számos, fitázműködést igénylő ipari folyamatban alkalmazhatjuk.
A találmány szerint előállított, fitázt tartalmazó növényeket vagy növényi szerveket fel lehet használni az ipari folyamatokban, például nem kérődző állatok esetében tápadalékként, a szója feldolgozásában vagy az inozit, illetve inozit-foszfát fitátból való előállításában. Más fitáttartalmú szubsztrátot használó ipari folyamat is van, például a keményítőipar és a fermentációs ipar. A fémionok fitát által okozott kelációja okozhatja azt, hogy ezek az ásványi anyagok nem hozzáférhetők a termelő mikroorganizmusok számára. A fitát enzimatikus hidrolízise megelőzi ezt a problémát.
A növényekben előállított fitázt alkalmazni lehet a kukorica vagy cirok áztatása során. A növényi szövetet meg lehet őrölni, mielőtt az áztatott kukoricához adnánk. A magvakból felszabadított fitáz működhet a fitinen, amely számos kukorica-készítményben jelen van. A fitin lebomlása az áztatott kukoricában előnyös a kukoricalekvár kereskedelmi értéknövekedése szempontjából, mivel ezt állati tápként vagy mikrobiális fermentációk tápanyagaként lehet használni. Emellett, a fitin lebontása megelőzheti a kukoricalekvár töményítése, szállítása és tárolása során fellépő lerakódások felhalmozódását a szűrőkön, csövekben, rektorokban stb. (Vaara et al., 1989). A fitáz működése felgyorsíthatja a nedves kukorica őrlésében szerepet játszó áztatási folyamatokat és elválasztási folyamatokat.
A növényeket vagy növényi szerveket alkalmazhatjuk közvetlenül, azaz minden további feldolgozás nélkül, illetve először szokásos módon feldolgozva, azaz a kívánt konzisztenciára őrölve a feldolgozás előtt.
Egy másik módszer szerint a fitázt kivonhatjuk a növényből vagy növényi szervből, és ha szükséges, akkor felhasználás előtt szokásos extrahálási és tisztítási technikákkal tisztíthatjuk.
A fitázok előállítása olyan növényekben, amelyek kompatibilisek a szándékolt felhasználási területtel, kényelmet nyújt, és a mikrobiális eredetű fitázokhoz képest csökkenti a termelési költségeket, ezzel lehetővé teszi a gazdaságos alkalmazását például állati tápokban, és ez végül a szervetlen foszfáttal versenyképes ár/in vivő teljesítményt eredményez. További előny, hogy lényegesen csökken a trágya foszfortartalma.
Nyilvánvaló, hogy a fitázok alkalmazása, a szervetlen foszfáttal versenyképes ár mellett, megnöveli a tápkészítő ipar lehetőségeit a magas tápértékű tápok előállítása során. Ha például a tápot fitázzal egészítjük ki, akkor nem kell szervetlen foszfátot hozzáadni, és a különböző, fitáttartalmú anyagok mennyiségét megnövelhetjük.
Az alábbi példákat úgy adjuk meg, hogy a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember teljes leírást kapjon arról, hogyan kell a találmányt alkalmazni, és nem szándékozunk a találmány oltalmi körét csupán a példákra korlátozni. Erőfeszítéseket tettünk arra, hogy a használt számok pontosak legyenek (például a mennyiségek, hőmérséklet, pH stb. vonatkozásában), de kísérleti hibákat és eltéréseket figyelembe kell venni. Ha külön nem jelöljük, akkor a hőmérsékletet Celsius fokban adjuk meg, a nyomás pedig közel atmoszferikus.
1. példa:
Poli-A4 RNS izolálása Aspergillus ficuumból
Az Aspergillus ficuum NRRL 3135 törzset az alábbi összetételű táptalajon növesztjük: 22,72 g/1 kukoricaliszt (amilázzal kezelve pH=7-en, 85 °C-on 15 percig), 9,36 g/1 glükóz, 2,9 g/1 kálium-nitrát, 0,142 g/1 káliumklorid, 0,142 g/1 mangán(II)-szulfát-7 víz és 56,8 mg/ml vas(II)-szulfát-7 víz. Hat nap elteltével a micéliumokat begyűjtjük.
0,5 g száraz micéliumot cseppfolyós nitrogénben lefagyasztunk, majd megőrlünk. Ezt követően az anyagot Ultra Turrax-szal homogenizáljuk (teljes sebesség, 1 perc) 0 °C-on 3 M lízium-klorid, 6 M karbamid összetételű oldatban, majd éjszakán át 4 °C-on tartjuk Auffray és Rougeon leírása szerint (1980). Az összes celluláris RNS-t úgy nyeljük ki, hogy 16000 x g-vel centrifugáljuk a szuszpenziót, majd kétszer extraháljuk egymás után fenol:kloroform:izoamil-alkohol (50:48:2) arányú elegyével. Az RNS-t etanollal kicsapjuk, majd 1 ml TRIS-HC1 (pH=7,4), 0,5% SDS elegyben oldjuk. A poli A+ szelekcióhoz az össz-RNS-t tartalmazó mintát 5 percre 65 °C-ra melegítjük, 0,5 mM nátrium-klorid koncentrációt állítunk be, majd ezt követen oligo(dT)-cellulóz oszlopra visszük fel. Miután néhányszor mostuk 10 mM TRIS (pH=7,0), 1 mM EDTA és 0,1 mM nátrium-klorid összetételű oldattal, a poli A+ RNS-t eluálás után (10 mM TRIS pH=7,0, 1 mM EDTA eluálószer) összegyűjtjük.
HU 215 164 Β
2. példa:
A fitázt kódoló cDNS készítése és klónozása
A cDNS első láncának szintéziséhez 5 μg poli A+ RNS-t, amelyet az 1. példa szerint izoláltunk, 16,5 μί vízben oldunk, és az alábbi komponenseket adjuk hozzá: 2,5 μΐ Rnasin-t (30 Ε/μ1), 10 μί puffért (összetétele: 50 mM TRIS-HC1 pH=7,6, 6 mM magnézium-klorid, 40 mM kálium-klorid), 2 μί 1 mM kálium-klorid, 5 μί 0,1 mM DTT, 0,5 μί oligo(dT)12-18 (2,5 mg/ml), 5 μί 8 mM dNTP keverék, 5 μΐ BSA (1 mg/ml) és 2,5 μί Moloney MLV reverz transzkriptáz (200 E/ml). Az elegyet 30 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd a reakciót 10 μί 0,2 mM EDTA és 50 μΐ víz hozzáadásával állítjuk le. Ezután extraháljuk 110 μΐ kloroformot alkalmazva, majd miután 5 percig centrifugáltuk, 5 M ammóniumacetátot és 440 μί abszolút etanolt adunk hozzá (-20 °C-on). A kicsapást szárazjég/etanol oldatban végezzük 30 percig.
Miután lecentrifugáltuk (10 perc, 0 °C), a cDNS/mRNS csapadékot megszárítjuk, és 20 μΐ vízben oldjuk.
A fitázt kódoló cDNS izolálását polimeráz láncreakcióval (PCR) végezzük, két fragmentben. A két fragmentet kombináljuk, a génen belül található BamHI restrikciós hasítási hely alkalmazásával, így állítjuk elő a teljes hosszúságú cDNS-t. A fitáz cDNS klónozásának stratégiáját az 1. ábrán mutatjuk be.
A fitáz gén részleges szekvenálása (van Gorcom et al., 1991) egy BamHI restrikciós hasítási helyet mutat az iniciációs kodon után körülbelül 800 bázispárral. Az említett BamHI hasítási hely körüli BamHI nukleotid szekvenciát, valamint a fitáz gén start kodonját megelőző nukleotid szekvenciát és a stop kodonját követő nukleotid szekvenciát használjuk a PCR-ben használt oligonukleotid szekvenciák tervezéséhez.
A polimeráz láncreakciót a Taq polimeráz szállítója (Cetus) előírásai szerint végezzük 1,5 μί, az első lánc szintézisének reakciótermékét tartalmazó oldattal és 0,5-0,5 μg oligonukleotidot tartalmazó oldattal. Az amplifikálást egy DNS amplifikáló berendezésben végezzük (Perkin Elmer/Cetus) 25 ciklust végzünk (2 perc 94 °C, 2 perc 55 °C, 3 perc 72 °C), majd a reakcióelegyet fenol és kloroform extrakcióval fehérjementesítjük. A DNS-t kicsapjuk, feloldjuk egy puffer20 ben (összetétele: 10 mM TRIS pH=7,0, 0,1 mM EDTA), majd ezt köveőten a megfelelő restrikciós enzimekkel emésztjük.
A fehérje N-terminális részét kódoló fragment amplifikálásához az alábbi két oligonukleotidot hasz25 náljuk:
Oligol: 5’GGGTAGAATTCAAAAATGGGCGTCTCTGCTGTTCTA 3’ Oligo2: 5’AGTGACGAATTCGTGCTGGTGGAGATGGTGTCG 3’
Az amplifikált fragmentet EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd a pTZ18R (a Pharmaciánál vásá- 30 rolható) plazmid EcoRI hasítási helyére klónozzuk.
A restrikciós hely térképezése és a nukleotid szekvencia meghatározása igazolja, hogy a fragment megfelelő. A kapott plazmid jele pGB925.
A második fragment amplifikálásához az alábbi két oligonukleotidot használjuk:
Oligo3: 5 ’GAGCACCAAGCTGAAGGATC C 3 ’
Oligo4: 5’ AAACTGCAGGCGTTGAGTGTGATTGTTTAAAGGG 3’
Az amplifikált fragmentet BamHI és PstI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd ezt követően BamHI és PstI restrikciós enzimekkel emésztett pTZ18R plazmidba klónozzuk. A restrikciós térképezés és szekvenálás azt mutatja, hogy a helyes fragmentet izoláltuk. A kapott plazmid jele pGB926.
