ES2321047T3 - Variantes de fitasa. - Google Patents
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Abstract
Fitasa que difiere de la secuencia de aminoácidos de la fitasa de Peniophora lycii de la Fig. 6 en una o más de las siguientes posiciones, usando la numeración de posición correspondiente a P. lycii de la Fig. 1: D45S; T61R; A115N; L118V; H126S,V; G172P; E173Q,S; D201E; D203R, K, S; N215A, P; M238L; V264R, I; G302R,H; T337Q,S,G; V339I; P340A; E360R; V365L,A,S; D366V,S; E411K,T.
Description
Variantes de fitasa.
Esta invención se refiere a una fitasa que
difiere de la secuencia de aminoácidos de la fitasa de
Peniophora lycii de la fig. 6 en una o más de las siguientes
posiciones, usando la numeración de posición correspondiente a
P. lycii de la fig. 1: D45S; T61R; A115N; L118V; H126S.V;
G172P; E173Q.S; D201E; D203R,K,S; N215A, P; M238L; V264R, I; G302R,
H; T337Q, S, G; V339I; P340A; E360R; V365L,A,S; D366V,S; E411 K,T.,
las secuencias clonadas de ADN correspondientes, un método para
producir este tipo de variantes de fitasa, y el uso del mismo para
varias aplicaciones industriales.
El ácido fítico o mio-inositol
1,2,3,4,5,6-hexaquis dihidrógeno fosfato (o para
abreviar mio-inositol hexaquisfosfato) es la fuente
primaria de inositol y la forma de almacenamiento primaria de
fosfato en semillas de planta. La fitina es una mezcla de potasio,
magnesio y sal cálcica de inositol.
Las fracciones de fosfato ácido fítico forma
quelatos de cationes divalentes y trivalentes tales como iones
metálicos, en ausencia de los iones nutricionalmente esenciales de
calcio, hierro, zinc y magnesio, al igual que los metales traza de
manganeso, cobre y molibdeno.
El ácido fítico y sus sales, fitatos, con
frecuencia no son metabolizados, es decir, ni el fósforo de las
mismas, ni los iones metálicos quelatados están disponibles
nutricionalmente.
Por consiguiente, los alimentos y los preparados
alimenticios necesitan suplementarse con fosfato inorgánico y, con
frecuencia, los iones nutricionalmente esenciales tales como el
hierro y el calcio también se deben suplementar.
Aún más, el fósforo de fitato pasa a través del
tracto gastrointestinal de animales de este tipo y es excretado con
el abono, dando como resultado una contaminación de fosfato
indeseable del medio ambiente, produciendo p. ej. una eutroficación
del medio ambiente acuático y un crecimiento extensivo de
algas.
Ácido fítico o fitatos, siendo dichos términos,
a menos que se indique lo contrario, usados en el presente contexto
como sinónimos o al azar, son degradables por las fitasas.
De la producción de fitasas por plantas al igual
que por microorganismos se ha presentado un informe. Entre los
microorganismos se reconocen bacterias productoras de fitasa al
igual que hongos productores de fitasa.
Hay diferentes descripciones de hongos
filamentosos productores de fitasa del filum fúngico Ascomycota
(ascomicetos). En particular, hay diferentes referencias para los
ascomicetos productores de fitasa del género Aspergillus tales como
el Aspergillus terreus (Yamada et al., 1986, Agric.
Biol. Chem. 322:1275-1282). La clonación y
expresión del gen de fitasa del Aspergillus Niger var.
Awamori también ha sido descrita (Piddington et al., 1993,
Gene 133:55-62). En EP 0420358 se describe la
clonación y expresión de una fitasa de Aspergillus ficuum
(Niger). En EP 0684313 se describe la clonación y expresión de
fitasas de los ascomicetos Aspergillus niger,
Myceliophthora thermophila, y Aspergillus terreus.
Además se dan algunas secuencias parciales de fitasas de
Aspergillus nidulans, Talaromyces termofilus,
Aspergillus fumigatus y de otra cepa de Aspergillus
terreus.
La clonación y expresión de una fitasa de
Thermomyces lanuginosus se describe en WO 97/35017.
Actualmente existe una necesidad por parte de
las fitasas de poseer propiedades modificadas o características, p.
ej. las fitasas de termoestabilidad aumentada, de un pH óptimo
alterado (para los tratamientos in vitro se desea un pH
óptimo alto, y para los tratamientos in-vivo
en el tracto gastro-intestinal uno bajo), y/o de
una actividad específica más alta.
Esta invención se refiere a una fitasa que
difiere de la secuencia de aminoácidos de la fitasa de
Peniophora lycii de la fig. 6 en 5 una o más de las
siguientes posiciones, usando la numeración de posición
correspondiente a P. lycii de la fig. 1: D45S; T61R; A115N;
L118V; H126S.V; G172P; E173Q,S; D201 E; D203R,K,S; N215A,P; M238L;
V264R,I; G302R,H; T337Q,S,G; V339I; P340A; E360R; V365L,A,S;
D366V,S; E411K,T., las 10 secuencias de ADN clonadas
correspondientes, un método de producción de este tipo de variantes
de fitasa, y el uso del mismo para varias aplicaciones
industriales.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
En la descripción de la invención detallada de
abajo se hace referencia a los dibujos, de los cuales
Fig. 1: es un alineamiento de trece secuencias
de fitasa específicas (un alineamiento de secuencia múltiple según
el programa PileUp; GapWeight: 3.000; GapLengtWeight: 0.100);
Fig. 2: esta figura muestra la secuencia de
aminoácidos y la secuencia de ADN de una primera fitasa ("P.
involtus-A1") derivada de la cepa CBS 100231 de Paxillus
involutus que fue depositada el 28.11.97; el plásmido de
expresión pYES 2.0 que comprende la secuencia de ADNc en su
longitud total fue transformado en la cepa DSM 11842 de E.
coli que fue depositada el 12.11.97 (véase WO 98/28409);
Fig. 3: esta figura muestra la secuencia de
aminoácidos y la secuencia de ADN de una segunda fitasa ("P.
involtus-A2") derivada de la cepa CBS 100231 de Paxillus
involutus que fue depositada el 28.11.97; el plásmido de
expresión pYES 2.0 que comprende la secuencia de ADNc en su
longitud total fue transformado en la cepa DSM 11843 de E.
coli que fue depositada el 12.11.97 (véase WO 98/28409);
Fig. 4: esta figura muestra la secuencia de
aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("T.
pubescens") derivada de la cepa CBS 100232 de Trametes
pubescens que fue depositada el 28.11.97; el plásmido de
expresión pYES 2.0 que comprende la secuencia de ADNc en su
longitud total fue transformado en la cepa DSM 11844 de E.
coli que fue depositada el 12.11.97 (véase WO 98/28409);
Fig. 5: esta figura muestra la secuencia de
aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("A.
pediades") derivada de la cepa CBS 900.96 de Agrocybe
pediades depositada el 04.12.96; el plásmido de expresión pYES
2.0 que comprende la secuencia de ADNc en su longitud total fue
transformada en la cepa DSM 11313 de E. coli que fue
depositada el 02.12.96 (véase WO 98/28409);
Fig. 6: esta figura muestra la secuencia de
aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("P.
lycii") derivada de la cepa CBS 686.96 de Peniophora
lycii que fue depositada el 04.12.96; el plásmido de expresión
pYES 2.0 que comprende la secuencia de ADNc en su longitud total
fue transformada en la cepa DSM 11312 de E. coli que fue
depositada el 02.12.96 (véase WO 98/28409);
Fig. 7: esta figura es igual a la figura 2 de EP
0684313 y muestra el aminoácido y secuencia de ADN de una fitasa
("M. thermophila") derivada de la cepa ATCC 48102
(=ATCC 74340) de Myceliophthora thermophila que fue
redepositada el 14.03.97;
Fig. 8: esta figura muestra la secuencia de
aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("A.
fumigatus") derivada de la cepa ATCC 13073 de Aspergillus
fumigatus (véase EP 0897985);
Fig. 9: esta figura muestra la secuencia de
aminoácidos ("Conphys") y la secuencia de ADN de una fitasa de
consenso de ascomiceto (en el presente contexto nombrada como
"consphyA") (véase EP 0897985);
Fig. 10: esta figura muestra la secuencia de
aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("A.
nidulans") derivada de la cepa DSM 9743 de Aspergillus
nidulans (véase EP 0897985);
Fig. 11: esta figura es igual a la figura 8 de
EP 0420358 y muestra la secuencia de aminoácidos y la secuencia de
ADN de una fitasa ("A. ficuum") derivada de la cepa
NRRL-3135 de Aspergillus ficuum;
Fig. 12: esta figura es igual a la figura 1 de
EP 0684313 y muestra la secuencia de aminoácidos y la secuencia de
ADN de una fitasa ("A. terreus") derivada de la cepa
CBS 220.95 de Aspergillus terreus;
Fig. 13: esta figura muestra la secuencia de
aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("T.
thermo") derivada de la cepa ATCC 20186 (=ATCC 74338) de
Talaromyces thermophilus que fue redepositada el 14.03.97
(véase EP 0897985);
Fig. 14: esta figura es igual a la figura 2 de
WO 97/35017 y muestra la secuencia de aminoácidos y la secuencia de
ADN de una fitasa ("T. lanuginosa") derivada de la cepa
CBS 586.94 de Thermomyces lanuginosus; un plásmido que
comprende la secuencia de ADNc en su longitud total fue
transformada en la cepa B-21527 de DH5\alpha
(pMWR46) de E. coli que fue depositada con NRRL el
23.02.96;
Fig. 15: esta figura muestra la secuencia de
aminoácidos y la secuencia de ADN de una fitasa ("C.
foecundissimum") derivada de la cepa CBS 427.97 de
Cladorrhinum foecundissimum que fue depositada el 23 de
enero de 1997; el plásmido de expresión pYES 2.0 que comprende la
secuencia de ADNc en su longitud total fue transformada en la cepa
DSM 12742 de E. coli que fue depositada el 17 de marzo de
1999;
Fig. 16: esta figura muestra un alineamiento de
la fitasa de C. foecundissimum con el fitasa modelo de M.
thermophila, usando el programa GAP gcg (Peso Gap: 3.000; peso
de longitud: 0.100); y
Fig. 17: muestra cómo la fitasa de C.
foecundissimum puede ser pegada sobre el alineamiento de la
fig. 1.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En el presente contexto una fitasa es una enzima
que cataliza la hidrólisis de fitato (mio-inositol
hexakisfosfato) a (1) mio-inositol y/o (2) mono-,
di-, tri-, tetra y/o penta-fosfatos del mismo, y (3)
fosfato inorgánico. En lo sucesivo, para abreviar, los compuestos
de arriba serán referidos a veces como IP6, I, IP1, IP2, IP3, IP4,
IP5 y P, respectivamente. Esto significa que por acción de una
fitasa, IP6 se degrada a P + uno o más de los componentes IP5, IP4,
IP3, IP2, IP1 y I. De forma alternativa, el
mio-inositol que llevaba en total n grupos fosfato
fijados en las posiciones p, q, r,... se denomina Ins (p,q,r, ..)
Pn. Por conveniencia, Ins (1, 2, 3, 4, 5, 6) P6 (ácido fítico) se
ha abreviado a PA.
Según la base de datos de nomenclaturas de
enzimas ExPASy (un repositorio de información relativa a la
nomenclatura de enzimas basada principalmente en las
recomendaciones del Comité de Nomenclaturas de la Unión
Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBBM) que
describe todos y cada uno de los tipos de enzima caracterizadas
para lo cual se proporcionó un número de la EC (Comisión
Enzimática)), son conocidos dos tipos diferentes de fitasas: una
así denominada 3-fitasa
(mio-inositol hexafosfato
3-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8) y una así denominada
6-fitasa (mio-inositol hexafosfato
6-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.26). La
3-fitasa hidroliza primero el enlace estérico en la
posición D-3, mientras que la
6-fitasa hidroliza primero el enlace estérico en la
posición D-6 o L-6.
La expresión "fitasa" o "polipéptido o
enzima que presenta actividad fitasa" se destina a cubrir
cualquier enzima capaz de efectuar la liberación de fosfato
inorgánico o fósforo de diferentes fosfatos de
mio-inositol. Ejemplos de fosfatos de
mio-inositol de este tipo (sustratos de fitasa) son
el ácido fítico y cualquier tipo de sal del mismo, p. ej. fitato de
sodio o fitato de potasio o sales mezcladas. Además, cualquier
estereoisómero de los mono-, di-, tri-, tetra o
penta-fosfatos de mio-inositol puede
servir como sustrato de fitasa. Un sustrato de fitasa preferido es
el ácido fítico y las sales del mismo.
Conforme a la definición de arriba, la actividad
fitasa se puede determinar usando cualquier ensayo en el que se use
uno de estos sustratos. En el presente contexto (a menos que se
especifique lo contrario) la actividad fitasa se determina en la
unidad de FYT, siendo un FYT la cantidad de enzimas que libera 1
\mumol de ortofosfato inorgánico por min. bajo las condiciones
siguientes: pH 5.5; temperatura 37ºC; sustrato: fitato de sodio
(C_{6} H_{6}O_{24}P_{6}Na_{12}) en una concentración de
0,0050 mol/L. Un ensayo de fitasa adecuado se describe en la parte
experimental.
La presente invención proporciona una fitasa
como se describe en las reivindicaciones anexas.
Una fitasa creada genéticamente es una fitasa
producida de forma no-natural, diferente de una
fitasa modelo, p. ej. una fitasa tipo salvaje. Entre las fitasas
creadas genéticamente se incluyen, pero no se limitan a, las fitasas
preparadas por mutagénesis dirigida, barajado de genes, mutagénesis
aleatoria, etc.
La invención también proporciona constructos de
ADN, vectores, células huéspedes, y métodos de producción de estas
fitasas, así como usos de los mismos.
Una variante de fitasa es un polipéptido, enzima
o fragmento del mismo que muestra actividad fitasa y que es
modificada en comparación con una fitasa modelo.
Modificado significa alterado por uno o más
aminoácidos o sustituciones peptídicas, deleciones, inserciones y/o
adiciones; en cada caso por o de uno o más aminoácidos. Tales
sustituciones, deleciones, inserciones, y adiciones se pueden
conseguir mediante cualquier método conocido en la técnica, p. ej.
mediante barajado de genes, mutagénesis aleatoria, mutagénesis
dirigida, etc.
La fitasa modelo o parental, de la cual se
deriva la variante de fitasa, puede ser cualquier fitasa, p. ej.
una fitasa tipo salvaje o un derivado, mutante o variante de la
misma, incluyendo variantes alélicas y de especies, al igual que
variantes creadas genéticamente a partir de las mismas que, p. ej.,
pueden ser preparadas por mutagénesis dirigida, mutagénesis
aleatoria, barajado, etc.
En el concepto de fitasa modelo también se
incluye cualquier híbrido o fitasa quimérica, es decir una fitasa
que comprende una combinación de secuencias parciales de
aminoácidos derivadas de al menos dos fitasas.
La fitasa híbrida puede comprender una
combinación de secuencias parciales de aminoácidos que derivan de
al menos dos fitasas de ascomiceto, de al menos dos fitasas de
basidiomiceto o de al menos una fitasa de un ascomiceto y de al
menos una fitasa de basidiomiceto. Estas fitasas de ascomiceto y de
basidiomiceto, de las cuales deriva una secuencia parcial de
aminoácidos, p. ej., pueden ser cualquiera de estas fitasas
específicas a las que se hace referencia en la presente.
En el presente contexto, una fitasa híbrida,
barajada, mutagenizada de forma aleatoria, mutagenizada de forma
dirigida o creada genéticamente, derivada únicamente de fitasas de
ascomiceto, es también una fitasa de ascomiceto; y una fitasa
híbrida, barajada, mutagenizada de forma aleatoria, mutagenizada de
forma dirigida o creada genéticamente, derivada únicamente de
fitasas modelo de basidiomiceto, también es una fitasa de
basidiomiceto. Cualquier híbrido derivado de al menos una fitasa de
ascomiceto, al igual que al menos una fitasa de basidiomiceto, se
denomina fitasa mezclada de ascomiceto/basidiomiceto, y una fitasa
de este tipo es también una fitasa modelo en el presente
contexto.
contexto.
