ES2800477T3 - Procesos para producir productos de fermentación - Google Patents

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Zhengfang Kang
Christie Strahler
Suzanne Clark
Kristian Bertel Rømer M Krogh
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Abstract

Proceso para generar productos de fermentación a partir de un material que contiene almidón que comprende los pasos de: i) licuefacción del material que contiene almidón durante 0.5-5 horas a una temperatura de 75-95 °C a un pH de 4-6 usando: - una alfa-amilasa; - una endoglucanasa que tiene la secuencia mostrada como SEC ID N.º: 3 o una secuencia que tiene 10 al menos un 80 % de identidad con la SEC ID N.º: 3 y además tiene un punto de fusión (DSC) por encima de 80 °C; ii) sacarificación del material licuado que contiene almidón de la etapa i) usando una glucoamilasa; iii) fermentación usando una cepa de Saccharomyces, en donde los pasos ii) y iii) se llevan a cabo como sacarificación y fermentación simultáneas a una temperatura de 25 °C a 40 °C.

Description

DESCRIPCIÓN
Procesos para producir productos de fermentación
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere a procesos para crear productos de fermentación a partir de un material que contiene almidón.
REFERENCIA A UN LISTADO DE SECUENCIAS
[0002] Esta patente contiene un listado de secuencias.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0003] La creación de productos de fermentación, como el etanol, a partir de un material que contiene almidón es bien conocida en la técnica. Industrialmente, hoy se utilizan dos tipos diferentes de procesos. El proceso más comúnmente utilizado, a menudo denominado "proceso convencional", incluye la licuefacción de almidón gelatinizado a alta temperatura utilizando típicamente una alfa-amilasa bacteriana, seguida de una sacarificación y fermentación simultáneas en presencia de una glucoamilasa y un organismo de fermentación. Otro proceso bien conocido, a menudo denominado proceso de "hidrólisis de almidón crudo" (proceso RSH), incluye sacarificación y fermentación simultáneas de almidón granular por debajo de la temperatura de gelatinización inicial, típicamente en presencia de al menos una glucoamilasa.
[0004] A pesar de la mejora significativa de los procesos de creación de productos de fermentación en la última década, una cantidad significativa de material de almidón residual no se convierte en el producto de fermentación deseado, por ejemplo, el etanol.
[0005] Por lo tanto, todavía existe el deseo y la necesidad de proporcionar procesos para crear productos de fermentación, como el etanol, a partir de un material que contiene almidón que puede proporcionar un mayor rendimiento del producto de fermentación u otras ventajas, en comparación con un proceso convencional. RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0006] La invención se refiere a procesos para crear productos de fermentación, tales como etanol, a partir de un material que contiene almidón que comprenden las etapas de:
i) licuefacción del material que contiene almidón durante 0.5-5 horas a una temperatura de 75-95 °C a un pH de 4-6 usando:
- una alfa-amilasa;
- una endoglucanasa que tiene la secuencia mostrada como SEC ID N.°: 3 o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEC ID N.°: 3 y además tiene un punto de fusión (DSC) por encima de 80 °C;
ii) sacarificación del material licuado que contiene almidón de la etapa i) usando una glucoamilasa; iii) fermentación usando una cepa de Saccharomyces, en donde los pasos ii) y iii) se llevan a cabo como sacarificación y fermentación simultáneas a una temperatura de 25 °C a 40 °C.
[0007] Se describen composiciones que comprenden:
i) una alfa-amilasa;
ii) una endoglucanasa que tiene la secuencia mostrada como SEC ID N.°: 3 o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEC ID N.°: 3 y además tiene un punto de fusión (DSC) por encima de 80 °C.
[0008] La composición puede usarse para licuar un material que contiene almidón.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0009] Los inventores han encontrado que se obtiene un mayor rendimiento de etanol al licuar material que contiene almidón usando una alfa-amilasa en presencia de una endoglucanasa termoestable según define en la reivindicación 1.
[0010] La invención se refiere a procesos para producir productos de fermentación, preferiblemente etanol, que comprenden los pasos de:
i) licuefacción del material que contiene almidón durante 0.5-5 horas a una temperatura de 75-95 °C a un pH de 4-6 usando:
- una alfa-amilasa;
- una endoglucanasa que tiene la secuencia mostrada como SEC ID N.°: 3 o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEC ID N.°: 3 y además tiene un punto de fusión (DSC) por encima de 80 °C;
ii) sacarificación del material licuado que contiene almidón de la etapa i) usando una glucoamilasa; iii) fermentación usando una cepa de Saccharomyces, en donde los pasos ii) y iii) se llevan a cabo como sacarificación y fermentación simultáneas a una temperatura de 25 °C a 40 °C. Los pasos ii) y iii) se llevan a cabo simultáneamente. La alfa-amilasa, la endoglucanasa termoestable que tiene la secuencia mostrada como SEC ID N.°: 3 o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEC ID N.°: 3 y que además tiene un punto de fusión (DSC) por encima de 80 °C, se puede agregar antes y/o durante el paso de licuefacción i). Opcionalmente, pueden también estar presentes o añadirse una proteasa, una enzima generadora de fuentes de carbohidratos, preferiblemente una glucoamilasa, una pululanasa y/o una fitasa. En una realización preferida, una composición de la invención definida a continuación puede usarse adecuadamente para la licuefacción en un proceso de la invención. Las enzimas pueden agregarse individualmente o como una composición de mezcla que comprende una alfa-amilasa y una endoglucanasa termoestable tal como se define en la reivindicación 1, y opcionalmente una proteasa, una enzima generadora de fuentes de carbohidratos, una pululanasa y/o una fitasa.
[0011] Se pueden encontrar ejemplos de alfa-amilasas en la sección "Alfa-amilasa presente y/o añadida durante la licuefacción" más adelante.
[0012] En una realización preferida, la alfa-amilasa es una variante de la que se muestra en la SEC ID N.°: 1 en el presente documento, por ejemplo, una derivada de una cepa de Bacillus stearothermophilus, con mutaciones seleccionadas del grupo de:
I181* G182* N193F E129V K177L R179E;
I181* G182* N193F V59A Q89R E129V K177L R179E H208Y K220P N224L Q254S; I181* G182* N193F V59A Q89R E129V K177L R179E Q254S M284V; y
I181* G182* N193F E129V K177L R179E K220P N224L S242Q Q254S (usando la SEC ID N. °: 1 en el presente documento para la numeración).
[0013] Las alfa-amilasas de Bacillus stearothermophilus generalmente se truncan de manera natural cuando se producen para tener alrededor de 491 aminoácidos de largo (en comparación con la SEC ID N.°: 3 en WO 99/19467 o la SEC ID N.°: 1 en el presente documento), por ejemplo, de 480-495 aminoácidos de longitud.
[0014] En una realización, la alfa-amilasa bacteriana, por ejemplo, la alfa-amilasa de Bacillus , especialmente la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus se dosifica en licuefacción en una concentración entre 0.01-10 KNU-A/g DS, por ejemplo, entre 0.02 y 5 KNU-A/g DS, por ejemplo, 0.03 y 3 KNU-A, preferiblemente 0.04 y 2 KNU-A/g DS, especialmente 0.01 y 2 KNU-A/g DS.
[0015] En una realización, la alfa-amilasa bacteriana, por ejemplo, alfa-amilasa de Bacillus , especialmente las alfa-amilasas de Bacillus stearothermophilus se dosifican en licuefacción en una concentración de entre O. 0001-1 mg PE (proteína enzimática)/g DS, por ejemplo, 0.0005-0.5 mg PE/g DS, por ejemplo, 0.001-0.1 mg PE/g DS.
[0016] Se pueden encontrar ejemplos de endoglucanasas que tienen un punto de fusión (DSC) por encima de 70 °C en la sección "Endoglucanasa termoestable presente y/o añadida durante la licuefacción" más adelante.
[0017] En una realización preferida, la endoglucanasa es la que se muestra en la SEC ID N.°: 3 en el presente documento, por ejemplo, una derivada de una cepa de Talaromyces leycettanus (WO2013/019780) o una endoglucanasa que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEC ID N.°: 3 en el presente documento y que además tiene un punto de fusión (DSC) superior a 80 °C.
[0018] En una realización preferida, la endoglucanasa es la que se muestra en la SEC ID N.°: 3 en el presente documento, por ejemplo, una derivada de una cepa de Talaromyces leycettanus (WO2013/019780) o una endoglucanasa que tiene al menos un 90 % de identidad con la s Ec ID N.°: 3 en el presente documento que tiene un punto de Fusión (DSC) por encima de 80 °C.
[0019] Se pueden encontrar ejemplos de proteasas opcionales en la sección "Proteasa presente y/o añadida durante la licuefacción" más adelante.
[0020] Se pueden encontrar ejemplos de enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos opcionales adecuadas, preferiblemente enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos termoestables, en particular glucoamilasas, en la sección "Enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos presentes y/o añadidas durante la licuefacción" más adelante.
[0021] Se puede encontrar una pululanasa opcional adecuada en la sección "Pululanasa presente y/o añadida durante la licuefacción" más adelante.
[0022] En una realización preferida, la pululanasa se obtiene de Bacillus sp.
[0023] Se pueden encontrar ejemplos de fitasas en la sección "Fitasa presente y/o añadida durante la licuefacción" más adelante.
[0024] En una realización preferida, la fitasa se obtiene de una cepa de Buttiauxella
[0025] Se puede encontrar una composición adecuada de celulasa o enzima celulolítica presente y/o añadida durante la sacarificación y/o fermentación o sacarificación y fermentación simultáneas (SSF) en la sección "Composición de celulasa o enzima celulolítica presente y/o añadida durante la sacarificación y/o la fermentación o la SSF" más adelante.
[0026] En una realización, la composición de celulasa o enzima celulolítica se obtiene de Trichoderma reesei.
[0027] En una realización preferida, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además un polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus con actividad potenciadora celulolítica (SEC ID N.°: 2 en WO 2005/074656 o la SEC ID N.°: 30 en el presente documento) y beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEC ID N.°: 2 de WO 2005/047499 o la SEC ID N.°: 29 en el presente documento).
[0028] En una realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además un polipéptido GH61A de Penicillium emersonii descrito como la SEC ID N.°: 2 en w O 2011/041397 o la SEC ID N.°: 31 en el presente documento y beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus descrita como la SEC ID N.°: 2 en WO 2005/047499 o la SEC ID N.°: 29 en el presente documento, o una variante de las mismas, cuya variante tiene una de las siguientes sustituciones o preferiblemente todas ellas: F100D, S283G, N456E, F512Y (usando la SEC ID N.°: 29 para la numeración).
[0029] De acuerdo con el proceso de la invención, el pH durante la licuefacción es de 4-6, por ejemplo, por encima de 4.8-6.0, por ejemplo, entre 5.0-5.8.
[0030] Según la invención, la temperatura está por encima de la temperatura de gelatinización inicial. El término "temperatura de gelatinización inicial" se refiere a la temperatura más baja a la que comienza la solubilización del almidón, típicamente por calentamiento. La temperatura puede variar para diferentes almidones. La temperatura inicial de gelatinización puede ser de 50-70 °C
[0031] En una realización, la temperatura durante la etapa de licuefacción i) está en el intervalo entre 75-90 °C, preferiblemente entre 80-90 °C, por ejemplo, alrededor de 85 °C.
[0032] En una realización, el proceso de la invención comprende además, antes del paso i), los pasos de:
a) reducir el tamaño de partícula del material que contiene almidón, preferiblemente mediante molienda en seco;
b) formar una suspensión que comprende agua y el material que contiene almidón.
[0033] El material de partida que contiene almidón, por ejemplo, los granos enteros, puede reducirse en tamaño de partícula, por ejemplo, mediante molienda, para abrir la estructura, aumentar el área de superficie y permitir un procesamiento adicional. En general, hay dos tipos de procesos: molienda en húmedo y en seco. En la molienda en seco se muelen y utilizan granos enteros. La molienda húmeda proporciona una buena separación de germen y harina (gránulos de almidón y proteínas). La molienda húmeda a menudo se aplica en lugares donde se usa el hidrolizado de almidón en la producción de, por ejemplo, jarabes. La molienda, tanto en seco como en húmedo, son bien conocidas en la técnica del procesamiento de almidón. De acuerdo con la presente invención, se prefiere la molienda en seco. En una realización, el tamaño de partícula se reduce hasta un valor entre 0.05 y 3.0 mm, preferiblemente 0.1-0.5 mm, o de modo que al menos el 30 %, preferiblemente al menos el 50 %, más preferiblemente al menos el 70 %, incluso más preferiblemente al menos el 90 % del material que contiene almidón pase a través de un tamiz con una malla de 0.05 a 3.0 mm, preferiblemente una malla de 0.1-0.5 mm. En otra realización, al menos el 50 %, preferiblemente al menos el 70 %, más preferiblemente al menos el 80 %, especialmente al menos el 90 % del material que contiene almidón pasa a través de un tamiz con malla 6.
[0034] La suspensión acuosa puede contener un 10-55 % p/p de sólidos secos (DS), preferiblemente un 25­ 45 % p/p de sólidos secos (DS), más preferiblemente un 30-40 % p/p de sólidos secos (DS) de material que contiene almidón.
[0035] La suspensión se puede calentar por encima de la temperatura de gelatinización inicial, preferiblemente entre 70-95 °C, por ejemplo entre 80-90 °C, preferiblemente entre pH 5.0 y 6.0, durante un tiempo de 30 minutos a 5 horas, por ejemplo, alrededor de 2 horas.
[0036] En una forma de realización preferida, la etapa de licuefacción i) se lleva a cabo durante 0.5-3 horas a una temperatura de 80-90 °C en un pH de 4-6.
[0037] La alfa-amilasa y la endoglucanasa termoestable, y la proteasa opcional, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos opcional, en particular la glucoamilasa, la pululanasa opcional y/o la fitasa opcional, pueden añadirse inicialmente a la suspensión acuosa para iniciar la licuefacción (dilución). En una realización, solo una porción de las enzimas se agrega a la suspensión acuosa, mientras que el resto de las enzimas se agregan durante la etapa de licuefacción i).
[0038] En una realización, la suspensión acuosa puede ser cocinada a chorro para gelatinizar aún más la suspensión antes de ser sometida a licuefacción en la etapa i). La cocción a chorro se puede llevar a cabo a una temperatura entre 95-160 °C, por ejemplo, entre 110-145 °C, preferiblemente 120-140 °C, por ejemplo 125-135 °C, preferiblemente alrededor de 130 °C durante aproximadamente 1 -15 minutos, preferiblemente durante aproximadamente 3-10 minutos, especialmente alrededor de aproximadamente 5 minutos.
Sacarificación y fermentación
[0039] De acuerdo con el proceso de la invención, una o más glucoamilasas pueden estar presentes y/o añadirse durante la etapa de sacarificación ii) y la etapa de fermentación iii). La glucoamilasa añadida durante la etapa de sacarificación ii) y la etapa de fermentación iii) es típicamente diferente de la enzima generadora de fuentes de carbohidratos opcional, en particular la glucoamilasa, opcionalmente añadida durante la etapa de licuefacción i). En una realización, la glucoamilasa se añade junto con una alfa-amilasa fúngica.
[0040] Se pueden encontrar ejemplos de glucoamilasas en la sección "Glucoamilasas presentes y/o añadidas durante la sacarificación y/o fermentación" más adelante.
[0041] Cuando se realiza la sacarificación y la fermentación secuenciales, la etapa de sacarificación ii) se puede llevar a cabo en condiciones bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la etapa de sacarificación ii) puede durar de aproximadamente 24 a aproximadamente 72 horas.
[0042] En una realización, se lleva a cabo una etapa de presacarificación. En una realización, se añade una enzima generadora de fuentes de carbohidratos durante la presacarificación realizada antes de la etapa de sacarificación ii) y/o la etapa de fermentación iii). La enzima generadora de fuentes de carbohidratos también se puede añadir durante la presacarificación realizada antes de la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF).
[0043] En una realización, se añade una enzima generadora de fuentes de carbohidratos, preferiblemente glucoamilasa, y/o la composición de enzimas celulolíticas durante la presacarificación realizada antes de la etapa de sacarificación (ii) y/o la etapa de fermentación (iii). La enzima generadora de fuentes de carbohidratos, preferiblemente glucoamilasa, y la composición de enzima celulolítica también se pueden añadir durante la presacarificación realizada antes de la sacarificación y la fermentación simultáneas (SSF).
[0044] La presacarificación se realiza típicamente durante 40-90 minutos a una temperatura entre 30-65 °C, típicamente a alrededor de 60 °C. En una realización, la presacarificación se lleva a cabo seguida de sacarificación durante la fermentación en el caso de sacarificación y fermentación simultáneas ("SSF"). La sacarificación se lleva a cabo típicamente a temperaturas de 20-75 °C, preferiblemente de 40-70 °C, típicamente alrededor de 60 °C, y a un pH entre 4 y 5, por ejemplo, alrededor de pH 4.5.
[0045] La sacarificación y fermentación simultáneas ("SSF") se utilizan ampliamente en los procesos de creación de productos de fermentación a escala industrial, especialmente en los procesos de producción de etanol. Al hacer SSF, la etapa de sacarificación ii) y la etapa de fermentación iii) se llevan a cabo simultáneamente. Puede que no haya una etapa de retención para la sacarificación, lo que significa que un organismo de fermentación, tal como levadura y enzima(s), en una realización preferida según la invención, se puede añadir una composición de glucoamilasa y una enzima celulolítica. Sin embargo, también se contempla agregar el organismo fermentador y la(s) enzima(s) por separado. La fermentación o la SSF pueden, según la invención, realizarse típicamente a una temperatura de 25 °C a 40 °C, por ejemplo, de 28 °C a 35 °C, por ejemplo, de 30 °C a 34 °C, preferiblemente alrededor de aproximadamente 32 °C. En una realización, la fermentación dura de 6 a 120 horas, en particular 24 a 96 horas. En una realización, el pH está entre 3.5-5, en particular entre 3.8 y 4.3.
Medio de fermentación
[0046] "Medios de fermentación" o "medio de fermentación" se refieren al entorno en el que se lleva a cabo la fermentación. El medio de fermentación incluye el sustrato de fermentación, es decir, la fuente de carbohidratos que es metabolizada por el organismo fermentador. De acuerdo con la invención, el medio de fermentación puede comprender nutrientes y estimuladores de crecimiento para los organismos de fermentación. Los estimuladores de nutrientes y crecimiento son ampliamente utilizados en la técnica de la fermentación e incluyen fuentes de nitrógeno, como el amoníaco; urea, vitaminas y minerales, o combinaciones de los mismos.
Organismos de fermentación
[0047] El término "organismo de fermentación" se refiere a cualquier organismo, incluidos organismos bacterianos y fúngicos, especialmente levadura, adecuado para su uso en un proceso de fermentación y capaz de crear el producto de fermentación deseado. Los organismos de fermentación especialmente adecuados son capaces de fermentar, es decir, convertir azúcares, como glucosa o maltosa, directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado, por ejemplo, el etanol. Según la invención, el organismo fermentador proviene de una cepa de Saccharomyces spp., en particular, Saccharomyces cerevisiae.
[0048] Una levadura de fermentación de etanol (p. ej., Saccharomyces cerevisiae) se añade al medio de fermentación para que el recuento de organismos de fermentación viables por ml de medio de fermentación esté en el rango de 105 a 1012, preferiblemente de 107 a 1010, especialmente alrededor de 5x107.
[0049] Los ejemplos de levadura comercialmente disponible incluyen, por ejemplo, levadura RED STAR™ y ETHANOL RED™ (disponible en Fermentis/Lesaffre, EE. UU.), FALI (disponible en levadura de Fleischmann, EE. UU.), Levadura fresca SUPERSTART y THERMOSACC™ (disponible en Ethanol Technology, WI) , EE. UU.), BIOFERM AFT y XR (disponible en NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, EE. UU.), Ge Rt STRAND (disponible en Gert Strand AB, Suecia) y FERMIOL (disponible en DSM Specialties).
Materiales que contienen almidón
[0050] De acuerdo con la presente invención se puede usar cualquier material adecuado que contenga almidón. El material de partida se selecciona generalmente basándose en producto de fermentación deseado. Los ejemplos de materiales que contienen almidón, adecuados para su uso en un proceso de la invención, incluyen granos enteros, maíz, trigo, cebada, centeno, mijo, sagú, yuca, tapioca, sorgo, arroz, guisantes, frijoles o batatas, o mezclas de los mismos o almidones derivados de los mismos, o cereales. También se contemplan los tipos cerosos y no cerosos de maíz y cebada.
[0051] En una realización preferida, el material que contiene almidón, usado para la producción de etanol según la invención, es maíz o trigo.
Productos de fermentación
[0052] El término "producto de fermentación" se refiere a un producto creado por un proceso que incluye una etapa de fermentación usando un organismo de fermentación. Los productos de fermentación contemplados según la invención incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol; polioles tales como glicerol, sorbitol e inositol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido succínico, ácido glucónico); cetonas (por ejemplo, acetona); aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico); gases (p. ej., H2 y CO2); antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina); enzimas vitaminas (p. ej., riboflavina, B12, betacaroteno); y hormonas. En una realización preferida, el producto de fermentación es etanol, por ejemplo, etanol combustible; etanol potable, es decir, bebidas espirituosas neutras potables; o etanol industrial o productos utilizados en la industria del consumo de alcohol (por ejemplo, cerveza y vino), industria láctea (por ejemplo, productos lácteos fermentados), industria del cuero e industria del tabaco. Los tipos de cerveza preferidos comprenden ales, cerveza negra, porter, lager, amargas, licores de malta, happoushu, cerveza con alto contenido de alcohol, cerveza con bajo contenido de alcohol, cerveza con bajo contenido calórico o cerveza light. Preferiblemente, los procesos de la invención se usan para producir un alcohol, p. ej., etanol. El producto de fermentación, como el etanol, obtenido de acuerdo con la invención, puede usarse como combustible, que típicamente se mezcla con gasolina. Sin embargo, en el caso del etanol, también puede usarse como etanol potable.
