DE69735677T2

DE69735677T2 - Endoglucanase

Info

Publication number: DE69735677T2
Application number: DE69735677T
Authority: DE
Inventors: Martin Schülein; Eskelund Mads BJOERNVAD; Iben Angelica Noerrevang
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-19
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2017-12-20
Also published as: MXPA99005465A; ES2262197T3; JP4327255B2; US6043075A; BR9713780A; TR199901393T2; WO1998028410A1; DE69735677D1; AU7873598A; ATE323156T1; EP0956348B1; JP2001507221A; EP0956348A1

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym mit cellulolytischer Aktivität bei hoher Temperatur, insbesondere eine Endoglucanase; eine klonierte DNA-Sequenz, die das Enzym mit cellulolytischer Aktivität kodiert; ein Verfahren zum Bereitstellen eines Gens, das ein solches Enzym kodiert; ein Verfahren zum Herstellen des Enzyms; eine Enzymzusammensetzung enthaltend das Enzym mit cellulolytischer Aktivität; und die Verwendung dieses Enzyms und dieser Enzymzusammensetzung für eine Reihe industrieller Anwendungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Cellulasen oder cellulolytische Enzyme sind Enzyme, die in die Hydrolyse von Cellulose einbezogen sind. Es ist bekannt, dass es bei der Hydrolyse nativer Cellulose drei Haupttypen von Cellulaseenzymen gibt, die darin einbezogen sind, nämlich Cellobiohydrolase (1,4-beta-D-Glucancellobiohydrolase, EC 3.2.1.91), Endo-beta-l,4-glucanase (Endo-1,4-beta-D-glucan-4-glucanohydrolase, EC 3.2.1.4) und beta-Glucosidase (EC 3.2.1.21).
Insbesondere die Endoglucanasen (EC Nr. 3.2.1.4) bilden eine interessante Gruppe von Hydrolasen für die genannten industriellen Verwendungen. Endoglucanasen katalysieren die Endohydrolyse von 1,4-beta-D-glycosidischen Bindungen in Cellulose, Cellulosederivaten (wie zum Beispiel Carboxymethylcellulose und Hydroxyethylcellulose), Lignin, beta-l,4-Bindungen in gemischten beta-1,3-Glucanen wie zum Beispiel beta-D-Glucanen oder Xyloglucanen aus Getreiden oder anderem Pflanzenmaterial, das Cellulosebestandteile enthält. Der offizielle Name ist Endo-1,4-beta-D-glucan-4-glucanohydrolase, aber die Abkürzung Endoglucanase wird in der vorliegenden Beschreibung verwendet. Bezug genommen werden kann auf T.-M. Enveri, „Microbial Cellulases" in W.M. Fogarty, Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science Publishers, S. 183-224 (1983); Methods in Enzymology, (1988) Bd. 160, S. 200-391 (herausgegeben von Wood, W.A. und Kellogg, S.T.); Béguin, P., „Molecular Biology of Cellulose Degradation", Annu. Rev. Microbiol. (1990), Bd. 44, S. 219-248; Béguin, P. und Aubert, J-P., „The biological degradation of cellulose", FEMS Microbiology Reviews 13 (1994) S. 25-58; Henrissat, B., „Cellulases and their interaction with cellulose", Cellulose (1994), Bd. 1, S. 169-196.
Cellulasen werden von einer großen Anzahl von Mikroorganismen, die Pilze, Actinomyceten, Myxobakterien und echte Bakterien einschließen, aber auch von Pflanzen synthetisiert. Insbesondere Endoglucanasen einer großen Vielzahl von Spezifitäten wurden bereits identifiziert. Viele bakterielle Endoglucanasen wurden bereits beschrieben (Henrissat, B. und Bairoch, A. (1993) Biochem J. 293: 781-788; Gilbert, H.J. und Hazlewood, G.P. (1993) J. Gen. Microbiol. 139: 187-194).