Análogamente, una fitasa híbrida, barajada,
mutagenizada de forma aleatoria, mutagenizada de forma dirigida o
creada genéticamente, derivada de una o más fitasas de Aspergillus,
también es una fitasa derivada de Aspergillus; y una fitasa
híbrida, barajada, mutagenizada de forma aleatoria, mutagenizada de
forma dirigida o creada genéticamente, derivada de cualquier otro
sub-agrupamiento taxonómico mencionado aquí,
también se denomina fitasa derivada de este
sub-agrupamiento taxonómico.
Además, en el presente contexto, "derivado
de" se usa para indicar una fitasa producida o producible por
una cepa del organismo en cuestión, pero también una fitasa
codificada por una secuencia de ADN aislada de tal cepa y producida
en un organismo huésped transformado con dicha secuencia de ADN.
Finalmente, el término se usa para indicar una fitasa codificada por
una secuencia de ADN de origen sintético y/o de ADNc, que tiene las
características identificadoras de la fitasa en cuestión.
Preferiblemente, la fitasa modelo es una fitasa
que puede ser alineada como se describe abajo con cualquiera de las
trece fitasas de la Fig. 1 (que son particularmente fitasas modelo
preferidas).
Las fitasas modelo salvajes preferidas (es
decir, ni fitasas recombinantes, ni barajadas, ni fitasas creadas
genéticamente) tienen un grado de similitud u homología,
preferiblemente identidad, con la secuencia de aminoácidos nº.
38-403 (números de Peniophora) de cualquiera de
estas trece fitasas de al menos un 40%, más preferiblemente de al
menos un 50%, más preferiblemente de al menos un 60%, en particular
de al menos un 70%, especialmente de al menos un 80%, y de la forma
más preferible con un grado de similitud de al menos un 90%.
Las fitasas modelo preferidas recombinantes,
barajadas o creadas genéticamente tienen un grado de similitud u
homología, preferiblemente identidad, con la secuencia parcial nº.
38-49, 63-77,
274-291, 281-300 y
389-403 (números de Peniophora) de cualquiera de
estas trece fitasas de al menos un 60%, a ser posible de al menos
un 70%, más preferiblemente de al menos un 80%, y en particular de
al menos un 90%.
El grado de similitud se basa preferiblemente en
una comparación con la secuencia de aminoácidos completa de
cualquiera de las trece fitasas.
El grado de similitud u homología, de forma
alternativa identidad, se puede determinar usando cualquier
programa de alineamiento conocido en la técnica. Un programa de
alineamiento preferido es GAP, proporcionado en el GCG, versión 8
del paquete de programas (Manual del Programa para el Paquete
Wisconsin, Versión 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575
Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (véase también
Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular
Biology, 48: 443-453). Usando GAP con los ajustes
siguientes para la comparación de secuencias polipeptídicas: peso
GAP de 3.000 y longitud GAP de 0.100.
También es preferida una fitasa modelo salvaje
que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una
secuencia de ADN la cual se hibrida a una secuencia ADN que
codifica una secuencia de aminoácidos 38-403
(números de Peniophora) de cualquiera de las secuencias de ADN que
codifican las trece secuencias específicas de fitasa de la Fig.
1.
Otra fitasa modelo preferida es una fitasa
creada genéticamente, que comprende una secuencia de aminoácidos
codificada por una secuencia de ADN la cual se hibrida a una
secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos
38-49, y a una secuencia de ADN que codifica una
secuencia de aminoácidos 63-77, y a una secuencia
de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos
274-291, y a una secuencia de ADN que codifica una
secuencia de aminoácidos 281-300, y a una secuencia
de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos
389-403 (números de Peniophora) de cualquiera de
las secuencias de ADN que codifiquen las trece secuencias de fitasa
específicas de la Fig. 1.
Preferiblemente, la hibridación es para la parte
codificante completa de la fitasa de cualquiera de las trece
fitasas.
Las condiciones experimentales adecuadas para
determinar si una secuencia de ADN o de ARN dadas se
"hibridan" a un nucleótido especifico o a una sonda de
oligonucleótidos es necesario un prerremojo del filtro que contiene
los fragmentos de ADN o ARN para examinar la hibridación en 5 X SSC
(cloruro de sodio/citrato de sodio), (J. Sambrook, E.F. Fritsch, and
T.. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d
edition, Cold Spring Harbor, New York) durante 10 min, y una
prehibridación del filtro en una solución de 5 x SSC, 5 x de
solución de Denhardt (Sambrook et al. 1989), 0,5% de SDS y
100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y
sometido a un baño de ultrasonidos (Sambrook et al. 1989),
seguida de una hibridación en la misma solución conteniendo una
concentración de 10 ng/ml de una sonda de marcaje aleatorio
(Feinberg, a. P. y Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem.
132:6-13), marcada en 32P-dCTP
(actividad específica > 1 X 109 cpm/\mug) durante 12 horas a
aproximadamente 45ºC.
Después se lava el filtro dos veces durante 30
minutos en 2 X SSC, 0,5% de SDS a al menos 55ºC (astringencia
baja), a al menos 60ºC (astringencia media), a al menos 65ºC
(astringencia media/alta), a al menos 70ºC (astringencia alta), o a
al menos 75ºC (astringencia muy alta).
Las moléculas con las cuales se hibrida la sonda
de oligonucleótidos bajo estas condiciones se detectan usando una
película radiográfica.
Debería observarse que una cierta variante
específica de fitasa no necesita en realidad haber sido preparada a
partir de una fitasa modelo específica para que esta fitasa modelo
sea calificada como "fitasa modelo" en el presente contexto.
Es suficiente con que la variante muestre al menos una de las
enmiendas aquí indicadas cuando ésta se compare después con la
fitasa modelo.
El alineamiento de la Fig. 1 se realiza usando
el programa Pileup (Program Manual for the Wisconsin Package,
Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive,
Madison, Wisconsin, USA 53711), con un Peso de Gap de 3.000 y un
Peso de Longitud de Gap de 0.100. Cuando se alinea una nueva fitasa
modelo o una nueva variante de fitasa las trece secuencias pueden
incluirse junto con la nueva (variante de) fitasa en un
alineamiento múltiple, o, de forma alternativa, al menos una de las
trece secuencias de la Fig. 1 se incluye junto con la nueva
(variante de) fitasa en un alineamiento.
Un procedimiento preferido para alinear una
nueva fitasa modelo (o una variante de fitasa) según la Fig. 1 es
el siguiente: la fitasa modelo nueva se alinea con aquella
secuencia específica de las trece secuencias de la Fig. 1 con la
que la tiene el grado más alto de homología. Para calcular el grado
de homología, y para realizar el "alineamiento según la Fig.
1" de las dos secuencias, se usa preferentemente el programa
GAP, al que se hace referencia abajo. Habiendo alineado las dos
secuencias, la fitasa modelo nueva (o variante de fitasa) se añade
(pega) al alineamiento de la Fig. 1 usando el resultado del primer
alineamiento (colocando los residuos de aminoácidos idénticos y
homólogos uno sobre otro se prescribe en el alineamiento),
siguiendo las posiciones correspondientes que son ahora fácilmente
identificables.
El Ejemplo 7 muestra un ejemplo de cómo añadir
una fitasa modelo nueva al alineamiento de la Fig. 1 y deducir
variantes de fitasa correspondientes de las mismas.
Otras fitasas modelo y variantes deducidas en
analogía con el Ejemplo 7 pueden ser alineadas. Esto es así para
las fitasas modelo siguientes en particular: la fitasa de
Aspergillus Niger var. awamori (patente US nº. 5.830.733);
la fitasa de Bacillus de WO 98/06858; la fitasa de soja de WO
98/20139; la fitasa de maíz de WO 98/05785; la fitasa de Aspergillus
de WO 97/38096; las fitasas de Monascus anka de WO 98/13480;
la fitasa de Schwanniomyces occidentalis de EP 0699762,
etc.
Al comparar una fitasa modelo con una variante
de fitasa propuesta usando el alineamiento como se describe en este
caso, se pueden identificar las posiciones de aminoácido
correspondientes, es decir, una posición modelo de la fitasa modelo
y una posición variante de la variante; la posición modelo y la
posición variante correspondientes se sitúan simplemente una debajo
de la otra en el alineamiento. Se dice que ha ocurrido una
modificación en una posición dada si el aminoácido modelo de la
posición modelo y el aminoácido variante de la posición variante
son diferentes. Las modificaciones preferidas de estas posiciones
se manifiestan ellas mismas como sustituciones de aminoácido,
deleciones o adiciones.
Modificado en al menos una posición significa
modificado en una o más posiciones, es decir, en una, dos, tres,
cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, etc.,
hasta todas las posiciones N catalogadas. Esta definición incluye
cualquier posible subcombinación de las mismas, p. ej. cualquier
conjunto de dos sustituciones, cualquier conjunto de tres, cualquier
conjunto de cuatro, etc.; hasta cualquier conjunto de posiciones
(N-1).
En el presente contexto todas las secuencias,
cualquiera que sea la fitasa modelo, incluyendo las trece
secuencias de la Fig. 1, se numeran usando la numeración
correspondiente a la fitasa de P. lycii. Estos "números de
Peniophora" se indican en la Fig. 1 junto con los "números de
alineamiento". La numeración de P. lycii comienza en M1 y
acaba en E439.
Como se ha explicado arriba, el alineamiento
revela qué posiciones de las distintas secuencias de fitasa
diferentes a las de P. lycii son equivalentes o corresponden
a la posición dada de P. lycii.
Una sustitución de aminoácidos se indica aquí
como por ejemplo "3S", lo que indica que en la posición 3 el
aminoácido S debería ser sustituido por la posición "original"
o la posición modelo del aminoácido 3, cualquiera que sea ésta. De
este modo, la sustitución debería dar como resultado una S en la
posición variante correspondiente. Considerando ahora el
alineamiento de la Fig. 1, una sustitución como p. ej. "3S" se
debe interpretar del siguiente modo para las respectivas fitasas
mostradas (el aminoácido indicado en primer lugar es el aminoácido
"original" o modelo en la "posición de la Peniophora"
3):
- P. involtus-A1:
- F3S (número 3F sustituido por S)
- P. involtus-A2:
- L3S
- T. pubescens:
- M3S
- A. pediades:
- M3S
- P. lycii:
- redundante (ya un S)
- A. fumigatus:
- T3S
- consphyA:
- V3S
- A. nidulans:
- T3S
- A. ficuum NRRL3135:
- A3S
- A. terreus:
- A3S
- T. thermo:
- L3S
- T. lanuginosa:
- V3S
- M. thermophila:
- G3S
\vskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, en lo sucesivo se denominará a las
sustituciones específicas de arriba de la siguiente manera (siempre
usando la numeración de la Peniophora):
- P. involtus-A1:
- F3S
- P. involtus-2:
- L3S
- T. pubescens:
- M3S
- A. pediades:
- M3S
- P. lycii:
- redundante (ya un S)
- A. fumigatus:
- T3S
- consphyA:
- V3S
- A. nidulans:
- T3S
- A. ficuum NRRL3135:
- A3S
- A. terreus:
- A3S
- T. thermo:
- L3S
- T. lanuginosa:
- V3S
- M. thermophila:
- G3S
\vskip1.000000\baselineskip
Además, denotaciones como p. ej. "3S,F,G"
significan que el aminoácido en la posición 3 (números de la
Peniophora) de la fitasa modelo en cuestión es sustituida con
cualquiera de S, F o G, es decir, p. ej. la designación
"3S,F,G" se considera como totalmente equivalente a la
designación "3S, 3F, 3G".
Una denotación como ()3S significa que el
aminoácido S se añade a la secuencia en cuestión (en un espacio en
la secuencia real), en una posición correspondiente al número 3 de
la Peniophora; y viceversa para las deleciones (S3()).
En el caso de regiones donde la secuencia de
fitasas de Peniophora tiene deleciones más grandes que algunas de
las otras fitasas de la Fig. 1, por ejemplo en la región entre la
posición 201 y 202 (números de la Peniophora), las posiciones
intermedias (residuos de aminoácidos en otras secuencias) se
numeran añadiendo a, b, c, d, etc, en minúscula al número en última
posición de la Peniophora, p. ej. para la fitasa de M.
thermophila: E201; G201a; P201b; Y201c; S201d; T201e; I201f;
G202; D203; etc.
En una de las solicitudes prioritarias de la
presente solicitud hay dos errores menores de numeración de
posición: según las definiciones de arriba, las posiciones a las
que se ha hecho referencia en la primera solicitud prioritaria como
204 y 205 (números de la Peniophora) están mal designados; éstas
deberían haber sido numeradas como 203a y 204, respectivamente. En
consecuencia, 204 ha sido sustituido por 203a y 205 por 204 a lo
largo de toda la presente solicitud.
Una variante de fitasa preferida comprende una
secuencia de aminoácidos que comprende, preferiblemente contiene,
una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 24C; 27P;
31Y; 33C; 39H,S,Q; 40L,N; 42S, G; 43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L,
M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y; 44N; 45D, S; 47Y,F; 49P; 51E, A, R;
56P; 58D,K,A; 59G; 61R; 62V, I; 69Q; 75W, F; 78D, S; 79G; 80K, A;
81A, G, Q, E; 82T; 83A, I, K, R, Q; 84I, Y, Q, V; 881; 90R, A; 102Y;
115N; 116S; 118V,L; 119E; 120L; 122A; 123N,Q,T; 125M,S; 126H,S,V;
127Q, E, N; 128A,S,T; 132F, I, L; 143N; 148V, I; 151A,S; 152G;
153D, Y; 154D, Q, S, G; 157V; 158D, A; 159T; 160A,S; 161T,N; 162N;
163W; 170fH; 170gA; 171N; 172P; 173Q,S; 184Q,S,P; 185S; 186A,E,P;
187A; 187aS; 190A,P; 193S; 194S, T; 195T, V, L; 198A,N,V; 200G,V;
201D,E; una deleción de al menos uno de 201a, 201b, 201c, 201d,
201e, 201f, preferiblemente todos; 201eT; 202S,A; 203R,K,S;
203aV,T; 204Q, E, S, A, V; 205E; 211L,V; 215A, P; 220L, N; 223H,D;
228N; 232T; 233E; 235Y, L, T; 236Y,N; 237F; 238L, M; 242P,S; 244D;
246V; 251eE, Q; 253P; 256D; 260A, H; 264R, I; 265A, Q; 267D; 270Y;
A, L, G; 271D,N; 273D,K; 275F,Y; 278T, H; 280A, P; 283P; 287A,T;
288L, I, F; 292F,Y; 293A, V; 302R,H; 304P,A; 332F; 336S;
337T,G,Q,S; 338I; 339V, I; 340P,A; 343A, S, F, I, L; 348Y; 349P;
352K; 360R; 362P; 364W,F; 365V, L, A, S; 366D, S, V; 367A,K; 368K;
369I, L; 370V; 373A,S; 374S,A; 375H; 376M; 383kQ,E; 387P; 393V;
396R; 404A,G; 409R; 411 K,T; 412R; 417E,R; 421F, Y; 431E.
Preferiblemente esto es con la condición de que
la fitasa modelo no comprenda ya la sustitución o adición o
deleción de aminoácidos arriba sugerida en la posición indicada. O
con la condición de que, para cada posición, el aminoácido modelo
ya no sea el aminoácido variante propuesto aquí. Pero estas
condiciones se pueden considerar ya de hecho inherentes en la
formulación de arriba, debido a la expresión "modificado".
Las diferentes variantes de fitasa preferidas
comprenden, preferiblemente contienen o tienen, secuencias de
aminoácidos que comprenden o contienen una o más de las
sustituciones de aminoácidos, adiciones, o deleciones catalogadas
en las respectivas reivindicaciones.
Las diferentes variantes de fitasa descritas
aquí comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o incluso 10 de estas
sustituciones; o varias sustituciones de 10-15,
15-20, 20-30 o incluso
30-50; finalmente hasta 60, 70, 80 o 90
sustituciones.
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de
las diferentes variantes de fitasa comprenden una o más
sustituciones de los sub-agrupamientos de
sustitución catalogados a continuación; o combinaciones de
sustituciones clasificadas en dos o más
sub-agrupamientos.
Generalmente, en vez de "comprender",
"contener" o "tener", las secuencias de aminoácidos de
variantes preferentes "consisten esencialmente en" o
"consisten en" las fitasas modelo específicas de la Fig. 1,
siendo modificadas por una o más de las sustituciones aquí
descritas.