Recuperación
[0053] Después de la fermentación, o SSF, el producto de fermentación puede separarse del medio de fermentación. La suspensión se puede destilar para extraer el producto de fermentación deseado (por ejemplo, etanol). Alternativamente, el producto de fermentación deseado puede extraerse del medio de fermentación mediante técnicas de microfiltración o filtración por membrana. El producto de fermentación también puede recuperarse mediante separación u otro método bien conocido en la técnica.
Alfa-amilasa presente y/o añadida durante la licuefacción
[0054] De acuerdo con la invención, una alfa-amilasa está presente y/o se añade durante la licuefacción junto con una endoglucanasa que tiene la secuencia que se muestra como la SEC ID N.°: 3 o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEC iD N.°: 3 y además tiene un punto de fusión (DSC) por encima de 80 °C, y una proteasa opcional, una enzima generadora de fuentes de carbohidratos opcional, en particular una glucoamilasa, una pululanasa opcional y/o una fitasa opcional.
[0055] La alfa-amilasa añadida durante el paso de licuefacción i) puede ser cualquier alfa-amilasa. Se prefieren las alfa-amilasas bacterianas, especialmente, por ejemplo, las alfa-amilasas Bacillus , tales como las alfaamilasas de Bacillus stearothermophilus, que son estables a la temperatura utilizada durante la licuefacción.
Alfa-amilasa bacteriana
[0056] El término "alfa-amilasa bacteriana" se refiere a cualquier alfa-amilasa bacteriana clasificada en EC 3.2.1.1. Una alfa-amilasa bacteriana usada de acuerdo con la invención puede, por ejemplo, obtenerse de una cepa del género Bacillus, que a veces también se conoce como género Geobacillus. En una realización, la alfa-amilasa de Bacillus se obtiene de una cepa de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus sp. TS-23 o Bacillus subtilis, pero también puede obtenerse de otros Bacillus sp.
[0057] Los ejemplos específicos de alfa-amilasas bacterianas incluyen la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus de la SEC ID N.°: 3 en WO 99/19467, la alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens de la SEC ID N.°: 5 en WO 99/19467 y la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis de la SEC ID N.°: 4 en WO 99/19467 y la alfa-amilasa de Bacillus sp. TS-23 descrita como la SEC ID N.°: 1 en WO 2009/061380.
[0058] En una realización, la alfa-amilasa bacteriana puede ser una enzima que tiene un grado de identidad de al menos un 60 %, p. ej., al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % con cualquiera de las secuencias mostradas en las SEC ID N.°: 3, 4 o 5, respectivamente, en WO 99/19467 y la SEC ID N.°: 1 en WO 2009/061380.
[0059] En una realización, la alfa-amilasa puede ser una enzima que tiene un grado de identidad de al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % con cualquiera de las secuencias mostradas en la SEC ID N.°: 3 en WO 99/19467 o la SEC ID N.°: 1 en el presente documento.
[0060] En una realización preferida, la alfa-amilasa se obtiene de Bacillus stearothermophilus. La alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus puede ser de tipo salvaje maduro o una variante madura del mismo. Las alfaamilasas maduras de Bacillus stearothermophilus o sus variantes, pueden truncarse de manera natural durante la producción recombinante. Por ejemplo, la alfa-amilasa madura de Bacillus stearothermophilus puede estar truncada, por lo que tiene alrededor de 491 aminoácidos (en comparación con la SEC ID N.°: 3 en WO 99/19467), por ejemplo, de 480-495 aminoácidos.
[0061] La alfa-amilasa de Bacillus también puede ser una variante y/o un híbrido. Se pueden encontrar ejemplos de dicha variante en WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059, WO 02/10355 y WO2009/061380. Se describen variantes específicas de alfa-amilasa en las patentes EE. UU. n.° 6.093.562, 6.187.576, 6.297.038 y 7.713.723 e incluyen las variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (a menudo denominada BSG alfa-amilasa) que tienen una deleción de uno o dos aminoácidos en las posiciones R179, G180, 1181 y/o G182, preferiblemente una doble deleción descrita en WO 96/23873 (ver, por ejemplo, página 20, líneas 1-10), preferiblemente correspondientes a la deleción de las posiciones 1181 y G182 en comparación con la secuencia de aminoácidos de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus establecida en la SEC ID N.°: 3 descrita en WO 99/19467 o la SEC ID N.°: 1 en el presente documento o la deleción de los aminoácidos R179 y G180 usando la SEC ID N.°: 3 en WO 99/19467 o la SEC ID N.°: 1 en el presente documento para la numeración. Se prefieren aún más las alfa-amilasas de Bacillus, especialmente las alfa-amilasas de Bacillus stearothermophilus, que tienen una doble deleción correspondiente a una deleción de las posiciones 181 y 182 y además comprenden una sustitución N193F (también denominada I181* G182* N193F) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la BSG alfa-amilasa de tipo salvaje establecida en la SEC ID N.°: 3 descrita en WO 99/19467 o la SEC ID N.°: 1 en el presente documento. La alfa-amilasa bacteriana también puede tener una sustitución en una posición correspondiente a S239 en la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis mostrada en la SEC ID N.°: 4 en WO 99/19467, o una variante S242 de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus de la SEC ID N.°: 3 en WO 99/19467 o SEC ID N.°: 1 en el presente documento.
[0062] En una realización, la variante es una variante S242A, E o Q, preferiblemente una variante S242Q, de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (usando la SEC ID N.°: 1 en el presente documento para la numeración).
[0063] En una realización, la variante es una variante de posición E188, preferiblemente una variante E188P de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (usando la SEC ID N.°: 1 en el presente documento para la numeración).
[0064] Otra variante contemplada son las variantes de Bacillus sp. TS-23 descritas en WO2009/061380, especialmente las variantes definidas en la reivindicación 1 de WO2009/061380.
Alfa-amilasas híbridas bacterianas
[0065] La alfa-amilasa bacteriana también puede ser una alfa-amilasa bacteriana híbrida, por ejemplo, una alfa-amilasa que comprende 445 residuos de aminoácidos C-terminales de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (se muestra en la SEC ID N.°: 4 de WO 99/19467) y los 37 residuos de aminoácidos N-terminales de la alfa-amilasa obtenida de Bacillus amyloliquefaciens (se muestra en la SEC ID N.°: 5 de WO 99/19467) En una realización preferida, este híbrido tiene una o más de las siguientes sustituciones, especialmente todas: G48A T49I G107A H156Y A181T N190F I201F A209V Q264S (utilizando la numeración de Bacillus licheniformis en la SEC ID N.°: 4 de WO 99/19467). También se prefieren las variantes que tienen una o varias de las siguientes mutaciones (o mutaciones correspondientes en otras alfa-amilasas de Bacillus ): H154Y, A181T, N190F, A209V y Q264s y/o la deleción de dos residuos entre las posiciones 176 y 179, preferiblemente la deleción de E178 y G179 (usando la SEC ID N.°: 5 de WO 99/19467 para la numeración de la posición).
[0066] En una realización, la alfa-amilasa bacteriana es la parte madura de la alfa-amilasa quimérica descrita en Richardson et al., 2002, The Journal of Biological Chemistry 277 (29) :. 267501-26507, denominada BD5088 o una variante de la misma. Esta alfa-amilasa es la misma que se muestra en la SEC ID N.°: 2 en WO 2007134207. La secuencia enzimática madura comienza después del aminoácido "Met" inicial en la posición 1.
Alfa-amilasa termoestable
[0067] Según la invención, la alfa-amilasa utilizada en un proceso de la invención o comprendida en una composición en combinación con una endoglucanasa que tiene la secuencia mostrada como SEC ID N.°: 3 o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEC ID N.°: 3 y además con un punto de fusión (DSC) por encima de 80 °C, puede ser una alfa-amilasa termoestable, por ejemplo, una alfa-amilasa bacteriana termoestable, preferiblemente de Bacillus stearothermophilus o Bacillus sp. TS-23. En una realización, la alfa-amilasa usada según la invención tiene una T ^ (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM de al menos 10.
[0068] En una realización, la alfa-amilasa termoestable tiene una T ^ (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM, de al menos 15.
[0069] En una realización, la alfa-amilasa termoestable tiene una T ^ (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM, de al menos 20.
[0070] En una realización, la alfa-amilasa termoestable tiene una T ^ (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM, de al menos 25.
[0071] En una realización, la alfa-amilasa termoestable tiene una T ^ (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM, de al menos 30.
[0072] En una realización, la alfa-amilasa termoestable tiene una T ^ (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM, de al menos 40.
[0073] En una realización, la alfa-amilasa termoestable tiene una T ^ (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM, de al menos 50.
[0074] En una realización, la alfa-amilasa termoestable tiene una T ^ (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM, de al menos 60.
[0075] En una realización, la alfa-amilasa termoestable tiene una TA (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM, entre 10-70.
[0076] En una realización, la alfa-amilasa termoestable tiene una TA (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM, entre 15-70.
[0077] En una realización, la alfa-amilasa termoestable tiene una TA (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM, entre 20-70.
[0078] En una realización, la alfa-amilasa termoestable tiene una TA (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM, entre 25-70.
[0079] En una realización, la alfa-amilasa termoestable tiene una TA (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM, entre 30-70.
[0080] En una realización, la alfa-amilasa termoestable tiene una TA (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM, entre 40-70.
[0081] En una realización, la alfa-amilasa termoestable tiene una TA (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM, entre 50-70.
[0082] En una realización, la alfa-amilasa termoestable tiene una TA (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl20.12 mM, entre 60-70.
[0083] En una realización, la alfa-amilasa es una alfa-amilasa bacteriana, preferiblemente derivada del género Bacillus, especialmente una cepa de Bacillus stearothermophilus, en particular de Bacillus stearothermophilus según se describe en WO 99/19467 como la SEC ID N.°: 3 o la SEC ID N.°: 1 en el presente documento con uno o dos aminoácidos eliminados en las posiciones R179, G180, 1181 y/o G182, en particular con R179 y G180 eliminados, o con 1181 y G182 eliminados, con mutaciones en la siguiente lista de mutaciones.
[0084] En realizaciones preferidas, las alfa-amilasas de Bacillus stearothermophilus tienen doble deleción 1181 G182 y sustitución opcional N193F, además de mutaciones seleccionadas de la siguiente lista:
- V59A Q89R G112D E129V K177L R179E K220P N224L Q254S;
- V59A Q89R E129V K177L R179E H208Y K220P N224L Q254S;
- V59A Q89R E129V K177L R179E K220P N224L Q254S D269E D281N;
- V59A Q89R E129V K177L R179E K220P N224L Q254S I270L;
- V59A Q89R E129V K177L R179E K220P N224L Q254S H274K;
-V59A Q89R E129V K177L R179E K220P N224L Q254S Y276F;
-V59A E129V R157Y K177L R179E K220P N224L S242Q Q254S;
-V59A E129V K177L R179E H208Y K220P N224L S242Q Q254S;
- V59A E129V K177L R179E K220P N224L S242Q Q254S;
-V59A E129V K177L R179E K220P N224L S242Q Q254S H274K;
-V59A E129V K177L R179E K220P N224L S242Q Q254S Y276F;
-V59A E129V K177L R179E K220P N224L S242Q Q254S D281N;
- V59A E129V K177L R179E K220P N224L S242Q Q254S M284T;
- V59A E129V K177L R179E K220P N224L S242Q Q254S G416V;
- V59A E129V K177L R179E K220P N224L Q254S;
-V59A E129V K177L R179E K220P N224L Q254S M284T;
- A91L M96I E129V K177L R179E K220P N224L S242Q Q254S;
-E129V+ K177L+ R179E;
-E129V K177L R179E K220P N224L S242Q Q254S;
-E129V K177L R179E K220P N224L S242Q Q254S Y276F L427M;
- E129V K177L R179E K220P N224L S242Q Q254S M284T;
- E129V K177L R179E K220P N224L S242Q Q254S N376* I377*;
- E129V K177L R179E K220P N224L Q254S;
-E129V K177L R179E K220P N224L Q254S M284T;
- E129V K177L R179E S242Q;
-E129V K177L R179V K220P N224L S242Q Q254S;
-K220P N224L S242Q Q254S;
-M284V;
-V59A Q89R E129V K177L R179E Q254S M284V.
[0085] En una realización preferida, la alfa-amilasa se selecciona del grupo de variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus:
- I181* G182* N193F E129V K177L R179E;
- I181* G182* N193F V59A Q89R E129V K177L R179E H208Y K220P N224L Q254S;
- I181* G182* N193F V59A Q89R E129V K177L R179E Q254S M284V; y - I181* G182* N193F E129V K177L R179E K220P N224L S242Q Q254S (usando la SEC ID N.°: 1 en el presente documento para la numeración).
[0086] En una realización, la alfa-amilasa bacteriana, por ejemplo la alfa-amilasa de Bacillus , por ejemplo, la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus tiene al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 75 % de identidad, preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 91 %, más preferiblemente al menos un 92 %, incluso más preferiblemente al menos un 93 %, más preferiblemente al menos un 94 %, e incluso más preferiblemente al menos un 95 %, por ejemplo, incluso al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, por ejemplo, un 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEC ID N.°: 1 en el presente documento.
[0087] En una realización, la variante de alfa-amilasa bacteriana, por ejemplo la variante de alfa-amilasa de Bacillus , por ejemplo, la variante de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus tiene al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 75 % de identidad, preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 91 %, más preferiblemente al menos un 92 %, incluso más preferiblemente al menos un 93 %, más preferiblemente al menos un 94 %, e incluso más preferiblemente al menos un 95 %, por ejemplo, incluso al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, por ejemplo, un 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEC ID N.°: 1 en el presente documento.
[0088] Debe entenderse que cuando se hace referencia a la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus y variantes de las mismas estas se producen normalmente de forma natural en forma truncada. En particular, el truncamiento puede ser de modo que la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus mostrada en la SEC ID N.°: 3 en WO 99/19467 o la SEC ID N.°: 1 en el presente documento o variantes de la misma, se trunquen en el terminal C y típicamente tengan alrededor de 491 aminoácidos de longitud, por ejemplo, 480-495 aminoácidos de longitud.
Endoglucanasa termoestable presente y/o añadida durante la licuefacción
[0089] De acuerdo con la invención, una endoglucanasa ("EG") que tiene la secuencia mostrada como SEC ID N.°: 3 o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEC ID N.°: 3 y además tiene un punto de fusión (DSC) superior a 80, está presente y/o se añade a la etapa de licuefacción i) en combinación con una alfa-amilasa, por ejemplo, una alfa-amilasa bacteriana termoestable. La endoglucanasa y la alfaamilasa se pueden agregar individualmente o como una composición de una mezcla enzimática.
[0090] La termoestabilidad de una endoglucanasa puede determinarse tal como se describe en la sección "Materiales y métodos" en "Determinación de Td mediante calorimetría diferencial de barrido para endoglucanasas".
[0091] En una realización, la endoglucanasa tiene un punto de fusión (DSC) por encima de 82 °C, por ejemplo, por encima de 84 °C, por ejemplo, por encima de 86 °C, por ejemplo, por encima de 88 °C, por ejemplo, entre 80 °C y 92 °C, por ejemplo, entre 82 °C y 91 °C, por ejemplo entre 84 °C y 90 °C.
[0092] En una realización preferida, la endoglucanasa utilizada en un proceso de la invención comprendida en una composición es una endoglucanasa de la familia 5 de glucósido hidrolasa o endoglucanasa g H5 (consulte la base de datos CAZy en la página web "www.cazy.org"). En una realización, la endoglucanasa GH5 es de la familia EG II, por ejemplo, la endoglucanasa de Talaromyces leycettanus mostrada en la SEC ID N.°: 3 en el presente documento.
[0093] En una realización, la endoglucanasa tiene al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 91 %, más preferiblemente al menos un 92 %, incluso más preferiblemente al menos un 93 %, lo más preferiblemente al menos un 94 %, e incluso lo más preferible al menos un 95 %, por ejemplo, incluso al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, por ejemplo, un 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEC ID N.° : 3 en el presente documento. En una realización, la endoglucanasa se obtiene de una cepa del género Talaromyces, por ejemplo, una cepa de Talaromyces leycettanus.
[0094] En una realización, la endoglucanasa termoestable se agrega en la etapa de licuefacción i) en una dosis de 1-10000 pg PE (proteína enzimática)/g DS), por ejemplo, 10-1000 pg PE/g DS.
Proteasa presente y/o añadida durante la licuefacción
[0095] En una realización de la invención, una proteasa, por ejemplo, una proteasa termoestable, está presente y/o se añade durante la licuefacción junto con una alfa-amilasa, por ejemplo, una alfa-amilasa termoestable, y una endoglucanasa que tiene la secuencia mostrada como SEC iD N.°: 3 o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEC ID N.°: 3 y que además tiene un punto de Fusión (DSC) superior a 80 °C, y opcionalmente una enzima generadora de fuentes de carbohidratos, en particular una glucoamilasa, opcionalmente una pululanasa y/u opcionalmente una fitasa.
[0096] Las proteasas se clasifican en función de su mecanismo catalítico en los siguientes grupos: serina proteasas (S), cisteína proteasas (C), proteasas aspárticas (A), metaloproteasas (M) y proteasas desconocidas o aún sin clasificar (U ), ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J.Barrett, N.D.Rawlings, J.F.Woessner (eds), Academic Press (1998), en particular la parte de introducción general.
[0097] En una realización preferida, la proteasa termoestable usada según la invención es una "metaloproteasa" definida como una proteasa perteneciente a EC 3.4.24 (metaloendopeptidasas); preferiblemente EC 3.4.24.39 (metaloproteinasas ácidas).
[0098] Para determinar si una proteasa dada es una metaloproteasa o no, se hace referencia al "Handbook of Proteolytic Enzymes" antes mencionado y a los principios allí indicados. Dicha determinación puede llevarse a cabo para todos los tipos de proteasas, ya sean de origen natural o de tipo salvaje; o proteasas genéticamente modificadas o sintéticas.
[0099] La actividad de la proteasa se puede medir usando cualquier ensayo adecuado en el que se emplee un sustrato que incluya enlaces peptídicos relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión. El ensayo de pH y el de temperatura también se deben adaptar a la proteasa en cuestión. Ejemplos de valores de pH de ensayo son pH 6, 7, 8, 9, 10 u 11. Ejemplos de temperaturas de ensayo son 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 u 80 °C.
[0100] Ejemplos de sustratos de proteasa son la caseína, por ejemplo, la caseína reticulada con azurina (caseína AZCL). Más adelante se describen dos ensayos de proteasa en la sección "Materiales y métodos", de los cuales el denominado "ensayo de caseína AZCL" es el ensayo preferido.
[0101] En una realización, la proteasa termoestable tiene al menos un 20 %, por ejemplo, al menos un 30 %, por ejemplo, al menos un 40 %, por ejemplo, al menos un 50 %, por ejemplo, al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 80 %, por ejemplo, al menos un 90 %, por ejemplo, al menos un 95 %, por ejemplo, al menos un 100 % de la actividad de proteasa de la variante de proteasa 196 o proteasa Pfu determinada mediante el ensayo de caseína AZCL descrito en la sección "Materiales y Métodos".
[0102] No existen limitaciones en el origen de la proteasa termoestable utilizada en un proceso o composición de la invención siempre que cumpla con las propiedades de termoestabilidad definidas más adelante.
[0103] En una realización, la proteasa es de origen fúngico.
[0104] La proteasa termoestable puede ser una variante de, por ejemplo, una proteasa de tipo salvaje siempre que la proteasa tenga las propiedades de termoestabilidad definidas en el presente documento. En una realización preferida, la proteasa termoestable es una variante de una metaloproteasa tal como se ha definido anteriormente. En una realización, la proteasa termoestable usada en un proceso o composición de la invención es de origen fúngico, por ejemplo, una metaloproteasa fúngica, por ejemplo, una metaloproteasa fúngica obtenida de una cepa del género Thermoascus, preferiblemente una cepa de Thermoascus aurantiacus, especialmente Thermoascus aurantiacus CGMCC N.° 0670 (clasificado como EC 3.4.24.39).