Abból a célból, hogy teljes hosszúságú cDNS-t izoláljunk, a pGB925 plazmidot EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a fitázt kódoló DNS-t izoláljuk. Ezt a fragmentet klónozzuk a pGB926 plazmidba, amelyet előzőleg EcoRI és BamHI restrikciós enzimmel emésztettünk, így kapjuk a pGB927 plazmidot. A pGB927 plazmid tartalmazza a fitázt kódoló teljes hosszúságú cDNS-t, mérete körülbelül 1,8 kb. A fitáz fehérjét kódoló cDNS régió szekvenciáját, valamint az ebből származtatott aminosavszekvenciát a 2. ábrán mutatjuk be.
3. példa:
A pMOG23 bináris vektor készítése
Ebben a példában a pMOG23 bináris vektor készítését írjuk le (Escherichia coli KI2 DH5a törzsben, letétbe helyezve a Centraal Bureal voor Schimmelcultures-nél, 1990. január 29-én, CBS 102.90 letéti szám alatt).
A pMOG23 bináris vektor (2. ábra) a Binl9 vektor származéka (Bevan, M., 1984). A pMOG23 előállításához a Bin 19 vektort oly módon változtatjuk meg, hogy az nem lényeges a jelen találmány szempontjából, a molekuláris biológia szakterületen jártas szakember számára ismert módszereket alkalmazva.
Elsőként a baloldali határoló szakaszt (LB) és a jobboldali határoló szakaszt (RB) cseréljük ki, a neomicinfoszfotranszferáz II gén (NPTII gén) alapján. Másodszor, az NPTII orientációját fordítjuk meg, ezzel az LB irányában kapunk transzkripciót. Végezetül, a Bin 19-ben levő polilinkert helyettesítjük egy olyan polilinkerrel, amely az alábbi restrikciós enzim felismerési helyeket tartalmazza: EcoRI, KpnI, Smal, BamHI, Xbal, SacI, Xhol és HindlII.
4. példa:
Az Aspergillus ficuum fitáz cDNS-ének klónozása egy olyan expressziós konstrukcióban, amely konstitutív expressziót biztosít növényekben Az Aspergillus ficuum fitáz génjét átalakítjuk, és egy olyan expressziós konstrukcióban klónozzuk, amely konstitutív expressziót biztosít a karfiol mozaikvírus 35S promotere után. Az expressziós konstrukció tartalmazza a növényi eredetű szignál-peptid szekvencia kódoló információját.
HU 215 164 Β
A fitáz cDNS-t a pMOG29 plazmidban levő (az a) pontban írjuk le) expressziiós szerkezetbe klónozzuk. Ezt követően a teljes konstrukciót a pMOG23 bináris vektorba építjük be, majd átvisszük Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzsbe.
a) A pMOG29 expressziós vektor készítése
A R0K1 expressziós konstrukciót [Baulcombe et al., Natúré, 321, 336 (1986)] egy EcoRI/HindlII fragment formájában klónozzuk pUC 18-ba. Ez a konstrukció tartalmazza a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S promoterét egy EcoRI/BamHI fragment formájában, valamint a nopalin szintetáz (nos) transzkripciós terminátort egy BamHI/HindlII fragment formájában. A promoter fragment a CaMV 35S promoter -800-tól a +l-es nukleotidig terjedő szekvenciáját tartalmazza. A benne levő +1 pozíció a transzkripciós iniciációs hely (Guilley et al., 1982). Az Ncol restrikciós hely előtt, a -512-es pozícióban levő szekvenciát deletáljuk, majd ezt a helyet egy EcoRI hasítási helyre változtatjuk. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy a pUC 18-ban levő expressziós konstrukciót Ncol-gyel hasítjuk. Az egyszálú végeket Klenow polimerázzal töltjük fel, majd EcoRI linkerrel ligáljuk. A kapott plazmidot EcoRI restrikciós enzimmel hasítjuk, ennek eredménye az eredeti Ncol hasítási hely előtt levő 35S promoter szekvenciákat hordozó EcoRI fragment deléciója. A BamHI/HindlII fragmentet, amely a nos terminátort tartalmazza, egy szintetikus DNS fragmenttel helyettesítjük (az A duplex oligonukleotid, 4. ábra), amely a lucerna mozaikvírus (A1MV) RNA4 leader szekvenciáját tartalmazza (Brerode et al., 1980). Ezt úgy hajtjuk végre, hogy először BamHI, majd HindlII restrikciós enzimmel hasítjuk, majd ligáljuk a szintetikus DNS fragmentet. A BamHI restrikciós helyet, és az előtte levő három nukleotidot helyspecifikus mutagenezissel távolítjuk el. A kapott plazmidba a nos terminátor szekvenciát tartalmazó BamHI/HindlII fragmentet újra bevisszük. A βglükuronidázt kódoló gént [eredete a pRAJ 275 plazmid; Jefferson, R. A., Plánt Mól. Bioi. Reporter, 5, 387 (1987)] egy NcoI/BamHI fragment formájában ligáljuk, így kapjuk a pMOG14 plazmidot. A szakirodalomból ismert, hogy a -343 és -90 bázisok közötti szekvencia duplikálódása megnöveli a -35S promoter aktivitását [Kay, R., Chan, A., Dayly, M. and McPherson, J., Science, 236, 1299 (1987)]. Ahhoz, hogy egy promoter fragmentet egy dupla, úgynevezett enhanszer szekvenciával kapjunk meg, a következő, a szakterületen jártas szakember számára ismert lépéseket hajtjuk végre. A pMOG14 plazmidból az enhanszer fragmentet egy AccI/EcoRI fragment formájában izoláljuk, majd ezt követően Klenow polimerázzal tompavégűvé tesszük. A kapott fragmentet egy EcoRI restrikciós enzimmel hasított és tompavégűvé tett pMOG14 plazmidba juttatjuk be, oly módon, hogy a tompavégűvé tett EcoRI és AccI hasítási helyek egy új EcoRI hasítási helyet hoznak létre. A keletkező plazmid (pMOG18) a 35S promotert egy dupla enhanszer szekvenciával együtt tartalmazza, egy expressziós konstrukcióban levő A1MV RNA4 leader szekvenciával és a nos terminátorral együtt egy EcoRI/HindlII fragmenten. Végezetül, a β-glükuronidázt kódoló NcoI/BamHI fragmentet a B szintetikus DNS fragmenttel helyettesítjük (4. ábra), amely a PROB12 cDNS-ből származik [Comelissen, B. J. C., Hoofit van Huijsduijnen, R. A. M. and Bol, J. F., Natúré, 321, 531 (1986)]. Ez a B fragment a Samsun NN dohány PR fehérjéje PR-S szignál peptidjét kódolja. Egy nukleotid megváltoztatásával egy Sphl hasítási helyet hozunk létre a szignál peptidet kódoló DNS szekvenciában. Ez a változtatás nem változtatja meg a kódolt PR-S szignál peptid aminosav szekvenciáját. A kapott plazmid jele pMOG29 (5. ábra).
b) Az Aspergillus ficuum fitáz génjének klónozása a bináris vektorban
A C jelű duplex oligonukleotidot (4. ábra) az Sphl és BamHI restrikciós enzimekkel emésztett pMOG29 plazmidba klónozzuk, így kapjuk a pMOG407 plazmidot. Az oligonukleotid duplex tartalmazza a PR-S szignálpeptid utolsó két aminosavát kódoló szekvenciát, majd ezt követően az érett fitáz első hat aminosavát kódoló információkat.
A pGB927 plazmidot, amely a teljes hosszúságú fitáz cDNS-t tartalmazza, részlegesen emésztjük Xhol, és teljesen megemésztjük PstI restrikciós enzimmel. Az érett fitáz 6. aminosavától kezdődően az érett fitázt kódoló DNS szakaszt tartalmazó XhoI/PstI fragmentet Xhol és PstI restrikciós enzimekkel linearizált pMOG407 plazmidba klónozzuk, így kapjuk a pMOG417 plazmidot. A teljes konstrukciót, amely a kiméra fitáz gént tartalmazza, egy EcoRI/HindlII fragment formájában beépítjük az EcoRI és HindlII restrikciós enzimekkel linearizált pMOG23 bináris vektorba. A kapott pMOG413 bináris plazmidot mobilizáljuk, egy háromszülős keresztezés során, az Escherichia coli K-12 RK2013 törzzsel (ez tartalmazza a pRK2013 plazmidot) [Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7347 (1980)], Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzsbe, amely a T DNS növénybe való transzferéhez szükséges virulencia géneket hordozó plazmidot tartalmazza.
5. példa:
Kiméra fitáz gén tranziens expressziója dohány protoplasztokban
Dohány protoplasztokat transzformálunk a konstitutív CaMV fitáz promoter szabályozása alatt álló kiméra fitáz gént tartalmazó plazmid DNS-sel. 72 óra elteltével a kezelt protoplasztokat megvizsgáljuk a bevitt fitáz gén tranziens expressziója szempontjából, a fitázaktivitás vizsgálatot alkalmazva.
A sterilen növesztett 1-2 hónapos dohánynövényekből (Nicotiana tabacum SRI) protoplasztokat készítünk. A teljes eljárást Rodenburg és munkatársai közük [Rodenburg, K. W., DeGroot, M. J. A., Schilperort, R. A., Hooykaas, P. J. J., Plánt Mól. Bioi., 13, 711 (1989)]. A transzformáláshoz 5*105 protoplasztot elektroporálunk 40 pg pMOG417 plazmid DNS-sel. Az elektroporáció után a protoplasztokat ülepítjük, és 3 ml felülúszót éjszakán át dializálunk fölös9
HU 215 164 Β legben levő vízzel szemben. A dializátumot fagyasztva szárítjuk, majd 300 μΐ 25 mM nátrium-acetát pufferben (pH=5,5) szuszpendáljuk. A vizsgálatot ezután oly módon hajtjuk végre, amint az a 10. példában részletesen le van írva, azzal az egyetlen eltéréssel, hogy a 250 mM glicin-HCl puffer (pH=2,5) helyett 25 mM nátriumacetát (pH=5,5) puffért használunk.
Ezekben a kísérletekben egy fitáz egységet úgy definiálunk, mint azt az enzimmennyiséget, amely 1,5 mM nátrium-fitát oldatból egy perc alatt 37 °C-on, pH=5,5ön 1 μΜ foszfátot szabadít fel.