En el presente contexto un basidiomiceto
significa un microorganismo del filo Basidiomycota. Este filo
Basidiomycota está comprendido en el reino fúngico junto con p. ej.
el filo Ascomycota ("ascomicetos").
Las cuestiones taxonómicas pueden clarificarse
consultando las referencias catalogadas abajo o consultando una
base de datos de taxonomía fúngica (base de datos NIH (Entrez)) que
está disponible vía Internet en la World Wide Web en la siguiente
dirección: http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/tax.html.
Para dar una definición de basidiomicetos, se
hace referencia bien a Jülich, 1981, Higher Taxa of Basidiomycetes;
Ainsworth & Bisby's (eds.) Dictionary of the Fungi, 1995,
Hawksworth, D.L., P.M. Kirk, B.C. Sutton & D.N. Pegler; o bien
a Hansen & Knudsen (Eds.), Nordic Macromycetes, vol. 2 (1992) y
3 (1997). Una referencia preferida es Hansen & Knudsen.
Para dar una definición de ascomicetos, se hace
referencia bien a Ainswort & Brisbi, citados arriba, o bien a
Systema Ascomycetum by Eriksson, O.E. & D. L. Hawksworth, Vol.
16, 1998. Una referencia preferida es Eriksson et al.
Generalmente, un microorganismo que se clasifica
como basidiomiceto/ascomiceto en cualquiera de las referencias
catalogadas arriba, incluida la base de datos, es un
basidiomiceto/ascomiceto en el presente contexto.
Algunas cepas de Aspergillus son difíciles de
clasificar porque son anamorfas, y en consecuencia se pueden
clasificar como Fungi Imperfecti. No obstante, una vez se ha
encontrado el equivalente teleomorfo, éste reclasifica de forma
taxonómica. Por ejemplo, el teleomorfo de A. nidulans es
Emericella nidulans (de la familia Trichocomaceae, el órden
Eurotiales, la clase Plectomycetes del filo Ascomycota). Estos
subagrupamientos de Ascomycota son preferidos, junto con la familia
Lasiosphaeriaceae, el orden Sordariales, la clase Pyrenomycetes del
filo Ascomycota.
Las palabras "ascomicetos" y análogos, como
se utiliza en este caso, incluye cualquier cepa de Aspergillus,
Thermomyces, Myceliophthora o Talaromyces que sea anamorfa y de
este modo serían clasificadas en Fungi Imperfecti.
Fitasas de basidiomiceto preferidas son aquellas
catalogadas en WO 98/28409, exactamente al principio de la sección
encabezada como "Descripción detallada de la invención".
Las secuencias de ADN que codifican las trece
fitasas modelo específicas catalogadas y otras fitasas modelo se
pueden preparar según las instrucciones de cada uno de los
documentos catalogados bajo la breve descripción de los
dibujos.
Una secuencia de ADN que codifica una fitasa
modelo se puede aislar de cualquier célula o microorganismo que
produce la fitasa en cuestión usando varios métodos bien conocidos
en la técnica. En primer lugar, se debería construir una biblioteca
de ADN genómico y/o de ADNc usando ADN cromosómico o ARN mensajero
del organismo que produce la fitasa. Después, si la secuencia de
aminoácidos de la fitasa se conoce, se pueden sintetizar y usar
sondas oligonucleótidas homólogas marcadas para identificar clones
codificadores de fitasa a partir de una genoteca obtenida a partir
del organismo en cuestión. De forma alternativa, una sonda de
oligonucleótidos marcada que contenga secuencias homólogas a un gen
de fitasa conocido podría usarse como sonda para identificar clones
codificadores de fitasa, usando condiciones de menor astringencia
para la hibridación y el lavado.
Otro método para identificar clones
codificadores de fitasa implicaría insertar fragmentos de ADN
genómico en un vector de expresión, tal como un un plásmido,
transformando las bacterias fitasa-negativas con la
biblioteca de ADN genómico resultante, y después depositar las
bacterias transformadas sobre agar, conteniendo éste un sustrato de
fitasa, permitiendo de ese modo identificar los clones que expresan
la fitasa.
De forma alternativa, la secuencia de ADN que
codifica la enzima puede prepararse sintéticamente mediante métodos
estándar establecidos, p. ej. el método de fosforamidita descrito
por S.L. Beaucage y M.H. Caruters (1981) o el método descrito por
Matthes et al. (1984). En el método de fosforamidita, los
oligonucleótidos son sintetizados, p. ej. en un sintetizador de ADN
automático, purificados, anillados, ligados y clonados en vectores
apropiados.
Finalmente, la secuencia de ADN puede ser de
origen mixto genómico y sintético, de origen mixto sintético y de
ADNc o de origen mixto genómico y de ADNc, lo cual se prepara
ligando fragmentos de origen mixto sintético, genómico o de ADNc
(siendo apropiados los fragmentos correspondientes a diferentes
partes de la secuencia completa de ADN) conforme a las técnicas
estándar. La secuencia de ADN también puede prepararse por reacción
en cadena de la polimerasa (PCR), usando cebadores específicos, por
ejemplo como se describe en US 4.683.202 o en R.K. Saiki et
al. (1988).
El ADN codificante de las variantes de fitasa se
puede preparar por métodos conocidos en la técnica, tales como la
mutagénesis dirigida. Una vez se ha aislado una secuencia de ADN
que codifica una fitasa modelo de interés, y se han identificado
sitios deseables para la mutación, se pueden introducir mutaciones
usando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos
contienen secuencias de nucleótidos que flanquean los sitios de
mutación deseados; los nucleótidos mutantes se insertan durante la
síntesis de oligonucleótidos. En un método específico se crea un
espacio monocatenario de ADN, el cual conecta la secuencia
codificante de fitasa, en un vector que lleva el gen codificador de
fitasa. Después, el nucleótido sintético que contiene la mutación
deseada se anilla hasta conseguir una porción homóloga del ADN
monocatenario. El espacio restante se llena entonces con ADN
polimerasa I (fragmento Klenow) y el constructo se liga usando T4
ligasa. Un ejemplo específico de este método se describe en
Morinaga et al. (1984). US 4.760.025 expone la introducción
de oligonucleótidos que codifican mutaciones múltiples mediante la
realización de alteraciones menores del casete. No obstante se
puede introducir una variedad incluso mayor de mutaciones en
cualquier momento mediante el método de Morinaga puesto que se
pueden introducir una multitud de oligonucleótidos de varias
longitudes.
Otro método para introducir mutaciones en
secuencias de ADN que codifican una fitasa modelo deseada se
describe en Nelson and Long (1989). Ello implica una generación de
3 fases de un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada, la
cual se introduce usando una cadena de ADN químicamente sintetizada
como uno de los cebadores en las reacciones de PCR. Del fragmento
generado por PCR se puede aislar un fragmento de ADN que lleva la
mutación mediante seccionamiento con endonucleasas de restricción y
reinsertar éste en un plásmido de expresión.
Otro método más para mutar secuencias de ADN que
codifiquen una fitasa modelo es la Mutagénesis Aleatoria. La
Mutagénesis Aleatoria se realiza de manera adecuada bien como
mutagénesis aleatoria localizada o en una región específica en al
menos tres partes del gen que traduce para la secuencia de
aminoácidos mostrada en cuestión, o dentro del gen entero.
La mutagénesis aleatoria de una secuencia de ADN
que codifica una fitasa modelo se puede realizar convenientemente
usando cualquier método conocido en la técnica.
En relación con lo expuesto arriba se describe
un método para generar una variante de una fitasa modelo, en el
cual la variante preferiblemente presenta características
modificadas como se describe abajo, y comprende:
(a) someter una secuencia de ADN que codifica la
fitasa modelo a una Mutagénesis Dirigida, o el método de Nelson y
Long para una mutagénesis de PCR o para una mutagénesis
aleatoria,
(b) expresar la secuencia mutada de ADN obtenida
en la fase (a) en una célula huésped, y
(c) seleccionar células huéspedes que expresan
una variante de fitasa, la cual tiene una propiedad alterada
relativa a la fitasa modelo.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se usa la Mutagénesis Aleatoria, la fase
(a) del método de la invención citado arriba se realiza
preferiblemente usando cebadores dopados.
Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria se puede
realizar usando un agente físico o mutagenizante químico adecuado,
usando un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de ADN
a la mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis aleatoria
se puede realizar usando cualquier combinación de estos agentes
mutagenizantes. El agente mutagenizante puede, p. ej., ser uno de
los que inducen transiciones, transversiones, inversiones,
aleatorizaciones, deleciones y/o inserciones.
Ejemplos de un agente mutagenizante físico o
químico adecuado para el presente objetivo incluyen irradiación
ultravioleta (UV), hidroxilamina,
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil
metano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y
análogos de nucleótidos. Cuando se usan tales agentes, la
mutagénesis se realiza normalmente mediante incubación de la
secuencia de ADN que codifica la enzima parental que debe ser
mutagenizada en presencia del agente mutagenizante elegido bajo
condiciones adecuadas para que ocurra la mutagénesis, y mediante la
selección de ADN mutado que tenga las propiedades deseadas.
Cuando la mutagénesis se realiza usando un
oligonucleótido, el oligonucleótido puede ser dopado o adicionado
con los tres nucleótidos no parentales durante la síntesis del
oligonucleótido en las posiciones que van a ser cambiadas. El
dopado o adicionado se pueden realizar con el fin de evitar codones
para aminoácidos indeseados. El oligonucleótido dopado o adicionado
se puede incorporar en el ADN que codifica la enzima de fitasa
mediante cualquier técnica publicada, usando p. ej. PCR, LCR o
cualquier ADN-polimerasa y ligasa como se crea
conveniente.
Preferiblemente, el dopado se realiza mediante
"dopado aleatorio constante", en el cual el porcentaje de tipo
salvaje y de mutación en cada posición está predefinido. Además, el
dopado puede ser dirigido hacia una preferencia para la
introducción de nucleótidos determinados, y de ese modo una
preferencia para la introducción de uno o más residuos de
aminoácidos específicos. El dopado se puede hacer, p. ej., para
permitir la introducción de un 90% de tipo salvaje y un 10% de
mutaciones en cada posición. Una consideración adicional en la
elección de un esquema de dopado se basa en limitaciones tanto
genéticas como de estructuras de proteína. El esquema de dopado se
puede hacer usando el programa DOPE, el cual, entre otras cosas,
evita de modo seguro la introducción de codones de parada.
Cuando se usa la mutagénesis generada por PCR,
bien un gen tratado o no tratado químicamente, el cual codifica una
fitasa modelo, está sometido a PCR bajo condiciones que aumentan la
no incorporación de nucleótidos (Deshler 1992; Leung et al.,
Technique, Vol.1, 1989, págs. 11-15).
Una cepa mutágena de E. coli (Fowler
et al., Molec. Gen. Genet., 133, 1974, págs.
179-191), S. cereviseae o cualquier otro
organismo microbiano se puede usar para la mutagénesis aleatoria
del ADN que codifica la fitasa modelo, p. ej., transformando un
plásmido que contenga la glicosilasa parental en la cepa mutágena,
haciendo crecer la cepa mutágena con el plásmido y aislando el
plásmido mutado de la cepa mutágena. El plásmido mutado puede ser
posteriormente transformado en el organismo de expresión.
La secuencia de ADN que se va a mutagenizar
puede estar convenientemente presente en una biblioteca genómica o
de ADNc obtenida a partir de organismo que expresa la fitasa
modelo. De forma alternativa, la secuencia de ADN puede estar
presente en un vector adecuado tal como un plásmido o un
bacteriófago, que como tal se puede incubar con el agente
mutagenizante o, de otro modo, exponer al mismo. El ADN que se va a
mutagenizar también puede estar presente en una célula huésped bien
siendo integrado en el genoma de dicha célula o bien estando
presente en un vector guardado en la célula. Finalmente, el ADN que
se va a mutagenizar puede estar en forma aislada. Se entenderá que
la secuencia de ADN que va a ser sometida a mutagénesis aleatoria
es preferiblemente una secuencia de ADNc o de ADN genómico.
En algunos casos puede ser conveniente
amplificar la secuencia mutada de ADN antes de realizar la fase de
expresión b) o la fase de selección c). Una amplificación de este
tipo se puede realizar conforme a métodos conocidos en la técnica.
El método actualmente preferido es el de amplificación generada por
PCR usando cebadores oligonucleótidos preparados en la base del ADN
o la secuencia de aminoácidos de la enzima parental.
Después de la incubación con o bajo exposición
al agente mutagenizante, el ADN mutado se expresa mediante cultivo
de una célula huésped adecuada, la cual lleva la secuencia de ADN,
bajo condiciones que permiten que la expresión tenga lugar. La
célula huésped usada para este propósito puede haber sido
transformada con la secuencia mutada de ADN, opcionalmente presente
en un vector, o haber portado la secuencia de ADN que codifica la
enzima madre durante el tratamiento de mutagénesis. Ejemplos de
células huéspedes adecuadas son los siguiente: bacterias gram
positivas tales como Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis,
Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus,
Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans,
Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus
megaterium, Bacillus thuringiensis, Streptomyces
lividans o Streptomyces murinus; y bacterias
gram-negativas tales como E. coli.
La secuencia mutada de ADN puede comprender
además una secuencia de ADN, la cual codifica funciones que
permiten la expresión de la secuencia mutada de ADN.
\newpage
La mutagénesis aleatoria puede ser
ventajosamente localizada para una parte de la fitasa modelo en
cuestión usando mutagénesis localizada aleatoria. Esto puede, p.
ej., ser ventajoso cuando diferentes regiones de la enzima se han
identificado como particularmente importantes para una propiedad
dada de la enzima, y cuando al modificarse se espera obtener una
variante con propiedades mejoradas. Tales regiones pueden
identificarse normalmente cuando la estructura terciaria de la
enzima parental se ha dilucidado y relacionado con la función de la
enzima.
La mutagénesis aleatoria localizada o de una
región específica se realiza convenientemente usando técnicas de
mutagénesis generada por PCR, como se ha descrito anteriormente, o
cualquier otra técnica adecuada conocida en la técnica. De forma
alternativa, la secuencia de ADN que codifica la parte de la
secuencia de ADN que va a ser modificada se puede aislar, p. ej.,
por inserción en un vector adecuado, y dicha parte puede ser
posteriormente sometida a mutagénesis usando cualquiera de los
métodos de mutagénesis mencionados anteriormente.
Para la mutagénesis aleatoria de una región
específica con vistas a modificar p. ej. la actividad específica de
una fitasa modelo, se pueden tomar apropiadamente como diana
posiciones de codón correspondientes a los siguientes residuos de
aminoácidos provenientes de las secuencias de aminoácidos expuestas
más adelante en la Fig. 1:
Residuos: 41-47,
68-80, 83-84,
115-118, 120-126, 128,
149-163, 184-185,
191-193, 198-201e,
202-203, 205, 235-236,
238-239, 242-243,
270-279, 285, 288, 332-343,
364-367, 369-375, 394.
Regiones: 41-47,
68-80, 120-128,
149-163, 270-279,
332-343, 364-375.
La mutagénesis aleatoria se puede realizar en
las siguientes fases:
- 1.
- Seleccionar regiones de interés para una modificación en la enzima parental
- 2.
- Decidir los sitios de mutación y los sitios de no mutación en la región seleccionada
- 3.
- Decidir qué tipo de mutaciones deberían realizarse, p. ej., con respecto a la estabilidad deseada y/o al rendimiento de la variante que se va a construir
- 4.
- Seleccionar mutaciones estructuralmente razonables
- 5.
- Ajustar los residuos seleccionados en la fase 3 teniendo en consideración la fase 4.
- 6.
- Analizar la distribución de nucleótidos usando un algoritmo de dopado adecuado.
- 7.
- Si es necesario, ajustar los residuos deseados a un realismo de códigos genéticos, p. ej. teniendo en cuenta las limitaciones que resultan del código genético, o p. ej. para evitar la introducción de codones de parada; el experto en la materia será consciente de que algunas combinaciones de codón no se pueden usar en la práctica y necesitarán ser adaptadas
- 8.
- Hacer cebadores
- 9.
- Realizar la mutagénesis aleatoria usando los cebadores
- 10.
- Seleccionar las variantes de fitasa resultantes mediante selección de las propiedades mejoradas deseadas.