[0105] En una realización, la proteasa termoestable es una variante de la parte madura de la metaloproteasa mostrada en la SEC ID N.°: 2 descrita en WO 2003/048353 o la parte madura de la SEC ID N.°: 1 en WO 2010/008841 y mostrada como SEC ID N.°: 2 más adelante en el presente documento con mutaciones seleccionadas de la siguiente lista:
- S5* D79L S87P A112P D142L;
- D79L S87P A112P T124V D142L;
- S5* N26R D79L S87P A112P D142L;
- N26R T46R D79L S87P A112P D142L;
- T46R D79L S87P T116V D142L;
- D79L+ P81R+ S87P+ A112P+ D142L;
- A27K D79L S87P A112P T124V D142L;
- D79L Y82F S87P A112P T124V D142L;
- D79L Y82F S87P A112P T124V D142L;
- D79L S87P A112P T124V A126V D142L;
- D79L S87P A112P D142L;
- D79L Y82F S87P A112P D142L;
- S38T D79L S87P A112P A126V D142L;
- D79L Y82F S87P A112P A126V D142L;
- A27K D79L S87P A112P A126V D142L;
- D79L S87P N98C A112P G135C D142L;
- D79L S87P A112P D142L T141C M161C;
- S36P D79L S87P A112P D142L;
- A37P D79L S87P A112P D142L;
- S49P D79L S87P A112P D142L;
- S50P D79L S87P A112P D142L;
- D79L S87P D104P A112P D142L;
- D79L Y82F S87G A112P D142L;
- S70V D79L Y82F S87G Y97W A112P D142L;
- D79L Y82F S87G Y97W D104P A112P D142L;
- S70V D79L Y82F S87G A112P D142L;
- D79L Y82F S87G D104P A112P D142L;
- D79L Y82F S87G A112P A126V D142L;
- Y82F S87G S70V D79L D104P A112P D142L;
- Y82F S87G D79L D104P A112P A126V D142L;
- A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L;
- A27K Y82F S87G D104P A112P A126V D142L;
- A27K D79L Y82F D104P A112P A126V D142L;
- A27K Y82F D104P A112P A126V D142L;
- A27K D79L S87P A112P D142L;
- D79L+ S87P+ D142L.
[0106] En una realización preferida, la proteasa termoestable es una variante de la metaloproteasa madura descrita como la parte madura de la SEC ID N.°: 2 descrita en WO 2003/048353 o la parte madura de la SEC ID N.°: 1 en WO 2010/008841 o la SEC ID N.°: 2 en el presente documento con las siguientes mutaciones:
D79L S87P A112P D142L;
D79L S87P D142L; o
A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L.
[0107] En una realización, la variante de proteasa tiene al menos un 75 % de identidad, preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 91 %, más preferiblemente al menos un 92 %, incluso más preferiblemente al menos un 93 %, lo más preferiblemente al menos un 94 %, e incluso lo más preferible al menos un 95 %, por ejemplo, incluso al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, por ejemplo, pero menos de un 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEC ID N.°: 2 descrita en WO 2003/048353 o la parte madura de la SEC ID N.°: 1 en WO 2010/008841 o la SEC ID N.°: 2 en el presente documento.
[0108] La proteasa termoestable también puede obtenerse de cualquier bacteria siempre que la proteasa tenga las propiedades de termoestabilidad definidas según la invención.
[0109] En una realización, la proteasa termoestable se obtiene de una cepa de la bacteria Pyrococcus, por ejemplo, una cepa de Pyrococcus furiosus (proteasa Pfu).
[0110] En una realización, la proteasa es una que se muestra como la SEC ID N.°: 1 en la patente EE. UU. n.° 6.358.726-B1 (Takara Shuzo Company) y la SEC ID N.°: 13 en el presente documento.
[0111] En otra realización, la proteasa termoestable es una descrita en la SEC ID N°: 13 en el presente documento o una proteasa que tiene al menos un 80 % de identidad, por ejemplo, al menos un 85 %, por ejemplo, al menos un 90 %, por ejemplo, al menos un 95 %, por ejemplo, al menos un 96 %, por ejemplo, al menos un 97 %, por ejemplo, al menos un 98 %, por ejemplo, al menos un 99 % de identidad con la SEC ID N.°: 1 en la patente EE. UU. n.° 6.358.726-B1 o la SEC iD N.°: 13 del presente documento. La proteasa de Pyrococcus furiosus se puede comprar en Takara Bio, Japón.
[0112] La proteasa de Pyrococcus furiosus es una proteasa termoestable según la invención. Se descubrió que el producto comercial proteasa de Pyrococcus furiosus (Pfu S) tenía una termoestabilidad del 110 % (80 °C/70 °C) y 103 % (90 °C/70 °C) a un pH 4.5 determinado tal como se describe en el ejemplo 2 de este documento.
[0113] En una realización, una proteasa termoestable usada en un proceso de la invención tiene un valor de termoestabilidad de más del 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C de la forma descrita en el ejemplo 2.
[0114] En una realización, la proteasa tiene una termoestabilidad de más del 30 %, más del 40 %, más del 50 %, más del 60 %, más del 70 %, más del 80 %, más del 90 %, más del 100 %, por ejemplo, más del 105 %, por ejemplo, más del 110 %, por ejemplo, más del 115 %, por ejemplo, más del 120 % determinada como actividad relativa a 80 °C/70 °C.
[0115] En una realización, la proteasa tiene una termoestabilidad de entre el 20 y el 50 %, por ejemplo, entre el 20 y el 40 %, por ejemplo, el 20 y el 30 % determinada como actividad relativa a 80 °C/70 °C.
[0116] En una realización, la proteasa tiene una termoestabilidad de entre el 50 y el 115 %, por ejemplo, entre el 50 y el 70 %, por ejemplo, entre el 50 y el 60 %, por ejemplo, entre el 100 y el 120 %, por ejemplo, entre el 105 y el 115 % determinada como actividad relativa a 80 °c /70 °C.
[0117] En una realización, la proteasa tiene un valor de termoestabilidad de más del 10 % determinado como actividad relativa a 85 °C/70 °C de la forma descrita en el ejemplo 2.
[0118] En una realización, la proteasa tiene una termoestabilidad de más del 10 %, por ejemplo, más del 12 %, más del 14 %, más del 16 %, más del 18 %, más del 20 %, más del 30 %, más del 40 %, más del 50 %, más del 60 %, más del 70 %, más del 80 %, más del 90 %, más del 100 %, más del 110 % determinada como actividad relativa a 85 °C/70 °C.
[0119] En una realización, la proteasa tiene una termoestabilidad de entre el 10 y el 50 %, por ejemplo, entre el 10 y el 30 %, por ejemplo, entre el 10 y el 25 % determinada como actividad relativa a 85 °C/70 °C.
[0120] En una realización, la proteasa tiene más del 20 %, más del 30 %, más del 40 %, más del 50 %, más del 60 %, más del 70 %, más del 80 %, más del 90 % determinada como actividad restante a 80 °C; y/o
[0121] En una realización, la proteasa tiene más del 20 %, más del 30 %, más del 40 %, más del 50 %, más del 60 %, más del 70 %, más del 80 %, más del 90 % determinada como actividad restante a 84 °C.
[0122] La determinación de la "actividad relativa" y la "actividad restante" se realiza como se describe en el ejemplo 2.
[0123] En una realización, la proteasa puede tener una capacidad de estabilidad por encima de 90, por ejemplo, por encima de 100 a 85 °C tal como se determina usando el ensayo de zeína-BCA según se describe en el ejemplo 3.
[0124] En una realización, la proteasa tiene una estabilidad por encima del 60 %, por ejemplo, por encima del 90 %, por ejemplo, por encima del 100 %, por ejemplo, por encima del 110 % a 85 °C, según se determina usando el ensayo de zeína-BCA.
[0125] En una realización, la proteasa tiene una estabilidad de entre el 60-120, por ejemplo, entre el 70-120 %, por ejemplo, entre el 80-120 %, por ejemplo, entre el 90-120 %, por ejemplo, entre el 100-120 %, por ejemplo, el 110-120 % a 85 °C tal como se determina usando el ensayo de zeína-BCA.
[0126] En una realización, la proteasa termoestable tiene al menos un 20 %, por ejemplo, al menos un 30 %, por ejemplo, al menos un 40 %, por ejemplo, al menos un 50 %, por ejemplo, al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 80 %, por ejemplo, al menos un 90 %, por ejemplo, al menos un 95 %, por ejemplo, al menos un 100 % de la actividad de la variante de proteasa JTP196 o proteasa Pfu determinada mediante el ensayo de caseína AZCL.
Enzima generadora de fuentes de carbohidratos presente y/o añadida durante la licuefacción
[0127] Según la invención, una enzima generadora de fuentes de carbohidratos, en particular una glucoamilasa, preferiblemente una glucoamilasa termoestable, puede estar presente y/o añadirse durante la licuefacción junto con una alfa-amilasa, por ejemplo, una alfa-amilasa termoestable, y una endoglucanasa con un punto de fusión (DSC) por encima de los 70 °C, y opcionalmente una pululanasa y/u opcionalmente una fitasa.
[0128] El término "enzima generadora de fuentes de carbohidratos" incluye cualquier enzima que genere azúcares fermentables. Una enzima generadora de fuentes de carbohidratos es capaz de producir un carbohidrato que puede ser utilizado como fuente de energía por el organismo u organismos de fermentación en cuestión, por ejemplo, cuando se usa en un proceso de la invención para producir un producto de fermentación, por ejemplo, etanol. Los carbohidratos generados pueden convertirse directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado, preferiblemente etanol. Según la invención, se puede usar una mezcla de enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos. Ejemplos específicos incluyen glucoamilasa (que son generadores de glucosa), beta-amilasa y amilasa maltogénica (que son generadores de maltosa).
[0129] En una realización preferida, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos es termoestable. La enzima generadora de fuentes de carbohidratos, en particular la glucoamilasa termoestable, se puede agregar junto con o por separado de la alfa-amilasa y la proteasa termoestables.
[0130] En una realización, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos, preferiblemente una glucoamilasa termoestable, tiene una estabilidad térmica de actividad relativa a 85 °C de al menos el 20 %, al menos el 30 %, preferiblemente de al menos el 35 % determinada como se describe en el ejemplo 4 (estabilidad térmica).
[0131] En una realización, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos es una glucoamilasa que tiene un pH óptimo de actividad relativa a pH 5.0 de al menos el 90 %, preferiblemente de al menos el 95 %, preferiblemente de al menos el 97 %, por ejemplo, el 100 % determinado como se describe en el ejemplo 4 (pH óptimo).
[0132] En una realización, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos es una glucoamilasa que tiene una estabilidad de pH a pH 5.0 de al menos el 80 %, de al menos el 85 %, de al menos el 90 % determinada como se describe en el ejemplo 4 (estabilidad de pH).
[0133] En una realización específica y preferida, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos es una glucoamilasa termoestable, preferiblemente de origen fúngico, preferiblemente un hongo filamentoso, tal como de una cepa del género Penicillium, especialmente una cepa de Penicillium oxalicum, en particular la glucoamilasa de Penicillium oxalicum descrita como la SEC ID N.°: 2 en WO 2011/127802 y mostrada en las SEC ID N.°: 14 en el presente documento.
[0134] En una realización, la glucoamilasa termoestable tiene al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 91 %, más preferiblemente al menos un 92 %, incluso más preferiblemente al menos un 93 %, lo más preferible al menos un 94 %, e incluso lo más preferible al menos un 95 %, tal como incluso al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad con el polipéptido maduro que se muestra en la SEC ID N.°: 2 en WO 2011/127802 o las SEC ID N.°: 14 en el presente documento.
[0135] En una realización, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos, en particular glucoamilasa termoestable, es la glucoamilasa de Penicillium oxalicum mostrada en la SEC ID N.°: 14 en el presente documento.
[0136] En una realización preferida, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos es una variante de glucoamilasa de Penicillium oxalicum descrita como la SEC ID N.°: 2 en WO 2011/127802 y mostrada en las SEC ID N.°: 9 o 14 en el presente documento, que tiene una sustitución K79V (denominada "PE001") (usando la secuencia madura mostrada en la SEC ID N.°: 14 para la numeración). La variante de glucoamilasa K79V tiene una sensibilidad reducida a la degradación de la proteasa en relación con la progenitora tal como se describe en WO 2013/036526.
[0137] En una realización, la glucoamilasa termoestable es una variante de glucoamilasa de Penicillium oxalicum descrita como la SEC ID N.°: 2 en WO 2011/127802 y se muestra como la secuencia madura en la SEC ID N.°: 9 o 14 en el presente documento. En una realización preferida, la glucoamilasa de Penicillium oxalicum es la descrita como la SEC ID N.°: 2 en WO 2011/127802 y mostrada en las SEC ID N.°: 9 o 14 en el presente documento que tiene Val (V) en la posición 79 (usando SEC ID N.°: 14 en el presente documento para la numeración).
[0138] Las variantes de glucoamilasa de Penicillium oxalicum contempladas se describen en WO 2013/053801.
[0139] En una realización, estas variantes tienen una sensibilidad reducida a la degradación de la proteasa.
[0140] En una realización, estas variantes tienen termoestabilidad mejorada en comparación con la progenitora.
[0141] Más específicamente, en una realización, la glucoamilasa tiene una sustitución K79V (usando la SEC ID N.°: 14 en el presente documento para la numeración), correspondiente a la variante PE001, y además comprende al menos una de las siguientes sustituciones o combinaciones de sustituciones:
T65A; o
Q327F; o
E501V; o
Y504T; o
Y504*; o
T65A Q327F; o
T65A E501V; o
T65A Y504T; o
T65A Y504*; o
Q327F E501V; o
Q327F Y504T; o
Q327F Y504*; o
E501V Y504T; o
E501V Y504*; o
T65A Q327F E501V; o
T65A Q327F Y504T; o
T65A E501V Y504T; o
Q327F E501V Y504T; o
T65A Q327F Y504*; o
T65A E501V Y504*; o
Q327F E501V Y504*; o
T65A Q327F E501V Y504T; o
T65A Q327F E501V Y504*;
E501V Y504T; o
T65A K161S; o
T65A Q405T; o
T65A Q327W; o
T65A Q327F; o
T65A Q327Y; o
P11F T65A Q327F; o
R1K D3W K5Q G7V N8S T10K P11S T65A Q327F; o
P2N P4S P11F T65A Q327F; o
P11F D26C K33C T65A Q327F; o
P2N P4S P11F T65A Q327W E501V Y504T; o
R1E D3N P4G G6R G7A N8A T10D P11D T65A Q327F; o
P11F T65A Q327W; o
P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T; o
P11F T65A Q327W E501V Y504T; o
T65A Q327F E501V Y504T; o
T65A S105P Q327W; o
T65A S105P Q327F; o
T65A Q327W S364P; o
T65A Q327F S364P; o
T65A S103N Q327F; o
P2N P4S P11F K34Y T65A Q327F; o
P2N P4S P11F T65A Q327F D445N V447S; o
P2N P4S P11F T65A 1172V Q327F; o
P2N P4S P11F T65A Q327F N502*; o
P2N P4S P11F T65A Q327F N502T P563S K571E; o
P2N P4S P11F R31S K33V T65A Q327F N564D K571S; o
P2N P4S P11F T65A Q327F S377T; o
P2N P4S P11F T65A V325T Q327W; o
P2N P4S P11F T65A Q327F D445N V447S E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A 1172V Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A Q327F S377T E501V Y504T; o
P2N P4S P11F D26N K34Y T65A Q327F; o
P2N P4S P11F T65A Q327F I375A E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A K218A K221D Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A S103N Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S T10D T65A Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S F12Y T65A Q327F E501V Y504T; o
K5A P11F T65A Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S T10E E18N T65A Q327F E501V Y504T; o
P2N T10E E18N T65A Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T T568N; o
P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T K524T G526A; o
P2N P4S P11F K34Y T65A Q327F D445N V447S E501V Y504T; o
P2N P4S P11F R31S K33V T65A Q327F D445N V447S E501V Y504T; o
P2N P4S P11F D26N K34Y T65A Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A F80* Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A K112S Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T T516P K524T G526A; o
P2N P4S P11F T65A Q327F E501V N502T Y504*; o
P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A S103N Q327F E501V Y504T; o
K5A P11F T65A Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T T516P K524T G526A; o
P2N P4S P11F T65A V79A Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A V79G Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A V79I Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A V79L Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A V79S Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A L72V Q327F E501V Y504T; o
S255N Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A E74N Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A G220N Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A Y245N Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A Q253N Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A D279N Q327F E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A Q327F S359N E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A Q327F D370N E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A Q327F V460S E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A Q327F V460T P468T E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A Q327F T463N E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A Q327F S465N E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A Q327F T477N E501V Y504T.
[0142] En una realización preferida, la variante de glucoamilasa de Penicillium oxalicum tiene una sustitución K79V usando la SEC ID N.°: 14 en el presente documento para la numeración (variante PE001), y además comprende una de las siguientes mutaciones:
P11F T65A Q327F; o
P2N P4S P11F T65A Q327F; o
P11F D26C K33C T65A Q327F; o
P2N P4S P11F T65A Q327W E501V Y504T; o
P2N P4S P11F T65A Q327F E501V Y504T; o
P11F T65A Q327W E501V Y504T.
[0143] En una realización, la variante de glucoamilasa, por ejemplo, la variante de glucoamilasa de Penicillium oxalicum tiene al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 75 % de identidad, preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 91 %, más preferiblemente al menos un 92 %, incluso más preferiblemente al menos un 93 %, más preferiblemente al menos un 94 %, e incluso más preferiblemente al menos un 95 %, por ejemplo, incluso al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, por ejemplo, un 100 % de identidad con el polipéptido maduro de la SEC ID N.°: 14 en el presente documento.
[0144] La enzima generadora de fuentes de carbohidratos, en particular, se puede agregar en cantidades de 0.1 a 100 microgramos EP/g, por ejemplo, 0.5-50 microgramos EP/g, por ejemplo, 1-25 microgramos EP/g, por ejemplo, 2-12 microgramos EP/g d S.
Pululanasa presente y/o añadida durante la licuefacción
[0145] Opcionalmente, una pululanasa puede estar presente y/o agregarse durante la etapa de licuefacción i) junto con una alfa-amilasa, una endoglucanasa que tiene la secuencia mostrada como SEC ID N.°: 3 o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEC ID N.°: 3 y además tiene un punto de fusión (DSC) por encima de 80 °C, y una proteasa. Tal como se ha mencionado anteriormente, una enzima generadora de fuentes de carbohidratos, preferiblemente una glucoamilasa termoestable, también puede estar presente y/o agregarse durante la etapa de licuefacción i).
[0146] La pululanasa puede estar presente y/o añadirse durante la etapa de licuefacción i) y/o la etapa de sacarificación ii) o la sacarificación y fermentación simultáneas.
[0147] Las pululanasas (E.C. 3.2.1.41, pululan 6-glucano-hidrolasa), son enzimas desramificantes caracterizadas por su capacidad de hidrolizar los enlaces alfa-1,6-glucosídicos en, por ejemplo, amilopectina y pululano.
[0148] Las pululanasas contempladas incluyen las pululanasas de Bacillus amyloderamificans descritas en la patente EE. UU. n.° 4.560.651, la pululanasa descrita como la SEC ID N.°: 2 en WO 01/151620, la Bacillus deramificans descrita como la SEC ID N.°: 4 en WO 01/151620 y la pululanasa de Bacillus acidopullulyticus descrita como la SEC ID N.°: 6 en WO 01/151620 y también descrita en FEMS Mic. Let. (1994) 115, 97-106.
[0149] Las pululanasas adicionales contempladas según la presente invención incluyen las pululanasas de Pyrococcus woesei, específicamente de Pyrococcus woesei DSM n.° 3773 descritas en WO 92/02614.
[0150] En una realización, la pululanasa es una pululanasa de la familia GH57. En una realización, la pululanasa incluye un dominio X47 tal como se describe en WO 2011/087836. Más específicamente, la pululanasa puede obtenerse de una cepa del género Thermococcus, incluyendo Thermococcus litoralis y Thermococcus hydrothermalis, por ejemplo, la pululanasa de Thermococcus hydrothermalis mostrada en WO 2011/087836 truncada en el sitio X4 justo después del dominio X47. La pululanasa también puede ser un híbrido de las pululanasas de Thermococcus litoralis y Thermococcus hydrothermalis o una enzima híbrida de T. hydrothermalis/T. litoralis con sitio de truncamiento X4 descrito en W o 2011/087836 (que se incorpora en el presente documento mediante referencia).
[0151] En otra realización, la pululanasa es tal que comprende un dominio X46 descrito en WO 2011/076123 (Novozymes)
[0152] La pululanasa puede añadirse según la invención en una cantidad eficaz que incluye la cantidad preferida de aproximadamente 0.0001-10 mg de proteína enzimática por gramo de DS, preferiblemente 0.0001-0.10 mg de proteína enzimática por gramo de DS, más preferiblemente 0.0001-0.010 mg de proteína enzimática por gramo de DS. La actividad de pululanasa se puede determinar como NPUN. Un ensayo para la determinación de NPUN se describe en la sección "Materiales y métodos" más adelante.
[0153] Los productos de pululanasa disponibles comercialmente adecuados incluyen PROMOZYME 400L, PROMOZYME™ D2 (Novozymes A/S, Dinamarca), OPTIMAX L-300 (Genencor Int., EE. UU.) y AMANO 8 (Amano, Japón).
Fitasa presente y/o añadida durante la licuefacción
[0154] Opcionalmente, una fitasa puede estar presente y/o añadirse durante la licuefacción en combinación con una alfa-amilasa y una endoglucanasa con un punto de fusión (DSC) por encima de 70 °C.
[0155] Una fitasa usada de acuerdo con la invención puede ser cualquier enzima capaz de efectuar la liberación de fosfato inorgánico del ácido fítico (mioinositol hexakisfosfato) o de cualquier sal del mismo (fitatos). Las fitasas se pueden clasificar según su especificidad en la etapa de hidrólisis inicial, esto es, según qué grupo fosfato-éster se hidroliza primero. La fitasa que se va a usar en la invención puede tener cualquier especificidad, por ejemplo, una 3-fitasa (EC 3.1.3.8), una 6-fitasa (EC 3.1.3.26) o una 5-fitasa (sin número de EC). En una realización, la fitasa tiene una temperatura óptima superior a 50 °C, por ejemplo, en el intervalo de 50-90 °C.
[0156] La fitasa puede obtenerse de plantas o microorganismos, tales como bacterias u hongos, por ejemplo, hongos de levadura o filamentosos.