Der Unterstamm Clostridia ist eine sehr unterschiedliche Gruppe von anaeroben Bakterien, die physiologisch sehr verschiedene Genera umfaßt. Früher wurde Clostridium als ein Genus betrachtet einschließlich aller Endosporen-bindenden anaeroben Bakterien. Allerdings ergab die Einführung molekularer taxonomischer Hilfsmittel wie zum Beispiel 16S rDNA-Segenzierung, dass die Gruppe in einem Maß heterogen ist, das weit über das eines Genus hinaus geht. Darüber hinaus wurden verschiedene Genera nicht Sporenbildender Anaerobia innerhalb von Clostridia klassifiziert, von denen sich herausstellte, dass sie eine übergeordnete taxonomische Gruppe, einen Unterstamm, darstellen. Dies stimmt mit den hoch verschiedenen Habitaten für diese Organismen überein. Der Unterstamm Clostridia zum Beispiel enthält Spezies mit optimaler Wachstumstemperatur eines sehr breiten Bereichs.
Der Genus Dictyoglomus enthält extrem thermophile anaerobe Bakterien, die phylogenetisch innerhalb des Unterstamms Clostridia lokalisiert sind. Dictyoglomus spp. sind unter den thermophilsten Organismen innerhalb des Unterstamms Clostridia. In dem phylogenetischen Stammbaum hinsichtlich 16S rDNA erscheint Dictyoglomus mit anderen thermophilen Genera wie zum Beispiel Thermoanaerobacter, Thermoanaerobacterium und Syntrophomonas als engste Verwandte. Allerdings bildet Dicryoglomus eine tiefliegende Verzweigung, was bestätigt, dass Dictyoglomus tatsächlich als ein separater Genus betrachtet werden sollte.
Dictyoglomus sp.-Stamm B1 wurde aus einer Schlamm- und Pulpeprobe aus einem Pulpenmasse-Kühltank, d.h. aus einer von Menschen hergestellten thermophilen Umgebung, isoliert. Eine Xylanase dieses Organismus wurde im Hinblick auf ein Temperaturoptimum (um 90 °C) beschrieben. Die Xylanaseproduktion dieses Stammes wurde Studien hinsichtlich der Optimierung der Fermentation unterzogen. Von dem Vorhandensein von Endoglucanase aus Spezien des Genus Dictyoglomus wurde niemals berichtet. Innerhalb des Stammes Clostridia wurden Cellulasen aus einigen Spezies beschrieben, von denen einige wenige thermophil sind. In wenigen Fällen wurde die Thermostabilität von Endoglucanasen bestimmt, wobei eine der am häufigsten untersuchten Spezies Clostridium thermocellum ist, von der bewiesen wurde, dass sie bis zu 80 °C stabil ist. Thermoanaerobacter cellulyticus produziert mindestens zwei Endoglucanasen mit Stabilität bis zu 80 °C. Auch von einem Stamm von Thermotoga maritima wurde gezeigt, dass er zwei thermostabile beta-Glucanasen produziert (Liebl et al. (1996) Microbiol. Immunol. 142: 2533-2542).
Bezug genommen werden kann auf Hudson et al. (1991) The cellulase activity of an extreme thermophile, Appl. Microbiol. Biotechnol. 35: 270-273; Mathrani und Ahring (1991) Isolation and characterization of strictly xylan-degrading Dictyoglomus from manmade thermophilic environment, Arch. Microbiol. 157: 13-17; Adamsen et al. (1995) Optimization of extracellular xylanase production by Dictyoglomus sp B1 in continuousculture, Appl. Microbiol. Biotechnol. 44: 327-332; Maidak et al. (1994) The Ribosomal Database Project, Nuc. Acids Res. 22: 3485-3487; Honda et al. (1987) Cloning and expression in E. coli of a Thermoanaerobacter cellulyticus gene encoding for heatstable beta-glucanase, Appl. Microbiol. Biotechnol. 25: 480-483; Honda et al. (1988) Isolation of a new cellulase gene from a thermophilic anaerobe and its expression in E. coli, Appl. Microbiol. Biotechnol. 29: 264-268.