Algoritmos de dopado adecuados para ser usados
en la fase 6 son conocidos en la técnica. Uno de estos algoritmos
está descrito por Tomandl, D. et al., 1997, Journal of
Computer-Aided Molecular Design
11:29-38. Otro algoritmo es el DOPE (Jensen, LJ.,
Andersen, KV., Svendsen, A., y Kretzschmar, T. (1998) Nucleic Acids
Research, 26: 697-702).
Una secuencia de ADN que codifica una fitasa
modelo o una variante de fitasa se puede expresar usando un vector
de expresión, un vector de expresión recombinante, el cual
normalmente incluye secuencias de control que codifican un
promotor, operador, sitio de unión al ribosoma, señal de iniciación
de la traducción, y, opcionalmente, un gen represor o varios genes
activadores.
El vector de expresión recombinante puede ser
cualquier vector que pueda ser convenientemente sometido a
procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector
dependerá frecuentemente de la célula huésped en la que se va a
introducir. De este modo, el vector puede ser un vector de
replicación autónoma, p. ej. un plásmido, un bacteriófago o un
elemento extra cromosómico. De forma alternativa, el vector puede
poseer la característica de, al ser introducido en una célula
huésped, integrarse éste en el genoma de la célula huésped y ser
replicado junto con el (los)cromosoma(s) en
el(los) que ha sido integrado.
En el vector, la secuencia de ADN debería estar
operativamente conectada a una secuencia del promotor adecuada. El
promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad
transcripcional en la célula huésped de elección y pueda ser
derivada de proteínas de genes que codifiquen proteínas tanto
homólogas como heterólogas a la célula huésped. Un ejemplo de
promotor adecuado para dirigir la transcripción de la secuencia de
ADN que codifica una variante de fitasa de la invención,
especialmente en un huésped bacteriano, es el promotor del operón
lac de E. coli. Para la transcripción en un huésped fúngico
son ejemplos de promotores útiles aquellos derivados del gen que
codifica la TAKA amilasa de A. oryzae.
El vector de expresión de la invención puede
comprender también un terminador de transcripción adecuado y, en
eucariotas, secuencias de poliadenilación operativamente conectadas
a la secuencia de ADN que codifica la variante de fitasa de la
invención. Las secuencias de terminación y poliadenilación pueden
derivar de manera adecuada de las mismas fuentes que el
promotor.
El vector puede comprender además una secuencia
de ADN que permita al vector replicarse en la célula huésped en
cuestión. Ejemplos de secuencias de este tipo son los orígenes de
replicación de los plásmidos pUC19; pACYC177; pUB110; pE194, pAMB1
y pIJ702.
El vector también puede comprender un marcador
seleccionable, p. ej. un gen cuyo producto complementa un defecto
en la célula huésped, como sucede con los genes dal de B.
subtilis o B. licheniformis, o uno que confiera
resistencia a los antibióticos, p. ej. resistencia a la ampicilina.
Además, el vector puede comprender marcadores de selección de
Aspergillus tales como amdS, argB, niaD y sC, o la selección puede
realizarse por cotransformación, p. ej. como se describe en WO
91/17243.
Los procedimientos usados para enlazar el
constructo de ADN de la invención que codifica una variante de
fitasa, el promotor, el terminador y otros elementos,
respectivamente, y para insertar estos en vectores adecuados que
contengan información necesaria para la replicación, son bien
conocidos por los expertos en la técnica (cf., por ejemplo,
Sambrook et al. (1989)).
La célula de la invención, tanto si comprende un
constructo de ADN como un vector de expresión de la invención tal
como se ha definido anteriormente, se usa ventajosamente como
célula huésped en la producción recombinante de una variante de
fitasa de la invención. La célula puede ser transformada
convenientemente con el constructo de ADN de la invención que
codifica la variante, integrando el constructo de ADN (en una o más
copias) en el cromosoma huésped. Esta integración está generalmente
considerada como una ventaja, ya que es probable que la secuencia
de ADN se mantenga de forma estable en la célula. La integración de
los constructos de ADN en el cromosoma huésped se puede realizar
según métodos convencionales, p. ej. por recombinación homóloga o
heteróloga. De forma alternativa, la célula puede ser transformada
con un vector de expresión tal como se ha descrito anteriormente en
relación con los diferentes tipos de células huéspedes.
Una molécula aislada de ADN o, de forma
alternativa, una "secuencia clonada de ADN", "un constructo
de ADN" "un segmento de ADN" o "una secuencia aislada de
ADN" se refiere a una molécula de ADN o secuencia que puede ser
clonada conforme a procedimientos de clonación estándar usados en
la ingeniería genética para recolocar el segmento de ADN desde su
ubicación natural a un sitio diferente donde éste será replicado. El
término se refiere generalmente a una secuencia de ácidos nucleicos
esencialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos, p.
ej., con al menos aproximadamente un 20% de pureza, preferiblemente
con al menos aproximadamente un 40% de pureza, más preferiblemente
con aproximadamente un 60% de pureza, incluso más preferiblemente
con aproximadamente un 80% de pureza, de la forma más preferible
con aproximadamente un 90% de pureza, e incluso de la forma más
preferible con aproximadamente un 95% de pureza, tal y como está
determinado por la electroforesis en gel de agarosa. Los
procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y
aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado que comprenda
la secuencia de ácidos nucleicos, que a su vez codifique el
polipéptido; la inserción del fragmento en una molécula de vector,
y la incorporación del vector recombinante en una célula huésped,
donde se replicarán múltiples copias o clones de la secuencia de
ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos puede ser de
origen genómico, de ADNc, de ARN, semisintético, sintético, o
cualquier combinación de los mismos.
El término "vector" se usa para incluir
términos/objetos de este tipo, como "constructos de ácidos
nucleicos", "constructos de ADN", "vectores de
expresión" o "vectores recombinantes".
El constructo de ácidos nucleicos comprende una
secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención
operativamente enlazada a una o más secuencias de control capaces
de dirigir la expresión de la secuencia codificante en una célula
huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de
control.
Un "constructo de ácido nucleico" se define
aquí como una molécula de ácido nucleico, ya sea única o
bicatenaria, que es aislada de un gen de origen natural o que ha
sido modificado para contener segmentos de ácido nucleico
combinados y yuxtapuestos de tal manera que de no ser así no
existiría en la naturaleza.
El término constructo de ácido nucleico puede
ser sinónimo del término casete de expresión cuando el constructo
de ácido nucleico contiene todas las secuencias de control
requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la
presente invención.
El término "secuencia codificante" como se
define aquí comprende principalmente una secuencia que es
transcrita en ARNm y traducida en un polipéptido de la presente
invención cuando se sitúa bajo control de las anteriormente
mencionadas secuencias de control. Los bordes de la secuencia
codificante son generalmente determinados por un codón ATG de
iniciación de la traducción en el 5'-término y un
codón de parada de la traducción en el 3'-término.
Una secuencia codificante puede incluir ADN, ADNc y secuencias de
ácidos nucleicos recombinantes, pero sin limitarse a éstos.
El término "secuencias de control" según se
define aquí incluye todos los componentes necesarios o ventajosos
para la expresión de la secuencia codificante de la secuencia de
ácidos nucleicos. Cada secuencia de control puede ser nativa o
extraña para la secuencia de ácido nucleico que codifica el
polipéptido. Este tipo de secuencias de control incluyen, pero no se
limitan a, una guía, una secuencia de poliadenilación, una
secuencia de propéptido, un promotor, una secuencia señal y un
terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de
control incluyen un promotor y señales de parada transcripcional y
traduccional. Las secuencias de control pueden ser provistas de
enlaces cuya finalidad es introducir sitios de restricción
específicos facilitando la ligadura de las secuencias de control
con la región de codificación de las secuencias de ácidos nucleicos
que codifican un polipéptido.
Una "célula huésped" o una "célula
huésped recombinante" abarca cualquier descendiente de una
célula madre no idéntica a la célula madre debido a mutaciones que
ocurren durante la replicación.
La célula es transformada preferiblemente con un
vector que comprenda una secuencia de ácidos nucleicos de la
invención seguida de la integración del vector en el cromosoma
huésped.
"Transformar" significa introducir un
vector que comprenda una secuencia de ácidos nucleicos de la
presente invención en una célula huésped de modo que el vector sea
mantenido como un integrante cromosómico o como un vector
extracromosómico que se autoreplica. La integración es generalmente
considerada como una ventaja, ya que la secuencia de ácidos
nucleicos será más probablemente mantenida de forma estable en la
célula. Una integración del vector en el cromosoma huésped puede
ocurrir por recombinación por homóloga o no homóloga, como se ha
descrito anteriormente.
La célula huésped puede ser un microorganismo
unicelular, p. ej., un procariota, o un microorganismo
pluricelular, p. ej., un eucariota. Ejemplos de célula eucariota
son una célula mamífera, una célula de insecto, una célula vegetal
o una célula fúngica. Las células mamíferas útiles incluyen células
de ovarios de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón
de cría de hámster (BHK), células COS, o cualquier número de otras
líneas celulares inmortalizadas disponibles, p. ej., de la
Colección Americana de Cultivos Tipo.
En una forma de realización preferida, la célula
huésped es una célula fúngica.
Las células micóticas pueden ser transformadas
por un proceso que implica formación de protoplastos,
transformación de los protoplastos, y regeneración de la pared
celular de una manera conocida per se.
La presente invención también se refiere a una
planta transgénica, a una parte de la planta, tal como una semilla
de planta, o una célula vegetal. También se describen composiciones
y usos tal planta o parte de la misma, especialmente su uso como
pienso o alimento o aditivos, a lo largo de las líneas del presente
uso y de las reivindicaciones para alimentos/piensos.
La planta transgénica puede ser dicotiledónea o
monocotiledónea, para abreviar una dicot o una monocot. Son de
interés primario las plantas que son componentes alimenticios
potenciales y las que contienen ácido fítico. Un nivel de ácido
fítico normal en componentes alimenticios es 0,1-100
g/kg, o más normalmente 0,5-50 g/kg, y la mayoría
normalmente 0,5-20 g/kg. Ejemplos de plantas
monocot son hierbas tales como poa de los prados (poa pratense,
Poa), hierbas forrajeras tales como festuca o lolium, hierba de
zonas templadas tal como agrostis, y cereales, p. ej. trigo, avena,
centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz.
Ejemplos de plantas dicot son legumbres, tales
como altramuces, guisantes, alubias y soja, y crucíferos (de la
familia Brassicaceae) tales como coliflor, aceite de semilla de
colza y el organismo modelo estrechamente relacionado
Arabidopsis thaliana.
Tal planta transgénica, etc., es capaz de
degradar su propio ácido fítico y, por consiguiente, la necesidad
de añadir enzimas de este tipo a alimento o alimentos que
comprendan este tipo de plantas se ve aliviada. Preferiblemente, la
planta o parte de la planta, p. ej. las semillas, son trituradas o
molidas, y posiblemente también mojadas antes de ser añadidas al
alimento o alimentos o antes el uso, p. ej. de la toma de los
mismos, con el propósito de adaptar la velocidad de degradación
enzimática al uso real.
Si se desea, la enzima producida de la planta
también puede recuperarse de la planta. En casos determinados la
recuperación de la planta será preferida con el propósito de
asegurar una formulación de calor estable en un proceso de
granulación potencial posterior.
Ejemplos de partes de la planta son tallos,
callos, hojas, raíces, frutas, semillas, tubérculos, etc. Pero
también se incluye en esta definición cualquier tejido vegetal.
Cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el
origen del tejido, se incluye en la definición de células vegetales
de arriba.
También están incluidos dentro del campo de la
invención los descendientes de plantas de este tipo, partes de la
planta y células vegetales.
El experto sabrá construir un constructo de
expresión de ADN para su inserción en la planta en cuestión,
prestando atención i.a. de si la enzima debería ser excretada en
una vía específica del tejido. Es relevante para esta evaluación la
estabilidad (estabilidad de pH, degradabilidad por proteasas
endógenas etc.) de la fitasa en los compartimientos de expresión de
la planta. Éste también será capaz de seleccionar secuencias
apropiadas reguladoras tales como secuencias del promotor y del
terminador, y secuencias señal o de tránsito si fuera necesario
(Tague et al, Plant, Phys., 86, 506, 1988).
La planta, parte de planta, etc., puede ser
transformada con este constructo de ADN usando cualquier método
conocido. Un ejemplo de método de este tipo es la transformación
mediante un vector vírico o bacteriano tal como especies
bacterianas del género Agrobacterium creadas genéticamente para
contener el gen que codifica la fitasa de la invención. También son
conocidos en la técnica métodos para introducir directamente el ADN
de fitasa en la célula vegetal o tejido vegetal, p. ej. la
microinyección y la electroporación (Gasser et al, Science,
244, 1293; Potrykus, Bio/Techn. 8, 535, 1990; Shimamoto et
al, Nature, 338, 274, 1989).
Después de la transformación se seleccionan los
transformantes usando cualquier método conocido por el experto,
después de lo cual éstos son regenerados en plantas completas.
Estas plantas, etc., al igual que sus
descendientes, llevan entonces el ADN codificador de fitasa como
parte de su equipamiento genético.
En general, se hace referencia en WO 9114782A y
en WO 9114772A.
La transferencia mediada de genes de
Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para
generar dicotiledóneas transgénicas (para revisión Hooykas &
Schilperoort, 1992. Plant Mol. Biol. 19: 15-38), no
obstante éste también se puede usar para transformar
monocotiledóneas. Debido a limitaciones variables del huésped
generalmente no es posible transformar monocotiledóneas con ayuda
de A. tumefaciens. Aquí se han de emplear otros métodos. El
método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas es el
bombardeo de partículas (partículas de oro o de tungsteno
microscópicas revestidas con el ADN transfomante) de callos
embrionarios o de embriones en estado de desarrollo (Christou,
1992. Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994. Curr.
Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al.,
1992. Bio/Technology 10: 667-674).
Además, otros sistemas para transportar ADN
libre hasta estas plantas, incluyendo los vectores víricos (Joshi
& Joshi, 1991. FEBS Left. 281: 1-8), la
transformación de protoplastos por medio de polietilenglicol o
electroporación (para revisión véase Potirkus, 1991. Annu. Girar.
Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205-225), la
microinyección de ADN en protoplastos de mesófilo (Crossway et
al., 1986. Mol. Gen. Genet. 202: 79-85), y la
macroinyección de ADN en brotes florales jóvenes de plantas de
cereales (de la Pena et al., 1987. Nature 325:
274-276) son métodos preferidos.
En general, el ADNc o gen que codifica la
variante de fitasa se coloca en un casete de expresión (p. ej.
Pietrzak et al., 1986, Nucleic Acids Res. 14:
5857-5868) que consiste en un promotor adecuado
activo en la planta diana y en un terminador adecuado (terminación
de transcripción). Este casete (que por supuesto incluye un
marcador de selección adecuado, ver abajo) se transformará en la
planta como tal en caso de monocotiledóneas por medio de bombardeo
de partículas . En caso de dicotiledóneas el casete de expresión se
coloca primero en un vector adecuado que suministra los bordes del
ADN-T y un marcador de selección adecuado que a su
vez se transforman en Agrobacterium tumefaciens. Las
dicotiledóneas se transformarán a través del Agrobacterium que
alberga el casete de expresión y el marcador de selección
flanqueado por ADN-T según los protocolos estándar
siguientes (p. ej. Akama et al., 1992. Plant Cell Reports
12: 7-11). La transferencia de ADN-T
de Agrobacterium a la célula vegetal se ha revisado recientemente
(Zupan & Zambriski, 1995. Plant Physiol. 107:
1041-1047). Los vectores para la transformación de
plantas por medio de Agrobacterium están disponibles a nivel
comercial o se pueden obtener de muchos laboratorios que construyan
este tipo de vectores (p. ej. Deblaere et al., 1985. Nucleic
Acids Res. 13: 4777-4788; para revisión véase Klee
et al., 1987. Annu. Rev. Plant Physiol. 38:
467-486).
Promotores de plantas disponibles: dependiendo
del proceso bajo manipulación se puede requerir una expresión
específica orgánica y/o celular así como un control apropiado del
desarrollo y medioambiental. Por ejemplo, es deseable expresar el
ADNc de fitasa en endospermo de maíz, etc. El promotor usado con
más frecuencia ha sido el promotor constitutivo 35S- CaMV (Franck
et al., 1980. Cell 21: 285-294). La expresión
será más o menos igual en toda la planta. Este promotor se ha usado
con éxito para manipular plantas resistentes a herbicidas y
patógenos (para revisión véase Stitt & Sonnewald, 1995. Annu.
Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46: 341-368).
Se ha informado sobre promotores orgánicos específicos para tejidos
sumidero de almacenamiento como semillas, tubérculos de patata y
frutas (Edwards & Coruzzi, 1990. Annu. Rev. Genet. 24:
275-303), y para tejidos sumidero metabólicos como
meristemas (Ito et al., 1994. Plant Mol. Biol. 24:
863-878).
El medio usado para cultivar las células
huéspedes transformadas puede ser cualquier medio convencional
adecuado para cultivar las células huéspedes en cuestión. La fitasa
expresada puede segregarse convenientemente en el medio de cultivo
y puede recuperarse del mismo mediante procedimientos bien
conocidos que incluyen la separación de las células del medio
mediante centrifugado o filtración, la precipitación de los
componentes proteínicos del medio mediante una sal, p. ej. sulfato
de amonio, seguido de procedimientos cromatográficos como
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, o
similares.
Las células huéspedes preferidas son una cepa de
Fusarium, Hansenula, Trichoderma o Aspergillus, en particular una
cepa de Fusarium graminearum, Fusarium venenatum,
Fusarium cerealis, Fusarium sp. con las características
identificativas del Fusarium ATCC 20334, como se describe más
adelante en PCT/US/95/07743; Hansenula polymorpha,
Triahoderma harzianum o Trichoderma reesei,
Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.
Referencias para la expresión en Hansenula
polymorpha: Gellissen, G., Piontek, M., Dahlems, U.,
Jenzelewski, V., Gavagan, J.E., DiCosimo, R., Anton, D.I. &
Janowicz, Z.A. (1996) Recombinant Hansenula polymorpha as a
biocatalyst: coexpression of the spinach glycolate oxidase (GO) and
the S. cerevisiae catalase T (CTT1) gene. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 46: 46-54.
Otros usos más específicos de las variantes de
fitasa aparecen en PCT/DK97/00568, en las últimas páginas de la
sección de la descripción detallada de la invención.
En una forma de realización preferida, la
variante de fitasa está esencialmente libre de otros polipéptidos
que no son de fitasa, p. ej., como mínimo tiene aproximadamente un
20% de pureza, preferiblemente al menos aproximadamente un 40% de
pureza, más preferiblemente aproximadamente un 60% de pureza,
incluso más preferiblemente aproximadamente un 80% de pureza, de la
forma más preferible aproximadamente un 90% de pureza, e incluso de
la forma más preferible aproximadamente un 95% de pureza, como está
determinado por SDS-PAGE. A veces se hace referencia
a tal polipéptido de forma alternativa como una fitasa
"purificada" y/o "aislada".
Un polipéptido de fitasa que comprende una
variante de fitasa, la cual a su vez incluye polipéptidos
fusionados o polipéptidos de fusión divisibles en los cuales se
fusiona otro polipéptido en el N-terminal o en el
C-terminal del polipéptido o fragmento del mismo.
Un polipéptido fusionado se produce por fusión de una secuencia de
ácidos nucleicos (o una parte de la misma) que codifica otro
polipéptido con una secuencia de ácidos nucleicos (o una parte de
la misma) que a su vez codifica una variante de fitasa. Las técnicas
para producir polipéptidos de fusión son conocidas en en la
técnica, e incluyen la ligadura de secuencias de que codifican los
polipéptidos de manera que forman un marco y que la expresión del
polipéptido fusionado está bajo el control del(los)
mismo(s) promotor(es) y terminador.
"Pienso" y "alimento",
respectivamente, significan cualquier dieta natural o artificial,
comida o similar o componentes de tales comidas destinadas o
adecuadas para ser comidas, tomadas, digeridas, por un animal y un
ser humano, respectivamente.
La variante de fitasa puede ejercer su efecto
in vitro o in vivo, es decir, antes de su toma o en
el estómago del individuo, respectivamente. También es posible una
acción combinada.
Una composición de fitasa según la invención
siempre comprende al menos una fitasa de la invención.
Generalmente, las composiciones de fitasa son
líquidas o secas.
Las composiciones líquidas no necesitan contener
más que la enzima fitasa, preferiblemente en una forma altamente
purificada. Normalmente, no obstante, también se añade un
estabilizador como puede ser glicerol, sorbitol o mono
propilenglicol. La composición líquida también puede comprender
otros aditivos tales como sales, azúcares, conservantes, agentes de
ajuste de pH, proteínas, fitato (un sustrato de fitasa). Las
composiciones líquidas típicas son mezclas acuosas o basadas en
aceite. Las composiciones líquidas pueden ser añadidas a uno
alimento o pienso después de una granulación opcional de las
mismas.
Las composiciones secas pueden ser atomizadas,
en cuyo caso la composición no necesita contener nada más que la
enzima en una forma seca. Normalmente, no obstante, las
composiciones secas se denominan granuladas cuando pueden mezclarse
fácilmente con p. ej. componentes alimentarios o de piensos, o más
preferiblemente, forman un componente de una premezcla. El tamaño
de partícula de los granulados enzimáticos es preferiblemente
compatible con los de los otros componentes de la mezcla. Esto
proporciona un medio seguro y conveniente para incorporar enzimas
p. ej. en pienso.
Los granulados de aglomeración se preparan
usando una técnica de aglomeración en un mezclador de alta cizalla
(p. ej. un Lödige) durante la cual un material de relleno y la
enzima son coaglomerados para formar gránulos. Los granulados de
absorción se preparan teniendo núcleos de un material portador para
absorber/ser revestidos por la enzima.
Materiales de relleno típicos son sales tales
como sulfato disodio. Otros productos de relleno son caolín, talco,
silicato alumínico de magnesio y fibras de celulosa. Opcionalmente,
aglutinantes tales como dextrinas también se incluyen en granulados
de aglomeración.
Materiales portadores típicos son almidón, p.
ej. en forma de mandioca, maíz, patata, arroz y trigo. También se
pueden usar sales.
Opcionalmente, los granulados son revestidos con
una mezcla de revestimiento. Este tipo de mezclas comprenden
agentes de revestimiento, preferiblemente agentes de revestimiento
hidrofóbicos tales como aceite de palma hidrogenado y sebo bovino,
y si se desea otros aditivos, tales como carbonato cálcico o
caolín.
Adicionalmente, las composiciones de fitasa
pueden contener otros sustituyentes tales como agentes colorantes,
compuestos aromáticos, estabilizadores, vitaminas, minerales, otras
enzimas enriquecedoras de piensos o de alimentos, es decir enzimas
que enriquecen las propiedades nutritivas del pienso/alimento, etc.
Esto es así en particular para las así denominadas premezclas.
Un "aditivo de pienso o de alimento" es un
compuesto esencialmente puro o una composición de varios
componentes destinada a o adecuada para ser añadida a un alimento o
pienso. En particular es una sustancia que mediante su uso
determinado se está convirtiendo en un componente de un producto
alimentario o de pienso o afecta a cualquier característica de un
producto alimentario o de pienso. Está compuesto según las
indicaciones para las composiciones de fitasa que se dan arriba. Un
aditivo típico normalmente comprende uno o más compuestos tales
como vitaminas, minerales o enzimas enriquecedoras de piensos y
portadores y/o excipientes adecuados.
En una forma de realización preferida, la
composición de fitasa de la invención comprende adicionalmente una
cantidad eficaz de una o más enzimas enriquecedoras de piensos, en
particular enzimas enriquecedoras de piensos seleccionadas del
grupo que consiste en \alpha-galactosidasas,
\beta-galactosidasas, en particular lactasas;
otras fitasas, \beta-glucanasas, en particular
endo-\beta-1,4-glucanasas
y
endo-\beta-1,3(4)-glucanasas;
celulasas, xilosidasas, galactanasas, en particular
arabinogalactano
endo-1.4-\beta-galactosidasas
y arabinogalactano
endo-1,3-\beta-galactosidasas;
endoglucanasas, en particular
endo-1,2-\beta-glucanasa;
endo-1,3-\alpha-glucanasa,
y
endo-1,3-\beta-glucanase,
enzimas degradantes de pectina, en particular pectinasas,
pectinesterasas, pectina liasas, poligalacturonasas, arabinanasas,
ramnogalacturonasas, ramnogalacturonano acetil esterasas,
ramnogalacturonano-\alpha-ramnosidasa,
pectato liasas, y \alpha-galacturonisidasas,
mananasas, \beta-manosidasas, manano acetil
esterasas, xilano acetil esterasas, proteasas, xilanasas,
arabinoxilanasas y enzimas lipolíticas tales como lipasas,
fosfolipasas y cutinasas.
El aditivo de pienso se suplementa antes o de
forma simultanea con la dieta al animal
mono-gástrico. Preferiblemente, el aditivo de pienso
se suplementa simultáneamente con la dieta al animal
mono-gástrico . En una forma de realización más
preferida, el aditivo de pienso se añade a la dieta en forma de un
granulado o de un líquido estabilizado.
Una cantidad eficaz de fitasa en un alimento o
pienso es a partir de aproximadamente 10-20.000;
preferiblemente a partir de aproximadamente 10 a 15.000, más
preferiblemente desde aproximadamente 10 a 10.000, en particular
desde aproximadamente 100 a 5.000, especialmente desde
aproximadamente 100 hasta aproximadamente 2.000 FYT/kg de pienso o
alimento.
Ejemplos de otros usos específicos de la fitasa
de la invención son en tratamientos de soja y en la producción de
inositol o derivados de los mismos.
La invención también se refiere a un método para
reducir los niveles de fitato en abono animal, en donde el animal
se alimenta con un alimento que comprende una cantidad eficaz de la
fitasa de la invención.
Esta invención también comprende el uso de una
fitasa de la invención durante la preparación de un alimento o
preparaciones de alimentos o aditivos, es decir que la fitasa
ejerce su actividad fitasa únicamente durante la producción y no es
activa en el alimento o producto alimenticio final. Este aspecto es
pertinente por ejemplo a la hora de hacer y cocer la masa.
Lo que se describe aquí es una variante de
fitasa que, cuando se alinea según la Fig. 1, se modifica en
comparación con una fitasa modelo en al menos una de las siguientes
posiciones, usando la numeración de posición correspondiente a
P. lycii: 24; 27; 31; 33; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47;
49; 51; 56; 58; 59; 61; 62; 68; 69; 70; 71; 72; 73; 74; 75; 76; 77;
78; 79; 80; 81; 82; 83; 84; 88; 90; 102; 115; 116; 117; 118; 119;
120; 121; 122; 123; 124; 125; 126; 127; 128; 132; 143; 148; 149;
150; 151; 152; 153; 154; 155; 156; 157; 158; 159; 160; 161; 162;
163; 170f; 170g; 171; 172; 173; 184; 185; 186; 187; 187a; . 190;
191; 192; 193; 194; 195; 198; 199; 200; 201; 201a; 201b; 201c; 201d;
201e; 201f; 202; 203; 203a; 204; 205; 211; 215; 220; 223; 228; 232;
233; 234; 235; 236; 237; 238; 239; 242; 243; 244; 246; 251e; 253;
256; 260; 264; 265; 267; 270; 271; 272; 273; 274; 275; 276; 277;
278; 279; 280; 283; 285; 287; 288; 292; 293; 302; 304; 332; 333;
334; 335; 336; 337; 338; 339; 340; 341; 342; 343; 348; 349; 352;
360; 362; 364; 365; 366; 367; 368; 369; 370; 371; 372; 373; 374;
375; 376; 383k; 387; 393; 394; 396; 404; 409; 411; 412; 413; 417;
421; 431.
De estas variantes esperamos características
modificadas, preferiblemente características de actividad
modificadas. De hecho, para diferentes variantes ya se han mostrado
tales características modificadas (ver la parte experimental). Como
se ha citado arriba, "modificada" significa en comparación con
la fitasa modelo. "Características de actividad modificadas"
significa modificadas en al menos una actividad fitasa relacionada
al respecto, como (lista no exclusiva): estabilidad de pH,
estabilidad de temperatura, perfil de pH, perfil de temperatura,
actividad específica (en particular en relación con el pH y la
temperatura), especificidad de sustrato, modelo de ruptura de
sustrato, unión de sustrato, especificidad de posición, la velocidad
y el nivel de liberación de fosfato de maíz, velocidad de reacción,
nivel de degradación de fitato), nivel final de fosfato liberado
alcanzado.
\newpage
Las características de velocidad modificadas
preferidas son actividad específica modificada,
preferiblemente
aumentada, y preferiblemente aumentada a un pH de 3, 4, 5, o 6; perfil de pH o de temperatura modificados; y/o termoestabilidad modificada, preferiblemente aumentada, p. ej. de una temperatura de fusión aumentada como se ha medido usando DSC.
aumentada, y preferiblemente aumentada a un pH de 3, 4, 5, o 6; perfil de pH o de temperatura modificados; y/o termoestabilidad modificada, preferiblemente aumentada, p. ej. de una temperatura de fusión aumentada como se ha medido usando DSC.
Variantes de fitasa preferidas son: variantes de
fitasa que, cuando se alinean según la Fig. 1, son modificadas en
comparación con una fitasa modelo en al menos una de las siguientes
posiciones, usando la numeración de posición correspondiente a
P. lycii: 43; 44; 47; 51; 58; 62; 78; 80; 83; 88; 90; 102;
143; 148; 153; 154; 186; 187a; 195; 198; 201e; 204; 205; 211; 215;
220; 242; 244; 251e; 260; 264; 265; 267; 270; 273; 278; 302; 336;
337; 339; 352; 365; 373; 383k; 404; 417.
Las siguientes variantes de A. fumigatus
constituyen un subgrupo: Q43L; Q270L; G273D,K; N336S; A205E; Y278H;
Q43L+Q270L; Q43L+Q270L+G273D; Q43L+Q270L+G273D+N336S; G273K+A205E;
G273K+A205E+
Y278H (véase EP 0897010).
Y278H (véase EP 0897010).
Generalmente, las variantes se pueden deducir o
identificar del siguiente modo: mirando en el alineamiento según la
Fig. 1, comparando dos secuencias, una de las cuales es una fitasa
modelo con propiedades mejoradas; identificando diferencias de
aminoácidos en posiciones/áreas pertinentes, y transfiriendo
(substituyendo con) el aminoácido en una posición pertinente del
modelo a la otra secuencia de fitasa.
La invención también expone un proceso para
preparar una variante de fitasa que incluye el método citado
arriba, y además incluye la deducción y síntesis de la secuencia de
ADN correspondiente, la transformación de una célula huésped, el
cultivo de la célula huésped y la recuperación de la variante de
fitasa.
Posiciones/áreas pertinentes incluyen aquellas
mencionadas abajo en relación con características de actividad de
fitasa importantes tales como actividad específica,
termoestabilidad, actividad/estabilidad de pH.
La presente invención también expone variantes
de fitasa (diversas según una fitasa modelo tal y como se define
aquí) que es obtenible, preferiblemente obtenida, mediante el
proceso perfilado arriba y que se espera que muestren una
característica/propiedad modificada, preferiblemente que muestren
este tipo de característica modificada, p. ej. una actividad
específica mejorada.
Al menos las fitasas modelo de basidiomiceto
P. lycii y T. pubescens muestran una alta actividad
específica (como se ha determinado usando aquí el método de Ejemplo
2).
Este es un ejemplo de una propiedad deseada que
se puede transferir a otras fitasas, p. ej. las otras fitasas
catalogadas en la Fig. 1, en particular al A. pediades y a
las fitasas de ascomiceto tales como A. fumigatus, A.
ficuum, consphyA, por un proceso de deducción como el que se ha
mencionado arriba.
Por lo tanto se espera una actividad específica
modificada, en particular una actividad específica mejorada, en
particular con un pH alto y/o una temperatura alta, de las
variantes que han sido modificadas en áreas pertinentes, es decir,
(i) en los residuos aminoácidos que apuntan a la hendidura del
sitio activo; o (ii) en los residuos aminoácidos en la periferia de
estos residuos de sitio activo. Preferiblemente, la periferia se
refiere a 10\ring{A} de los residuos de sitio activo.
Se pueden identificar regiones del sitio activo
del fichero pdb 1IHP (Brookhaven Database entry of 18.03.98 re
1IHP, Structure of Phosphomonoesterase, D. Kostrewa; o como está
publicado en Nature Structural Biology, 4, 1997, pgs.