[0157] Una fitasa vegetal puede ser de salvado de trigo, maíz, soja o polen de lirio. Las fitasas vegetales adecuadas se describen en Thomlinson et al., Biochemistry, 1 (1962), 166-171; Barrientos et al., Plant. Physiol., 106 (1994), 1489-1495; WO 98/05785; WO 98/20139.
[0158] Una fitasa bacteriana puede ser de los géneros Bacillus, Citrobacter, Hafnia, Pseudomonas, Buttiauxella o Escherichia, específicamente las especies Bacillus subtilis, Citrobacter braakii, Citrobacter freundii, Hafnia alvei, Buttiauxella gaviniae, Buttiauxella agrestis, Buttiauxella noackies y E. coli. Las fitasas bacterianas adecuadas se describen en Paver y Jagannathan, 1982, Journal of Bacteriology 151: 1102-1108; Cosgrove, 1970, Australian Journal of Biological Sciences 23: 1207-1220; Greiner et al., Arch. Biochem. Biophys., 303, 107-113, 1993; WO 1997/33976; WO 1997/48812, WO 1998/06856, WO 1998/028408, WO 2004/085638, WO 2006/037327, WO 2006/038062, WO 2006/063588, WO 2008/092901, WO 2008/116878 y WO 2010/034835.
[0159] Una fitasa de levadura puede obtenerse de los géneros Saccharomyces o Schwanniomyces, específicamente las especies Saccharomyces cerevisiae o Schwanniomyces occidentalis. La enzima anterior se ha descrito como una levadura adecuada. Las fitasas se describen en Nayini et al, 1984, Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17: 24-26; Wodzinski et al., Adv. Appl. Microbiol., 42, 263-303; AU-A-24840/95; Las fitasas de hongos filamentosos pueden obtenerse del filo fúngico de Ascomycota (ascomicetos) o del filo Basidiomycota, por ejemplo, los géneros Aspergillus, Thermomyces (también llamado Humicola), Myceliophthora, Monascus, Penicillium, Peniophora, Agrocybe, Paxillus, o Trametes, específicamente las especies Aspergillus terreus, Aspergillus niger, Aspergillus niger var. awamori Aspergillus ficuum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus oryzae, T. lanuginosus (también conocido como H. lanuginosa), Myceliophthora thermophila, Peniophora lycii, Agrocybe pediades, Monascus anka, Paxillus involutus o Trametes pubescens. Fitasas fúngicas adecuadas se describen en Yamada et al., 1986, Agric. Biol. Chem 322: 1275-1282; Piddington et al., 1993, Gene 133: 55-62; EP 684 313; EP 0420 358; EP 0684 313; WO 1998/28408; WO 1998/28409; JP 7-67635; WO 1998/44125; WO 1997/38096; WO 1998/13480.
[0160] En una realización preferida, la fitasa se obtiene de Buttiauxella, por ejemplo, Buttiauxella gaviniae, Buttiauxella agrestis o Buttiauxella noackies, por ejemplo, las descritas como SEC ID N.°: 2, SEC ID N.°: 4 y SEC ID N.°: 6, respectivamente, en WO 2008/092901.
[0161] En una realización preferida, la fitasa se obtiene de Citrobacter, por ejemplo, Citrobacterbraakii, como la descrita en WO 2006/037328.
[0162] Las fitasas modificadas o las variantes de fitasa se pueden obtener por métodos conocidos en la técnica, en particular por los métodos descritos en EP 897010; EP 897985; WO 99/49022; WO 99/48330, WO 2003/066847, WO 2007/112739, WO 2009/129489 y WO 2010/034835.
[0163] Los productos con contenido de fitasa disponibles comercialmente incluyen BIO-FEED PHYTASE™, PHYTASE NOVO™ CT o L (todos de Novozymes), LIQMAX (DuPont) o RONOZYME™ NP, RONOZYME® HiPhos, RONOZYME® P5000 (CT), NATUPHOS™ NG 5000 (de DSM).
Glucoamilasa presente y/o añadida durante la sacarificación y/o la fermentación
[0164] De acuerdo con la invención, una glucoamilasa, está presente y/o se añade durante la sacarificación y la fermentación.
[0165] En una realización preferida, la glucoamilasa es de origen fúngico, preferiblemente de una cepa de Aspergillus, preferiblemente A. Niger, A. Awamori o A. oryzae; o una cepa de Trichoderma, preferiblemente T. reesei; o una cepa de Talaromyces, preferiblemente T. emersonii,
Glucoamilasa
[0166] De acuerdo con la invención, la glucoamilasa presente y/o añadida durante la sacarificación y/o la fermentación puede derivarse de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, de un microorganismo o una planta. Las glucoamilasas preferidas son de origen fúngico o bacteriano, seleccionadas del grupo que consiste en glucoamilasas de Aspergillus , en particular glucoamilasas de Aspergillus niger G1 o G2 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), págs. 1097-1102), o sus variantes, como las descritas en WO 92/00381, WO 00/04136 y w O 01/04273 (de Novozymes, Dinamarca); la glucoamilasa de A. awamori descrita en WO 84/02921, la glucoamilasa de Aspergillus oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), págs. 941-949), o variantes o fragmentos de las mismas. Otras variantes de glucoamilasa de Aspergillus incluyen variantes con estabilidad térmica mejorada: G137A y G139A (Chen et al. (1996), Prot. Eng. 9, 499-505); D257E y D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Eng. 8, 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); enlaces disulfuro, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704; e introducción de residuos Pro en las posiciones A435 y S436 (Li et al. (1997), Protein Eng. 10, 1199-1204.
[0167] Otras glucoamilasas incluyen glucoamilasa de Athelia rolfsii (anteriormente designado Corticium rolfsii) (ver patente EE. UU. n.° 4.727.026 y (Nagasaka et al. (1998) Purification and properties of the raw-starchdegrading glucoamylases from Corticium rolfsii, Appl Microbiol Biotechnol 50: 323-330), glucoamilasas de Talaromyces, en particular derivadas de Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (patente EE. UU. n.° Re. 32.153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (patente EE. UU. n.° 4.587.215). En una realización preferida, la glucoamilasa usada durante la sacarificación y/o la fermentación es la glucoamilasa de Talaromyces emersonii descrita en WO 99/28448.
[0168] Las glucoamilasas bacterianas contempladas incluyen glucoamilasas del género Clostridium, en particular C. Thermoamylolyticum (EP 135,138), y C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831).
[0169] Las glucoamilasas fúngicas contempladas incluyen Trametes cingulata, Pachykytospora papyracea y Leucopaxillus giganteus todas descritas en WO 2006/069289; y Peniophora rufomarginata descrita en WO2007/124285; o una mezcla de las mismas. También se contempla la glucoamilasa híbrida según la invención. Los ejemplos incluyen las glucoamilasas híbridas descritas en WO 2005/045018. Los ejemplos específicos incluyen la glucoamilasa híbrida descrita en las tablas 1 y 4 del ejemplo 1 (cuyos híbridos se incorporan en el presente documento mediante referencia).
[0170] En una realización, la glucoamilasa se deriva de una cepa del género Pycnoporus, en particular una cepa de Pycnoporus tal como se describe en WO 2011/066576 (SEC ID N.° 2, 4 o 6), o de una cepa del género Gloephyllum, en particular una cepa de Gloephyllum tal como se describe en WO 2011/068803 (SEC ID N.°: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16) o una cepa del género Nigrofomes, en particular una cepa de Nigrofomes sp. descrita en WO 2012/064351 (SEC ID N.°: 2) (todas las referencias incorporadas en el presente documento mediante referencia). También se contemplan las glucoamilasas que exhiben una alta identidad con cualquiera de las glucoamilasas mencionadas anteriormente, es decir, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, por ejemplo, un 100 % de identidad con cualquiera de las partes maduras de las secuencias enzimáticas mencionadas anteriormente.
[0171] Las glucoamilasas pueden añadirse en una realización a la sacarificación y/o fermentación en una cantidad de 0.0001-20 AGU/g de DS, preferiblemente 0.001-10 AGU/g de DS, especialmente entre 0.01-5 AGU/g de DS, por ejemplo, 0.1-2 AGU/g de DS.
[0172] Las composiciones disponibles comercialmente que comprenden glucoamilasa incluyen AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME™ ULTRA, SPIRIZYME™ EXCEL, SPIRIZYME ACHIEVE y AMG™ E (de Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300, GC480, GC417 (de Genencor Int.); AMIGASE™ y AMIGASE™ PLUS (de DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ y G990 ZR (de Genencor Int.).
Amilasa maltogénica
[0173] La enzima generadora de fuentes de carbohidratos presente y/o añadida durante la sacarificación y/o la fermentación también puede ser una alfa-amilasa maltogénica. Una "alfa-amilasa maltogénica" (glucano 1,4-alfa-maltohidrolasa, E.C. 3.2.1.133) es capaz de hidrolizar amilosa y amilopectina para maltosa en la configuración alfa. Una amilasa maltogénica de la cepa NCIB 11837 de Bacillus stearothermophilus está disponible comercialmente en Novozymes A/S. Las alfa-amilasas maltogénicas se describen en las patentes EE. UU. n.° 4.598.048, 4.604.355 y 6.162.628, que se incorporan aquí mediante referencia. La amilasa maltogénica puede añadirse en una realización preferida en una cantidad de 0.05-5 mg de proteína total/g de DS o 0.05-5 MANU/g de DS.
Composición de celulasa o enzima celulolítica presente y/o añadida durante la sacarificación y/o la fermentación o la SSF
[0174] En una realización preferida de la invención, una composición de celulasa o enzima celulolítica está presente y/o se añade durante la sacarificación en el paso ii) y/o la fermentación en el paso iii) o la SSF.
[0175] La composición de celulasa o enzima celulolítica puede comprender una o más enzimas celulolíticas. La composición de celulasa o enzima celulolítica puede ser de cualquier origen. En una realización preferida, la composición de celulasa o enzima celulolítica comprende enzimas celulolíticas de origen fúngico.
[0176] En una realización, la composición de celulasa o enzima celulolítica se obtiene de una cepa de Trichoderma, por ejemplo, Trichoderma reesei; o una cepa de Humicola, por ejemplo, Humicola insolens; o una cepa de Chrysosporium, por ejemplo, Chrysosporium lucknowense; o una cepa de Penicillium, por ejemplo, Penicillium decumbens. En una realización preferida, la composición de enzima celulolítica se obtiene de una cepa de Trichoderma reesei.
[0177] La celulasa puede ser una beta-glucosidasa, una celobiohidrolasa y una endoglucanasa o una combinación de las mismas.
[0178] La composición de enzima celulolítica puede comprender una beta-glucosidasa, una celobiohidrolasa y una endoglucanasa.
[0179] En una realización, la composición de celulasa o enzima celulolítica que comprende uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consta de:
beta-glucosidasa;
celobiohidrolasa I;
celobiohidrolasa II;
o una mezcla de las mismas.
[0180] En una realización preferida, la composición de celulasa o enzima celulolítica comprende además un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica. La actividad potenciadora celulolítica se define y se determina tal como se describe en WO 2011/041397 (incorporado mediante referencia).
[0181] El término "polipéptido GH61 con actividad potenciadora celulolítica" significa un polipéptido GH61 que mejora la hidrólisis de un material celulósico mediante enzimas que tienen actividad celulolítica. Para los fines de la presente invención, la actividad de mejora celulolítica puede determinarse midiendo el aumento de azúcares reductores o el aumento del total de celobiosa y glucosa de la hidrólisis de un material celulósico mediante enzimas celulolíticas en las siguientes condiciones: 1-50 mg de proteína total/g de celulosa en PCS (rastrojo de maíz pretratado), donde la proteína total está compuesta por un 50-99.5 % p/p de proteína enzimática celulolítica y un 0.5-50 % p/p de proteína de un polipéptido GH61 con actividad potenciadora celulolítica durante 1-7 días a 50 °C en comparación con una hidrólisis de control con igual carga de proteína total sin actividad potenciadora celulolítica (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulosa en PCS). En un aspecto preferido, una mezcla de CELLUCLAST™ 1.5L (Novozymes A/S, Bagsv^rd, Dinamarca) en presencia de un 2-3 % del peso total proteico de beta-glucosidasa de Aspergillus oryzae (producida de manera recombinante en Aspergillus oryzae según WO 02/095014) o un 2-3 % del peso total proteico de betaglucosidasa de Aspergillus fumigatus (producida de manera recombinante en Aspergillus oryzae tal como se describe en WO 2002/095014) de la carga de proteína de celulasa se utiliza como fuente de la actividad celulolítica.
[0182] La composición de enzima celulolítica puede comprender una beta-glucosidasa, preferiblemente una obtenida de una cepa del género Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus oryzae como la descrita en WO 2002/095014 o la proteína de fusión que tiene actividad beta-glucosidasa descrita en WO 2008/057637 (vea las SEC ID N.°: 74 o 76), o Aspergillus fumigatus, como la descrita en la SEC ID N.°: 2 en WO 2005/047499 o la SEC ID N.°: 29 en el presente documento o una variante de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus descrita en WO 2012/044915; o una cepa del género Penicillium, por ejemplo, una cepa de Penicillium brasilianum descrita en WO 2007/019442 o una cepa del género Trichoderma, por ejemplo, una cepa de Trichoderma reesei.
[0183] En una realización, la beta-glucosidasa es de una cepa de Aspergillus, por ejemplo, una cepa de Aspergillus fumigatus, por ejemplo, beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEC ID N.°: 29 en el presente documento), o una variante de la misma, que comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consta de L89M, G91L, F100D, 1140V, 1186V, S283G, N456E y F512Y; por ejemplo, una variante de la misma con las siguientes sustituciones:
F100D S283G N456E F512Y;
L89M G91L 1186V 1140V;
I186V L89M G91L 1140V F100D S283G N456E F512Y.
[0184] La beta-glucosidasa progenitora tiene al menos un 60 % de identidad, por ejemplo, al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 80 %, por ejemplo, al menos un 90 %, por ejemplo, al menos un 95 %, por ejemplo, al menos un 96 %, por ejemplo, al menos al menos un 97 %, por ejemplo, al menos un 98 %, por ejemplo, al menos un 99 %, por ejemplo, un 100 % de identidad con el polipéptido maduro de la SEC ID N.°: 29 en el presente documento.
[0185] En caso de que la beta-glucosidasa sea una variante de beta-glucosidasa, tiene al menos un 60 % de identidad, por ejemplo, al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 80 %, por ejemplo, al menos un 90 %, por ejemplo, al menos un 95 %, por ejemplo, al menos un 96 %, por ejemplo, al menos al menos un 97 %, por ejemplo, al menos un 98 %, por ejemplo, al menos un 99 %, pero menos de un 100 % de identidad con el polipéptido maduro de la SEC ID N.°: 29 en el presente documento.
[0186] En caso de que la composición de la enzima celulolítica pueda comprender un polipéptido GH61, puede ser uno derivado del género Thermoascus, por ejemplo, una cepa de Thermoascus aurantiacus, como la descrita en WO 2005/074656 como SEC ID N.°: 2 o la SEC ID N.°: 30 en el presente documento; o una derivada del género Thielavia, por ejemplo, una cepa de Thielavia terrestris, como la descrita en WO 2005/074647 como SEC ID N.°: 7 y s Ec ID N.°: 8; o uno derivado de una cepa de Aspergillus, por ejemplo, una cepa de Aspergillus fumigatus, como la descrita en WO 2010/138754 como SEC ID N.°: 1 y SEC ID N.°: 2; o una derivada de una cepa de Penicillium, por ejemplo, una cepa de Penicillium emersonii, como la descrita en WO 2011/041397 como SEC ID N.°: 2 o la SEC ID N.°: 31 en el presente documento.
[0187] En una realización preferida, el polipéptido GH61, por ejemplo, uno derivado de una cepa de Penicillium emersonii se selecciona del grupo que consta de:
(i) un polipéptido GH61 que comprende el polipéptido maduro de la SEC ID N.°: 31 en el presente documento; (ii) un polipéptido GH61 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con el polipéptido maduro de la SEC ID N.°: 31 en el presente documento.
[0188] En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende una celobiohidrolasa I (CBH I), por ejemplo, una derivada de una cepa del género Aspergillus, por ejemplo, una cepa de Aspergillus fumigatus, por ejemplo, la Cel7a CBHI descrita en la SEC ID N.°: 6 en WO 2011/057140 o la SEC ID N.°: 32 en el presente documento, o una cepa del género Trichoderma, por ejemplo, una cepa de Trichoderma reesei.
[0189] En una realización preferida, la celobiohidrolasa I, por ejemplo, una derivada de una cepa de Aspergillus fumigatus, se selecciona del grupo que consta de:
(i) una celobiohidrolasa I que comprende el polipéptido maduro de la SEC ID N.°: 32 en el presente documento;
(ii) una celobiohidrolasa I que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con el polipéptido maduro de la SEC ID N.°: 32 en el presente documento.
[0190] En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende una celobiohidrolasa II (CBH II), por ejemplo, una derivada de una cepa del género Aspergillus, por ejemplo, una cepa de Aspergillus fumigatus, por ejemplo, la que se describe como la SEC ID N.°: 33 en el presente documento; o una cepa del género Trichoderma, por ejemplo, Trichoderma reesei o una cepa del género Thielavia, por ejemplo, una cepa de Thielavia terrestris, como la celobiohidrolasa II CEL6A de Thielavia terrestris.
[0191] En una realización preferida, la celobiohidrolasa II, por ejemplo, una derivada de una cepa de Aspergillus fumigatus, se selecciona del grupo que consta de:
(i) una celobiohidrolasa II que comprende el polipéptido maduro de la SEC ID N.°: 33 en el presente documento;
(ii) una celobiohidrolasa II que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con el polipéptido maduro de la SEC ID N.°: 33 en el presente documento.
[0192] En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica y una beta-glucosidasa.
[0193] En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica derivada de una cepa de Penicillium, por ejemplo, una cepa de Penicillium emersonii por ejemplo, la descrita como la SEC ID N.°: 2 en WO 2011/041397 o la SEC ID N.°: 31 en el presente documento, y una beta-glucosidasa.
[0194] En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa y una CBH I.
[0195] En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica derivada de una cepa de Penicillium, por ejemplo, una cepa de Penicillium emersonii por ejemplo, la descrita como la SEC ID N.°: 2 en WO 2011/041397 o la SEC ID N.°: 31 en el presente documento, una beta-glucosidasa y una CBH I.
[0196] En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica, una beta-glucosidasa, una CBH I y una CBH II.
[0197] En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende un polipéptido GH61 que tiene actividad potenciadora celulolítica derivada de una cepa de Penicillium, por ejemplo, una cepa de Penicillium emersonii por ejemplo, la descrita como la SEC ID N.°: 2 en WO 2011/041397 o la SEC ID N.°: 31 en el presente documento, una beta-glucosidasa, una CBH I y una CBH II.
[0198] En una realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además un polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus (SEC ID N.°: 2 en WO 2005/074656 o SEC ID N.°: 30 en el presente documento) y una proteína de fusión de betaglucosidasa de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637).
[0199] En una realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además un polipéptido GH61A de Thermoascus aurantiacus con actividad potenciadora celulolítica (SEC ID N.°: 2 en WO 2005/074656 o la SEC ID N.°: 30 en el presente documento) y beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEC ID N.°: 2 de WO 2005/047499 o la SEC ID N.°: 29 en el presente documento).
[0200] En una realización, la composición de enzima celulolítica es una composición de enzima celulolítica de Trichoderma reesei, que comprende además un polipéptido GH61A de Penicillium emersonii descrito como la SEC ID N.°: 2 en w O 2011/041397 o la SEC ID N.°: 10 en el presente documento y beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus descrita como la SEC ID N.°: 2 en WO 2005/047499 o la SEC ID N.°: 29 en el presente documento, o una variante de las mismas, cuya variante tiene una de las siguientes sustituciones o preferiblemente todas ellas: F100D, S283G, N456E, F512Y.
[0201] En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende uno o más de los siguientes componentes:
(i) una celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus;
(ii) una celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus;
(iii) una beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus o una variante de la misma.
[0202] En una realización, la beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEC ID N.°: 29 en el presente documento) comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consta de L89M, G91L, F100D, 1140V, 1186V, S283G, N456E y F512Y; por ejemplo, una variante de la misma con las siguientes sustituciones:
F100D S283G N456E F512Y;
L89M G91L 1186V 1140V; o
I186V L89M G91L 1140V F100D S283G N456E F512Y.
[0203] En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende además el polipéptido GH61 de Penicillium sp. mostrado en la SEC ID N.°: 31 en el presente documento; o un polipéptido GH61 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %, por ejemplo, un 100 % de identidad con el polipéptido maduro de la SEC ID N.°: 31 en el presente documento.
[0204] En una realización, la composición de enzima celulolítica comprende los siguientes componentes:
(i) celobiohidrolasa I de Aspergillus fumigatus mostrada en la SEC ID N.°: 32 en el presente documento; (ii) celobiohidrolasa II de Aspergillus fumigatus mostrada en la SEC ID N.°: 33 en el presente documento; (iii) variante de beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus mostrada en la SEC ID N.°: 29 con las siguientes sustituciones: F100D S283G N456E F512Y; y
(iv) polipéptido GH61 de Penicillium sp. mostrado en la SEC ID N.°: 31 en el presente documento.
[0205] En una realización, la composición de enzima celulolítica se dosifica (es decir, durante la sacarificación en el paso ii) y/o la fermentación en el paso iii) o la SSF) de 0.0001-3 mg PE/g DS, preferiblemente 0.0005-2 mg PE/g DS, preferiblemente 0.001 -1 mg/g DS, más preferiblemente de 0.005-0.5 mg PE/g DS, aún más preferiblemente 0.01-0.1 mg PE/g DS.