Eine sehr wichtige industrielle Verwendung von cellulolytischen Enzymen ist die Verwendung zur Behandlung von Cellulosetextil oder Gewebe, z.B. als Bestandteil in Detergenzzusammensetzungen oder als Faserweichmacherzusammensetzungen, zum Biopolieren neuer Fasern, Textilfertigteilveredelung und zum Erhalten eines „stone-washed"-Aussehens von Cellulose-enthaltenden Fasern, insbesondere Denim, und es wurden einige Verfahren für eine solche Behandlung vorgeschlagen, z.B. in GB-A-1 368 599, EP-A-0 307 564 und EP-A-0 435 876, WO 91/17243, WO 91/10732, WO 91/17244, WO 95/24471 und WO 95/26398. Eine andere wichtige industrielle Verwendung von cellulytischen Enzymen ist in Verwendung zur Behandlung von Papierpulpe, z.B. zum Verbessern des Entwässerns oder zum Deinking von recyceltem Papier.
Es ist auch bekannt, dass Cellulasen eine Cellulosebindedomäne (eine CBD) haben oder nicht haben können. Die CBD verstärkt die Bindung des Enzyms an eine Celluloseenthaltende Faser und erhöht die Wirksamkeit des katalytisch aktiven Teils des Enzyms.
Es gibt einen Bedarf, wirtschaftlich umsetzbare Cellulaseenzymzubereitungen bereitzustellen, die für solche Anwendungen verwendet werden können, wo eine Cellulaseaktivität, vorzugsweise eine Endoglucanaseaktivität, bei hohen Temperaturen wünschenswert ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue Enzymzusammensetzungen oder rekombinante Enzyme mit im Wesentlichen cellulolytischer Aktivität bei Bedingungen mit hoher Temperatur und verbesserter Performance in industriellen Anwendungen, z.B. in der Prozessierung von Papierpulpe, Textilbehandlung, Reinigungsverfahren, Extraktionsprozessen oder bei Tierfuttermittel bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder waren nun beim Klonieren und Charakterisieren einer DNA-Sequenz aus dem Bakteriumgenus Dicryoglomus erfolgreich, welche ein Enzym kodiert, das cellulolytische Aktivität bei extrem hohen Temperaturen in einem sehr breiten pH-Bereich zeigt, wodurch es möglich wird, eine nur aus einem Bestandteil bestehende cellulolytische Enzymzusammensetzung mit den gewünschten Eigenschaften herzustellen.
Folglich betrifft ein erster Aspekt der Erfindung eine Enzymzubereitung mit einer Endoglucanaseaktivität, die eine optimale Aktivität bei einer Temperatur über 85 °C, vorzugsweise über 90 °C, weiter bevorzugt über 95 °C, insbesondere über 100 °C besitzt.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine Enzymzubereitung mit einer Endoglucanaseaktivität bei 70 °C und pH 10 gegenüber Carboxymethylcellulose (CMC-Test) von mehr als 50 %, vorzugsweise mehr als 55 %, weiter bevorzugt mehr als 60 %, weiter bevorzugt mehr als 65 %, insbesondere mehr als 70 %, relativ zu der Aktivität bei 70 °C und optimalem pH.
In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung ein DNA-Konstrukt enthaltend eine DNA-Sequenz, die ein Enzym mit Endoglucanaseaktivität und optimaler Aktivität über 85 °C, vorzugsweise über 90 °C, weiter bevorzugt über 100 °C kodiert, wobei die DNA-Sequenz umfasst

a) die DNA-Sequenz, entsprechend dem Endoglucanase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Escherichia coli DSM 11201 erhältlich ist, oder
b) ein Analog der DNA-Sequenz entsprechend dem Endoglucanase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid in Escherichia coli DSM 11201 erhältlich ist, das
i) homolog ist, vorzugsweise zu mindestestens 70 % homolog, mit der DNA-Sequenz, die dem Endoglucanase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz entspricht, die aus dem Plasmid in Escherichia coli DSM 11201 erhältlich ist, oder
ii) mit der gleichen Oligonucleotidsonde hybridisiert, wie die DNA-Sequenz, die dem Endoglucanase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz entspricht, die aus dem Plasmid in Escherichia coli DSM 11201 erhältlich ist, oder
iii) ein Polypeptid kodiert, das homolog ist, vorzugsweise zu mindestens 70 % homolog, mit dem Polypeptid, das von einer DNA-Sequenz kodiert wird, die die DNA-Sequenz umfasst, die dem Endoglucanase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz entspricht, die aus dem Plasmid in Escherichia coli DSM 11201 erhältlich ist.