185-190) usando el programa INSIGHTII del Molecular
Simulations MSI, San Diego, California, y usando el comando de
subconjunto, una "estructura de sitio activo" se puede definir
comprendiendo aquellos residuos aminoácidos que yacen cerca de los
residuos catalíticos, definidos como H59, D339 y R58 en fitasa de
A. ficuum (que corresponden a los números de Peniophora H71,
D335 y R70, respectivamente). Una "cubierta de sitio activo
(10\ring{A})" comprende aquellos residuos que yacen dentro de
los 10\ring{A} de los residuos catalíticos de arriba.
Los residuos dentro de los 10\ring{A} de H71 y
D335 son los siguientes (usando números de Peniophora):
41-47, 68-77,
115-118, 120-126, 128,
149-163, 185, 191-193, 199, 243,
270-271, 273-275,
277-279, 288, 332-343,
364-367, 369-375, 394 ("la
cubierta del sitio activo (10\ring{A})").
Preferiblemente, para definir una "cubierta de
unión de sustratos" también puede decirse que comprende aquellos
residuos que están muy próximos al sitio de unión de sustratos y
que en consecuencia puede esperarse que esté en contacto con el
sustrato.
Esta información se puede deducir como se ha
descrito anteriormente, acoplando un análogo de azúcar a fitina en
la estructura del sitio activo (los residuos constituyen la
superficie del sitio activo). Si un azúcar sin grupos fosfato se
acopla en la hendidura del sitio activo, p. ej.
alfa-D-Glucosa (conformación en
forma de silla, estructura proporcionada por el programa
INSIGHTII), usando una distancia fija como se muestra abajo, los
residuos que apuntan hacia la hendidura del sitio activo se pueden
extraer usando el comando de subconjunto y usando una distancia de
10\ring{A} desde el análogo de sustrato. De forma alternativa, el
compuesto inositol-1,4,5-trifosfato
(archivo 1djx.
Inositol-1,4,5-trifosfato de la base
de datos Brookhaven) puede acoplarse en la hendidura del sitio
activo. Estos compuesto y glucosa, no obstante, son más o menos
superponibles.
Las distancias en \ring{A}ngstrom (\ring{A})
son: del átomo de oxigeno en la posición
alfa-D-glucosa a
- átomo ND1 de H59:
- 5.84
- átomo NH2 de R58:
- 6.77
- átomo NH2 de R142:
- 5.09
- átomo ND2 de N340:
- 3.00
- átomo ND1 de H59:
- 7.76
- átomo NH2 de R58:
- 8.58.
(los números de Peniophora de los
residuos de arriba son: H71, R70, R155, N336, H71 y R70,
respectivamente).
\vskip1.000000\baselineskip
En este sentido, los residuos en contacto con
los sustratos se identifican del siguiente modo (números de
Peniophora): 43-44; 70-80;
83-84; 115; 153; 155-156; 184;
191-192; 198-202; 205; 235; 238;
242; 270; 272-273; 275-277;
332-336; 338; 369; 371 ("la estructura de unión al
sustrato (10\ring{A})").
En las variantes que son modificadas en una o
más de (1) la cubierta del sitio activo o (2) la cubierta de unión
de sustratos, se prevé con mucha seguridad encontrar una actividad
específica modificada. Esto conduce al siguiente agrupamiento de
conexiones posicionales (todavía números de Peniophora y cubiertas
de 10\ring{A}): 41-47, 68-80,
83-84, 115-118,
120-126, 128, 149-163,
184-185, 191-193, 198- 201e,
202-203, 205, 235-236,
238-239, 242-243,
270-279, 285, 288, 332-343,
364-367, 369-375, 394.
Preferiblemente, la cubierta del sitio activo y
la cubierta de unión de sustratos se definen como se ha descrito
anteriormente usando las fitasas modelo de basidiomiceto de la Fig.
1, siendo la fitasa de Peniophora un modelo preferido. Es posible
una deducción de las variantes correspondientes de otras fitasas
modelo usando la alineación de la Fig.
Preferiblemente, una distancia de 5A se usa en
el comando de subconjunto, definiendo así un sitio activo y
cubiertas de unión de sustratos de un tamaño más limitado, p. ej.
una cubierta del sitio activo que comprende los residuos
43-44, 69-74, 117, 125,
155-156, 159, 274, 332-340,
370-374 (5\ring{A} desde H71 y D335), "cubierta
del sitio activo (5\ring{A})".
Generalmente la cubierta de centro activo y las
regiones de la cubierta de unión de sustratos forman la base para
seleccionar regiones de mutagénesis aleatorias. Ejemplos de
regiones preferidas de mutagénesis aleatoria son las
regiones 69-74,
332-340, 370-374, dopado para ser
añadido (un enfoque 5A);
\hskip0.2cmy las
regiones 57-62,
142-146, 337-343, dopado para ser
añadido (un enfoque 10\ring{A}).
\vskip1.000000\baselineskip
Se contempla actualmente que cualquier
modificación en cualquiera de estas posiciones llevará a una fitasa
de características modificadas, p. ej. de una actividad específica
modificada.
La expresión de arriba "cualquier modificación
en cualquiera de las posiciones" se considera completamente
equivalente para catalogar cada posición y cada sustitución, p. ej.
del siguiente modo para el subgrupo de arriba
41-47:
41A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R,
S, T, V, W, Y;
42A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R,
S, T, V, W, Y;
43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R,
S, T, V, W, Y;
44A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R,
S, T, V, W, Y;
45A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R,
S, T, V, W, Y;
46A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R,
S, T, V, W, Y;
47A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R,
S, T, V, W, Y.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prevé una actividad específica modificada en
particular de las siguientes variantes:
42S,G; 43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P,
Q, R, S, T, V, W, Y; 45D,S; 47Y,F; 51E,A; 75W,F; 785, D; 79G; 80K,
A; 83I, Q; 84Q,V; 116S; 118V,L; 119E; 120L; 122A; 123N,T; 125S;
126H,S; 127Q,E; 128A, T; 151A, S; 152G; 153D, Y; 154Q,D,G; 157V;
158D, A; 159T; 160A, S; 161T,N; 162N; 163W; 184Q,S; 186A,E; 198A,N;
200G,V; 201D; deleciones de uno o más de 201a, 201b, 201c, 201d,
201e, 201f - preferiblemente todos; 202S; 205Q,E; 235Y,L; 238L,M;
242P; 270Y,A,L; 271D; 273D,K; 275F,Y; 278T,H; 332F; 336S; 337T,Q;
339V; 340P, A; 343A, S; 364W,F; 365V,L; 366D,V; 367K; 368K; 369I,
L; 370V; 373S; 374A; 375H; 376M; 393V.
\vskip1.000000\baselineskip
Son variantes particularmente preferidas las
siguientes: 78S; 79G; 80A; 83I,Q; 84Q,V; 198A,N; 200G,V; 201D;
deleciones en uno o más de 201a, 201b, 201c, 201d, 201e, 201f,
preferiblemente todas las deleciones; 202S; 205Q, E; 235Y, L;
238L,M; 242P, 273D; 275F, Y.
Otras variantes particularmente preferidas son
las siguientes: 3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T,
V, W, Y; en particular 43M,P; 75W, F; 80K; 153D; 184Q,S; 270Y, A;
332F; 369I, L.
Las variantes siguientes son especialmente
preferidas: 43L,G,N,V,A,I,T; 78D; 153Y; 154G; 270L; 273D,K. También
son especialmente preferidas las variantes dobles y triples
(43L/270L); (43L/270L/273D); (43L/78D) y (43L/
153Y/154G). Otras variantes preferidas son 205E; 278H; 336S.
153Y/154G). Otras variantes preferidas son 205E; 278H; 336S.
Estas variantes únicas, dobles y triples
especialmente preferidas son preferiblemente variantes de fitasas
modelo que pueden ser alineadas según la Fig. 1, en particular
variantes de las fitasas modelo específicas catalogadas en la Fig.
1.
ConsphyA es al menos conocida por tener una alta
termoestabilidad. Además, la termoestabilidad de P. lycii es
más bien alta.
Este es un ejemplo de una propiedad deseada que
se puede transferir a otras fitasas, p. ej. las otras fitasas
catalogadas en la Fig. 1, en particular a las fitasas de
basidiomiceto tales como P. lycii y A. pediades,
mediante un proceso de deducción como el ya mencionado arriba.
Con estos antecedentes se prevé una
termoestabilidad modificada, en particular una termoestabilidad
mejorada, de las siguientes variantes:
39H,S; 40L,N; 43P; 47Y,F; 49P; 51E,A; 56P; 58D;
61R; 62V; 80K; 83A; 84Y; 172P; 184P; 195T; 198A; 204V; 211L; 223D;
236Y; 242P; 246V; 253P; 264R; 265Q; 280A, P; 283P; 287A; 292F,Y;
293A; 302R; 304P; 337S; 348Y; 387P; 396R; 409R; 411K; 412R; 417E;
421F,Y.
\vskip1.000000\baselineskip
Son particularmente preferidas las siguientes
variantes de termoestabilidad modificada: 39S; 40N; 47Y,F; 51A;
83A; 195T; 204V; 211L; 242P; 265A.
Otras variantes de termoestabilidad modificada
son las siguientes: 42G; 43T,L,G; 44N; 58K,A; 59G; 62I; 69Q; 75F;
78D; 79G; 80A; 81A, G; 82T; 83K,R; 84I; 88I; 90R, A; 102Y; 115N;
118V; 122A; 123Q,N; 125M,S; 126V,S; 127N,Q; 128S, A; 143N,K; 148V,
I; 154S; 158D; 170fH; 170gA; 171T,N; 172N; 173W, 184S; 186A; 187A;
187aS; 193S; 195V, L; 198V; 201E; 201eT; 202A, 203aT; 204A; 211V,
215P, A; 220L,N; 223H; 228N; 232T; 322E; 235T; 236N; 242S; 244D;
251eQ, E; 256D; 264I; 260A,H; 265A; 267D; 270G; 271D; 273K,D;
278T,H; 287T; 293V; 302H; 337T,G; 338I; 339V,I; 340A; 352K; 365A, S;
366S; 367A; 369L; 373S, A; 374S; 376M; 383kE, Q; 404G, A; 411T;
417R; 431E.
Otros conceptos, que pueden ser previstos para
impartir una termoestabilidad mejorada a una fitasa, considerando
la estructura 1IHP previamente mencionada y transfiriendo a través
de un alineamiento según la Fig. 1 como se perfila aquí, son los
siguientes:
(A) Introducir residuos de prolina en posiciones
espaciales donde se satisfacen los ángulos diédricos especiales de
la prolina y no se impide la red de unión de hidrógeno ni se
observan conflictos estéricos.
(B) Llenar agujeros: mediante sustitución por
residuos mayores en cavidades internas se puede obtener
frecuentemente una mejora en la estabilidad.
(C) Puente de cistina: los puentes de cistina
harán frecuentemente más rígidas las proteínas y aumentarán la
energía de desdoblamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Otras variantes de las cuales se prevé una
termoestabilidad modificada según estos conceptos de (A) a (C) son:
27P, 31Y, 132F, 132I, 132L, 184P, 186P, 190P, 280P, 343F, 343I,
343L, 349P, 362P y (33C y 24C).
Concepto (A): 27P, 184P, 186P, 190P, 349P,
362P.
Concepto (B): 343F, I, L; 31Y; 132F,I,L;
273F.
Concepto (C): 33C/24C.
\vskip1.000000\baselineskip
Actividad o estabilidad del pH modificada,
preferiblemente estabilidad, en particular a un pH bajo, en
particular mejorado, es otra propiedad deseada que se puede
transferir mediante alineamiento según la Fig. 1 y transferencia
desde modelos con perfiles de pH mejorados a otras fitasas, como se
perfila arriba.
Otros conceptos, los cuales pueden preverse para
impartir una estabilidad mejorada a una fitasa a un pH bajo,
considerando la estructura de 1 IHP previamente mencionada y
transfiriendo a través de una alineación según la Fig. 1 como se
perfila aquí, son los siguientes:
(D) Cargas de superficie: mejor distribución a
un bajo pH para evitar agrupaciones de negativo o positivo, y para
evitar que los residuos con la misma carga se acerquen
demasiado.
(E) Prevenir la desamidación: superficie
expuesta Q o N en contacto cercano a residuos negativamente
cargados.
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Se prevé que las variantes de fitasa que han
mejorado su estabilidad/actividad de pH a bajo pH sean: 39H; 39Q;
80A; 203R; 271N; 51R; 154S; 185S; 194S; 194T; 288L; 288I; 288F;
360R; 173Q,S; 204Q,S; 303K,S; 81Q,E.
Concepto (D): 203R, 271N, 51R, 185S, 360R; 173Q,
S; 204Q,S; 303K,S; 81Q, E.
Concepto (E): 154S; 194S, T; 288L, I, F.
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Una fitasa modelo preferida para estos conceptos
de (D) y (E) es P. lycii.
Se ha probado experimentalmente que tiene un pH
óptimo rebajado: la variante 80A de fitasas de ascomiceto, en
particular de A. fumigatus y consphyA.
Son variantes únicas, dobles y triples
especialmente preferidas 43L; (43L/270L) y (43L/270L/273D). Estas
variantes tienen un perfil de pH cambiado. Estas son
preferiblemente variantes de las fitasas modelo específicas
catalogadas en la Fig. 1.
Para todas las variantes preferidas catalogadas
arriba:
la estabilidad se modifica preferiblemente a
alta temperatura, es decir, en el rango de temperatura
50-100ºC, en particular 60-90ºC, más
preferiblemente en el rango 70-90ºC;
la actividad se modifica preferiblemente en un
rango de temperatura pertinente para el uso en el sistema
gastro-intestinal de animales, p. ej.
30-40ºC, más preferiblemente
32-38ºC, y de la forma más preferible en un rango de
35-38ºC; la estabilidad se modifica preferiblemente
a bajo pH, es decir. en el rango de pH 1.5-7,
preferiblemente 2-6, más preferiblemente
3-5;
la actividad se modifica preferiblemente en el
rango de pH 1.5-5.5, más preferiblemente a un pH de
2.5-4.5, y más preferiblemente
3-5.
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Unas pruebas para características de fitasa
modificadas, como las mencionadas arriba, se conocen bien en la
técnica y cualquier prueba de este tipo se puede utilizar para
comparar el rendimiento de las variantes de fitasa con los modelos
de fitasa.
Una prueba preferida para actividad específica
se da en el Ejemplo 2. Las pruebas preferidas para el pH y la
actividad y estabilidad de la temperatura se dan en el ejemplo 3.
Una prueba incluso más preferida para la termoestabilidad es el
método DSC del Ejemplo 4.
En WO 98/28409 también se exponen pruebas para
otros parámetros diferentes, tales como la especificidad de
posición. Todas las pruebas de WO 98/28409 son pruebas
preferidas.
Generalmente, por supuesto todas estas pruebas
se pueden conducir a valores y temperaturas de pH deseados.
De forma análoga se pueden deducir fácilmente
otras variantes preferidas basadas en las ocho fitasas modelo
restantes especialmente descritas combinando las modificaciones
sugeridas con cada una de las secuencias correspondientes de la Fig.
1. Estas variantes preferidas se deducen fácilmente, es decir, lo
siguiente:
Las variantes de una fitasa modelo derivada de
Paxillus, preferiblemente Paxillus involutus,
preferiblemente derivada de la cepa CBS 100231, preferiblemente
variantes de P. involtus-A1, cuya secuencia se muestra en la
Fig. 2, comprendiendo dichas variantes al menos una de las
siguientes modificaciones:
() 24C; T27P; F31Y; 133C; R39H,S,Q; N4OL;
S42G;
P43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S,
T, V, W, Y; Y44N; S45D; Y47F; A51E, R; A58D; K; Q61R; 162V; F75W;
S78D; A80K; T81Q, E, G, A; R83A, I, Q, K; 184Y, Q, V; L88I; K90R,
A; F102Y; S115N; D116S; V118L; P119E; F120L; A123N,T,Q; S125M;
F126H,S,V; D127Q,E,N; A128T,S; A132F, I, L; 1148V; D151A, S; S153D,
Y; D154Q,S, G; D158A; S159T; A160S; T161N; ()170fH; () 170gA;
S171N; H172P; N173Q, S; P184Q, S; Q185S; T186A,E,P; G187A; ()187aS;
T190P,A; D193S; N194S,T; M195T,V,L; A198N,V; G200V; D201E; ()201eT;
S202A; D203R,K,S; P203aV,T; Q204E, S, A, V; V205E; V211L; S215A, I;
L220N; A223D, H; D233E; F235Y,L,T; N236Y; L237F; V238L,M; A242P,S;
M244D; () 251eE,Q; D253P; T256D; P260A,H; E264R, I; A265Q; A267D;
G270Y, A, L; D271N; D273K; F275Y; T278H; Y280A,P; E283P; V287A, T;
Q288L, I, F; Y292F; V293A; N302R,H; A304P; N336S; L337T,Q,S,G; M
338I; V339I; A340P; S343A, F, I, L; F348Y; R349P; A352K; P360R;
R362P; W364F; R365V, L, A, S; T366D,V,S; S367K, A; S368K; L369I;
S373A; G374A,S; R375H; ()383kQ,E; T387P; Q396R; G404A; L409R;
T411K; L412R; E417R; F421Y.