A kezeletlen protoplasztokban nincs kimutatható aktivitás. A pMOG417 plazmiddal elektroporált protoplasztok 0,26 PTU (fitáz egység, lásd a 10. példát) aktivitást mutatnak a felülúszóban levő fehérje milligramjára számítva.
6. példa:
Egy kiméra fitáz gén stabil expressziója dohánynövényekben, a CaMV 3 5S promoter szabályozása alatt
A dohányt úgy transzformáljuk, hogy növényi szövetet együtt tenyésztünk Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzzsel, amely a CaMV 35S promoter szabályozása alatt levő kiméra fitáz gént hordozó pMOG413 bináris vektort tartalmazza. A transzformáció végrehajtásához dohány (Nicotiana tabacum) levélkorongokat tenyésztünk együtt Horsch és munkatársai módszerével (1985). A transzgenikus növényeket azokból a hajtásokból regeneráljuk, amelyek szelekciós táptalajon nőnek (100 mg/liter kanamicin), meggyökereztetjük őket, és talajra visszük át őket. A fiatal növényeknek vizsgáljuk az NPTII aktivitását (kanamicin rezisztencia), érettségig felneveljük őket, hagyjuk, hogy önmagukat beporozzák és magokat termeljenek.
Abból a célból, hogy meghatározzuk a transzgenikus magvakban található fitáz aktivitás mértékét, körülbelül 50 mg-os mennyiséget veszünk, és jéghideg mozsárban eldörzsöljük 1 ml 25 mM nátrium-acetát pufferben (pH=5,5). A centrifugálás után a felülúszót a tranziens vizsgálatoknál leírt módszerrel vizsgáljuk meg. 32 függetlenül transzformált dohánynövényben 2 PTU/mg összes oldható fehérje maximális aktivitást figyeltünk meg az extraktumokban. Ez megfelel 1,7% oldható összfehérjének. Ezeknek a transzformált dohánynövényeknek a magvaiban az összes oldható magfehérje 0,4%-át kitevő maximális fitázaktivitás figyelhető meg. A transzformálatlan növényekben nincs megfigyelhető fitázaktivitás.
Két transzgenikus növényvonalat a 413.25-öst és a 413.32-est választjuk ki, azon az alapon, hogy jól expresszálódik bennük a fitáz.
7. példa:
Az Aspergillus ficuum fitáz cDNS-ének klónozása egy magspecifikus expressziós konstrukcióban Egy expressziós konstrukciót állítunk elő, oly módon, hogy magspecifikus expressziót kapjunk, a Brassica napus kruciferin 12S tartalék fehérjéje génjéből származó szekvenciákat alkalmazva (cruA; Ryan et al., 1989). Ezeket a szekvenciákat hasonló magspecifikus génekből származó szekvenciákkal helyettesíthetjük, ezzel a jelen találmány tárgyával azonos célt érhetünk el.
A fitáz cDNS-t klónozzuk az expressziós konstrukcióba. Végül az egész konstrukciót bejuttatjuk Agrobacterium tumefaciensbe, amelyet a transzformáláshoz használunk. Bármely egyéb, számunkra fontos fehérje génjének vagy cDNS-ének klónozása esetében a klónozást lényegében ugyanúgy végezzük, mint ahogy az előzőekben a fitáz cDNS-re leírtuk.
Az ebben a példában említett összes Eseherichia coli transzformáláshoz az Eseherichia coli K-12 DH5a törzset használjuk.
a) Az expressziós konstrukció előállítása
A magspecifikus expresszióhoz használt expressziós konstrukció készítéséhez a Brassica napus cv. Jet Neuf kruciferin A (cruA) gén promoter és terminátor szekvenciáját PCR technológia alkalmazásával megszintetizáljuk izolált genomiális DNS-ről, mint templátról [Mettler, I. J., Plánt Mól. Bioi. Rep., 54, 346 (1987)]. Ez a gén magspecifikus expressziót mutat, kódoló, valamint határoló szekvenciáit meghatározták (Ryan et al., 1989).
Két oligonukleotid készletet szintetizálunk. Az egyik lehetővé teszi a cruA 5’ határoló régió, valamint a szignál peptid kódoló szekvencia egy részének amplifikálását egy EcoRI/NcoI fragment formájában:
5’ GTTCGGAATTCGGGTTCCGG 3’ és
5’ AACTGTTGAGCTGTAGAGCC 3’
A másik, a 3’ határoló szekvenciának egy BglII/HindlII fragment formájában való amplifikálásához:
5’ CTTAAGATCTTACCCAGTGA 3’ és 5’ CGGAGAAGCTTGCATCTCGT 3’
Az oligonukleotidokat úgy terveztük meg, hogy alkalmas restrikciós hasítási helyeket tartalmazzanak a végükön, hogy ezzel lehetővé váljon az expressziós konstrukció közvetlen összeállítása, a fragmentek restrikciós enzimekkel való emésztése után.
A cruA gén 5’ fragmentjét, amely magában foglalja a szignál peptidet kódoló szekvencia 54 nukleotidját, az EcoRI és Ncol restrikciós enzimekkel hasított pMOG445 vektorba klónozzuk (E duplex oligonukleotid, 4. ábra, a pUC18 vektorba klónozva, SstI és EcoRI restrikciós enzimekkel linearizálva), így kapjuk a pMOG424 vektort. A D szintetikus duplex oligonukleotidot, amely tartalmazza a Brassica napus kruciferin szignál szekvenciájának utolsó 5 kódoló triplettjét, az érett fitáz 1-6 aminosavát kódoló szekvenciát, és egy többszörös klónozó helyet, az Ncol és HindlII restrikciós enzimekkel hasított pMOG424 vektorba klónozzuk. A kapott vektor jele pMOG425. A 3’ cruA PCR fragmentet egy BglII/HindlII fragment formájában klónozzuk BglII és HindlII restrikciós enzimekkel emésztett pMOG425 plazmidba, így kapjuk a pMOG426 vektort.
b) Az Aspergillus ficuum fitáz génjének klónozása a bináris vektorban
A pGB497 plazmidot, amely az Aspergillus ficuum fitáz gén teljes hosszúságú kódoló szekvenciáját tartal10
HU 215 164 Β mázzá, részlegesen emésztjük Xhol enzimmel, és teljesen megemésztjük PstI restrikciós enzimmel. Az XhoI/PstI fragmentet, amely a 6-os aminosavtól kezdődően tartalmazza az érett fitázt kódoló DNS szekvenciát, a pMOG426 vektorba klónozzuk, amelyet Xhol és PstI restrikciós enzimmel emésztettünk. A keletkező pMOG428 vektorból a teljes, a kiméra fitáz gént tartalmazó konstrukciót egy EcoRI/HindlII fragment formájában beépítjük a pMOG23 bináris vektorba, amelyet EcoRI és HindUI restrikciós enzimekkel linearizáltunk. A kapott, pMOG429 bináris vektort (5. ábra), az Escherichia coli K-12 RK2013 törzzsel (amely a pRK2013 plazmidot tartalmazza) (Ditta et al., supra) egy háromszülős keresztezés során mobilizáljuk, az Agrobacterium LBA4404 törzsbe (Hoekema et al., 1983, supra), amely egy olyan plazmidot hordoz, amely tartalmazza a T DNS növényekbe való átviteléhez szükséges virulencia géneket.
8. példa:
A fitáz stabil magspecifikus expressziója dohánymagvakban, a kruciferin promoter szabályozása alatt
Az Agrobacterium LBA4404 törzset, amely a pMOG429 bináris vektort tartalmazza, benne a fitáz cDNS a kruciferin promoter szabályozása alatt, használjuk a transzformációs kísérletekben. A dohány (Nicotiana tabacum SRI) transzformálását úgy hajtjuk végre, hogy a levélkorongokat együtt tenyésztjük Horsch és munkatársai eljárása szerint (1985). A transzgenikus növényeket olyan hajtásokról szelektáljuk, amelyek szelekciós táptalajon nőnek (100 mg/liter kanamicin). A fiatal növényekben vizsgáljuk az NPTII aktivitást (kanamicin rezisztencia), teljes érettségig felneveljük, hagyjuk, hogy önmagukat beporozzák, majd termeljenek magvakat. Az egyes transzformánsokból származó magvakat egyesítjük, majd a magminta egy részében megvizsgáljuk a fitáz aktivitását. Azokból a klónokból, amelyek a legmagasabb expressziós szintet mutatják a transzformálatlan kontroll magvakhoz viszonyítva, a megmaradó magvakat kanamicinen (200 mg/liter) csíráztatjuk. A kapott S2 magvakból kapott adatok alapján az NPTII-re homozigóta (és így a fitázra is homozigóta) magvakat szelektáljuk, és azoknak a növényeknek a nagymennyiségben való előállítására használjuk, amelyek a legnagyobb mennyiségben képesek a fitáz előállítására a magvaikban. Ezeket lehet azután használni, például az emésztési kísérletekben.
A transzgenikus magvakban talált fitázaktivitás meghatározásához körülbelül 50 mg magot veszünk, és egy jéghideg dörzscsészében eldörzsöljük 1 ml 25 mM nátrium-acetát pufferrel (pH=5,5). A centrifugálás után a felülúszót a tranziens vizsgálatnál leírt módon vizsgáljuk. 55 függetlenül transzformált dohánynövényben az összes oldható magfehérjére vonatkoztatva 0,15%-os maximális fitázexpressziós szintet figyeltünk meg. A fitázaktivitás nem volt kimutatható a transzgenikus növények szárában, gyökereiben és ágaiban. Fitázaktivitás nem mutatható ki a transzformálatlan növényekben sem.
9. példa:
Repce transzformálása
Ebben a példában a repce olyan transzformálását írjuk le, melynek során a növényi szövetet együtt tenyésztjük a kiméra fitáz gént hordozó bináris vektort tartalmazó Agrobacterium turnéfacienssel. A transzgenikus növényeket az antibiotikum rezisztencia alapján lehet szelektálni. A transzgenikus növényekben vizsgálhatjuk a fitáz aktivitását. A magas szinten expresszálókat alaposabban vizsgáljuk, és a további kísérletekben alkalmazzuk.