Composición
[0206] Se describe una composición que comprende una alfa-amilasa, por ejemplo, una alfa-amilasa termoestable, y una endoglucanasa que tiene la secuencia mostrada como SEC ID N.°: 3 o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEC ID N.°: 3 y que además tiene un punto de fusión (DSC) por encima de 80 °C; opcionalmente una proteasa, por ejemplo, una proteasa termoestable. La composición también puede comprender además una enzima generadora de fuentes de carbohidratos, en particular una glucoamilasa, opcionalmente una pululanasa y opcionalmente también una fitasa.
[0207] Por lo tanto, la composición puede comprender:
i) una alfa-amilasa;
ii) una endoglucanasa que tiene la secuencia mostrada como SEC ID N.°: 3 o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEC ID N.°: 3 y además tiene un punto de fusión (DSC) superior a 80 °C;
iii) opcionalmente una proteasa;
iv) opcionalmente una enzima generadora de fuentes de carbohidratos.
[0208] Alfa-amilasa: La alfa-amilasa puede ser cualquier alfa-amilasa. En una realización preferida, la alfaamilasa es una alfa-amilasa bacteriana, como las alfa-amilasas derivadas del género Bacillus, por ejemplo, Bacillus stearothermophilus.
[0209] La alfa-amilasa puede ser una alfa-amilasa termoestable. La alfa-amilasa termoestable puede tener una (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCh 0.12 mM de al menos 10, por ejemplo, al menos 15, por ejemplo, al menos 20, por ejemplo, al menos 25, por ejemplo, al menos 30, por ejemplo, al menos 40, por ejemplo, al menos 50, por ejemplo, al menos 60, por ejemplo, entre 10-70, por ejemplo, entre 15-70, por ejemplo, entre 20-70, por ejemplo, entre 25-70, por ejemplo, entre 30-70, por ejemplo, entre 40-70, por ejemplo, entre 50-70, por ejemplo, entre 60-70.
[0210] En una realización, la alfa-amilasa se selecciona del grupo de variantes de alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, en particular las que se truncan para tener 491 aminoácidos de longitud, por ejemplo, de 480 a 495 aminoácidos de longitud, con mutaciones seleccionadas del grupo de:
- I181* G182* N193F E129V K177L R179E;
- I181* G182* N193F V59A Q89R E129V K177L R179E H208Y K220P N224L Q254S;
- I181* G182* N193F V59A Q89R E129V K177L R179E Q254S M284V; y
- I181* G182* N193F E129V K177L R179E K220P N224L S242Q Q254S (usando la SEC ID N.°: 1 en el presente documento para la numeración).
[0211] Debe entenderse que estas alfa-amilasas son solo ejemplos específicos. Cualquier alfa-amilasa descrita anteriormente en la sección "Alfa-amilasa presente y/o añadida durante la licuefacción" puede usarse como componente de alfa-amilasa en una composición de la invención.
[0212] Endoglucanasa: El componente de endoglucanasa en la composición puede ser cualquier endoglucanasa que tenga la secuencia mostrada como SEC ID N.°: 3 o una secuencia que tenga al menos un 80 % de identidad con la SEC ID N.°: 3 y que además tenga un punto de fusión (DSC) superior a 80 °C determinado usando el "Ensayo de calorimetría diferencial de barrido (DSC)" descrito en la sección "Materiales y métodos" más adelante.
[0213] En una realización, la endoglucanasa tiene un punto de fusión (DSC) por encima de 82 °C, por ejemplo, por encima de 84 °C, por ejemplo, por encima de 86 °C, por ejemplo, por encima de 88 °C, por ejemplo, entre 80 °C y 92 °C, por ejemplo, entre 82 °C y 91 °C, por ejemplo entre 84 °C y 90 °C.
[0214] La endoglucanasa utilizada en un proceso de la invención comprendida en una composición es una endoglucanasa de la familia 5 de glucósido hidrolasa o endoglucanasa GH5 (consulte la base de datos CAZy en la página web "www.cazy.org"). La endoglucanasa GH5 es la endoglucanasa de Talaromyces leycettanus mostrada en la SEC ID N.°: 3 en el presente documento.
[0215] En una realización, la endoglucanasa tiene al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 91 %, más preferiblemente al menos un 92 %, incluso más preferiblemente al menos un 93 %, lo más preferiblemente al menos un 94 %, e incluso lo más preferible al menos un 95 %, por ejemplo, incluso al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, por ejemplo, un 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEC ID N.° : 3 en el presente documento. En una realización, la endoglucanasa se obtiene de una cepa del género Talaromyces, por ejemplo, una cepa de Talaromyces leycettanus.
[0216] En una realización preferida, la endoglucanasa tiene al menos un 90 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEC ID N.°: 3 derivada de una cepa de Talaromyces leycettanus que tiene un punto de fusión (DSC) por encima de 80 °C.
[0217] Proteasa: Una composición puede comprender opcionalmente una proteasa, por ejemplo, una proteasa termoestable. No hay limitación en el origen del componente de proteasa siempre que cumpla con las propiedades de termoestabilidad definidas en el presente documento.
[0218] En una realización, la proteasa es de origen fúngico. En una realización, la proteasa es una metaloproteasa. En una realización, la proteasa se obtiene de Thermoascus aurantiacus mostrada en la SEC ID N.°: 2 en el presente documento.
[0219] En una realización preferida, la proteasa es una variante de la proteasa de Thermoascus aurantiacus mencionada anteriormente que tiene un valor de termoestabilidad de más del 20 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C determinada como se describe en el ejemplo 2.
[0220] En una realización preferida específica, la proteasa es una variante de la metaloproteasa derivada de Thermoascus aurantiacus descrita como la parte madura de la SEC ID N.°: 2 descrita en WO 2003/048353 o la parte madura de la SEC ID N.°: 1 en w O 2010/008841 o la SEC ID N.°: 2 en el presente documento con mutaciones seleccionadas del grupo de:
- D79L S87P A112P D142L;
- D79L S87P D142L; y
- A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L.
[0221] En otra realización, la proteasa es una proteasa bacteriana. [0221] En otra realización, la proteasa es una serina proteasa. En una realización preferida, la proteasa se obtiene de una cepa de Pyrococcus furiosus, como la que se muestra en la SEC ID N.°: 1 en Ee . UU. 6.358.726 o la SEC ID N.°: 13 en el presente documento.
[0222] Debe entenderse que estas proteasas son solo ejemplos. Cualquier proteasa descrita anteriormente en la sección "Proteasa presente y/o añadida durante la licuefacción" puede usarse como el componente de proteasa en una composición.
[0223] Enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos: Opcionalmente, una composición puede comprender además una enzima generadora de fuentes de carbohidrato, en particular una glucoamilasa, por ejemplo, una glucoamilasa termoestable que tiene una estabilidad térmica a 85 °C, pH 5.3, de al menos un 30 %, preferiblemente al menos un 35 %.
[0224] Dicha enzima generadora de fuentes de carbohidratos puede ser una glucoamilasa termoestable que tiene una estabilidad térmica de actividad relativa a 85 °C de al menos 20 %, al menos un 30 %, preferiblemente al menos un 35 % determinada tal como se describe en el ejemplo 4 (estabilidad térmica).
[0225] En una realización, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos es una glucoamilasa que tiene un pH óptimo de actividad relativa a pH 5.0 de al menos el 90 %, preferiblemente de al menos el 95 %, preferiblemente de al menos el 97 %, por ejemplo, el 100 % determinado como se describe en el ejemplo 4 (pH óptimo).
[0226] En una realización, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos es una glucoamilasa que tiene una estabilidad de pH a pH 5.0 de al menos el 80 %, de al menos el 85 %, de al menos el 90 % determinada como se describe en el ejemplo 4 (estabilidad de pH).
[0227] En una realización preferida, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos es una glucoamilasa termoestable, preferiblemente de origen fúngico, preferiblemente un hongo filamentoso, tal como de una cepa del género Penicillium, especialmente una cepa de Penicillium oxalicum descrita como la SEC ID N.°: 2 en WO 2011/127802 (que se incorpora aquí mediante referencia), o una variante de la misma, y se muestra en las SEC ID N°: 9 o 14 en el presente documento.
[0228] En una realización, la glucoamilasa, o una variante de la misma, puede tener al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 91 %, más preferiblemente al menos un 92 %, incluso más preferiblemente al menos un 93 %, lo más preferible al menos un 94 %, e incluso lo más preferible al menos un 95 %, tal como incluso al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, por ejemplo, un 100 % de identidad con el polipéptido maduro que se muestra en la SEC ID N.°: 2 en WO 2011/127802 o la SEC ID N.°: 14 en el presente documento.
[0229] En una realización específica y preferida, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos es una variante de glucoamilasa de Penicillium oxalicum descrita como la SEC ID N.°: 2 en WO 2011/127802 y mostrada en las SEC ID N.°: 9 y 14 en el presente documento, que tiene una sustitución K79V (usando la secuencia madura mostrada en la SEC ID N.°: 14 para la numeración). La variante de glucoamilasa K79V tiene una sensibilidad reducida a la degradación de la proteasa en relación con la progenitora tal como se describe en WO 2013/036526.
[0230] Ejemplos de variantes de glucoamilasa termoestable de Penicillium oxalicum adecuadas se han enumerado anteriormente y en los ejemplos 17 y 18 más adelante.
[0231] En una realización, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos, por ejemplo, glucoamilasa, por ejemplo, la glucoamilasa de Penicillium oxalicum, tiene actividad lateral de pululanasa.
[0232] Debe entenderse que estas enzimas generadoras de fuentes de carbohidratos, en particular glucoamilasas, son solo ejemplos. Cualquier enzima generadora de fuentes de carbohidratos descrita anteriormente en la sección "Enzima generadora de fuentes de carbohidratos presente y/o añadida durante la licuefacción" puede usarse como componente en una composición de la invención.
[0233] En una realización preferida, la enzima generadora de fuentes de carbohidratos es la glucoamilasa de Penicillium oxalicum mostrada en la SEC ID N.°: 14 en el presente documento o una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad con la misma que comprende además una sustitución K79V.
[0234] Pululanasa: Opcionalmente, una composición puede comprender además una pululanasa. La pululanasa puede ser de cualquier origen.
[0235] En una realización, la pululanasa es de origen bacteriano. En una realización, la pululanasa se obtiene de una cepa de Bacillus sp.
[0236] En una realización, la pululanasa es una pululanasa de la familia GH57. En una realización preferida, la pululanasa incluye un dominio X47 tal como se describe en WO 2011/087836 (que se incorporan aquí mediante referencia).
[0237] Específicamente, la pululanasa puede obtenerse de una cepa del género Thermococcus, incluyendo Thermococcus litoralis y Thermococcus hydrothermalis, o un híbrido de las mismas.
[0238] La pululanasa puede ser la pululanasa de Thermococcus hydrothermalis mostrada en la SEC ID N.°: 11 en el presente documento truncada en el sitio X4 o una enzima híbrida de Thermococcus hydrothermalis/T. litoralis con sitio de truncamiento X4 tal como se describe en WO 2011/087836.
[0239] En otra realización, la pululanasa es tal que comprende un dominio X46 descrito en WO 2011/076123 (Novozymes)
[0240] Debe entenderse que estas pululanasas son solo ejemplos específicos. Cualquier pululanasa descrita anteriormente en la sección "Pululanasa presente y/o añadida durante la licuefacción" puede usarse como componente opcional de pululanasa en una composición de la invención.
[0241] Fitasa Una composición puede además comprender opcionalmente una fitasa. La fitasa puede ser de cualquier origen.
[0242] En una realización, la fitasa es de origen bacteriano. En una realización, la fitasa se obtiene de una cepa de Buttiauxella, por ejemplo, Buttiauxella gaviniae como la descrita como la SEC ID N.°: 2 (los aminoácidos 1-33 son péptidos señal esperados) en WO 2008/092901; o Buttiauxella agrestis, como la que se muestra como la SEC ID N.°: 4 (se espera que los aminoácidos -9 a -1 sean parte del péptido señal) en WO 2008/092901; o Buttiauxella noackies, como la que se muestra como la SEC iD N.°: 6 en WO 2008/092901.
[0243] En otra realización, la fitasa se obtiene de una cepa de Citrobacter, por ejemplo, una cepa de Citrobacterbraakii, como las descritas como las SEC ID N.°: 2 o 4 en WO 2006/037328.
[0244] Debe entenderse que estas fitasas son solo ejemplos específicos. Cualquier fitasa descrita anteriormente en la sección "Fitasa presente y/o añadida durante la licuefacción" puede usarse como componente opcional de pululanasa en una composición de la invención.
[0245] En una realización preferida, la fitasa se obtiene de una cepa de Buttiauxella
Materiales y métodos
Materiales:
[0246]
Alfa-amilasa 369 (AA369): Alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus con las mutaciones: I181 * G182 * N193F V59A Q89R E129V K177L R179E Q254S M284V truncadas a 491 aminoácidos (SEC ID NO: 1 en el presente documento).
Endoglucanasa TL (EG TL): Endoglucanasa GH5 de Talaromyces leycettanus descrita en WO2013/019780 como la SEC ID N.°: 2 y SEC ID N.°: 3 en el presente documento. (P23YSQ).
Endoglucanasa PC (EG PC): Endoglucanasa GH5 de Penicillium capsulatum descrita como la SEC ID N.°: 4 en el presente documento. (P244HZ)
Endoglucanasa TS (EG TS): Endoglucanasa GH5 de Trichophaea saccata descrita como la SEC ID N.°: 5 en el presente documento. (P2PJ)
Endoglucanasa TT (EG TT): Endoglucanasa GH45 de Thielavia terrestris descrita en la SEC ID N.°: 6 en el presente documento. (P24PYU)
Endoglucanasa SF (EG SF): Endoglucanasa GH45 de Sordaria fimicola descrita en la solicitud pendiente PCT/CN2012/080220 como la SEC ID N.°: 2 y SEC ID N.°: 7 en el presente documento (P2CF).
Proteasa 196: (JTP196) Metaloproteasa derivada de Thermoascus aurantiacus CGMCC n.° 0670 descrita como los aminoácidos 1-177 en la SEC ID NO: 2 en el presente documento y los aminoácidos 1-177 de la SEC ID N.°: 2 en WO 2003/048353 con las siguientes mutaciones: A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L.
Proteasa Pfu: Proteasa derivada de Pyrococcus furiosus comprada en Takara Bio (Japón) como proteasa Pfu S (actividad 10.5 mg/ml) y también se muestra en la SEC Id N.°: 13 en el presente documento.
Glucoamilasa PO: Parte madura de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum descrita como SEC ID N.°: 2 en WO 2011/127802 y mostrada en las SEC ID N.°: 9 en el presente documento.
Glucoamilasa PE001: Variante de la glucoamilasa Penicillium oxalicum, que tiene una sustitución K79V (usando la secuencia madura mostrada en la SEC ID N.°: 14 para la numeración.
Glucoamilasa AC: Mezcla que comprende la glucoamilasa de Talaromyces emersonii descrita en WO 99/28448, la glucoamilasa de Trametes cingulata descrita en WO 06/69289 y la alfa-amilasa de Rhizomucor pusillus con un enlazador de glucoamilasa de Aspergillus niger y un SBD descrita como V039 en la tabla 5 de WO 2006/069290 como actividades secundarias; y composición de enzima celulolítica que comprende el polipéptido GH61A que tiene actividad potenciadora celulolítica obtenida de una cepa de Penicillium emersonii (SEC ID N.°: 2 en WO 2011/041397), beta-glucosidasa de Aspergillus fumigatus (SEC ID N.°: 22 en WO 2005/047499) variante F100D, S283G, N456E, F512Y descrita en WO 2012/044915; Cel7A CBH1 de Aspergillus fumigatus descrita como la s Ec ID N.°: 6 en WO2011/057140; y CBH II de Aspergillus fumigatus descrita como la SEC ID N.°: 18 en WO 2011/057140.
Levadura: RED STAR ETHANOL RED™ disponible en Red Star/Lesaffre, EE. UU.
Métodos
Determinación de Td mediante calorimetría diferencial de barrido para endoglucanasas.
[0247] La termoestabilidad de una enzima se determina mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) utilizando un calorímetro diferencial de barrido VP-capillary (MicroCal Inc., Piscataway, NJ, EE. UU.). La temperatura de desnaturalización térmica, Td (°C), se tomó como la parte superior del pico de desnaturalización (pico endotérmico principal) en los termogramas (Cp vs. T) obtenidos después de calentar soluciones enzimáticas (aprox. 0.5 mg/ml) en tampón (acetato 50 mM, pH 5.0) a una velocidad de calentamiento programada constante de 200 K/h.
[0248] Las soluciones de muestra y de referencia (aprox. 0.2 ml) se cargaron en el calorímetro (referencia: tampón sin enzima) desde las condiciones de almacenamiento a 10 °C y se equilibraron térmicamente durante 20 minutos a 20 °C antes del escaneo de DSC desde 20 °C hasta 110 °C. Las temperaturas de desnaturalización se determinaron con una precisión de aproximadamente /- 1 °C.
[0249] Identidad: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad".
[0250] Para los fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, así como el grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos, puede determinarse mediante el programa "alinear', que es una alineación de Needleman-Wunsch (es decir, una alineación global) . El programa se utiliza para la alineación de polipéptidos, así como de secuencias de nucleótidos. La matriz de puntuación predeterminada BLOSUM50 se usa para la alineación de polipéptidos, y la matriz de identidad predeterminada se usa para la alineación de nucleótidos. La penalización por el primer residuo de un gap es -12 para polipéptidos y -16 para nucleótidos. Las penalizaciones por residuos adicionales de un gap son -2 para polipéptidos y -4 para nucleótidos.
[0251] "Alinear" forma parte del paquete FASTA versión v20u6 (ver W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85: 2444-2448 y W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FAs Tp and FASTA", Methods in Enzymology 183: 63-98) Las alineaciones de proteínas FASTA utilizan el algoritmo Smith-Waterman sin limitación en el tamaño de gap (ver "Smith-Waterman algorithm", T. F. Smith y M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147: 195-197).
Ensayos de proteasa
Ensayo de AZCL-caseína
[0252] Una solución del 0.2 % del sustrato azul AZCL-caseína se suspende en tampón Bórax/NaH2PO4 pH 9 mientras se agita. La solución se distribuye mientras se agita en una placa de microtitulación (100 pl en cada pocilio), se añaden 30 pl de muestra de enzima y las placas se incuban en un Eppendorf Thermomixer durante 30 minutos a 45 °C y 600 rpm. La muestra de enzima desnaturalizada (100 °C en ebullición durante 20 minutos) se usa como blanco. Después de la incubación, la reacción se detiene transfiriendo la placa de microtitulación en hielo y la solución coloreada se separa del sólido mediante centrifugación a 3000 rpm durante 5 minutos a 4 °C. Se transfieren 60 pl de sobrenadante a una placa de microtitulación y se mide la absorbancia a 595 nm utilizando un lector de microplacas BioRad.
Ensayo de APN
[0253] La muestra que contiene 50 pl de proteasa se agrega a una placa de microtitulación y el ensayo se inicia añadiendo 100 pl de sustrato de APN 1 mM (5 mg disueltos en 100 pl de DMSO y luego diluidos hasta 10 ml con tampón Bórax/NaH2PO4 pH 9.0). El aumento en OD405 a temperatura ambiente se monitoriza como una medida de la actividad de proteasa.
Actividad de glucoamilasa (AGU)
[0254] La actividad de glucoamilasa se puede medir en unidades de glucoamilasa (AGU).
[0255] La unidad de glucoamilasa novo (AGU) se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto en condiciones estándar de 37 °C, pH 4.3, sustrato: maltosa 23.2 mM, tampón: acetato 0.1 M, tiempo de reacción 5 minutos.
[0256] Se puede usar un sistema de autoanalizador. Se agrega mutarotasa al reactivo de glucosa deshidrogenasa para que cualquier alfa-D-glucosa presente se convierta en beta-D-glucosa. La glucosa deshidrogenasa reacciona específicamente con la beta-D-glucosa en la reacción mencionada anteriormente, formando NADH, lo que se determina usando un fotómetro a 340 nm como una medida de la concentración de glucosa original.
Figure imgf000027_0001
[0257] Una carpeta (EB-SM-0131.02/01) que describe este método analítico con más detalle está disponible a petición en Novozymes A/S, Dinamarca.
Actividad de alfa-amilasa (KNU)
[0258] La actividad de alfa-amilasa puede determinarse usando almidón de patata como sustrato. Este método se basa en la descomposición del almidón de patata modificado por la enzima, seguida de la mezcla de muestras de la solución de almidón/enzima con una solución de yodo. Inicialmente, se forma un color azul negruzco, pero durante la descomposición del almidón, el color azul se debilita y gradualmente se convierte en un marrón rojizo, que se compara con un estándar de vidrio coloreado.
[0259] Una unidad de alfa amilasa de Kilo Novo (KNU) se define como la cantidad de enzima que, en condiciones estándar (es decir, a 37 °C /- 0.05; Ca2+ 0.0003 M; y pH 5.6) dextriniza 5260 mg sustancia seca de almidón Merck Amylum soluble.
[0260] Una carpeta EB-SM-0009.02/01 que describe este método analítico con más detalle está disponible previa solicitud en Novozymes A/S, Dinamarca.
Actividad de alfa-amilasa (KNU-A)
[0261] Una carpeta EB-SM-5091.02-D para determinar la actividad KNU-A está disponible previa solicitud en Novozymes A/S, Dinamarca.