In ihrem vierten, fünften und sechsten Aspekt stellt die Erfindung einen Expressionsvektor bereit, der die klonierte DNA-Sequenz der Erfindung beherbergt, eine Zelle, die die klonierte DNA-Sequenz oder den Expressionsvektor enthält und ein Verfahren zum Herstellen eines Enzyms, das cellulolytische Aktivität aufweist, wobei das Verfahren das Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die die Herstellung des Enzyms erlauben, und das Gewinnen des Enzyms aus der Kultur umfasst.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes Enzym bereit, das cellulolytische Aktivität aufweist, und das gekennzeichnet ist dadurch, dass (i) es frei von homologen Verunreinigungen ist und (ii) das Enzym durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein isoliertes Enzym mit cellulolytischer Aktivität, vorzugsweise eine Endoglucanase, die von dem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt kodiert wird.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines solchen Enzyms oder der erfindungsgemäßen Enzymzubereitung für industrielle Anwendungen wie zum Beispiel in der Textilindustrie zur Verbesserung der Eigenschaften der Cellulosefasern oder -gewebe oder zum Bereitstellen eines „stone-washed"-Aussehens von Denim; oder in industriellen Reinigungsverfahren oder bei Hitze-extrudiertem polymerem Material; oder in der Umwandlung von Biomasse zu Zuckern; oder in der Herstellung von Alkohol; oder für die Vorverdauung von z.B. Getreiden, die in der Futtermittelherstellung verwendet werden; oder in der Herstellung von Instantkaffee oder ähnlichen Extraktionsverfahren.
Die Erfindung betrifft auch eine isolierte, im Wesentlichen reine biologische Kultur des Escherichia coli-Stamms DSM 11201, der eine Cellulase-kodierende DNA-Sequenz beherbergt, oder jede beliebige Mutante dieses Stammes von E. coli.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In dem vorliegenden Zusammenhang bezeichnet der Ausdruck „die 20 natürlich vorkommenden Aminosäurereste", die 20 Aminosäurereste, die für gewöhnlich in Proteinen gefunden werden und konventionell bekannt sind als Alanin (Ala oder A), Valin (Val oder V), Leucin (Leu oder L), Isoleucin (Ile oder I), Prolin (Pro oder P), Phenylalanin (Phe oder F), Tryptophan (Trp oder W), Methionin (Met oder M), Glycin (Gly oder G), Serin (Ser oder S), Threonin (Thr oder T), Cystein (Cys oder C), Tyrosin (Tyr oder Y), Asparagin (Asn oder N), Glutamin (Gln oder Q, Asparaginsäure (Asp oder D), Glutaminsäure (Glu oder E), Lysin (Lys oder K), Arginin (Arg oder R) und Histidin (His oder H).
Das erfindungsgemäße Enzym und die erfindungsgemäße Enzymzubereitung sind über einen breiten pH-Bereich aktiv, vorzugsweise aktiv bei einem pH zwischen ungefähr 4 und ungefähr 11, vorzugsweise zwischen ungefähr 5,5 und ungefähr 10.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Enzym oder die erfindungsgemäße Enzymzubereitung erhältlich aus oder endogen in einem Stamm, der zu dem Stamm Gram-positiver Bakterium gehört, weiter bevorzugt einem Stamm, der zu dem Unterstamm Clostridia gehört, noch weiter bevorzugt der zu dem Genus Dictyoglomus gehört.