Ugyanazt a bináris vektorban levő kiméra fitáz konstrukciót (pMOG429) mobilizáljuk Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzsbe, ahhoz hasonló módon, mint amit a 7. példában leírtunk. Ezt a törzset használhatjuk repce (Brassica napus cv. Westar) transzformálására. Ebből a célból 5-6 hetes, éppen virágzás előtt álló növényekből vett, felületen sterilezett szárdarabokat veszünk, 24 óra hosszat előkondicionáljuk MS táptalajban [Fry et al., Plánt Cell Reports, 6, 321 (1987)] 1 mg/liter BAP-pal, majd 48 óra hosszat együtt tenyésztjük Agrobacteriummal, ugyanazt a táptalajt tartalmazó friss lemezeken. A transzgenikus növénykezdemények azokról a hajtásokról regenerálhatok, amelyek nőnek szelekciós táptalajon (500 mg/liter karbenicillin, 40 mg/liter paromimicin), majd tovább elemezzük a 8. példában dohányra leírt módon.
10. példa:
A fitázaktivitás vizsgálata
Olyan mennyiségű transzgenikus növényből származó anyagot őrölünk meg, amelyben összesen körülbelül 0,25 PTU van. (PTU = fitáz egység. Egy egység fitázaktivitást úgy definiálunk, mint azt az enzimmennyiséget, amely 1,5 mM nátrium-fitátból 1 pmol/pcrc sebességgel (37 °C, pH=2,5) szabadít fel szervetlen foszfátot.
A megőrölt növényi anyagot 50 ml össztérfogatú 250 mM glicin/HCl pufferben (pH=2,5) inkubáljuk, amely 0,86 g nátrium-fitát χ 11 H2O-t tartalmaz. Jóllehet az Aspergillus fitáz mind 2,5-ös, mind 5,5-ös pH optimum mellett expresszál, az alacsonyabb pH-t választjuk, hogy a növény fitázaktivitását kizárjuk.
A kapott elegyet 15, illetve 60 percig inkubáljuk 37 °C-on. A reakciót úgy állítjuk le, hogy az inkubált reakcióelegyből 5 ml-t teszünk 5 ml 10%-os TCA-ba (triklór-ecetsav). Ezután 10 ml indikátor reagenst [3,66 g vas(II)-szulfát-7 víz, 50 ml ammóniummolibdát oldatban (2,5 g (NH4)6Mo7O24 x 4H2O és 8 ml koncentrált kénsav, 250 ml-re hígítva desztillált vízzel)] adunk a leállított enzimoldathoz. A kék szín intenzitását spektrofotometriásán mérjük 700 nm-en.
A T=0 időpontban mért szervetlen foszfáttartalom szolgál kontrollként.
A mérések a felszabadított foszfát mennyiségét jelzik, a 0-1 mM koncentráció-tartományban levő foszfát kalibrációs görbe alapján.
HU 215 164 Β
11. példa:
A megőrölt Nicotiana tabacum növényi anyag inkubálása tápokkal
Egy tipikus kísérletben 0,25 g oldószerrel extrahált szójalisztet inkubálunk 25 mg őrölt Nicotiana tabacum növényi anyaggal, amely körülbelül 0,25 PTU-t tartalmaz a fentiek szerint, azzal az eltéréssel, hogy nátriumfitátot adunk hozzá. Ebben az esetben a hozzáadott inkubáló anyag 410 ml puffer és 90 ml víz elegye.
A foszfát felszabadulását fitátból oldószerrel extrahált szójalisztben, a 6. ábrán mutatjuk be. Hozzáadott őrölt mag nélkül nincs megfigyelhető aktivitás.
Egy látszólag azonos kísérletben hasonló eredményeket kapunk kukorica glutén táppal is, mint szubsztrátummal. Az eredményeket a 6. ábrán mutatjuk be.
Nincs megfigyelhető aktivitás az őrölt növényi anyag távollétében, illetve akkor, ha a hozzáadott növényi anyag nem tartalmaz fitázaktivitást.
12. példa:
A fitázt tartalmazó transzgenikus növényi anyag in vitro vizsgálata olyan körülmények között, amelyek a szárnyasok emésztőrendszerét szimulálják
Hogy felbecsüljük transzgenikus dohánynövényben termelt fitáz hatékonyságát, az Aspergillusból származó fitáz aktivitását olyan modellben határozzuk meg, amely a szárnyasok emésztőrendszerében található körülményeket utánozza.
Egy standard szárnyastáp mintát először 1 g/15 ml víz koncentrációban inkubálunk 60 percig 39 °C-on, hogy ezzel szimuláljuk az állatokban előforduló körülményeket a terményben. Ezt követően 5 ml pepszinoldatot (Merck: 5,28 g/1, pH=3,0, sósavval beállítva) adunk hozzá, a pH értéket sósavval pH=3,0-ra állítva, majd az inkubálást további 90 percig folytatjuk ugyanezen a hőméréskleten, hogy a gyomorban előforduló körülményeket szimuláljuk.
Az inkubációs periódus során mintákat veszünk, hogy meghatározzuk a tápban levő fitátból felszabadult foszfát mennyiségét.
A gomba fitázhatása nyilvánvaló a 10. ábrából. A fitáz dózisát 250 PTU/kg tápról 1000 PTU/kg tápra növelve, a tápmintából megnövekedett mennyiségű foszfát szabadul fel.
Ha egy transzgenikus dohánynövényi anyagot, akár magvakat, akár leveleket (413.25 vagy 413.32 vonalak, dörzscsészében megőrölve) alkalmazunk a gomba fitáz helyett, hasonló mértékben foszfát felszabadulást figyelhetünk meg (11. ábra). Kontroll dohánynövényt is vizsgáltunk, amely nem tartalmaz fitázt. A vak kontrollal összehasonlítva nem volt foszfátfelhalmozás megfigyelhető.
Az 50 g transzgenikus dohánymag/kg táppal kapott eredményeket összehasonlítva azokkal, amelyeket az 500-750 PTU/kg táppal kaptunk, azt az eredményt kapjuk, hogy 1 g dohánymag körülbelül 12 PTU-nak felel meg ebben az in vitro szárnyas emésztési modellben. Levelekből származó anyag vizsgálatával az derült ki, hogy 1 g (nedves súly) dohánylevél körülbelül 25 PTU-t tartalmaz.
13. példa:
Vizsgálatok állatokban
A vizsgálatokat brojlerekkel végezzük, hogy igazoljuk a növényi magvakban expresszálódott fitáz hatékonyságát, valamint bármely, a dohánymagvakból származó negatív hatás hiányát a zootechnikai eredményekre.
A fitázt expresszáló dohánymagvakat és kontroll magvakat begyűjtjük. A magvakat 100 grammos részletekben megőröljük, és egy olyan szitát alkalmazunk (Retch-mill ZM1), amelynek a pórusmérete 500 pm, és vigyázunk arra, hogy a magvakat hűtve tartsuk.
Egynapos broiler kakasokat (Hybro) tartunk kétállatos ketrecekben (0,45 m2). Az első két napban a szobahőmérséklet 32 °C, majd az első héten 4 °C-kal csökkentjük. Minden ezt követő héten a hőmérsékletet 2 °Ckal csökkentjük. A broilereket egy óra megvilágítás és három óra sötétséget váltogatva tenyésztjük.
Az állatokat New Castle betegséggel szemben egynapos korukban vakcináljuk, Clone 30 vakcina alkalmazásával. A kísérletek során a broilereket a kísérleti táppal etetjük, tetszés szerinti mennyiségben. A növekedési és a táp/súlynövekedés arányt a kísérleti időszakban méijük. Az összes foszfor látszólagos hozzáférhetőségét háromnapos periódusokban mérjük, amely során a tápfogyasztást szárazanyag felvétellel mérjük, az ürüléket pedig teljes egészében összegyűjtjük.
A foszfor látszólagos hozzáférhetőségét úgy határozzuk meg, mint azt a különbséget, ami a felvett foszfor és a kiürített foszfor mennyiséget között van.
Az alábbi, fitáz hozzáadása nélküli kontroll étrendet alkalmazzuk:
Étrendek Ca (%) Össz-foszfor (%) fitát-foszfor (%)
1 0,60 0,45 0,30
2 0,75 0,60 0,30
3 0,90 0,75 0,30
Foszfátot nem adunk az 1-es étrendhez (alap étrend). Kalciumot és foszfort vízmentes dikalcium-foszfát és monoammónium-foszfát 5:1 arányú elegyével viszünk be a 2-es és 3-as étrendekbe. Az összes kísérleti étrendet az alapétrend kiegészítésével állítjuk elő (1. táblázat).
A 4-es kísérleti étrend tartalmaz mikrobiális eredetű fitázt 400 PTU/kg táp mennyiségben, Van Gorcom és munkatársai által leírt módon előállítva (1991).
Az 5-ös kísérleti étrend hasonlít a 4-eshez, de őrölt nem-transzgenikus dohánymagvakat adunk a tápkeverékhez, ezzel a 3 kg/90 kg táp végső arányt állítva be.
A 6-os kísérleti étrend is hasonló a 4-eshez, de 3 kg transzgenikus dohányból származó (413.25 vonal) őrölt magot adunk 90 kg táphoz, így kapjuk a 400 PTU/kg táp végkoncentrációt.
A kísérletet 176 brojlerrel végezzük 16 ketreccsoportban (11 per ketreccsoport) 24 napos korig. A kezeléseket (étrendek) kétszer megismételjük, és az egyes sorokban levő ketrecekhez véletlenszerűen rendeljük hozzá.
HU 215 164 Β
A foszfor felhasználhatóságát 21-24 napos kortól mérjük.