Actividad de alfa-amilasa KNU (S)
[0262] La amilasa de BS en muestras y la enzima alfa-glucosidasa en el kit de reactivos hidrolizan el sustrato (4,6-etilideno(G7)-p-nitrofenil(G1)-alfa-D-maltoheptaósido (etilideno-G7PNP)) a glucosa y al p-nitrofenol de color amarillo.
[0263] La velocidad de formación de p-nitrofenol puede observarse mediante Konelab 30. Esta es una expresión de la velocidad de reacción y, por lo tanto, de la actividad enzimática.
Condiciones de reacción
Figure imgf000028_0001
Definición de la unidad
[0264] La actividad de la amilasa de Bacillus stearothermophilus (amilasa BS) se mide en KNU(S), unidades Kilo Novo (stearothermophilus), en relación con un estándar enzimático de una potencia declarada.
[0265] Este método analítico se describe con más detalles en EB-SM-0221.02 disponible en Novozymes A/S, Dinamarca, previa solicitud.
Determinación de la actividad de FAU
[0266] Una unidad de alfa-amilasa fúngica (FAU) se define como la cantidad de enzima que descompone 5.26 g de almidón (Merck Amylum soluble Erg. B.6, lote 9947275) por hora en función de las siguientes condiciones estándar:
Sustrato Almidón soluble
Temperatura 37 °C
pH 4.7
Tiempo de reacción 7-20 minutos
Determinación de la actividad de la alfa-amilasa ácida (AFAU)
[0267] La actividad de la alfa-amilasa ácida se mide en AFAU (unidades de alfa-amilasa fúngica ácida), que se determinan en relación con un estándar enzimático.
[0268] El estándar utilizado es AMG 300 L (de Novozymes A/S, glucoamilasa de tipo salvaje de Aspergillus niger G1, también descrito en Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), págs. 1097-1102) y WO 92/00381). La alfaamilasa neutra en este AMG cae por debajo de 0.05 FAU/ml después del almacenamiento a temperatura ambiente durante 3 semanas a partir de aprox. 1 FAU/ml.
[0269] La actividad de la alfa-amilasa ácida en este estándar AMG se determina de acuerdo con la siguiente descripción. En este método, 1 AFAU se define como la cantidad de enzima que degradan 5.260 mg de materia seca de almidón por hora en condiciones estándar.
[0270] El yodo forma un complejo azul con el almidón pero no con sus productos de degradación. La intensidad del color es, por lo tanto, directamente proporcional a la concentración de almidón. La actividad de la amilasa se determina usando colorimetría inversa como una reducción en la concentración de almidón en condiciones analíticas específicas.
Alfaamilasa
Almidón ^ Dextrinas Yodo Oligosacáridos
40 °C, pH
2.5
azul/violeta t = 23 seg. Decoloración
n i i n n r n i i n r i n: r min
Figure imgf000029_0001
[0271] Si se prefieren más detalles, estos se pueden encontrar en EB-SM-0259.02/01 disponible previa solicitud en Novozymes A/S.
Determinación de la actividad de pululanasa (NPUN)
[0272] La actividad de endo-pululanasa en NPUN se mide en relación con un estándar de pululanasa Novozymes. Una unidad de pululanasa (NPUN) se define como la cantidad de enzima que libera 1 micromol de glucosa por minuto en condiciones estándar (0.7 % de pululano rojo (Megazyme), pH 5, 40 °C, 20 minutos). La actividad se mide en NPUN/ml utilizando pululano rojo.
[0273] 1 ml de muestra diluida o estándar se incuba a 40 °C durante 2 minutos. Se añaden y mezclan 0.5 ml de pululano rojo al 2 %, KCl 0.5 M, ácido cítrico 50 mM, pH 5. Los tubos se incuban a 40 °C durante 20 minutos y se detienen mediante la adición de 2.5 ml de etanol al 80 %. Los tubos se dejan reposar a temperatura ambiente durante 10-60 minutos y, a continuación, se centrifugan durante 10 minutos a 4000 rpm. La OD de los sobrenadantes se mide luego a 510 nm y la actividad se calcula utilizando una curva estándar.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Estabilidad de las variantes de alfa-amilasa
[0274] La estabilidad de una alfa-amilasa de referencia (alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus con las mutaciones I181* G182* N193F truncadas a 491 aminoácidos (SEC ID N.°: 1 en este documento para la numeración)) y las variantes de alfa-amilasa de las mismas se determinó incubando la alfa-amilasa de referencia y las variantes a pH 4.5 y 5.5 y temperaturas de 75 °C y 85 °C con CaCl20.12 mM y, a continuación, determinando la actividad residual utilizando el sustrato EnzChek® (kit de ensayo de amilasa EnzChek® Ultra, E33651, Molecular Probes).
[0275] Las muestras de enzimas purificadas se diluyeron hasta concentraciones de trabajo de 0.5 y 1 o 5 y 10 ppm (microgramos/ml) en tampón de dilución enzimática (acetato 10 mM, Triton X100 al 0.01 %, CaCh 0.12 mM, pH 5.0). Se transfirió una muestra de enzima de veinte microlitros a una PCR de MTP de 48 pocillos y un tampón de estabilidad de 180 microlitros (acetato 150 mM, MES 150 mM, Triton X100 al 0.01 %, CaCh 0.12 mM, pH 4.5 o 5.5) a cada pozo y se mezclaron. El ensayo se realizó usando dos concentraciones de enzima por duplicado. Antes de la incubación a 75 °C u 85 °C, se extrajeron 20 microlitros y se almacenaron en hielo como muestras de control. La incubación se realizó en una máquina de PCR a 75 °C y 85 °C. Después de la incubación, las muestras se diluyeron hasta 15 ng/ml en tampón de actividad residual (acetato 100 mM, Triton X100 al 0.01 %, CaCl20.12 mM, pH 5.5) y 25 microlitros de enzima diluida se transfirieron a un MTP de 384 negro. La actividad residual se determinó usando el sustrato EnzChek agregando 25 microlitros de solución de sustrato (100 microgramos/ml) a cada pocillo. La fluorescencia se determinó cada minuto durante 15 minutos usando un filtro de excitación a 485-P nm y un filtro de emisión a 555 nm (el lector de fluorescencia es Polarstar, BMG). La actividad residual se normalizó a las muestras de control para cada configuración.
[0276] Suponiendo que el tiempo de vida media de desintegración logarítmica (T / (min)) se calculó utilizando la ecuación: T / (min) = T (min)*LN (0.5)/LN (% RA/100), donde T es el tiempo de incubación del ensayo en minutos, y %RA es el % de actividad residual determinada en el ensayo.
[0277] Usando esta configuración de ensayo, se determinó la semivida para la alfa-amilasa de referencia y su variante, como se muestra en la tabla 1.
Tabla 1
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Figure imgf000031_0001
[0278] Los resultados demuestran que las variantes de alfa-amilasa tienen una semivida y una estabilidad significativamente mayores que la alfa-amilasa de referencia.
Ejemplo 2
Preparación de variantes de proteasa y prueba de termoestabilidad
Cepas y plásmidos
[0279] Se usó E. coli DH12S (disponible en Gibco BRL) para el rescate del plásmido de levadura. pJTP000 es un S. cerevisiae y E. coli un vector lanzadera bajo el control del promotor TPI, construidos a partir de pJC039 descrito en WO 01/92502, en el que se ha insertado el gen de proteasa M35 Thermoascus aurantiacus (WO 03/048353).
[0280] Células competentes de Saccharomyces cerevisiae YNG318: se usó MATa Dpep4 [cir ] ura3-52, leu2-D2, his4-539 para la expresión de variantes de proteasa. Se describe en J. Biol. Chem 272 (15), págs. 9720­ 9727, 1997.
Medios y sustratos
[0281] Solución basal 10X: Base nitrogenada de levadura sin aminoácidos (DIFCO) 66.8 g/l, succinato 100 g/l, NaOH 60 g/l.
[0282] Glucosa SC: 20 % de glucosa (es decir, una concentración final del 2 % = 2 g/100 ml)) 100 ml/l, 5 % de treonina 4 ml/l, 1 % de triptófano 10 ml/l, 20 % de ácidos casamino 25 ml/l, solución basal 10 X 100 ml/l. La solución se esteriliza usando un filtro de un tamaño de poro de 0.20 micrómetros. Agar (2 %) y H2O (aprox.
761 ml) se esterilizan conjuntamente en autoclave, y la solución de glucosa SC esterilizada por separado se agrega a la solución de agar.
[0283] YPD: 20 g/l de peptona Bacto, 10 g/l de extracto de levadura, 100 ml/l de glucosa al 20 %.
[0284] YPD Zn: YPD ZnSO40.25 mM .
[0285] Solución PEG/LiAc: 50 ml de PEG4000 al 40 %, 1 ml de acetato de litio 5 M.
[0286] Placa de microtitulación de zeína de 96 pocillos:
[0287] Cada pocilio contiene 200 |jl del 0.05-0.1 % de zeína (Sigma), ZnSO40.25 mM y 1 % de agar en tampón de acetato de sodio 20 mM, pH 4.5.
Manipulaciones de ADN
[0288] A menos que se indique lo contrario, las manipulaciones y transformaciones de ADN se realizaron utilizando métodos estándar de biología molecular tal como se describe en Sambrook y col. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, lab. Cold Spring Harbor. Cold Spring Harbor, Nueva York; Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R. y Cutting, S. M. (Eds.).
Transformación de levadura
[0289] La transformación de levadura se realizó utilizando el método de acetato de litio. Se mezclan 0.5 j l de vector (digerido mediante endonucleasas de restricción) y 1 j l de fragmentos de PCR. La mezcla de ADN, 100 j l de células competentes YNG318 y 10 j l de ADN portador YEAST MAKER (Clontech) se agrega a un tubo de polipropileno de 12 ml (Falcon 2059). Agregar 0.6 ml de solución de PEG/LiAc y mezclar suavemente. Incubar durante 30 minutos a 30 °C y 200 rpm, luego durante 30 minutos a 42 °C (choque térmico). Transferir a un tubo Eppendorf y centrifugar durante 5 segundos. Eliminar el sobrenadante y disolver en 3 ml de YPD. Incubar la suspensión celular durante 45 minutos a 200 rpm a 30 °C. Verter la suspensión en placas de glucosa SC e incubar a 30 °C durante 3 días para cultivar colonias. El ADN total de levadura se extrae con el kit Miniprep de plásmido de levadura Zymoprep (ZYMO research).
Secuenciación de ADN
[0290] La transformación de E. coli para la secuenciación del ADN se llevó a cabo mediante electroporación (BIO-RAD Gene Pulser). Los plásmidos de ADN se prepararon mediante un método alcalino (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor) o con el kit de plásmido de Qiagen®. Los fragmentos de ADN se recuperaron del gel de agarosa con el kit de extracción de gel de Qiagen. La PCR se realizó usando un PTC-200 DNA Engine. El analizador genético ABI PRISM 310 se utilizó para determinar todas las secuencias de ADN.
Construcción del vector de expresión de proteasa
[0291] El gen de la proteasa M35 de Thermoascus se amplificó con el par de cebadores Prot F (SEC ID N.°: 15 en el presente documento) y Prot R (SEC ID N.°: 16 en el presente documento). Los fragmentos de PCR resultantes se introdujeron en S. cerevisiae YNG318 junto con el vector pJC039 (descrito en WO2001/92502) digeridos con enzimas de restricción para eliminar el gen de la cutinasa de Humicola insolens.
[0292] El plásmido en clones de levadura en las placas de glucosa SC se recuperó para confirmar la secuencia interna y se denominó pJTP001.
Construcción de la biblioteca de levadura y variantes dirigidas
[0293] La biblioteca de levadura y las variantes dirigidas se construyeron mediante el método SOE PCR (Empalme por extensión de solapamiento, ver "PCR: A practical approach", p. 207-209, Oxford University press, eds. McPherson, Quirke, Taylor), seguido de recombinación de levadura in vivo
Cebadores generales para amplificación y secuenciación.
[0294] Los cebadores AM34 (SEC ID N.°: 17 en el presente documento) y AM35 (SEC ID N.°: 18 en el presente documento) se usaron para hacer fragmentos de ADN que contenían cualquier fragmento mutado por el método SOE junto con cebadores degenerados (AM34 cebador inverso y AM35 cebador directo) o simplemente para amplificar un gen de proteasa completo (AM34 AM35).
Figure imgf000033_0001
[0295] Los fragmentos de ADN se recuperaron del gel de agarosa con el kit de extracción de gel de Qiagen. Los fragmentos purificados resultantes se mezclaron con la digestión del vector. La solución mixta se introdujo en Saccharomyces cerevisiae para construir bibliotecas o variantes dirigidas mediante recombinación in vivo
Ensayo de actividad relativa
[0296] Los clones de levadura en glucosa SC se inocularon en un pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos que contenía medio YPD Zn y se cultivaron a 28 °C durante 3 días. Los sobrenadantes del cultivo se aplicaron a una placa de microtitulación de zeína de 96 pocillos y se incubaron a al menos 2 temperaturas (por ejemplo, 60 °C y 65 °C, 70 °C y 75 °C, 70 °C y 80 °C) durante más de 4 horas o toda la noche. La turbidez de la zeína en la placa se midió como A630 y la actividad relativa (temperaturas más altas/más bajas) se determinó como un indicador de la mejora de la termoactividad. Se seleccionaron los clones con mayor actividad relativa que la variante progenitora y se determinó la secuencia.
Ensayo de actividad restante
[0297] Los clones de levadura en glucosa SC se inocularon en un pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos y se cultivaron a 28 °C durante 3 días. La actividad de la proteasa se midió a 65 °C usando azocaseína (Megazyme) después de incubar el sobrenadante de cultivo en tampón de acetato de sodio 20 mM, pH 4.5, durante 10 minutos a una temperatura determinada (80 °C u 84 °C con 4 °C como referencia) para determinar la actividad restante. Se seleccionaron los clones con mayor actividad restante que la variante progenitora y se determinó la secuencia.
Ensayo de azocaseína
[0298] Se mezclaron 20 pl de muestras con 150 pl de solución de sustrato (4 ml de azocaseína al 12.5 % en etanol en 96 ml de acetato sódico 20 mM, pH 4.5, que contiene 0.01 % de Triton-100 y ZnSO40.25 mM) y se incubaron durante 4 horas o más.
[0299] Después de agregar 20 pl/pocillo de solución de ácido tricloroacético (TCA) al 100 %, la placa se centrifugó y se pipetearon 100 pl de sobrenadantes para medir A440.
Expresión de las variantes de proteasa en Aspergillus oryzae
[0300] Los constructos que comprenden los genes variantes de la proteasa se usaron para construir vectores de expresión para Aspergillus. Los vectores de expresión de Aspergillus consisten en un casete de expresión basado en el promotor de amilasa II neutral de Aspergillus niger fusionado con la secuencia líder no traducida de triosa fosfato isomerasa (Pna2/tpi) de Aspergillus nidulans y el terminador de amiloglucosidasa (Tamg) de Aspergillus niger. También estaba presente en el plásmido el marcador selectivo amdS de Aspergillus nidulans que permite el crecimiento de acetamida como única fuente de nitrógeno. Los plásmidos de expresión para las variantes de proteasa se transformaron en Aspergillus como se describe en Lassen et al. (2001), Appl. Environ. Microbiol 67, 4701-4707. Para cada uno de los constructos, se aislaron, se purificaron y se cultivaron 10-20 cepas en matraces de agitación.
Purificación de variantes expresadas
[0301]
1. Ajustar a 4.0 el pH de la muestra de fermentación filtrada de 0.22 pm.
2. Poner la muestra en un baño de hielo con agitación magnética. Añadir (NH4)2SO4 en pequeñas alícuotas (correspondientes a aproximadamente (NH4)2SO42.0-2.2 M sin tener en cuenta el aumento de volumen al agregar el compuesto).
3. Después de la adición final de (NH4)2SO4, incubar la muestra en el baño de hielo con agitación magnética suave durante un mínimo de 45 min.
4. Centrifugación: centrífuga refrigerada de alta velocidad Hitachi himac CR20G equipada con cabezal de rotor R20A2, 5 °C, 20000 rpm, 30 min.
5. Disolver el precipitado formado en 200 ml de acetato de Na 50 mM pH 4.0.
6. Filtrar la muestra por succión al vacío utilizando una membrana PES PLUS de 0.22 pm (IWAKI). 7. Desalinizar/intercambiar tampón de la muestra a acetato de Na 50 mM pH 4.0 usando ultrafiltración (Vivacell 250 de Vivascience equipado con membrana MWCO PES de 5 kDa) durante la noche en una habitación fría. Diluir la muestra retenida hasta 200 ml usando acetato de Na 50 mM pH 4.0. La conductividad de la muestra es preferiblemente inferior a 5 mS/cm.
8. Cargar la muestra en una columna de intercambio catiónico equilibrada con acetato de Na 50 mM pH 4.0. Lavar la muestra no unida de la columna usando 3 volúmenes de columna de tampón de unión (acetato de Na 50 mM pH 4.0), y eluir la muestra usando un gradiente lineal, 0-100 % de tampón de elución (acetato de Na 50 mM NaCl 1 M pH 4.0) en 10 volúmenes de columna.
9. Las fracciones recogidas se analizan mediante un ensayo de endoproteasa (véase más adelante) y, a continuación, SDS-PAGE estándar (condiciones reductoras) en fracciones seleccionadas. Las fracciones se agrupan sobre la base del ensayo de endoproteasa y SDS-PAGE.
Ensayo de endoproteasa
[0302]
1. Comprimido Protazyme OL/5 ml de acetato de Na 250 mM pH 5.0 se disuelve mediante agitación magnética (sustrato: comprimido Protazyme AK de endoproteasa de Megazyme - cat. # PRAK 11/08).
2. Con agitación, se transfieren 250 pl de solución de sustrato a un tubo Eppendorf de 1.5 ml.
3. Se añaden 25 pl de muestra a cada tubo (el blanco es el tampón de muestra).
4. Los tubos se incuban en un termomezclador con agitación (1000 rpm) a 50 °C durante 15 minutos.
5. Se agregan 250 pl de NaOH 1 M a cada tubo y, a continuación, se agita en vórtice.
6. Centrifugación durante 3 min. a 16100 * G y 25 °C.
7. Se transfieren 200 pl del sobrenadante a un MTP y se registra la absorbancia a 590 nm.
Resultados
[0303]
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Ejemplo 3
Perfil de temperatura de variantes seleccionadas usando enzimas purificadas
[0304] Las variantes seleccionadas que muestran una buena estabilidad térmica se purificaron y las enzimas purificadas se usaron en un ensayo de zeína-BCA como se describe a continuación. La actividad restante de proteasa se determinó a 60 °C después de la incubación de la enzima a temperaturas elevadas durante 60 minutos tal como se indica.
Ensayo de zeína-BCA:
[0305] El ensayo de zeína-BCA se realizó para detectar la cuantificación de proteínas solubles liberadas de zeína por las variantes de proteasas a varias temperaturas.
Protocolo:
[0306]
1) Mezclar 10 microlitros de 10 microgramos/ml de soluciones enzimáticas y 100 ul de solución de zeína al 0.025 % en una placa de microtitulación (MTP).
2) Incubar a varias temperaturas durante 60 minutos.
3) Añadir 10 microlitros de solución de ácido tricloroacético (TCA) al 100 %.
4) Centrifugar MTP a 3500 rpm durante 5 minutos.
5) Llevar 15 microlitros a un nuevo MTP que contenga 100 microlitros de solución de ensayo de BCA (Pierce n.° cat: 23225, kit de ensayo de proteínas BCA).
6) Incubar durante 30 minutos a 60 °C.
7) Medir A562.
[0307] Los resultados se muestran en la tabla 7. Todas las variantes ensayadas mostraron una termoestabilidad mejorada en comparación con la proteasa ts.
Tabla 7. Ensa o de zeína-BCA
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Ejemplo 4
Caracterización de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum
[0308] La glucoamilasa de Penicillium oxalicum se describe en las SEC ID N.°: 9 y 14 (maduras) del presente documento.
[0309] Sustrato. Sustrato: almidón soluble (Sigma S-9765) del 1 % en agua desionizada
[0310] Tampón de reacción: tampón de acetato 0.1 M a pH 5.3
[0311] Kit de determinación de concentración de glucosa: kit de ensayo de glucosa Wako (LabAssay glucose, WAKO, n.° cat 298-65701).
[0312] Condición de reacción. Se mezclaron 20 pl de almidón soluble y 50 pl tampón acetato a pH 5.3. Se añadieron 30 pl de solución enzimática (50 pg de proteína enzimática/ml) a un volumen final de 100 pl seguido de incubación a 37 °C durante 15 min.
[0313] La concentración de glucosa se determinó mediante kits Wako.
[0314] Todo el trabajo se realizó en paralelo.
[0315] Temperatura óptima. Para evaluar la temperatura óptima de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum el ensayo de "condición de reacción" descrito anteriormente se realizó a 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90 y 95 °C. Los resultados se muestran en la tabla 8.
Tabla 8 Tem eratura ó tima
Figure imgf000037_0002
[0316] De los resultados se puede ver que la temperatura óptima para la glucoamilasa de Penicillium oxalicum en las condiciones dadas está entre 50 °C y 70 °C y la glucoamilasa mantiene más del 80 % de actividad a 95 °C.