In dem vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck „eine klonierte DNA-Sequenz" entweder teilweise oder vollständig auf eine DNA-Sequenz, die durch Standardklonierungsvorgehensweisen, die in der Gentechnik verwendet werden, kloniert wurde, um einen Abschnitt einer DNA von seiner natürlichen Lokalisierung an eine andere Stelle zu überführen, wo er reproduziert werden wird. Das Klonierungsverfahren bezieht das Ausschneiden und die Isolierung des gewünschten DNA-Abschnitts, Insertieren des Stückes von DNA in das Vektormolekül und die Aufnahme des rekombinanten Vektors in eine Zelle ein, wo eine Vielzahl von Kopien oder Klonen des DNA-Abschnitt repliziert werden.
Die erfindungsgemäße „klonierte DNA-Sequenz" kann alternativ mit „DNA-Konstrukt" oder „isolierte DNA-Sequenz" benannt werden.
Die DNA-Sequenz kann genomischen, cDNA- oder synthetischen Ursprungs oder jede beliebige Kombination dieser sein.
Der Cellulase-kodierende Teil der DNA-Sequenz, der in das Plasmid pSJ1678 kloniert ist, welches in Escherichia coli DSM 11201 vorhanden ist und/oder eine erfindungsgemäße analoge DNA-Sequenz können aus einem Stamm des bakteriellen Genus Dicryoglomus, vorzugsweise dem Stamm Dicryoglomus, DSM 6262, der das Enzym mit Cellulaseaktivität, vorzugsweise Endoglucanaseaktivität, produziert oder einem anderen oder verwandten Organismus, wie weiter unten beschrieben, kloniert werden.
Alternativ kann die analoge Sequenz auf der Grundlage der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid erhältlich ist, das in Escherichia coli DSM 11201 vorhanden ist, z.B. eine Untersequenz hiervon sein, und/oder durch Einfügen von Nukleotidsubstitutionen, die zu keiner anderen Aminosäuresequenz der Cellulase, die durch die DNA-Sequenz kodiert wird, führen, die aber der Kodonverwendung des Wirtsorganismus, der für die Herstellung des Enzyms beabsichtigt ist, entspricht, oder durch Einführen von Nukleotidsubstitutionen, die zu einer anderen Aminosäuresequenz führen (d.h. einer Variante der erfindungsgemäßen Cellulase), konstruiert werden.
Beim Ausführen von Nukleotidsubstitutionen sind die Aminosäureveränderungen vorzugsweise von geringerer Natur, d.h. konservative Aminosäuresubstitutionen, die nicht signifikant das Falten oder die Enzymaktivität des Protein beeinflussen, kleine Deletionen, typischerweise von einer bis 30 Aminosäuren; kleine amino- oder carboxy-terminale Verlängerungen, wie zum Beispiel ein amino-terminaler Methioninrest, ein kleines Linkerpeptid von bis zu etwa 20 bis 25 Resten, oder eine kleine Verlängerung, die die Aufreinigung erleichtert, wie zum Beispiel ein Polyhistidinteil, ein antigenes Epitop oder eine Bindedomäne.
Beispiele von konservativen Substitutionen sind innerhalb der Gruppe der basischen Aminosäuren (wie zum Beispiel Arginin, Lysin, Histidin), sauren Aminosäuren (wie zum Beispiel Glutaminsäure oder Asparginsäure), polaren Aminosäuren (wie zum Beispiel Glutamin und Asparagin), hydrophoben Aminosäuren (wie zum Beispiel Leucin, Isoleucin, Valin), aromatischen Aminosäuren (wie zum Beispiel Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin) und kleinen Aminosäuren (wie zum Beispiel Glycin, Alanin, Serin, Threonin, Methionin). Für eine allgemeine Beschreibung von Nukleotidsubstitutionen, siehe z.B. Ford et al., (1991), Protein Expression and Purification 2, 95-107.