A foszfor felhasználhatóságát és a 4-es, 5-ös és 6-os étrenden tartott állatok növekedése a fitáz hozzáadásának pozitív hatását mutatja (2. táblázat). A 4-es, 5-ös és 6-os étrendek összehasonlítása azt mutatja, hogy a dohánymagvak belekeverése az étrendbe összefér a mikrobiális fitáz működésével haszonállatok, például broilerek emésztési rendszerében, és nem mutat negatív hatást a zootechnikai eredményekre.
Jóllehet a találmányt specifikus megvalósítási módjaira való hivatkozásokkal írtuk le, a szakterületen jártas szakemberek számára világos, hogy különböző változtatások hajthatók végre, és az egymással egyenértékű dolgok helyettesíthetők egymással anélkül, hogy eltérnénk a jelen találmány oltalmi körétől és szellemétől.
Emellett számos módosítás hajtható végre, hogy egy adott helyzethez, anyaghoz, növényhez, maghoz, eljáráshoz, vagy a találmány tárgyának, szellemének és oltalmi körének eljárási lépéséhez vagy lépéseihez alkalmazkodjunk. Az összes ilyen módosítás a megadott igénypontok oltalmi körébe tartoznak.

Claims (21)

  1. Broilerekkel végzett kísérletek alapétrendjének összetétele
    Adalékanyagok Mennyiség (g/k) Sárga kukorica 28,0 Cirok (alacsony tannintartalom) 200,0
    Adalékanyagok Mennyiség (g/k) Napraforgóliszt (oldószerrel extr.) 80,0 Szójaliszt (oldószerrel extr., 48% fehérje) 350,0 Szójaolaj 58,5 Vitaminok* 5,0 Ásványi anyagok* 15,0 Mészkő 1,0 Szintetikus metionin 1,0 Cr2O3 0,5 1001,0 ME (MJ/kg) 13,1 Lizin 12,9 Metionin+cisztein 9,1 Kalcium 6,0 (6,0-6,6)** Össz-foszfor 4,5 (4,7-4,7)** Szerves fitikus foszfor 3,0 (3,1-3,!)**
    * Az egy kg táppal bevitt mennyiség: 12 000 UJ A vitamin; 2000 IU D3 vitamin; 5 IU E vitamin; 1,5 mg K3 vitamin; 1 mg tiamin; 5 mg riboflavin; 1 mg piridoxin; 30 mg nikotinsav; 7,5 mg D-pantoténsav: 0,015 mg B12 vitamin; 0,5 mg fólsav; 350 mg kolin-klorid; 75 mg etoxiquin; 9,5 g CaCO3; 2,5 g NaCl; 0,25 g FeSO4; 0,24 g MnSO4; 45 mg CuSO4; 60 mg ZnSO4; 105 mg KI elegy.
    ** () Az 1-es, illetve 2-es kísérletekhez elemezve.
  2. 2. táblázat
    A fitáz hatása az ossz foszfát és kalcium látszólagos felhasználhatóságára, a P tartalom a trágyában és a broilerek teljesítménye
    Étrendek Ca/P (g/kg) Hozzáadott fitáz (U/kg) Felhasználhatóság (%) 21-24. nap A P mennyisége a trágyában (g) per kg táp felv. Növ. 0-24 (g) P Ca 1 6/4,5 0 49,8 47,2 2,7 338 2 7/5,6 0 45,6 48,9 3,8 592 3 9/7,5 0 44,6 46,9 4,9 683 4 mint az 1. 400 60,5 58,6 2,1 620 5 mint az 1. 0 48,5 48,0 2,7 340 6 mint az 1. 400 60,2 59,3 2,1 615
    SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás megnövelt mennyiségű fitázt tartalmazó transzgenikus növények vagy növényi szervek előállítására, azzal jellemezve, hogy egy növényi gazdaszervezetet olyan expressziós konstrukcióval transzformálunk, amely egy fitázt kódoló, mikrobiális forrásból származó DNS-szekvenciát tartalmaz a fitáz növényi gazdaszervezetben való expresszióját vezérlő szabályozó szekvenciákhoz működőképesen kapcsolva, és a transzformált növényt a fitázt kódoló DNS-szekvencia expresszióját biztosító körülmények között nö55 vesztjük.
    Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
    2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az expressziós konstrukció a fitáz konstitutív expresszióját irányító szabályozó szekvenciát tartalmaz.
    60 Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
    HU 215 164 Β
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az expressziós konstrukció a Fitáz szövet-specifikus expresszióját vezérli.
    Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fitázt kódoló DNS-szekvencia egy fonalasgombából származik.
    Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fitázt kódoló DNS-szekvencia egy Aspergillusból származik.
    Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fitázt kódoló DNS-szekvencia egy Aspergillus ficuum, Aspergillus niger, Aspergillus awamori vagy egy Aspergillus nidulans fajból származik.
    Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
  7. 7. Eljárás expressziós konstrukció előállítására, azzal jellemezve, hogy egy mikrobiális fitázt kódoló DNS-szekvenciát működőképesen összekapcsolunk egy növényi gazdaszervezetben a fitáz konstitutív expresszióját biztosító szabályozó szekvenciával. Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
  8. 8. Eljárás vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas vektorba beépítünk egy 7. igénypont szerint előállított expressziós konstrukciót.
    Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pMOG29 vektort állítjuk elő.
    Elsőbbsége: 1990. 03. 23.
  10. 10. Eljárás baktériumtörzs előállítására, azzal jellemezve, hogy egy megfelelő baktériumtörzset egy 8. igénypont szerint előállított vektorral transzformálunk. Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
  11. 11. Eljárás expressziós konstrukció előállítására, azzal jellemezve, hogy egy mikrobiális fitázt kódoló DNS-szekvenciát működőképesen összekapcsolunk egy növényi gazdszervezetben a fitáz szövetspecifikus expresszióját biztosító szabályozó szekvenciával. Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
  12. 12. Eljárás vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas vektorba beépítünk egy 11. igénypont szerint előállított expressziós konstrukciót. Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
  13. 13. Eljárás egy baktériumtörzs előállítására, azzal jellemezve, hogy egy megfelelő baktériumtörzset egy 12. igénypont szerint előállított vektorral transzformálunk.
    Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
  14. 14. Eljárás transzgenikus növény vagy növényi szerv előállítására, azzal jellemezve, hogy egy növény vagy növényi szerv genomjába bejuttatunk egy 7. vagy 11. igénypont szerint előállított expressziós konstrukciót. Elsőbbsége: 1990.09. 21.
  15. 15. Eljárás fitáz kinyerésére egy növényből vagy növényi szervből, azzal jellemezve, hogy a fitázt szokásos eljárással az 1-6. vagy 14. igénypontok bármelyike szerint előállított transzgenikus növényből vagy növényi szervből nyerjük ki.
    Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
  16. 16. Eljárás fitáz átalakítására inozittá és szervetlen foszfáttá, azzal jellemezve, hogy egy 15. igénypont szerint előállított fitáz enzimet fitátot tartalmazó szubsztrátra alkalmazunk.
    Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
  17. 17. Eljárás állati tápkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy szokásos állati tápot egy 15. igénypont szerint előállított fitázzal összekeverünk.
    Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
  18. 18. Eljárás állati tápkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy szokásosan alkalmazott állati tápot egy, az 1-6. igénypontok bármelyike szerint előállított fitáz-tartalmú transzgenikus növénnyel vagy növényi szervvel összekeverünk.
    Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
  19. 19. Eljárás állatok növekedésének elősegítésére, azzal jellemezve, hogy az állatokat egy 17. vagy 18. igénypont szerint előállított hatékony mennyiségű tápkészítménnyel etetjük.
    Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
  20. 20. Eljárás állati trágyában a fitát szintjének csökkentésére, azzal jellemezve, hogy az állatokat egy 17. vagy 18. igénypont szerint előállított, a tápban lévő fitátot inozittá és szervetlen foszfáttá átalakító, hatékony mennyiségű tápkészítménnyel etetjük.
    Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
  21. 21. Eljárás fitáz előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) egy növényi gazdaszervezetet olyan expressziós konstrukcióval transzformálunk, amely egy mikrobiális eredetű fitázt kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz - a növényi gazdaszervezetben megnövelt mennyiségű fitáz expresszióját vezérlő - szabályozó szekvenciákhoz működőképesen kapcsolva, majd a transzformált növényt a fitázt kódoló DNS-szekvencia expresszióját a növényi szövetben biztosító körülmények között növesztjük; és (ii) a transzgenikus növényi szövetből a fitázt kinyelj ük.
    Elsőbbsége: 1990. 09. 21.