\vskip1.000000\baselineskip
Variantes de una fitasa modelo derivada de una
especie del género Paxillus, preferiblemente de la especie
Paxillus involutus, preferiblemente derivada de la cepa CBS
100231, preferiblemente variantes de P. involtus-A2, cuya
secuencia se muestra en la Fig. 3, comprendiendo dichas variantes al
menos una de las siguientes modificaciones:
P24C; 127P; F31Y; I33C; R39H,S,Q; N4OL;
S42G;
P43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S,
T, V, W, Y; Y44N; S45D; Y47F; A51E,R; A58D, K; E61R; 162V; F75W;
S78D; A80K; A81Q, E, G; R83A, I, Q, R, K; I84Y, Q, V; L881; K90R,A;
F102Y; S115N; D116S; V118L; P119E; F120L; A123N,T,Q; S125M;
F126H,S,V; D127Q,E,N; A128T,S; V132F, I, L; D143N; I148V; D151A, S;
S153D,Y; D154Q, S, G; D158A; A160S; T161N; ()170fH; ()170gA; S171N;
R172P; N173Q,S; P184Q,S; Q185S; T186A, E, P; G187A; ()187aS;
T190P,A; D193S; N194S,T; M195T,V,L; A198N,V; G200V; E201D; ()201eT;
S202A; D203R,K,S; P203aV,T; Q204E,S,A,V; V205E; S211L,V; S215A, P;
L220N; A223D,H; A232T; F235Y, L, T; N236Y; L237F; V238L,M; P242S;
M244D; () 251eE, Q; D253P; T256D; P260A,H; E264R, I; A265Q; A267D;
G270Y, A, L; D271N; D273K; F275Y; T278H; Y280A,P; A283P; V287A, T;
Q288L, I, F; Y292F; I293A, V; N302R,H; A304P; N336S; L337T, Q, S, G;
M338I; V339I; 340P,A; A343S,F,I,L; F348Y; R349P; A352K; P360R;
R362P; W364F; L365V, A, S; T366D,V,S; S367K, A; S368K; V369I, L;
S373A; R375H; ()383kQ,E; T387P; Q396R; G404A; L409R; A411K,T;
L412R; E417R; Y421F.
\vskip1.000000\baselineskip
Variantes de una fitasa modelo derivada de una
especie del género Trametes, preferiblemente de la especie
Trametes pubescens, preferiblemente derivada de la cepa CBS
100232, preferiblemente variantes de T. pubescens, cuya
secuencia se muestra en la Fig. 4, comprendiendo dichas variantes al
menos una de las siguientes modificaciones:
R24C; T27P; L31Y; V33C; Q39H,S; S40L,N;
S42G;
M43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S,
T, V, W, Y; Y44N; S45D; Y47F; A51E,R; A58D,K; S59G; Q61R; 162V;
F75W; S78D; A80K; A81Q, E, G; R83A, I, Q, K; I84Y, Q, V; V88I;
K90R,A; L102Y; D115N; V118L; T123N,Q; S125M; S126H,V; E127Q,N;
A128T,S; A132F, I, L; D143N; V148I; S151A; S153D,Y;
D154Q,S,G;
A158D; A160S; N161T; ()170fH; ()170gA; S171N; S172P; N173Q,S; S184Q,P; E185S; A186E,P; G187A; () 187aS; T190P,A; N194S,T; M195T,V,L; A198N,V; G200V; () 201eT; S202A; D203R, K, S; P203aV,T; Q204E,S,A,V; V205E; Q211L, V; P215A; L220N; G223D,H; D233E; Y235L,T; N236Y; L237F; L238M; P242S; E244D; Q 251eE, Q; E253P; Q260A, H; D264R, I; A265Q; A267D; A270Y,L,G; D271N; D273K; F275Y; T278H; Y280A,P; V287A,T; Q288L, I, F; Y292F; I293A, V; A302R,H; N304P,A; N336S; Q337T, S, G; M338I; V339I; A340P; S343A, F, I, L; F348Y; N349P; A352K; P360R; R362P; F364W; L365V,A,S; V366D,S; K367A; 1369L; A373S; A374S; R375H; ()383kQ,E; Q387P; A396R; G404A; V409R; T411K; L412R; E417R; Y421F.
A158D; A160S; N161T; ()170fH; ()170gA; S171N; S172P; N173Q,S; S184Q,P; E185S; A186E,P; G187A; () 187aS; T190P,A; N194S,T; M195T,V,L; A198N,V; G200V; () 201eT; S202A; D203R, K, S; P203aV,T; Q204E,S,A,V; V205E; Q211L, V; P215A; L220N; G223D,H; D233E; Y235L,T; N236Y; L237F; L238M; P242S; E244D; Q 251eE, Q; E253P; Q260A, H; D264R, I; A265Q; A267D; A270Y,L,G; D271N; D273K; F275Y; T278H; Y280A,P; V287A,T; Q288L, I, F; Y292F; I293A, V; A302R,H; N304P,A; N336S; Q337T, S, G; M338I; V339I; A340P; S343A, F, I, L; F348Y; N349P; A352K; P360R; R362P; F364W; L365V,A,S; V366D,S; K367A; 1369L; A373S; A374S; R375H; ()383kQ,E; Q387P; A396R; G404A; V409R; T411K; L412R; E417R; Y421F.
\vskip1.000000\baselineskip
Variantes de una fitasa modelo derivada de una
especie del género Aspergillus, preferiblemente de la especie
Aspergillus nidulans, preferiblemente derivada de la cepa
DSM 9743, preferiblemente variantes de A. nidulans, cuya
secuencia se muestra en la Fig. 10, comprendiendo dichas variantes
al menos una de las siguientes modificaciones:
V24C; A27P; H39S,Q; V40L,N; G42S;
Q43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S,
T, V, W, Y; Y44N; S45D; Y47F; S49P; E51A,R; V56P; H58D,K,A;
E61R; V62I; S69Q; Y75W, F; E78D,S; S79G; K80A;
S81Q, E,A,G; K82T; A83I,Q,K,R; Y84Q,V,I; A90R; D115N; D116S;
T118V,L; 1119E; F120L; E122A; N123T,Q; M125S; V126H,S; D127Q,E,N;
S128A,T; F132I,L; K143N; I148V; S151A; S153D,Y; D154Q,S,G; A158D;
S159T; A160S; E161T,N; K162N; F163W; G170fH; S170gA; () 171N;
()172P; K173Q,S; P184Q,S; E185S; I186A,E,P; D187A; G187aS; T190P,A;
H193S; S194T; S198A,N,V; E200G,V; N201D, E; D201e(); E201e (), T;
R201f() (una deleción de al menos uno de 201d, 201e, 201f,
preferiblemente todos); A202S; D203R,K,S; E203aV,T; I204Q, E, S, A,
V; 1211L,V; P215A; L220N; D223H; K228N; E232T; N233E; I235Y, L,T;
Y236N; L237F; M238L; S242P; M246V; E251eQ; A256D; E260A,H; L264R,I;
Q270Y, A, L, G; S271D,N; S273D,K; Y275F; G278T,H; A280P; A287T;
Q288L, I, F; F292Y; T293A,V; Q302R,H; P304A; N336S; S337T,Q,G;
M338I; I339V; S340P,A; F343A, S, I, L; N349P; Q352K; S360R; Q362P;
Y364W, F; A365V,L,S; A366D, V, S; S367K, A; W368K; T369I, L; G373S,
A; A374S; R375H; A376M; E383kQ; A404G; T411K; L412R; E417R; F421Y;
K431E.
\vskip1.000000\baselineskip
Variantes de una fitasa modelo derivada de una
especie de Aspergillus, preferiblemente Aspergillus terreus,
preferiblemente derivada de la cepa CBS 220.95, preferiblemente
variantes de A. terreus, cuya secuencia se muestra en la
Fig. 12, comprendiendo dichas variantes al menos una de las
siguientes modificaciones:
G24C; V27P; H39S,Q; K40L,N; G42S;
L43A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S,
T, V, W, Y; Y44N; A45D, S; Y47F; S49P; Q51E, A, R; V56P; P58D, K,A;
D59G; H61R; I62V; A69Q; S75W, F; H78D, S: S79G; K80A; T81Q, E, A,
G; A83I, Q, K, R; Y84Q, V, I; A90R; E115N; E116S; T118V,L; P119E;
F120L; R122A; N123T,Q; L125S,H; R126H,S,V; D127Q,E,N; L128A, T,S;
F132I,L; H143N; V148I; T151A,S; D152G; A153D, Y; S154D,Q,G; H157V;
E158D, A; S159T; A160S; E161T,N; K162N; F163W; H173Q,S; P184Q,S;
E185S; G186A,E,P; S187A; A187aS; T190P, A; H193S; S194T; L195T, V;
A198N,V; E200G,V; S201D,E; S201d (); T201e (); V201f (); G202S,A;
D203R,K,S; D203aV,T; A204Q,E,S,V;
V205E; V211L; A215P; L220N; D223H; Q228N; D232T; D233E; V235Y,L,T; N236Y; L237F; M238L; P242S; E244E; T251eE,Q; A260H; T264R,I; Q265A; N267D; L270Y,A,G; S271D,N; K273D; Y275F; H278T; G280A,P; V287A,T; Q288L,I,F; W292F,Y; A293V; Q302H; P304A; N337T,Q,S,G; L338I; V339I; S340P,A; W343A,S,F,I,L; N349P; A352K; S360R; S362P; Y364W,F; A365V,L,S; A366D,V,S; A367K; W368K; T369I,L; A373S; A374S; R375H; A376M; R383kQ,E; P404A,G; K411T; A417E, R; F421Y;. A431E.
V205E; V211L; A215P; L220N; D223H; Q228N; D232T; D233E; V235Y,L,T; N236Y; L237F; M238L; P242S; E244E; T251eE,Q; A260H; T264R,I; Q265A; N267D; L270Y,A,G; S271D,N; K273D; Y275F; H278T; G280A,P; V287A,T; Q288L,I,F; W292F,Y; A293V; Q302H; P304A; N337T,Q,S,G; L338I; V339I; S340P,A; W343A,S,F,I,L; N349P; A352K; S360R; S362P; Y364W,F; A365V,L,S; A366D,V,S; A367K; W368K; T369I,L; A373S; A374S; R375H; A376M; R383kQ,E; P404A,G; K411T; A417E, R; F421Y;. A431E.
\vskip1.000000\baselineskip
Variantes de una fitasa modelo derivada de una
especie de Talaromyces, preferiblemente la especie Talaromyces
thermophilus, preferiblemente derivadas de la cepa ATCC 20186 o
ATCC 74338, preferiblemente variantes de T. thermo, cuya
secuencia se muestra en la Fig. 13, comprendiendo dichas variantes
al menos una de las siguientes modificaciones:
H24C; V27P; H39S,Q; S40L,N; G42S;
Q43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S,
T, V, W, Y; Y44N; S45D; F47Y; S49P; A51E, R; V56P; Q58D, K, A;
N59G; K61R; I62V; Y75W, F; S78D; S79G; K80A; T81Q, E, A, G; E82T;
L83A, I, Q, R, K; Y84Q, V, I: R90A; D116S; T118V,L; P119E; F120L;
E122A; N123T,Q; M125S: I126H,S,V; Q127E,N; L128A,T,S; F132I,L;
V148I; S151A; S153D,Y; D154Q,S,G; I157V; A158D; S159T; G160A,S;
R161T,N; L162N; F163W; S170gA; D171N;
K172P; H173Q,S; E184Q,S,P; E185S; G186A,E,P: D187A; T190P,A; T193S; G194S,T; S195T,V,L; V198A,N;
E200G,V; D201E; S201dQ; S201e (), T; S201f (); G202S, A; H203R, K, S; D203aV,T; A204Q,E,S,V; Q205E; Q211L,V; A215P; 1220N,L; H223D; D228N; S232T; D233E; P235Y,L,T; Y236N; M237F; D238L,M; P242S; E244D; L246V; () 251eE, Q; A256D; Q260A, H; Q264R, I; A265Q; Q270Y, A, L, G; S271D,N; G273D,K; Y275F; N278T,H; G280A,P; A287T; Q288L, I, F; F292Y; V293A; H302R; P304A; N336S; T337Q, S, G; M338I; T339V, I; S340P, A; A343S, F, I, L; N349P; A352K; S360R; E362P; Y364W,F; S365V, L, A; A366D,V,S; A367K; W368K; T369I, L; G373S, A; G374A, S; R375H; A376M; D383kQ,E; E404A; K411T; R417E; F421Y.
K172P; H173Q,S; E184Q,S,P; E185S; G186A,E,P: D187A; T190P,A; T193S; G194S,T; S195T,V,L; V198A,N;
E200G,V; D201E; S201dQ; S201e (), T; S201f (); G202S, A; H203R, K, S; D203aV,T; A204Q,E,S,V; Q205E; Q211L,V; A215P; 1220N,L; H223D; D228N; S232T; D233E; P235Y,L,T; Y236N; M237F; D238L,M; P242S; E244D; L246V; () 251eE, Q; A256D; Q260A, H; Q264R, I; A265Q; Q270Y, A, L, G; S271D,N; G273D,K; Y275F; N278T,H; G280A,P; A287T; Q288L, I, F; F292Y; V293A; H302R; P304A; N336S; T337Q, S, G; M338I; T339V, I; S340P, A; A343S, F, I, L; N349P; A352K; S360R; E362P; Y364W,F; S365V, L, A; A366D,V,S; A367K; W368K; T369I, L; G373S, A; G374A, S; R375H; A376M; D383kQ,E; E404A; K411T; R417E; F421Y.
\vskip1.000000\baselineskip
Variantes de una fitasa modelo derivada de una
especie de Thermomyces, preferiblemente la especie Thermomyces
lanuginosus, preferiblemente derivada de la cepa DBS 586.94,
preferiblemente variantes de T. lanuginosa, cuya secuencia se
muestra en la Fig. 14, comprendiendo dichas variantes al menos una
de las siguientes modificaciones:
K24C; ()27P; ()31Y; ()33C; R39H,S,Q; H40L,N;
G42S;
Q43A, C, D, E, F, G, H; I, K, L, M, N, P, R, S,
T, V, W, Y; Y44N; S45D; F47Y; S49P; A51E,R; V56P; K58D,A; V62I;
S69Q; Y75W,F; A78D,S; H79G; K80A; S81Q,E,A,G; E82T; V83A,I,Q,K,R;
Y84Q,V,I; L88I; R90A; F102Y; D115N; N116S; T118V,L; R119E; F120L;
E122A; E123N,T,Q; M125S; M126H,S,V; E127Q,N; S128A,T; F132I,L;
E143N; V148I; A151S; S153D,Y; A154D,Q,S,G; I157V; A158D; S159T;
A160S; E161T,N; F162N; F163W; R170fH; S170gA; K172P; D173Q,S;
S184Q,P; E185S; E186A,P; T187A; G187aS; T190P,A; G193S; L194S,T;
T195V,L; A198N,V; E200G,V; E201D; A201d (); P201e (), T; D202S, A;
P203R,K,S; T203aV; Q204E, S, A, V; P205E; V211L; R215A,P; 1220L, N;
H223D; E232T; D233E; P235Y,L,T; L236Y,N; M238L; P242S; Q251eE;
H256D; Q260H; M264R, I; A265Q; Y270A,L,G; T271D,N; D273K; Y275F;
H278T; G280A,P; A283P; S287A; R288L, I, F; F292Y; V293A; G302R,H;
P304A; N336S; T337Q,S,G; M338I; T339V, I; G340P,A; S343A, F, I, L;
N349P; P360R; T362P; Y364W,F; A365V, L, S; A366D, V, S; S367K, A;
W368K; T369I,L; A373S; A374S; R375H; A376M; E383kQ; R404A,G;
R411K,T; K417E, R; F421Y; D431E.