[0317] Estabilidad térmica. Para evaluar la estabilidad térmica de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum, el ensayo de la condición de reacción se modificó en que la solución enzimática y el tampón de acetato se preincubaron durante 15 minutos a 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90 y 95 °C. Después de la incubación, se añadieron 20 pl de almidón a la solución y el ensayo se realizó tal como se ha descrito anteriormente.
[0318] Los resultados se muestran en la tabla 9.
Tabla 9 Estabilidad térmica
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[0319] De los resultados se puede ver que la glucoamilasa de Penicillium oxalicum es estable hasta 70 °C después de la preincubación durante 15 minutos, ya que mantiene más del 80 % de actividad.
[0320] pH óptimo. Para evaluar el pH óptimo de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum el ensayo de la condición de reacción descrito anteriormente se realizó a pH 2.0, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 y 11.0. En lugar de usar el tampón de acetato descrito en el ensayo de la condición de reacción, se usó el siguiente tampón de ácido succínico 100 mM, HEPES, CHES, Ca Ps O, CaCh 1 mM, KCI 150 mM, Triton X-100 al 0.01 %, pH ajustado a 2.0, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 u 11.0 con HCl o NaOH.
[0321] Los resultados se muestran en la tabla 10.
Tabla 10 H ó timo
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[0322] De los resultados se puede ver que la glucoamilasa de Penicillium oxalicum en las condiciones dadas tiene la mayor actividad a pH 5.0. La glucoamilasa de Penicillium oxalicum es activa en un amplio rango de pH, ya que mantiene más del 50 % de actividad de pH 2 a 7.
[0323] Estabilidad de pH. Para evaluar la estabilidad térmica de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum, el ensayo de la condición de reacción se modificó en que la solución enzimática (50 microgramos/ml) se preincubó durante 20 horas en tampones con pH 2.0, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 y 11.0 usando los tampones descritos bajo pH óptimo. Después de la preincubación, se agregaron 20 pl de almidón soluble hasta un volumen final de 100 pl a la solución y el ensayo se realizó tal como se ha descrito anteriormente.
[0324] Los resultados se muestran en la tabla 11.
Figure imgf000038_0003
[0325] De los resultados se puede ver que la glucoamilasa de Penicillium oxalicum, es estable desde pH 3 hasta pH 7 después de la preincubación durante 20 horas y disminuye su actividad a pH 8.
Ejemplo 5
Termoestabilidad de la proteasa Pfu.
[0326] La termoestabilidad de la proteasa de Pyrococcus furiosus (Pfu S) comprada en Takara Bio Inc, (Japón) se ensayó utilizando los mismos métodos que en el ejemplo 2. Se encontró que la termoestabilidad (actividad relativa) era del 110 % a (80 °C/70 °C) y del 103 % (90 °C/70 °C) a pH 4.5.
Ejemplo 6
Clonación del gen de glucoamilasa de la cepa de Penicillium oxalicum
Preparación de la cepa de ADNc de Penicillium oxalicum.
[0327] El ADNc se sintetizó siguiendo las instrucciones del sistema de amplificación rápida de extremos de ADNc 3' (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, EE. UU.).
Clonación del gen de glucoamilasa de la cepa de Penicillium oxalicum
[0328] El gen de glucoamilasa de Penicillium oxalicum se clonó usando el cebador oligonucleotídico que se muestra a continuación, diseñado para amplificar el gen de glucoamilasa desde el extremo 5'.
[0329] Cebador sentido: 5'- ATGCGTCTCACTCTATTATCAGGTG-3' (SEC ID N.°: 19)
[0330] El gen de longitud completa se amplificó por PCR con cebador sentido y AUAP (suministrado por el sistema de amplificación rápida de extremos de ADNc 3') usando Platinum HIFI Taq DNA polymerase (Invitrogen Corp., Carlsbad, Ca , EE. UU.). La reacción de amplificación estaba compuesta por 5 pl de tampón 10x de PCR, 2 pl de MgCh 25 mM, 1 pl de dNTP 10 mM, 1 pl de cebador sentido 10 pM, 1 pl de A uAP 10 pM, 2 pl del ADNc de la primera cadena, 0.5 pl de Taq HIFI y 37.5 pl de agua desionizada. El programa de PCR fue: 94 °C, 3 minutos; 10 ciclos de 94 °C durante 40 segundos, 60 °C 40 segundos con 1 °C de disminución por ciclo, 68 °C durante 2 minutos; 25 ciclos de 94 °C durante 40 segundos, 50 °C durante 40 segundos, 68 °C durante 2 minutos; extensión final a 68 °C durante 10 minutos.
[0331] El fragmento de PCR obtenido se clonó en el vector pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, EE. UU.) Utilizando un sistema de vectores pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, EE. UU.) para generar el plásmido AMG 1. El gen de glucoamilasa insertado en el plásmido AMG 1 confirmó la secuenciación de la cepa E. coli TOP10 que contiene el plásmido AMG 1 (designado NN059173), se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) el 23 de noviembre de 2009, y se le asignó el número de acceso DSM 23123.
Ejemplo 7
Expresión de la glucoamilasa de Penicillium oxalicum clonada
[0332] El gen de glucoamilasa de Penicillium oxalicum se volvió a clonar del plásmido AMG 1 en un vector de expresión de Aspergillus mediante PCR usando dos cebadores de clonación F y R que se muestran a continuación, diseñados basándose en la secuencia conocida y se agregaron marcadores para la clonación directa mediante la estrategia IN-FUSION™.
Cebador F: 5' ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC (SEC ID N.°: 20)
Cebador R: 5' AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG (SEC ID N.°: 21)
[0333] Se realizó una reacción de PCR con el plásmido AMG 1 para amplificar el gen de longitud completa. La reacción de PCR estaba compuesta por 40 pg de ADN del plásmido AMG 1, 1 pl de cada cebador (100 pM); 12.5 pl de 2X Extensor Hi-Fidelity master mix (Extensor Hi-Fidelity master mix, ABgene, Reino Unido) y 9.5 pl de agua de calidad PCR. La reacción de PCR se realizó utilizando una máquina de PCR DYAD (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU.) programada durante 2 minutos a 94 °C seguida de 25 ciclos de 94 °C durante 15 segundos, 50 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 minuto; y luego 10 minutos a 72 °C.
[0334] Los productos de reacción se aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.0 % usando tampón 1 x TAE donde se separó del gel una banda de producto de PCR de aproximadamente 1.9 kb y se purificó usando un kit de purificación de banda de gel y ADN de PCR GFX® (GE Healthcare, Reino Unido) según a las instrucciones del fabricante. Se clonó ADN correspondiente al gen de glucoamilasa de Penicillium oxalicum en un vector de expresión de Aspergillus linealizado con SamHI y HindIII, utilizando un kit de clonación de PCR en seco IN-FUSION™ (BD Biosciences, Palo Alto, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La construcción del vector linealizado se realiza como se describe en WO 2005/042735 A1.
[0335] Se usó un volumen de 2 pl de la mezcla de ligadura para transformar 25 pl de células de E. coli Fusion Blue (incluidas en el kit de clonación de PCR en seco IN-FUSION™). Después de un choque térmico a 42 °C durante 45 segundos, y enfriando en hielo, se añadieron 250 pl de medio SOC, y las células se incubaron a 37 °C a 225 rpm durante 90 minutos antes de ser sembradas en placas de agar LB que contenían 50 pg de ampicilina por ml, y cultivadas durante la noche a 37 °C. Las colonias seleccionadas se inocularon en 3 ml de medio LB suplementado con 50 pg de ampicilina por ml y se incubaron a 37 °C a 225 rpm durante la noche. El ADN plasmídico de las colonias seleccionadas se purificó usando Mini JETSTAR (Genomed, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuencia del gen de glucoamilasa de Penicillium oxalicum se verificó mediante secuenciación de Sanger antes de la expresión heteróloga. Se seleccionó uno de los plásmidos para expresión adicional, y se denominó XYZ XYZ1471-4.
[0336] Se prepararon protoplastos de Aspergillus niger MBin118 como se describe en WO 95/02043. Se mezclaron cien pl de suspensión de protoplastos con 2.5 pg del plásmido XYZ1471-4 y se añadieron y mezclaron suavemente 250 microlitros de PEG 4000 al 60 % (Applichem) (polietilenglicol, peso molecular 4000), CaCl2 10 mM y Tris-HCl 10 mM, pH 7.5 . La mezcla se incubó a 37 °C durante 30 minutos y los protoplastos se mezclaron con agarosa al 6 % de bajo punto de fusión (Biowhittaker Molecular Applications) en placas de sacarosa COVE (Cove, 1996, Biochim. Biophys Acta 133: 51-56) (1 M) suplementadas con acetamida 10 mM y CsCl 15 mM y agregadas como capa superior en placas de sacarosa de COVE (1 M) suplementadas con acetamida 10 mM y CsCl 15 mM para la selección de transformantes (4 ml de agar superior por placa). Después de la incubación durante 5 días a 37 °C, se recogieron esporas de dieciséis transformantes y se sembraron en 750 pl YP-2 % de medio de Maltosa en placas MT de 96 pocillos. Después de 5 días de cultivo estacionario a 30 °C, se analizaron 10 pl del caldo de cultivo de cada pocillo en un gel SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio), Griton XT Precast gel (BioRad, CA, EE. UU.) para identificar los mejores transformantes basándose en la capacidad de producir gran cantidad de glucoamilasa. Se identificó un transformante seleccionado en la placa de transformación original y se conservó como esporas en materia prima de glicerol al 20 % y se almacenó congelado (-80 °C).
[0337] Cultivo. El transformante seleccionado se inoculó en 100 ml de medio MLC y se cultivó a 30 °C durante 2 días en matraces de agitación de 500 ml en un agitador rotatorio. Se inocularon 3 ml del caldo de cultivo en 100 ml de medio M410 y se cultivaron a 30 °C durante 3 días. El caldo de cultivo se centrifugó y el sobrenadante se filtró usando filtros de membrana de 0.2 pm.
[0338] Gel de afinidad de alfa-ciclodextrina. Se suspendieron diez gramos de polvo de Sepharose 6B (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Reino Unido) activada con epoxi y se lavaron con agua destilada en un filtro de vidrio sinterizado. El gel se suspendió en solución de acoplamiento (100 ml de 12.5 mg/ml de alfa-ciclodextrina, NaOH 0.5 M) y se incubó a temperatura ambiente durante un día con agitación suave. El gel se lavó con agua destilada en un filtro de vidrio sinterizado, se suspendió en 100 ml de etanolamina 1 M, pH 10, y se incubó a 50 °C durante 4 horas para el bloqueo. El gel se lavó varias veces usando Tris-HCl 50 mM, pH 8 y NaOAc 50 mM, pH 4.0 alternativamente. El gel se envasó finalmente en una columna de 35-40 ml usando tampón de equilibrio (NaOAc 50 mM, NaCl 150 mM, pH 4.5).
[0339] Purificación de glucoamilasa del caldo de cultivo. El caldo de cultivo de fermentación de A. niger MBin118 que contenía el gen de la glucoamilasa se filtró a través de un filtro PES de 0.22 pm y se aplicó en una columna de gel de afinidad de alfa-ciclodextrina previamente equilibrada en NaOAc 50 mM, NaCl 150 mM, pH 4.5. El material no unido se retiró de la columna lavando con tampón de equilibrado y la glucoamilasa se eluyó usando el mismo tampón que contenía beta-ciclodextrina 10 mM en 3 volúmenes de columna.
[0340] Se comprobó la actividad de glucoamilasa del eluyente para ver si la glucoamilasa se había unido al gel de afinidad de alfa-ciclodextrina. La muestra de glucoamilasa purificada se dializó luego contra NaOAc 20 mM, pH 5.0. Finalmente, se comprobó la pureza mediante SDS-PAGE y solo se encontró una banda individual.
Ejemplo 8
Construcción y expresión de una variante dirigida de glucoamilasa de Penicillium oxalicum (PE001)
[0341] Se realizaron dos reacciones de PCR con el plásmido XYZ1471-4, descrito en el ejemplo 9, usando los cebadores K79V F y K79V R que se muestran a continuación, que fueron diseñados para sustituir la lisina K en la posición 79 de la secuencia madura a valina V y los cebadores F-NP003940 y R-NP003940 mostrados a continuación, que se diseñaron basándose en la secuencia conocida y se agregaron marcadores para la clonación directa mediante la estrategia IN-FUSION ™ .
Cebador K79V F 18mer GCAGTCTTTCCAATTGAC (SEC ID N.°: 22)
Cebador K79V R 18mer AATTGGAAAGACTGCCCG (SEC ID N.°: 23)
Cebador F-NP003940: 5' ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC (SEC ID N.°: 24) Cebador R-NP003940: 5' AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG (SEC ID N.°: 25)
[0342] La PCR se realizó utilizando un motor de ADN PTC-200 en las condiciones que se describen a continuación.
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[0343] Los fragmentos de ADN se recuperaron del gel de agarosa mediante el kit de extracción de gel de Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los dos fragmentos purificados resultantes se clonaron en un vector de expresión de Aspergillus linealizado con BamHI y HindIII, utilizando un kit de clonación de PCR en seco IN-FUSION™ (BD Biosciences, Palo Alto, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La construcción del vector linealizado se realiza como se describe en WO 2005/042735 A1.
[0344] La mezcla de ligadura se usó para transformar células de E. coli DH5a (TOYOBO). Las colonias seleccionadas se inocularon en 3 ml de medio LB suplementado con 50 pg de ampicilina por ml y se incubaron a 37 °C a 225 rpm durante la noche. El ADN plasmídico de las colonias seleccionadas se purificó usando el mini kit de plásmido Qiagen (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuencia del gen variante dirigida de glucoamilasa de Penicillium oxalicum se comprobó antes de la expresión heteróloga y se seleccionó uno de los plásmidos para expresión adicional, y se denominó pPoPE001.
[0345] Se prepararon protoplastos de Aspergillus niger MBin118 como se describe en WO 95/02043. Se mezclaron cien pl de suspensión de protoplastos con 2.5 pg del plásmido pPoPE001 y se añadieron y mezclaron suavemente 250 microlitros de PEG 4000 al 60 % (Applichem) (polietilenglicol, peso molecular 4000), CaCl2 10 mM y Tris-HCl 10 mM, pH 7.5 . La mezcla se incubó a 37 °C durante 30 minutos y los protoplastos se mezclaron con agarosa L al 1 % (gen Nippon) en sacarosa de COVE (Cove, 1996, Biochim. Biophys Acta 133: 51-56) (1 M) suplementada con acetamida 10 mM y CsCl 15 mM y añadida como capa superior en placas de sacarosa de COVE (1 M) suplementadas con acetamida 10 mM y CsCl 15 mM para la selección de transformantes (4 ml de agar superior por placa). Después de la incubación durante 5 días a 37 °C, se recogieron esporas de dieciséis transformantes y se sembraron en 750 pl YP-2 % de medio de Maltosa en placas MT de 96 pocillos. Después de 5 días de cultivo estacionario a 30 °C, se analizaron 10 pl del caldo de cultivo de cada pocillo en un gel SDS-PAGE para identificar los mejores transformantes en función de la capacidad de producir una gran cantidad de glucoamilasa.
Ejemplo 9
Purificación de la variante dirigida de Po AMG PE001
[0346] El transformante seleccionado de la variante y la cepa que expresa la glucoamilasa de Penicillium oxalicum de tipo salvaje descrita en el ejemplo 8 se cultivó en 100 ml de medio YP- 2 % de maltosa y el cultivo se filtró a través de un filtro PES de 0.22 pm, y se aplicó en una columna de gel de afinidad de alfa-ciclodextrina previamente equilibrada en NaOAc 50 mM, NaCl 150 mM, tampón pH 4.5. Los materiales no unidos se retiraron de la columna lavando con tampón de equilibrado y la glucoamilasa se eluyó usando el mismo tampón que contenía beta-ciclodextrina 10 mM en 3 volúmenes de columna.
[0347] Se comprobó la actividad de glucoamilasa del eluyente para ver si la glucoamilasa se había unido al gel de afinidad de alfa-ciclodextrina. Las muestras de glucoamilasa purificadas se dializaron luego contra NaOAc 20 mM, pH 5.0.
Ejemplo 10
Caracterización de la estabilidad de la proteasa PE001
[0348] Se mezclaron 40 |jl de soluciones enzimáticas (1 mg/ml) en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 4.5, con 1/10 de volumen de soluciones de proteasa de 1 mg/ml como la aspergilopepsina I descrita en Biochem J. 1975 Apr; 147 (1): 45-53, o el producto comercialmente disponible en Sigma y aorsin descrito en Biochemical journal [0264-6021] Ichishima, 2003, 371 (2): 541 e incubado a 4 o 32 °C durante la noche. Como experimento de control, H2O se añadió a la muestra en lugar de proteasas. Las muestras se cargaron en SDS-pAg E para ver si las proteasas dividen las glucoamilasas.
[0349] En SDS-PAGE, PE001 solo mostró una banda correspondiente a la molécula intacta, mientras que la glucoamilasa de tipo salvaje fue degradada por las proteasas y mostró una banda de menor tamaño molecular a 60 kCa.
TABLA 12 El r l D -PA E l r mi n n r
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Ejemplo 11
Menos escisión durante el cultivo
[0350] El transformante de Aspergillus de la variante (PE001) y la glucoamilasa de Penicillium oxalicum de tipo salvaje se cultivó en placas MT de 6 pocillos que contenían un medio YP- 2 % de maltosa diluida 4X suplementado con tampón de acetato de sodio 10 mM, pH 4.5, a 32 °C durante 1 semana.
[0351] Los sobrenadantes de cultivo se cargaron en SDS-PAGE.
TABLA 13 El resultado de SDS-PAGE de los sobrenadantes de cultivo
Figure imgf000042_0002
[0352] La glucoamilasa de tipo salvaje fue dividida por las proteasas del huésped durante la fermentación, mientras que la variante produjo solo una molécula intacta.
Ejemplo 12
Actividad de glucoamilasa de la variante PE001 en comparación con la progenitora
[0353] La actividad de la glucoamilasa medida como AGU como se ha descrito anteriormente se comprobó para controlar las enzimas purificadas de tipo salvaje de Penicillium oxalicum y la variante de glucoamilasa.
[0354] La unidad de glucoamilasa (AGU) se definió como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto en condiciones estándar (37 °C, pH 4.3, sustrato: maltosa 100 mM, tampón: acetato 0.1 M, tiempo de reacción 6 minutos).
Tabla 14
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Ejemplo 13
Purificación de variantes de glucoamilasa que tienen termoestabilidad incrementada
[0355] Las variantes que muestran una mayor termoestabilidad pueden construirse y expresarse de manera similar al procedimiento descrito en el ejemplo 8. Todas las variantes se derivaron de la PE001. Después de la expresión en medio YPM, las variantes que comprenden las sustituciones T65A o Q327F (SEC ID N.°: 14 numeración) se micropurificaron de la siguiente manera:
El micelio se eliminó por filtración a través de un filtro de 0.22 pm. Se añadieron 50 pl de material de columna (alfa-ciclodextrina acoplada al medio de agarosa activado por divinilsulfona Mini-Leak según las recomendaciones del fabricante) a los pocillos de una placa de filtro (Whatman, Unifilter 800 pl, 25-30 pm MBPP). El material de la columna se equilibró con tampón de unión (acetato de sodio 200 mM, pH 4.5) añadiendo dos veces 200 pl de tampón, agitando intensamente durante 10 min (Heidolph, Titramax 101, 1000 rpm) y eliminando el tampón mediante vacío (Whatman, UniVac 3). Posteriormente, se añadieron 400 pl de sobrenadante de cultivo y 100 pl de tampón de unión y la placa se incubó 30 minutos con agitación intensa. El material no unido se eliminó por vacío y se repitió el paso de unión. Normalmente se utilizaron 4 pozos por variante. Luego se realizaron tres pasos de lavado añadiendo 200 pl de tampón de concentración iónica decreciente (acetato de sodio 50/10/5 mM, pH 4.5), agitando durante 15 minutos y eliminando el tampón mediante vacío. La elución del AMG unido se logró añadiendo dos veces 100 pl de tampón de elución (acetato de sodio 250 mM, alfa-ciclodextrina al 0.1 %, pH 6.0), agitando durante 15 minutos y recogiendo el material eluido en una placa de microtitulación mediante vacío. Los eluidos agrupados se concentraron y el tampón se cambió a acetato de sodio 50 mM pH 4.5 usando unidades de filtro centrífugo con un corte de 10 kDa (Millipore Microcon Ultracel YM-10). Las muestras micropurificadas se almacenaron a -18 °C hasta la prueba de termoestabilidad.
Ejemplo 14
Análisis de despliegue térmico de proteínas (TSA, ensayo de cambio térmico)
[0356] El despliegue térmico de proteínas de las variantes T65A y Q327F se monitorizó utilizando Sypro Orange (In-Vitrogen, S-6650) y se realizó utilizando un instrumento de PCR en tiempo real (Applied Biosystems; Step-One-Plus).
[0357] En una placa de 96 pocillos, se mezcló una muestra micropurificada de 25 microlitros en acetato 50 mM pH 4.5 a aprox. 100 microgramos/ml (5: 1) con Sypro Orange (concentración resultante = 5X; solución madre del proveedor = 5000X). La placa se selló con un sello óptico de PCR. El instrumento de PCR se ajustó a una velocidad de exploración de 76 °C p. h., comenzando a 25 °C y terminando a 96 °C.
[0358] El despliegue térmico de proteínas de la variante E501V Y504T se monitorizó usando Sypro Orange (in-Vitrogen, S-6650) y se realizó con un instrumento de PCR en tiempo real (Applied Biosystems; Step-One-Plus).