    HU 215 164 Β
    Int. Cl.6: C 12 N 15/55
    1. ÁBRA
    EcoRI
    BamHI | EcoRI
    PCR fragmens
    BamHI PstI
    1_I
    PCR fragmens Ec°\RI Xhol BamHI Xhol PstI
    I 111 teljes hosszúságú cDNS
    HU 215 164 Β Int. Cl.6: C 12 N 15/55
    2. ÁBRA (2/1 lap)
    1 ATGGGCGTCTCTGCTGTTCTACTTCCTTTGTATCTCCTGTCTGGAGTC ACCTCCGGACTG -23 HGVSAVLLPLYLLSGVTSGL
    61 GCAGTCCCCGCCTCGAGAAATCAATCCAGTTGCGATACGGTCGATCAGGGGTATCAATGC AVPASRNQSSCDTVDQGYQC
    -1 +1
    121 TTCTCCGAGACTTCGCATCTTTGGGGTCAATACGCACCGTTCTTCTCTCTGGCAAACGAA 18FSETSHLWGQYAPFFSLANE
    181 TCGGTCATCTCCCCTGAGGTGCCCGCCGGATGCAGAGTCACTTTCGCTCAGGTCCTCTCC 38SVISPEVPAGCRVTFAQVLS
    2Ml CGTCATGGAGCGCGGTAYCCGACCGACTCCAAGGGCAAGAAATACTCCGCTCTCATTGAG
    58RHGARYPT DSKGKKYSALIE
    301 GAGATCCAGCAGAACGCGACCACCTTTGACGGAAAATATGCCTTCCTGAAGACATACAAC 78EIQQNATTFDGKYAFLKTYN
    361 TACAGCTTGGGTGCAGATGACCTGACTCCCTTCGGAGAACAGGAGCTAGTCAACTCCGGC 98YSLGADDLTPFGEQELVNSG
    Ű21 ATCAAGTTCTACCAGCGGTACGAATCGCTCACAAGGAACATCGTTCCATTCATCCGATCC 118 IKFYQRYESLTRNIVPFIRS ilöl TCTGGCTCCAGCCGCGTGATCGCCTCCGGCAAGAAATTCATCGAGGGCTTCCAGAGCACC 138SGSSRVIASGKKFIEGFQST
    5'U AAGCTGAAGGATCCTCGTGCCCAGCCCGGCCAATCGTCGCCCAAGATCGACGTGGTCATT 158KLKDPRAQPGQSSPKIDVVI
    601 TCCGAGGCCAGCTCATCCAACAACACTCTCGACCCAGGCACCTGCACTGTCTTCGAAGAC 178SEASSSNNTLDPGTCTVFED
    661 AGCGAATTGGCCGATACCGTCGAAGCCAATTTCACCGCCACGTTCGTCCCCTCCATTCGT
    198 S E L A D T V E A N F T A T F V P S I R
    721 CAACGTCTGGAGAACGACCTGTCCGGTGTGACTCTCACAGACACAGAAGTGACCTACCTC 218 Q R L Ε N D L S G V T L T D T Ε V T Y L
    781 ATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCACCGTCGACACCAAGCTGTCCCCC 238 MDMCSFDTISTSTV DTKLSP
    HU 215 164 Β
    Int. Cl.6: C 12 N 15/55
    2. ÁBRA (2/2 lap)
    841 TTCTGTGACCTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGACTACCTCCAGTCCTTGAAA
    258 FCDLFTHDEWINYDYLQSLK
    901 AAGTATTACGGCCATGGTGCAGGTAACCCGCTCGGCCCGACCCAGGGCGTCGGCTACGCT 278KYYGHGAGNPLGPTQGVGYA
    961 AACGAGCTCATCGCCCGTCTGACCCACTCGCCTGTCCACGATGACACCAGTTCCAACCAC
    298 NELIARLTHSPVHD DTSSNH
    1021 ACTTTGGACTCGAGCCCGGCTACCTTTCC^GTCAACTCTACTCTCTACGCGGACTTTTCG 318TLDSSPATFPLNSTLYADFS
    1081 CATGACAACGGCATCATCTCCATTCTCTTTGCTTTAGGTCTGTAC AACGGCACTAAGCCG 338 HDNGIISI LFALGLYNGTKP ll4l CTATCTACCACGACCGTGGAGAATATCACCCAGACAGATGGATTCTCGTCTGCTTGGACG 358 LSTTTVENITQTDGFSSAWT
    1201 GTTCCGTTTGCTTCGCGTTTGTACGTCGAGATGATGCAGTGTCAGGCGGAGCAGGAGCCG 378 VPFASRLYVEMMQCQAEQEP
    1261 CTGGTCCGTGTCTTGGTTAATGATCGCGTTGTCCCGCTGCATGGGTGTCCGGTTGATGCT 398 LVRVLVNDRVVPLHGCPVDA
    1321 TTGGGGAGATGTACCCGGGATAGCTTTGTGAGGGGGTTGAGCTTTGCTAGATCTGGGGGT 4l8 LGRCTRDSFVRGLSFARSGG
    1381 GATTGGGCGGAGTGTTTTGC'rTAG 438 DWAECFA*
    HU 215 164 B
    Int. Cl.6: C 12 N 15/55
    CO
    TJ c
    X
    Hindlll tü x:
    X tű
    JJ
    X
    X
    E cn
    E ω
    (Ö ”* Ή c Φ α c X 0) > 44 Φ N cn X Φ o 44 Ü C UJ Ή r-1 Ή rH 0 CM
    O F F O 0 < < F 0 < 0 0 I— 0 0 < 0 < F O F < O O F < 0 0 < 0 0 0 O O o F O O < F 0 0 F O <
    <
    o ω
    HU 215 164 Β
    Int. Cl.6: C 12 N 15/55 co io
    H ro to
    Ό
    C •H
    K
    H
    W β
    rt (Ώ w
    e rt w
    H o[ rt rd rH
    CM <
    &
    m
    H
    O υ
    %
    M· <
    X ω
    r—1
    P
    P
    T3
    CQ
    X
    Φ rH
    P
    P
    TJ
    X
    Φ rH
    P p
    Ό
    H-i rt «
    H
    P w
    Pl l-l o
    X
    X
    TJ •H p 0 Φ r—I c
    o u
    •H
    Ό
    Ή
    -μ
    Ο
    Φ
    Ή
    C
    O
    U •H
    Ό •H
    P o
    Φ rd
    P c
    o
    Ö •H
    HX!
    P wl in ro in ro
    ro lo 0 0 Eh 0 0 < EH 0 0 0 U H < 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < Eh 0 0 0 0 Η 0 0 υ 0 0 0 0 0 N 0 0 rt 0 0 P 0 0 -H Eh p 0 0 «< Eh P 0 0 P 0 0 Φ 0 0 μ Eh < « U 0
    υ o oj h O r-Hrt Ό < W C ·Η Η O dnp ο «·η a ft N (U
    - - Ül IO ro
    HU 215 164 B
    Int. Cl.6: C 12 N 15/55
    H-i H I—I
    Cr
    CQ
    H
    Η—i H τ
    c
    H
    WH
    H
    -P in
    P (2/2 lap)
    H o| d
    X
    CQ
    Q
    X
    Φ
    Γ—1
    P
    P
    Ό τι
    -H
    4->
    O
    Φ rH w
    P
    C o
    &
    •rH
    Η—i 0 ü £
    m in 0 >1 0 r-4 Eh Φ Eh Λ 0 0 0 0 H 0 0 K o 0 fd Eh < N 0 0 0 Eh rtí cd Eh '0 0 0 i—1 Eh rM o 0 0 0 CQ EH S0 0 0 P 0 0 :0 Eh c N Eh W EH Λ Eh Λ 0 0 :0 0 0 Eh Eh P 0 0 Φ u 0 CQ H < tú 0 0 rH 0 0 0 0 0 0 0 P 0 0 N P 0 0 (d I—1 0 0 4-> fÖ EH rij •H > 0 0 Μ EH 1—1 0 0 4-1 W < 0 0 •P P 0 0 Φ X φ EH < P φ i-l 0 0 Ή γΗ — Ρ (d Eh Ρ i—1 0 0 τ 0 0 P Eh H XJ 0 0 vd τ τ Eh Eh β ·Η •Η P Eh cn-μ -Ρ Φ 0 0 •Η Ρι 0 ω Eh Ν φ φ XU 0 W Ρι rH 0 0 2 0 0 Ρ w EH C •H Ρ 0 w 0 0 tr •Η * — ι—1 in n ο
    m in
    Eh 0 0
    0 Eh
    0 0 Eh
    0 0 Eh r<
    0 0 Eh 0 EH
    0 <
    0 Eh Eh
    GTCTAGAGGTACCTAGCTAC in r>
    HU 215 164 Β
HU914086A 1990-03-23 1991-03-25 Eljárás fitáz kifejezésére transzgenikus növényekben, valamint eljárás ilyen növények előállítására és felhasználására HU215164B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US49856190A 1990-03-23 1990-03-23
US58676590A 1990-09-21 1990-09-21

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU914086D0 HU914086D0 (en) 1992-07-28
HUT60780A HUT60780A (en) 1992-10-28
HU215164B true HU215164B (hu) 1998-10-28

Family

ID=27052867

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU914086A HU215164B (hu) 1990-03-23 1991-03-25 Eljárás fitáz kifejezésére transzgenikus növényekben, valamint eljárás ilyen növények előállítására és felhasználására

Country Status (16)

Country Link
US (1) US5770413A (hu)
EP (1) EP0449375B1 (hu)
JP (1) JP3471795B2 (hu)
KR (1) KR100225087B1 (hu)
AT (1) ATE328093T1 (hu)
AU (1) AU632941B2 (hu)
CA (1) CA2056396C (hu)
DE (1) DE69133533T2 (hu)
ES (1) ES2267092T3 (hu)
FI (1) FI915477A0 (hu)
HU (1) HU215164B (hu)
IL (1) IL97646A (hu)
NZ (1) NZ237550A (hu)
PT (1) PT97111B (hu)
RU (1) RU2128228C1 (hu)
WO (1) WO1991014782A1 (hu)

Families Citing this family (138)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7091401B2 (en) 1991-02-22 2006-08-15 Sembiosys Genetics Inc. Expression of epidermal growth factor in plant seeds
US5650554A (en) * 1991-02-22 1997-07-22 Sembiosys Genetics Inc. Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants
ATE287962T1 (de) * 1992-07-31 2005-02-15 Ab Enzymes Gmbh Rekombinante zelle, dna-konstruktionen, vektoren und methoden zur expression von phytatabbauenden enzymen in gewünschten verhältnissen
PT619369E (pt) * 1993-04-05 2003-11-28 Aveve Nv Hidrolise de fitato e composicao enzimatica para a hidrolise de fitato
US5689054A (en) * 1994-03-17 1997-11-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Low phytic acid mutants and selection thereof
US6080560A (en) * 1994-07-25 2000-06-27 Monsanto Company Method for producing antibodies in plant cells
US6140075A (en) * 1994-07-25 2000-10-31 Monsanto Company Method for producing antibodies and protein toxins in plant cells