\newpage
Variantes de una fitasa modelo derivada de una
especie de Myceliophthora, preferiblemente la especie
Myceliophthora thermophila, preferiblemente derivada de la
cepa ATCC 48102 o ATCC 74340, preferiblemente variantes de M.
thermophila, cuya secuencia se muestra en la Fig. 7,
comprendiendo dichas variantes al menos una de las siguientes
modificaciones:
S24C; F31Y; H39S,Q; F40L,N; G42S;
Q43A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S,
T, V, W, Y; Y44N; S45D; Y47F; S49P; P51E,A,R; I56P; D58K,A; D59G;
E61R; V62I; S69Q; A75W, F; L78D,S; K79G; R80K, A; A81Q, E, G; A82T;
S83A, I, Q, K, R; Y84Q,V,I; R90A; D115N; E116S; T118V,L; R119E;
T120L; Q122A; Q123N,T; M125S; V126H,S; N127Q,E; S128A,T; F132I,L;
K143N; V148I; A151S; Q153D,Y; D154Q,S,G; H158D,A; S159T; A160S;
E161T,N; G170fH; S170gA; T171N; F163W; V172P; R173Q,S; P184Q,S;
E185S; T186A,E,P; G187aS; T190P, A; N193S; D194S,T; L195T, V;
A198N, V; E200G,V; E201D; G201a (); P201b (); Y201c (); S201d ();
T201e (); I201f (); G202S, A; D203R,K,S; D203aV,T; A204Q, E, S, V;
Q205E; T211L,V; P215A; V220N,L; N223D,H; A232T; D233E; V235Y,L,T;
A236Y,N; L237F; M238L; P242S; E244D; A251eE, Q; R256D; E260A, H;
R264I; A265Q; Q270Y,A,L,G; S271D,N; K273D; Y275F; Y278T,H; P280A;
T287A; Q288L,I,F; F292Y; V293A; ()302R,H; P304A; N336S;
D337T,Q,S,G; M338I; M339V, I; G340P, A; G343A, S, F, I, L; D349P;
P352K; D360R; E362P; Y364W,F; A365V, L, S; A366D, V, S; S367K, A;
W368K; A369I, L; A373S; A374S; R375H; I376M; E383kQ; E387P; G404A;
M409R; T411K; L412R; E417R; F421Y; D431E.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describe una fitasa nueva que ha sido
derivada de una cepa de Cladorrhinum, es decir, C.
foecundissimum. Por consiguiente, se describe un polipéptido
que tiene actividad fitasa y que comprende SEC ID NO:2 o la parte
madura (aminoácidos nos 16-495) de la misma; o un
polipéptido homólogo al mismo en al menos un 70, más
preferiblemente 75, 80, 85, 90, 95%; homología significando
similitud, preferiblemente identidad, y estando determinada usando
el programa GAP y los ajustes tal y como se define anteriormente. Y
se describe un constructo de ADN que codifica un polipéptido que a
su vez tiene actividad fitasa; dicho constructo de ADN comprende una
molécula de ADN que a su vez comprende SEC ID NO:1 o nucleótidos
nos. 20-70 y 207-1560 de la misma;
o nucleótidos nos. 20-70 y 207-1563
de la misma; o nucleótidos nos. 65-70 y
207-1560 de la misma; o nucleótidos nos.
65-70 y 207-1563 de la misma; o un
constructo de ADN o molécula homóloga en al menos un 70, 75, 80,
85, 90, 95% a cualquiera de estas secuencias de nucleótidos;
homología significando similitud, preferiblemente identidad, y
estando determinada usando programas informáticos conocidos en la
técnica tales como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG
(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1996,
Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA
53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of
Molecular Biology, 48: 443-453). Usando GAP con los
ajustes siguientes para la comparación de secuencias de ADN:
penalización de creación de GAP de 5.0 y penalización de extensión
de GAP de 0.3. También se describe un constructo de ADN que se
hibrida con cualquiera de las secuencias de ADN de arriba bajo las
condiciones mencionadas anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad fitasa se puede medir usando el
siguiente ensayo:
Se añaden 10 \mul de muestras de enzima
diluida (diluidas en 0.1 M de acetato sódico, 0,01% de Tween20, pH
de 5.5) en 250 \mul de fitato de sodio 5 mM (Sigma) en 0,1 M de
acetato sódico, 0,01% de Tween20, pH de 5.5 (pH ajustado después de
disolver el fitato de sodio; el sustrato es precalentado) y se
incuba durante 30 minutos a 37ºC. La reacción se detiene añadiendo
250 \mul de TCA al 10% y el fosfato libre se mide añadiendo 500
\mul 7.3 g de FeSO4 en 100 ml de reactivo de molibdato (2,5 g
(NH_{4})_{6}Mo_{7} O_{24}.4H_{2}O en 8 ml
H_{2}SO_{4} diluido a 250 ml). La absorbencia a 750 nm se mide
en muestras de 200 \mul en placas de microtitulación de 96
pocillos. Se incluyen sustrato y formas preliminares enzimáticas.
También se incluye una curva estándar de fosfato
(0-2 mM de fosfato). 1 FYT es igual a la cantidad
de enzimas que libera 1 \mumol de fosfato/min en las condiciones
dadas.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad específica se puede determinar del
siguiente modo:
Se usa una muestra altamente purificada de la
fitasa (la pureza se controla previamente en un gel de
poliacrilamida SDS que muestra la presencia de un sólo
componente).
La concentración de proteína en la muestra de
fitasa se determina por análisis de aminoácido del siguiente modo:
una alícuota de la muestra de fitasa se hidroliza en 6N HCl, 0,1%
de fenol durante 16 h a 110ºC en un tubo de vidrio evacuado. Los
aminoácidos resultantes se cuantifican usando un sistema de
análisis de aminoácidos Applied Biosystems 420A accionado según las
instrucciones del fabricante. Puede calcularse a partir de las
cantidades de aminoácidos la masa total, y así también la
concentración, de proteína en la alícuota hidrolizada.
La actividad se determina en las unidades de
FYT. Una FYT equivale a la cantidad de enzima que libera 1 micromol
de fosfato inorgánico de fitato (5 mM de fitato) por minuto a un pH
de 5.5, a 37ºC; el ensayo se describe p. ej. en el ejemplo 1.
La actividad específica es el valor de FYT/mg de
proteína enzimática.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad y estabilidad de temperatura y de
pH se puede determinar del siguiente modo:
Perfiles de temperatura (es decir, relación de
actividad de temperatura) llevando a cabo el ensayo de FYT del
Ejemplo 1 a diferentes temperaturas (precalentando el
sustrato).
Estabilidad de temperatura preincubando la
fitasa en 0,1 M de fosfato sódico, a un pH de 5.5 a diferentes
temperaturas antes de medir de la actividad residual.
La estabilidad de pH incubando la enzima a un pH
de 3 (25 mM de glicina-HCl), a un pH de
4-5 (25 mM de acetato sódico), a un pH de 6 (25 mM
de MES), a un pH de 7-9 (25 mM de
Tris-HCl) durante 1 hora a 40ºC, antes de medir la
actividad residual.
Los perfiles de pH (es decir, la relación de
actividad de pH) llevando a cabo el ensayo con los diferentes pH
usando los mismos sistemas tampón (50 mM, pH reajustado al disolver
el sustrato).
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La termoestabilidad o temperatura de fusión, Tm,
se puede determinar del siguiente modo:
En una DSC el calor consumido para mantener un
aumento de temperatura constante en la célula de muestra se mide
con respecto a una célula de referencia. Se mantiene un nivel de
calentamiento constante (p. ej. 90ºC/hora). Un proceso endotérmico
(proceso de consumo de calor, p. ej. el desarrollo de una
enzima/proteína) se observa como un aumento en el calor transferido
a la célula para mantener el aumento de temperatura constante.
Una DSC se puede realizar usando el aparato MC2
de MicroCal. Las células son equilibradas 20 minutos a 20ºC antes
de ser escaneadas a 90ºC a una tasa de barrido de 90º/h. Se cargan
muestras de p. ej. aproximadamente 2,5 mg/ml de fitasa en 0,1 M de
acetato sódico, con un pH 5.5.
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Se prepararon variantes de una fitasa modelo de
Aspergillus fumigatus (una fitasa de tipo salvaje derivada
de la cepa ATCC 13073) como se describe en EP 98104858.0
(EP-A-0897010), ejemplos
2-3 y 5, y la actividad fitasa se determinó como se
describe en el ejemplo 7 de la misma. El pH y la temperatura
óptimos y el punto de fusión se determinaron como se describe en
los ejemplos 9 y 10 de EP 98113176.6
(EP-A-0897985).
En la Tabla 1 están catalogadas variantes de
actividad específica mejorada a un pH 5.0. La tabla 2 cataloga
variantes de actividad relativa mejorada a un pH 3.0, y la Tabla 3
cataloga variantes de termoestabilidad mejorada (temperatura
óptima, p. ej. determinada por DSC).
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Se prepararon variantes de la secuencia de
consenso de ascomiceto "conphys" de la Fig. 9 como se describe
en EP 98113176.6 (EP-A-0897985),
ejemplos 4-8. La actividad fitasa, incluyendo un pH
y una temperatura óptimos, y el punto de fusión se determinaron
como se describe en los ejemplos 9 y 10, respectivamente, de la
misma.
Las tablas más abajo catalogan variantes de
características de actividad modificadas, es decir,
En la Tabla 4 variantes de actividad específica
mejorada a un pH 6.0;
En la Tabla 5 variantes de pH óptimo modificado
(el pH óptimo indicado es un valor aproximado, determinado como el
valor de pH (seleccionado del grupo que consiste en pH 4.0, 4.5,
5.0, 5.5, 6.0, 6.5; y 7,0) en el que se obtuvo la actividad fitasa
máxima);
En la Tabla 6 una variante de termoestabilidad
mejorada (expresada por medio del punto de fusión como se determina
por calorimetría diferencial de barrido (DSC)); y
En la Tabla 7 variantes de termoestabilidad
modificada (temperatura óptima); un "+" o "-" indica un
efecto positivo o negativo, respectivamente, en una temperatura
óptima de hasta 1ºC; y un "++" y "- -" significa un efecto
positivo o negativo, respectivamente, en una temperatura óptima de
entre 1 y 3ºC.
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Se ha clonado ADN que codifica una fitasa de CBS
427.97 de Cladorrhinum foecundissimum, y la enzima aislada y
purificada, esencialmente como se describe en WO 98/28409.
La Fig. 15 muestra la secuencia de ADN del
producto PCR clonado de HindIII/XbaI en pA2phy8. El producto PCR
clonado se amplifica desde la región genómica que codifica un gen
phyA de CBS 427.97 de Cladorrhinum foecundissimum. El intrón
putativo se indica mediante doble subrayado de los puntos de
escisión-ligadura conforme a la regla
GT-AG (R. Breathnach et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 75 (1978) pgs. 4853-4857). Los sitios
de restricción usados para clonar están subrayados.
Según la predicción de SignalP V1.1 (Henrik
Nielsen, Jacob Engelbrecht, Stren Brunak y Gunnar von Heijne:
"Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and
prediction of their cleavage sites", Protein Engineering 10,
1-6 (1997)), la parte del péptido señal de la enzima
corresponde a los aminoácidos nos. 1-15, por
consiguiente la enzima madura es los aminoácidos nos.
16-495.
La enzima muestra un pH óptimo de
aproximadamente pH 6 sin actividad apH bajo (pH 3), sino con una
actividad significante de hasta un pH 7.5; de este modo es una
fitasa más alcalina en comparación con la fitasa de Aspergillus
ficuum.
Se encontró una temperatura óptima de alrededor
de 60ºC a un pH 5.5. Así pues, esta fitasa es más termoestable que
la fitasa de A. ficuum.
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La secuencia de fitasa de Cladorrhinum
foecundissimum como se describe en el ejemplo 7 se compara con
las 13 fitasas modelo de la Fig. 1 usando la versión 8 de GAP
mencionada arriba con un peso GAP de 3.000 y un peso de longitud
GAP de 0.100. Se comparan secuencias completas de aminoácidos. La
secuencia de la fitasa de M. thermophila llega a ser la
secuencia más homóloga, mostrando un grado de similitud con la
secuencia de C. foecundissimum de un 70.86%.
Además, usando el programa GAP y los parámetros
mencionados arriba, la secuencia de la fitasa de "C.
foecundissimum" se alinea ahora con la fitasa de "M.
thermophila"; ver Fig. 16. El promedio de correspondencia es
de 0.540;, el promedio de no correspondencia de -0.396; la calidad
de 445.2; la longitud de 505; la proporción de 0.914; los espacios
9; el porcentaje de similitud 70.860; el porcentaje de identidad
53.878.
En una siguiente fase, ver Fig. 17, la C.
foecundissimum se pega (o se podría simplemente escribir) sobre
el alineamiento de la Fig. 1 como la fila inferior, asegurando que
estos residuos de aminoácidos que según el alineamiento en la Fig.
16 son idénticos (indicado por una línea vertical) o similares
(indicado por uno o dos puntos) se coloquen uno encima del otro. En
5 posiciones a lo largo de la secuencia, la secuencia de C.
foecundissimum comprende residuos de aminoácidos en
"exceso", para los cuales el alineamiento de la Fig. 1 no deja
espacio. En la Fig. 17, estos residuos en exceso se transfieren
sobre una fila siguiente (pero pueden incluirse en la alineación
múltiple y numerarse como se describe previamente en los párrafos
relacionados de numeración de posición (usando las denotaciones a,
b, c, etc.).
Las variantes correspondientes de la fitasa de
C. foecundissimum se deducen entonces fácilmente basándose
en la Fig. 17. Algunos ejemplos: las variantes generalmente
designadas "80K,A" y "43T" en C. foecundissimum
corresponden a "K80A" y "Q43T", respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citada por el
solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector. No forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cladorrhinum
foecundissimum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (71).. (126)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(70)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (127).. (1563)
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido señal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)..(64)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 495
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cladorrhinum
foecundissimum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (14)
1. Fitasa que difiere de la secuencia de
aminoácidos de la fitasa de Peniophora lycii de la Fig. 6 en
una o más de las siguientes posiciones, usando la numeración de
posición correspondiente a P. lycii de la Fig. 1: D45S;
T61R; A115N; L118V; H126S,V; G172P; E173Q,S; D201E; D203R, K, S;
N215A, P; M238L; V264R, I; G302R,H; T337Q,S,G; V339I; P340A; E360R;
V365L,A,S; D366V,S; E411K,T.
2. Polipéptido de fitasa que comprende una
fitasa según la reivindicación 1.
3. Constructo de ADN que comprende una secuencia
de ADN que codifica una fitasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2.
4. Vector de expresión recombinante que
comprende un constructo de ADN según la reivindicación 3.
5. Célula huésped que se transforma con un
constructo de ADN según la reivindicación 3 o un vector según la
reivindicación 4.
6. Proceso para preparar una fitasa,
comprendiendo éste un cultivo de la célula huésped según la
reivindicación 5 bajo condiciones que permiten la producción de la
fitasa, y la recuperación de la fitasa del caldo de cultivo.
7. Alimento o alimentos que comprenden al menos
una fitasa de cualquiera de las reivindicaciones
1-2.
8. Proceso para preparar un pienso o alimento
según la reivindicación 7, donde se añade al menos una fitasa a los
componentes alimentarios o de piensos.
9. Composición que comprende al menos una fitasa
de cualquiera de las reivindicaciones 1-2.
10. Composición según la reivindicación 9
adecuada para su uso en preparaciones alimentarias o de
piensos.
11. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 9-10 que es un aditivo para
pienso.
12. Proceso para reducir los niveles de fitato
en abono animal que comprende la alimentación de un animal con una
cantidad eficaz del pienso según la reivindicación 7 u obtenible
según la reivindicación 8.
13. Uso de la fitasa de cualquiera de las
reivindicaciones 1-2; o la composición de
cualquiera de las reivindicaciones 9-10 para liberar
fósforo de un sustrato de fitasa.
14. Planta transgénica o parte de la planta que
es capaz de expresar una fitasa según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2.
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