[0359] En una placa de 96 pocillos, se mezcló una muestra purificada de 15 microlitros en acetato 50 mM pH 4.5 a aprox. 50 microgramos/ml (1: 1) con Sypro Orange (concentración resultante = 5X; solución madre del proveedor = 5000X) con o sin 200 ppm de Acarbosa (Sigma A8980). La placa se selló con un sello óptico de PCR. El instrumento de PCR se ajustó a una velocidad de exploración de 76 °C p. h., comenzando a 25 °C y terminando a 96 °C.
[0360] La fluorescencia se monitorizó cada 20 segundos usando luz LED azul incorporada para la excitación y filtro ROX (610 nm, emisión).
[0361] Los valores de Tm se calcularon como el valor máximo de la primera derivada (dF/dK) (ref .: Gregory et al., 2009, J. Biomol. Screen. 14: 700).
Tabla 15a.
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Tabla 15b.
Figure imgf000043_0002
Ejemplo 15
Análisis de termoestabilidad por calorimetría diferencial de barrido (DSC)
[0362] Las variantes específicas del sitio adicionales que tienen sustituciones y/o deleciones en posiciones específicas se construyeron básicamente como se describe en el ejemplo 8 y se purificaron como se describe en el ejemplo 9.
[0363] La termoestabilidad de las variantes derivadas de Po-AMG PE001 purificadas se determinó a pH 4.0 o 4.8 (acetato de sodio 50 mM) mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC) utilizando un calorímetro de barrido diferencial con capilar VP (MicroCal Inc., Piscataway, NJ, EE. UU.) . La temperatura de desnaturalización térmica, Td (°C), se tomó como la parte superior del pico de desnaturalización (pico endotérmico principal) en los termogramas (Cp vs. T) obtenidos después de calentar las soluciones enzimáticas en tampones seleccionados (acetato de sodio 50 mM, pH 4.0 o 4.8) a una velocidad de calentamiento programada constante de 200 K/h.
[0364] Las soluciones de muestra y de referencia (aproximadamente 0.3 ml) se cargaron en el calorímetro (referencia: tampón sin enzima) desde las condiciones de almacenamiento a 10 °C y se preequilibraron térmicamente durante 10 minutos a 20 °C antes del escaneo de DSC desde 20 °C hasta 110 °C. Las temperaturas de desnaturalización se determinaron con una precisión de aproximadamente /- 1 °C.
[0365] Las variantes aisladas y los datos de DSC se describen en la tabla 16 a continuación.
Tabla 16.
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Ejemplo 16
Análisis de termoestabilidad mediante prueba de estrés térmico y ensayo de pNPG
[0366] Partiendo de una de las variantes de sustitución identificadas del ejemplo 10, identificadas como PE008, se probaron variantes adicionales mediante un ensayo de estrés térmico en el que se analizó la actividad de glucoamilasa (AMG) en el sobrenadante de cultivos de crecimiento después de un choque térmico a 83 °C durante 5 minutos.
[0367] Después del choque térmico, se midió la actividad residual de la variante, así como de una muestra sin estrés.
Descripción del ensayo de actividad de Po-AMG pNPG:
[0368] El ensayo de actividad de pNPG de glucoamilasa de Penicillium oxalicum es un ensayo de punto final espectrométrico en el que las muestras se dividen en dos y se miden con estrés térmico y sin estrés térmico. La salida de datos es, por lo tanto, una medida de la actividad residual en las muestras con estrés.
Cultivo:
[0369] Se añadió a una placa de microtitulación esterilizada (MTP) 200 pl de medio de crecimiento enriquecido (FT X-14 sin Dowfax) en cada pocillo. Las cepas de interés se inocularon por triplicado directamente de las reservas congeladas hasta la MTP. El punto de referencia se inoculó en 20 pozos. Los pocillos no inoculados con medio se usaron como blancos de ensayo. El MTP se colocó en una caja de plástico que contenía tejido húmedo para evitar la evaporación desde los pocillos durante la incubación. La caja de plástico se colocó a 34 °C durante 4 días.
Ensayo:
[0370] Se transfirieron 50 microlitros de sobrenadante a 50 microlitros de NaAc 0.5 M a pH 4.8 para obtener el pH de muestra correcto.
[0371] La dilución de 50 microlitros se transfirió a una placa de PCR y se sometió a estrés térmico a 83 °C durante 5 minutos en una máquina de PCR. La mitad restante de la dilución se mantuvo a temperatura ambiente.
[0372] Se transfirieron 20 microlitros de muestras estresadas y no estresadas a un MTP estándar. Se añadieron 20 microlitros de sustrato de pNPG para comenzar la reacción. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h.
[0373] La reacción se detuvo y el color se desarrolló mediante la adición de 50 microlitros de Na2CÜ30.5 M. El color amarillo se midió en un lector de placas (Molecular Devices) a 405 nm.
Tampones:
[0374]
NaAc 0.5 M pH 4.8
NaAc 0.25 M pH 4.8
Sustrato, pNPG 6 mM:
[0375] 15 mg de 4-nitrofenil D-glucopiranósido en 10 ml 0.25 NaAc pH 4.8
Solución de parada/desarrollo:
[0376] Na2COa 0.5 M
Tratamiento de datos:
[0377] En Excel, los datos brutos de Abs405 de muestras con estrés y sin estrés se restaron en blanco con sus respectivos espacios en blanco. La actividad residual (% act. res. = (Abssin estrés (Abssin estrés - Abscon estrés))/Abscon estrés *100 %) se calculó y trazó en relación con el punto de referencia, Po-amg0008.
Tabla 17
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Tabla 18
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Ejemplo 17
Prueba de actividad de glucoamilasa de variantes termoestables según la invención
[0378] Todas las variantes descritas anteriormente mostradas en las tablas 16, 17 y 18 se han comprobado para determinar la actividad de glucoamilasa en sobrenadantes de cultivo usando el ensayo de pNPG descrito en el ejemplo 16.
Ejemplo 18
Determinación de la termoestabilidad de las endo-beta-glucanasas (EG) mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC)
[0379] La termoestabilidad de las EG se ensayó como se describe en la sección "Materiales y métodos" en "Determinación de Td mediante calorimetría diferencial de barrido para endoglucanasas".
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Ejemplo 19
Adición de endo-beta-glucanasa termoestable (EG) en la licuefacción del maíz
[0380] Todos los tratamientos se evaluaron mediante licuefacción a pequeña escala de 25 g. Para los experimentos se utilizaron harina de maíz y vinaza diluida obtenidas de plantas industriales de etanol de maíz. Los sólidos secos (DS) de la harina de maíz constituyeron el 85.62 % y los DS de la vinaza diluida eran el 8.08 %, ambos según lo determinado por el equilibrio de humedad halógeno Mettler-Toledo HB43. Para la licuefacción, se agregaron 7.9 g de harina de maíz, 7.5 g de vinaza diluida y 9.6 g de agua corriente para alcanzar un DS del 29.5 % y una masa de 25 g en un tubo de policarbonato Nalgene de 30 ml con una tapa roscada y un sello de goma. Se encontró que el pH de la suspensión de maíz era de aproximadamente 5.1 sin ajuste. Los tubos que contenían la suspensión de maíz se colocaron luego en un horno de hibridación Boekel con un estante giratorio ajustado a 60 ± 1 °C para calentar antes de añadir la enzima; la rotación se fijó a 20 rpm. La alfa-amilasa (AA) utilizada fue BE369. Además del control de solo AA, se evaluaron cinco EG termoestables tal como se muestra en la tabla 19. Después de precalentar durante 20-30 minutos, los tubos se retiraron y se dosificaron con la cantidad apropiada de enzima diluida tal como se muestra en la tabla 20 a continuación. Cada tratamiento de licuefacción se ensayó por duplicado. Las dosis reales de enzimas suponen un volumen constante de maceración en cada tubo; el DS final de la suspensión de maíz después de todas las adiciones y antes de la licuefacción fue del 28.2 %. Después de añadir la enzima, los tubos se agitaron a conciencia y luego se devolvieron al horno de hibridación Boekel calentado a 75 ± 1 °C durante dos horas y diez minutos; la rotación del el estante se fijó a 20 rpm. El tiempo deseado a 75 ± 1 °C fue de dos horas, los diez minutos adicionales sirvieron para permitir que la temperatura de la suspensión de maíz se equilibrara.
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[0381] Después de dos horas de licuefacción, los tubos se retiraron del horno, se sumergieron en agua fría y se agitaron periódicamente durante aproximadamente 15 minutos hasta que los tubos estaban fríos al tacto. Las soluciones de urea y penicilina de preparación propia se añadieron a cada tubo para alcanzar concentraciones finales de 1000 ppm y 3 ppm, respectivamente. Para la fermentación, se prepararon tubos de polipropileno de 15 ml perforando un orificio de 1/32 pulgadas (1.5 mm) en la tapa y luego se pesaron para registrar el peso vacío. Se transfirieron aproximadamente 5 g de suspensión de cada tubo de Nalgene (licuefacción) a cada uno de los cuatro tubos de 15 ml. Luego se volvieron a pesar los tubos para determinar el peso exacto de la maceración de maíz en cada tubo. Cada tubo se dosificó con la cantidad apropiada de glucoamilasa AC diluida. La dosificación real de la enzima fue de 0.6 AGU/g DS basada en el peso exacto de la suspensión de maíz en cada tubo. Todos los tubos se dosificaron con 100 pl de propagación de levadura y luego se colocaron en un baño de agua a 32 °C para la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). El DS final calculado fue del 27.8 % al inicio de la s Sf .
[0382] Se recogieron muestras para análisis mediante HPLC tras 53 horas de fermentación. La preparación de la muestra de HPLC consistió en detener las reacciones de enzimas y levaduras mediante la adición de 50 pl de H2SO4 al 40 %, agitar en vórtice para distribuir el ácido, centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos y hacer pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0.45 pm. Las muestras se almacenaron a 4 °C hasta el análisis. El sistema utilizado para determinar la concentración de etanol y oligosacáridos fue un sistema HPLC Agilent™ 100 junto con un detector RI. La columna de separación era una columna de exclusión de iones BioRad™ Aminex HPX-87H (300 mm x 7.8 mm).
Resultados
[0383] Los resultados del análisis mediante HPLC se resumen en la tabla 21 a continuación. Cinco EG mostraron un mayor rendimiento final de etanol después de la SSF que con la maceración de maíz licuada con BE369 AA sola (Control) cuando se añadió en la licuefacción a 75 °C durante 2 horas. Un GH5 de Talaromyces leycettanus aumentó el rendimiento final de etanol en un 1.93 % en comparación con el control BE369 Aa solo. Esta EG tiene una Td de 89 °C.
T l 21: R l r mi r n imi n n l m i r n l
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Ejemplo 20
Adición de endo-beta-glucanasa termoestable (EG) en la licuefacción del maíz
[0384] Todos los tratamientos se evaluaron mediante licuefacción de 100 o 107 g. Se obtuvieron dos harinas de maíz diferentes, denominadas harina de maíz A y harina de maíz B, de plantas industriales de etanol de maíz que se van a utilizar para los experimentos; cada harina se evaluó en un experimento separado. Los sólidos secos (% DS) de la harina de maíz A fueron del 86.1 % y de la harina de maíz B fueron del 86.3 % según lo determinado mediante el equilibrio de humedad halógeno Mettler-Toledo HB43 por duplicado.
[0385] Para la licuefacción de la harina de maíz A, se añadieron 37.2 g de harina de maíz y 62.8 g de agua corriente para alcanzar un DS del 32 % y una masa de 100 g en un recipiente de 200 ml de acero inoxidable Lab-O-Mat. Se encontró que el pH de la suspensión de maíz era de aproximadamente 6.0; 80 pl de H2SO4 al 40 % se agregaron para reducir el pH a 5.0 en la licuefacción. La alfa-amilasa (AA) utilizada fue BE369. Además del control de solo AA, se evaluaron tres EG termoestables tal como se muestra en la tabla 22. Cada recipiente se dosificó con la cantidad apropiada de enzima diluida como se muestra en la tabla 23 a continuación. Cada tratamiento de licuefacción se ensayó por duplicado. Las dosis reales de enzimas suponen un volumen constante de maceración en cada recipiente; el volumen final de la suspensión de maíz después de todas las adiciones y antes de la licuefacción era de 107 g y el DS final fue del 29.9 %. Después de añadir la enzima, los recipientes se sellaron herméticamente, se agitaron completamente y luego se colocaron en la cámara Lab-O-Mat. El programa utilizado para la licuefacción comenzó con una rampa de temperatura de 5 °C/min para alcanzar los 75 °C; los 75 °C se mantuvieron durante dos minutos. Esto fue seguido inmediatamente por una rampa de temperatura de 1 °C/min para alcanzar 80 °C; se mantuvieron los 80 °C durante 110 minutos. La rotación alterna de 45 rpm en sentido horario durante 30 segundos seguida de 45 rpm en sentido antihorario durante 30 segundos continuó durante todo el programa.
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[0386] Una vez completado el programa, los recipientes se retiraron del Lab-O-Mat y se sumergieron en hielo durante aproximadamente 20 minutos hasta que estuvieron fríos al tacto. Las soluciones de urea y penicilina de preparación propia se añadieron a cada recipiente para alcanzar concentraciones finales de 800 ppm y 3 ppm, respectivamente. Para la fermentación, se pesaron matraces de policarbonato de 125 ml con deflectores y tapones de rosca fabricados por Corning para registrar el peso vacío. Se transfirieron aproximadamente 50 g de suspensión de cada recipiente (licuefacción) a cada uno de los dos matraces de 125 ml. Los matraces se volvieron a pesar para determinar el peso exacto de la maceración de maíz en cada matraz. Cada matraz se dosificó con la cantidad apropiada de glucoamilasa AC diluida. La dosificación real de la enzima fue de 0.6 AGU/g DS basada en el peso exacto de la suspensión de maíz en cada matraz. Todos los matraces se dosificaron con 1100 pl de propagación de levadura basándose en el peso promedio de la maceración en cada matraz y una dosis de levadura de 20 pl/g de maceración de maíz redondeada hasta los 100 más cercanos. Luego, los matraces se colocaron en una incubadora de agitación controlada mediante humedad de Infors para la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). La temperatura era de 32 °C, la humedad se fijó al 80 % y se agitó a 150 rpm. El DS final calculado fue del 28.6 % al comienzo de la SSF.
[0387] Se recogieron muestras para análisis mediante HPLC tras 62 horas de fermentación. La preparación de la muestra de HPLC consistió en detener las reacciones de enzimas y levaduras mediante la adición de 550 pl de H2SO4 al 40 %, (10 pl/g de puré de maíz), mezclar para distribuir el ácido, transferir aproximadamente 5 g a un tubo Falcon de 15 ml, centrifugar a 3000 rpm durante 8 minutos y hacer pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0.45 pm. Las muestras se almacenaron a 4 °C hasta el análisis. El sistema utilizado para determinar la concentración de etanol y oligosacáridos fue un sistema HPLC Agilent™ 100 junto con un detector RI. La columna de separación era una columna de exclusión de iones BioRad™ Aminex HPX-87H (300 mm x 7.8 mm).
[0388] Para la licuefacción de la harina de maíz B, se añadieron 37.7 g de harina de maíz y 55.3 g de agua corriente para alcanzar un DS del 35 % y una masa de 93 g en un recipiente de 200 ml de acero inoxidable Lab-O-Mat. Se encontró que el pH de la suspensión de maíz era de aproximadamente 6.0; 75 pl de H2SO4 al 40 % se agregaron para reducir el pH a 5.0 en la licuefacción. La alfa-amilasa (AA) utilizada fue BE369. Además del control de solo AA, se evaluaron tres EG termoestables tal como se muestra en la tabla 22. Cada recipiente se dosificó con la cantidad apropiada de enzima diluida tal como se muestra en la tabla 23; se añadió más agua corriente para llevar el volumen final de cada recipiente a 100 g. Cada tratamiento de licuefacción se ensayó por duplicado. Las dosis reales de enzimas suponen un volumen constante de maceración en cada recipiente; el volumen final de la suspensión de maíz después de todas las adiciones y antes de la licuefacción era de 100 g y el DS final fue del 32.6 %. Después de añadir la enzima, los recipientes se sellaron herméticamente, se agitaron completamente y luego se colocaron en la cámara Lab-O-Mat. El programa utilizado para la licuefacción comenzó con una rampa de temperatura de 5 °C/min para alcanzar los 75 °C; los 75 °C se mantuvieron durante dos minutos. Esto fue seguido inmediatamente por una rampa de temperatura de 1 °C/min para alcanzar 80 °C; se mantuvieron los 80 °C durante 110 minutos. La rotación alterna de 45 rpm en sentido horario durante 30 segundos seguida de 45 rpm en sentido antihorario durante 30 segundos continuó durante todo el programa.
[0389] Una vez completado el programa, los recipientes se retiraron del Lab-O-Mat y se sumergieron en hielo durante aproximadamente 20 minutos hasta que estuvieron fríos al tacto. Para la fermentación, se pesaron matraces de policarbonato de 125 ml con deflectores y tapones de rosca fabricados por Corning para registrar el peso vacío. Se transfirieron aproximadamente 50 g de suspensión de cada recipiente (licuefacción) a cada uno de los dos matraces de 125 ml. Los matraces se volvieron a pesar para determinar el peso exacto de la maceración de maíz en cada matraz. Las soluciones de urea y penicilina de preparación propia se añadieron a cada matraz para alcanzar concentraciones finales de 800 ppm y 3 ppm, respectivamente. Cada matraz se dosificó con la cantidad apropiada de glucoamilasa AC diluida. La dosificación real de la enzima fue de 0.6 AGU/g DS basada en el peso exacto de la suspensión de maíz en cada matraz. Todos los matraces se dosificaron con 1000 pl de propagación de levadura basándose en el peso promedio de la maceración en cada matraz y una dosis de levadura de 20 pl/g de maceración de maíz redondeada hasta los 100 más cercanos. Luego, los matraces se colocaron en una incubadora con agitación controlada mediante humedad de Infors para la sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). La temperatura era de 32 °C, la humedad se fijó al 80 % y se agitó a 150 rpm. El DS final calculado fue del 30.5 % al comienzo de la SSF.
[0390] Se recogieron muestras para análisis mediante HPLC tras 63 horas de fermentación. La preparación de la muestra de HPLC consistió en detener las reacciones de enzimas y levaduras mediante la adición de 500 pl de H2SO4 al 40 %, (10 pl/g de puré de maíz), mezclar para distribuir el ácido, transferir aproximadamente 5 g a un tubo Falcon de 15 ml, centrifugar a 3000 rpm durante 8 minutos y hacer pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0.45 pm. Las muestras se almacenaron a 4 °C hasta el análisis. El sistema utilizado para determinar la concentración de etanol y oligosacáridos fue un sistema HPLC Agilent™ 100 junto con un detector RI. La columna de separación era una columna de exclusión de iones BioRad™ Aminex HPX-87H (300 mm x 7.8 mm).
Resultados
[0391] Los resultados del análisis mediante HPLC se resumen en la tabla 24 a continuación. Todos las EG ensayadas en harina de maíz A y harina de maíz B mostraron un mayor rendimiento final de etanol después de la SSF que la maceración de maíz licuada con BE369 AA sola (control) cuando se añade en la licuefacción a 80 °C durante 2 horas.
T l 24: R l r mi r n imi n n l m i r n l
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Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Proceso para generar productos de fermentación a partir de un material que contiene almidón que comprende los pasos de:
i) licuefacción del material que contiene almidón durante 0.5-5 horas a una temperatura de 75-95 °C a un pH de 4-6 usando:
- una alfa-amilasa;
- una endoglucanasa que tiene la secuencia mostrada como SEC ID N.°: 3 o una secuencia que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEC ID N.°: 3 y además tiene un punto de fusión (DSC) por encima de 80 °C;
ii) sacarificación del material licuado que contiene almidón de la etapa i) usando una glucoamilasa;
iii) fermentación usando una cepa de Saccharomyces, en donde los pasos ii) y iii) se llevan a cabo como sacarificación y fermentación simultáneas a una temperatura de 25 °C a 40 °C.
2. Proceso según la reivindicación 1, en donde la alfa-amilasa es del género Bacillus.
3. Proceso según las reivindicaciones 1 o 2, en donde la alfa-amilasa tiene una (min) a pH 4.5, 85 °C, CaCl2 0.12 mM) de al menos 10.
4. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que además está presente una proteasa y/o se añade en licuefacción, en donde la proteasa tiene un valor de termoestabilidad de más del 25 % determinado como actividad relativa a 80 °C/70 °C.
5. Proceso según la reivindicación 4, en donde la proteasa es una variante de proteasa que tiene al menos un 75 % de identidad, pero menos del 100 % de identidad con la parte madura del polipéptido de la SEC ID N.°: 2.
6. Proceso según la reivindicación 4, en donde la proteasa tiene al menos un 80 % de identidad con la SEC ID N.°: 13.
7. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde, además, una enzima generadora de fuentes de carbohidratos está presente y/o se añade durante la etapa de licuefacción i).
8. Proceso según la reivindicación 7, en donde la enzima generadora de fuentes de carbohidratos presente y/o añadida durante la etapa de licuefacción i) es una glucoamilasa que tiene una estabilidad térmica a 85 °C, pH 5.3, de al menos un 20 %.
9. Proceso según la reivindicación 7 u 8, en donde la enzima generadora de fuentes de carbohidratos presente y/o añadida durante la etapa de licuefacción i) es una glucoamilasa que tiene al menos un 80 % de identidad con el polipéptido maduro mostrado en las SEC ID N.°: 9 o 14.
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