MY134684A (en) * 1995-05-15 2007-12-31 Gist Brocades Bv Application of phospholipases in animal feed
EP0743017B1 (en) * 1995-05-15 2004-09-29 DSM IP Assets B.V. Application of phospholipases in animal feed
US6936289B2 (en) 1995-06-07 2005-08-30 Danisco A/S Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products
BR9606683A (pt) * 1995-11-07 1998-06-09 Gist Brocades Bv Composições estáveis compreendendo material vegetal transgênico
CN1220697A (zh) * 1996-04-05 1999-06-23 协和发酵工业株式会社 新型肌醇六磷酸酶及编码该新型肌醇六磷酸酶的基因
US5939303A (en) * 1996-06-14 1999-08-17 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada Phytases of ruminal microorganisms
US5985605A (en) * 1996-06-14 1999-11-16 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada DNA sequences encoding phytases of ruminal microorganisms
FR2751987B1 (fr) * 1996-08-01 1998-12-31 Biocem Phytases de plantes et applications biotechnologiques
GB9907461D0 (en) 1999-03-31 1999-05-26 King S College London Neurite regeneration
GB2319030A (en) * 1996-11-05 1998-05-13 Finnfeeds Int Ltd Phytase extracted from soybean
KR100222638B1 (ko) * 1997-01-20 1999-10-01 배희동 종자를 이용한 효소산물 및 사료원료의 생산
NZ336608A (en) 1997-02-21 2001-07-27 Danisco Method of inhibiting gene expression where the nucleotide codes for a Class A SBE intron in the antisense direction
US6774288B1 (en) 1997-07-07 2004-08-10 Basf Plant Science L.L.C. Animal feed with low phytic acid, oil, burdened and protein laden grain
US6197561B1 (en) 1997-07-22 2001-03-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes controlling phytate metabolism in plants and uses thereof
EP0990040B1 (en) * 1997-07-22 2007-10-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes controlling phytate metabolism in plants and uses thereof
JP2001513326A (ja) * 1997-08-11 2001-09-04 エクシード・ジェネティックス・エルエルシー 誘導可能なフィチン酸遺伝子を用いた制御された発芽
US7279619B2 (en) 1998-01-22 2007-10-09 National Research Council Of Canada Methods and compositions for modifying levels of secondary metabolic compounds in plants
BR9907223A (pt) 1998-01-22 2000-10-24 Ca Nat Research Council Métodos e composições para modificação dos nìveis de compostos metabólicos secundários em plantas
US6514495B1 (en) 1998-03-23 2003-02-04 Novozymes A/S Phytase varinats
AU2003270969B2 (en) * 1998-03-23 2006-08-03 Novozymes A/S Phytase Variants
KR20010042063A (ko) * 1998-03-23 2001-05-25 피아 스타르 사료 제제 및 식물 발현에 있어서의 열안정성 피타제
AU2003203147B2 (en) * 1998-03-23 2008-05-29 Novozymes A/S Phytase variants
BR9909010A (pt) * 1998-03-23 2000-11-28 Novo Nordisk As Variante de fitase, polipeptìdeo de fitase, construção de dna, vetor recombinante de expressão, célula hospedeira, processos para preparar uma variante de fitase, ração ou alimento, para preparar uma ração ou alimento composição, e para reduzir os nìveis de fitato em estrume animal, uso da variante de fitase ou da composição, e planta transgênica ou parte de planta
KR20010042395A (ko) * 1998-04-01 2001-05-25 윌리암 로엘프 드 보에르 저 함량의 피테이트를 가지는 사료에서 피타제의 사용
EP1071789A1 (en) * 1998-04-24 2001-01-31 E.I. Du Pont De Nemours And Company Phytic acid biosynthetic enzymes
US6451572B1 (en) 1998-06-25 2002-09-17 Cornell Research Foundation, Inc. Overexpression of phytase genes in yeast systems
ES2188190T5 (es) 1998-07-21 2007-11-16 Danisco A/S Producto alimentario.
DE60021715T2 (de) 1999-03-31 2006-06-01 Cornell Research Foundation, Inc. Phospahatasen mit verbesserter phytase-aktivität
US7148064B1 (en) 1999-05-26 2006-12-12 National Research Council Of Canada Method for reducing phytate in canola meal using genetic manipulation involving myo-inositol 1-phospathe synthase gene
AU4905500A (en) * 1999-05-26 2000-12-18 National Research Council Of Canada Method for reducing phytate in canola meal using genetic manipulation involving myo-inositol 1-phosphate synthase gene
US6841370B1 (en) 1999-11-18 2005-01-11 Cornell Research Foundation, Inc. Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase
EP1749887A3 (en) * 2000-05-04 2007-02-28 Forskningscenter Riso Phytase polypeptides
AU7242200A (en) * 2000-06-12 2001-12-13 Academia Sinica Protein production in transgenic plant seeds
GB0020498D0 (en) 2000-08-18 2000-10-11 Sterix Ltd Compound
BR0017339A (pt) 2000-09-21 2004-07-27 Dsm Nv Xilanases de talaromices
MXPA03010511A (es) 2001-05-18 2004-03-02 Danisco Metodo para preparar una masa con una enzima.
TWI332822B (en) 2001-10-31 2010-11-11 Phytex Llc Phytase-containing animal food and method
US7238378B2 (en) 2002-02-08 2007-07-03 Novozymes A/S Phytase variants
US8114443B2 (en) * 2002-03-13 2012-02-14 Academia Sinica Phytase-expressing transgenic plants
CA2498017C (en) 2002-09-13 2016-06-14 Cornell Research Foundation, Inc. Using mutations to improve aspergillus phytases
MXPA05004434A (es) 2002-10-24 2005-07-26 Sterix Ltd Inhibidores de 11-beta-hidroxi esteroide deshidrogenasa tipo 1 y tipo 2.
MXPA05007653A (es) 2003-01-17 2005-09-30 Danisco Metodo.
US7955814B2 (en) 2003-01-17 2011-06-07 Danisco A/S Method
US20050196766A1 (en) 2003-12-24 2005-09-08 Soe Jorn B. Proteins
BR122016015076B1 (pt) 2003-01-17 2017-05-16 Dupont Nutrition Biosci Aps método de produção de um éster de carboidrato e uso de uma enzima lipídio aciltransferase para produzir um éster de carboidrato
EP2119771B1 (en) 2003-12-24 2018-08-22 DuPont Nutrition Biosciences ApS Proteins
US7906307B2 (en) 2003-12-24 2011-03-15 Danisco A/S Variant lipid acyltransferases and methods of making
GB0716126D0 (en) 2007-08-17 2007-09-26 Danisco Process
US7718408B2 (en) 2003-12-24 2010-05-18 Danisco A/S Method
GB0403864D0 (en) 2004-02-20 2004-03-24 Ucl Ventures Modulator
GB0405637D0 (en) 2004-03-12 2004-04-21 Danisco Protein
DE602005020927D1 (de) 2004-05-20 2010-06-10 Pioneer Hi Bred Int Multidrug-resistenz-proteinpolynukleotide aus mais und verwendungsverfahren
PL1791933T3 (pl) 2004-07-16 2011-12-30 Dupont Nutrition Biosci Aps Sposób enzymatycznego odgumowania oleju
GB0421598D0 (en) 2004-09-29 2004-10-27 Cambridge Advanced Tech Modification of plant development and morphology
WO2006038128A2 (en) 2004-10-04 2006-04-13 Danisco A/S Citrobacter freundii phytase and homologues
GB0422052D0 (en) 2004-10-04 2004-11-03 Dansico As Enzymes
GB0423139D0 (en) 2004-10-18 2004-11-17 Danisco Enzymes
US7919297B2 (en) 2006-02-21 2011-04-05 Cornell Research Foundation, Inc. Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase
WO2008017066A2 (en) 2006-08-03 2008-02-07 Cornell Research Foundation, Inc. Phytases with improved thermal stability
EP2617820B1 (en) 2006-09-21 2016-03-23 BASF Enzymes LLC Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
MX2009008021A (es) 2007-01-25 2009-08-07 Danisco Produccion de una aciltransferasa de lipido de celulas de bacillus licheniformis transformadas.
US8143046B2 (en) 2007-02-07 2012-03-27 Danisco Us Inc., Genencor Division Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties
EA020035B1 (ru) 2007-12-21 2014-08-29 ДюПон НЬЮТРИШН БАЙОСАЙЕНСИЗ АпС Способы
WO2009133464A2 (en) 2008-04-30 2009-11-05 Danisco A/S Oxidation process
WO2010079332A1 (en) 2009-01-09 2010-07-15 Rothamsted Research Ltd. Improving biomass yield
CA2761767A1 (en) 2009-05-19 2010-11-25 Danisco A/S Use of amylase and lipolytic enzyme in bread
AU2010249500B2 (en) 2009-05-21 2016-03-24 Basf Enzymes Llc Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN102459581B (zh) 2009-06-25 2014-10-29 杜邦营养生物科学有限公司 蛋白质
GB0920089D0 (en) 2009-11-17 2009-12-30 Danisco Method
WO2011114251A1 (en) 2010-03-18 2011-09-22 Danisco A/S Foodstuff
GB201011513D0 (en) 2010-07-08 2010-08-25 Danisco Method
EP2625269A2 (en) 2010-10-06 2013-08-14 BP Corporation North America Inc. Variant cbh i polypeptides with reduced product inhibition
EP2694537A1 (en) 2011-04-08 2014-02-12 Danisco US Inc. Compositions
GB201112091D0 (en) 2011-07-14 2011-08-31 Gt Biolog Ltd Bacterial strains isolated from pigs
GB201117313D0 (en) 2011-10-07 2011-11-16 Gt Biolog Ltd Bacterium for use in medicine
GB201200075D0 (en) 2012-01-04 2012-02-15 Univ Nac De Rosario Grf3 mutants, methods and plants
CA2872901A1 (en) 2012-05-10 2013-11-14 Adynxx, Inc. Formulations for the delivery of active ingredients
US10226744B2 (en) 2012-10-19 2019-03-12 Danisco Us Inc Stabilization of biomimetic membranes
GB201306536D0 (en) 2013-04-10 2013-05-22 Gt Biolog Ltd Polypeptide and immune modulation
US9982229B2 (en) 2013-12-19 2018-05-29 Danisco Us Inc. Use of hydrophobins to increase gas transfer in aerobic fermentation processes
PT3180434T (pt) 2014-08-15 2019-10-29 Adynxx Inc Chamarizes oligonucleotídicos para o tratamento da dor
WO2016062855A1 (en) 2014-10-24 2016-04-28 Dupont Nutrition Biosciences Aps Proline tolerant tripeptidyl peptidases and uses thereof
CN107075534A (zh) 2014-10-24 2017-08-18 丹尼斯科美国公司 使用三肽基肽酶制备醇的方法
KR101942955B1 (ko) 2014-12-23 2019-01-28 4디 파마 리서치 리미티드 면역 조정
EA035925B1 (ru) 2014-12-23 2020-09-01 4Д Фарма Рисерч Лимитед Полипептид и иммуномодуляция
GB201501941D0 (en) 2015-02-05 2015-03-25 British American Tobacco Co Method
GB201502409D0 (en) 2015-02-13 2015-04-01 British American Tobacco Co Method
NZ777234A (en) 2015-06-15 2022-02-25 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
MA41060B1 (fr) 2015-06-15 2019-11-29 4D Pharma Res Ltd Compositions comprenant des souches bactériennes
MA41010B1 (fr) 2015-06-15 2020-01-31 4D Pharma Res Ltd Compositions comprenant des souches bactériennes
EP3307288B1 (en) 2015-06-15 2019-07-24 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strains
LT3240554T (lt) 2015-06-15 2019-11-11 4D Pharma Res Ltd Blautia stercosis ir wexlerae, skirtos naudoti uždegiminių ir autoimuninių ligų gydymui
WO2016210395A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Dupont Nutrition Biosciences Aps Aminopeptidases for protein hydrlyzates
ES2662617T3 (es) 2015-11-20 2018-04-09 4D Pharma Research Limited Composiciones que comprenden cepas bacterianas
GB201520497D0 (en) 2015-11-20 2016-01-06 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
GB201520631D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
GB201520638D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 4D Pharma Res Ltd Compositions comprising bacterial strains
CN108883139B (zh) 2016-03-04 2022-04-26 4D制药有限公司 包含细菌菌株的组合物
GB201612191D0 (en) 2016-07-13 2016-08-24 4D Pharma Plc Compositions comprising bacterial strains
WO2017223129A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 North Carolina State University Method for increasing nitrogen-use efficiency and or nitrogen-utilisation efficiency in plants
TW201821093A (zh) 2016-07-13 2018-06-16 英商４Ｄ製藥有限公司 包含細菌菌株之組合物
GB201621123D0 (en) 2016-12-12 2017-01-25 4D Pharma Plc Compositions comprising bacterial strains
BR112019016390A2 (pt) 2017-02-07 2020-04-07 University Of Kentucky Research Foundation método para aumentar o teor de éster de sacarose de uma planta de tabaco, uso de um gene de síntese de diterpenos, método para produzir uma planta de tabaco, planta de tabaco, material de propagação de plantas de tabaco, uso, folha colhida, folha de tabaco processada, material de tabaco curado, mistura de tabaco, produto da indústria do tabaco e artigo
CN110913878A (zh) 2017-05-22 2020-03-24 4D制药研究有限公司 包含细菌菌株的组合物
EP3630942B1 (en) 2017-05-24 2022-11-30 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strain
WO2018229189A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 4D Pharma Research Limited Compositions comprising bacterial strains
PT3638271T (pt) 2017-06-14 2021-01-05 4D Pharma Res Ltd Composições contendo estirpes bacterianas
DK3804737T3 (da) 2017-06-14 2022-07-25 4D Pharma Res Ltd Sammensætninger omfattende bakteriestammer
US20200291413A1 (en) 2017-06-23 2020-09-17 University Of Kentucky Research Foundation Method
EP3727661A1 (en) 2017-12-20 2020-10-28 Société des Produits Nestlé S.A. Process for the preparation of pickering emulsion forming particles by derivatization of cellulose-rich dietary fibers with enzymes and emulsions prepared
GB201812603D0 (en) 2018-08-02 2018-09-19 British American Tobacco Investments Ltd Method
GB201817971D0 (en) 2018-11-02 2018-12-19 British American Tobacco Investments Ltd Method
GB201818715D0 (en) 2018-11-16 2019-01-02 British American Tobacco Investments Ltd Method
GB201900940D0 (en) 2019-01-23 2019-03-13 British American Tobacco Investments Ltd Method
GB201906768D0 (en) 2019-05-14 2019-06-26 British American Tobacco Investments Ltd Method
GB201909562D0 (en) 2019-07-03 2019-08-14 British American Tobacco Investments Ltd Method
GB201909563D0 (en) 2019-07-03 2019-08-14 British American Tobacco Investments Ltd Method
EP3835309A1 (en) 2019-12-13 2021-06-16 KWS SAAT SE & Co. KGaA Method for increasing cold or frost tolerance in a plant
EP4132266A2 (en) 2020-04-09 2023-02-15 R. J. Reynolds Tobacco Company Methods for modulating the nicotine level in nicotiana tabacum
CN113134396B (zh) * 2021-04-24 2022-07-19 诸城市浩天药业有限公司 一种利用玉米浸泡水制备植酸钾时可降低解吸剂用量的工艺方法
KR20240132132A (ko) 2022-02-03 2024-09-02 니코벤처스 트레이딩 리미티드 담배 식물들에서 알칼로이드 함량을 조절하는 방법
WO2023148478A1 (en) 2022-02-03 2023-08-10 Nicoventures Trading Limited Method of modulating alkaloid content in tobacco plants
MX2024009605A (es) 2022-02-04 2024-08-14 Nicoventures Trading Ltd Metodo para modular el contenido de alcaloides en plantas de tabaco.
GB202205149D0 (en) 2022-04-07 2022-05-25 Nicoventures Trading Ltd Method
GB202205148D0 (en) 2022-04-07 2022-05-25 Nicoventures Trading Ltd Method
GB202205561D0 (en) 2022-04-14 2022-06-01 Nicoventures Trading Ltd Method
GB202205562D0 (en) 2022-04-14 2022-06-01 Nicoventures Trading Ltd Method
GB202206109D0 (en) 2022-04-27 2022-06-08 Nicoventures Trading Ltd Method
GB202206107D0 (en) 2022-04-27 2022-06-08 Nicoventures Trading Ltd Method
GB202300905D0 (en) 2023-01-20 2023-03-08 Nicoventures Trading Ltd Method
CN117448390B (zh) * 2023-12-25 2024-03-26 诸城市浩天药业有限公司 一种利用玉米浸泡水生产低分子磷酸肌醇盐的方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3297548A (en) * 1964-07-28 1967-01-10 Int Minerals & Chem Corp Preparation of acid phytase
JPS59166049A (ja) * 1983-03-09 1984-09-19 Nippon Shinyaku Co Ltd 豆乳の製法
SE465951B (sv) * 1984-10-23 1991-11-25 Perstorp Ab Isomer av inositoltrifosfat foeretraedesvis i saltform foer anvaendning som terapeutiskt eller profylaktiskt medel samt kompositioner daerav
US4956282A (en) * 1985-07-29 1990-09-11 Calgene, Inc. Mammalian peptide expression in plant cells
US4859486A (en) * 1986-03-31 1989-08-22 Douglass John M Preparation of an uncooked sunflower seed foodstuff
FI881496A (fi) * 1987-04-06 1988-10-07 Gist Brocades Nv Foerfarande foer framstaellning eller extraktion av aminosyror ur dynga.
NL8702735A (nl) * 1987-11-17 1989-06-16 Dorr Oliver Inc Werkwijze voor het weken van granen met een nieuw enzympreparaat.
FI83151C (fi) * 1988-06-17 1991-06-10 Cultor Oy Fermentativt foerfarande och tillaegsaemne foer konservering av foder.
WO1990001551A1 (en) * 1988-07-29 1990-02-22 Washington University School Of Medicine Producing commercially valuable polypeptides with genetically transformed endosperm tissue
CA2044240A1 (en) * 1989-01-25 1990-07-26 Maarit Simell Method for production of phytate-free or low-phytate soy protein isolate and concentrate
SK280670B6 (sk) * 1989-09-27 2000-05-16 Gist-Brocades N.V. Vyčistená a izolovaná sekvencia dna, konštrukt, ve

Also Published As

Publication number Publication date
IL97646A (en) 2003-05-29
DE69133533D1 (de) 2006-07-06
ES2267092T3 (es) 2007-03-01
WO1991014782A1 (en) 1991-10-03
HUT60780A (en) 1992-10-28
CA2056396A1 (en) 1991-09-24
KR920701454A (ko) 1992-08-11
KR100225087B1 (ko) 1999-10-15
IL97646A0 (en) 1992-06-21
DE69133533T2 (de) 2006-11-23
EP0449375A2 (en) 1991-10-02
EP0449375A3 (en) 1991-10-09
PT97111A (pt) 1991-12-31
FI915477A0 (fi) 1991-11-20
RU2128228C1 (ru) 1999-03-27
AU7776691A (en) 1991-10-21
US5770413A (en) 1998-06-23
ATE328093T1 (de) 2006-06-15
JP3471795B2 (ja) 2003-12-02
NZ237550A (en) 1993-09-27
CA2056396C (en) 2007-06-05
AU632941B2 (en) 1993-01-14
HU914086D0 (en) 1992-07-28
JPH06501838A (ja) 1994-03-03
EP0449375B1 (en) 2006-05-31
PT97111B (pt) 2001-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU215164B (hu) Eljárás fitáz kifejezésére transzgenikus növényekben, valamint eljárás ilyen növények előállítására és felhasználására
US5593963A (en) Expression of phytase in plants
KR100211308B1 (ko) 종자내의 효소의 생산 및 그 이용
US5543576A (en) Production of enzymes in seeds and their use
US6022846A (en) Expression of phytase in plants
US7736680B2 (en) Using mutations to improve Aspergillus phytases
AU753475C (en) Thermostable phytases in feed preparation and plant expression
JP3600614B6 (ja) 植物におけるフィターゼの発現
JP3600614B2 (ja) 植物におけるフィターゼの発現
US8114443B2 (en) Phytase-expressing transgenic plants
AU7242200A (en) Protein production in transgenic plant seeds
CA2408254A1 (en) Phytase polypeptides
CA2309342A1 (en) Protein production in transgenic plant seeds

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: SYNGENTA MOGEN B. V., NL

Owner name: GIST-BROCADES N.V., NL