Es wird für den Fachmann offensichtlich, dass solche Substitutionen außerhalb der für die Funktion des Moleküls kritischen Regionen durchgeführt werden können und dennoch in einem aktiven Polypeptid resultieren. Aminosäuren, die für die Aktivität des Polypeptids, das von der klonierten erfindungsgemäßen DNA-Sequenz kodiert wird, essentiell sind und daher vorzugsweise nicht Gegenstand von Substitution sind, können nach den im Stand der Technik bekannten Vorgehensweisen identifiziert werden, wie zum Beispiel ortsgerichtete Mutagenese oder Alanin-scannende Mutagenese (vgl. z.B. Cunningham und Wells, (1989), Science 244, 1081-1085). In der letztgenannten Technik werden Mutationen an jedem Rest in dem Molekül eingeführt und die resultierendenden mutierten Moleküle werden auf ihre biologische (d.h. cellulolytische) Aktivität getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Orte der Substrat-Enzym-Wechselwirkung können auch durch Analyse der Kristallstruktur bestimmt werden, was durch die Techniken wie zum Beispiel Kernspinresonanzanalyse, Kristallographie oder Fotoaffinitätsmarkierung bestimmt wird (vgl. z.B. de Vos et al., (1992), Science 255, 306-312; Smith et al., (1992), J. Mol. Biol. 224, 899-904; Wlodaver et al., (1992), FEBS Lett. 309, 59-64).
Die Endoglucanase, die von der DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts kodiert wird, kann eine Cellulosebindedomäne (CBD) umfassen, die als ein integraler Teil des kodierten Enzyms existiert, oder eine CBD anderen Ursprungs kann in die Endoglucanase integriert werden, wodurch ein Enzymhybrid gebildet wird. In diesem Zusammenhang ist von dem Ausdruck „Cellulose-Bindedomäne" beabsichtigt, dass er so verstanden wird, wie von Peter Tomme et al., „Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties" in „Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates", John N. Saddler und Michael H. Penner (Herausgeber), ACS-Symposium-Serien, Nr. 618, 1996 definiert. Diese Definition klassifiziert mehr als 120 Cellulose-Bindedomänen in 10 Familien (I-X), und zeigt, dass die CBDs in verschiedenen Enzymen gefunden werden, wie zum Beispiel Cellulasen, Xylanasen, Mannanasen, Arabinofuranosidasen, Acetylesterasen und Chitinasen. CBDs werden auch in Algen gefunden, z.B. in der Rotalgen Porphyra purpurea als ein nicht-hydrolytisches Polysaccharid-Bindeprotein, siehe Tomme et al., op. cit. Allerdings sind die meisten CBDs aus Cellulasen und Xylanasen, CBDs werden an den N- und C-Termini von Proteinen gefunden oder sind internal. Enzymhybride sind im Stand der Technik bekannt, siehe zum Beispiel WO 90/00609 und WO 95/16782 und können durch Transformieren eines DNA-Konstrukts, das mindestens ein Fragment an DNA umfasst, das eine Cellulose-Bindedomän kodiert, die mit oder ohne Linker an eine DNA-Sequenz ligiert ist, die die Endoglucanase kodiert, in eine Wirtszelle und Wachsen der Wirtszelle, um das fusionierte Gen zu exprimieren, hergestellt werden. Enzymhybride können durch die folgende Formel beschrieben werden:
CBD-MR-X
wobei CBD die N-terminale oder die C-terminale Region einer Aminosäuresequenz ist, die zumindest der Cellulose-Bindedomäne entspricht; MR die mittlere Region (der Linker) ist und eine Bindung oder eine kurze verbindende Gruppe vorzugsweise von ungefähr 2 bis 100 Kohlenstoffatomen, weiter bevorzugt von 2 bis 40 Kohlenstoffatomen sein kann; oder vorzugsweise von ungefähr 2 bis ungefähr 100 Aminosäuren, weiter bevorzugt von 2 bis 40 Aminosäuren ist; und X eine N-terminale oder C-terminale Region eines Polypeptids ist, das von der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz kodiert wird.
Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kann auch durch Standarderfahren, aus dem Stamm Escherichia coli DSM 11201, z.B. wie von Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab.; Cold Spring Harbor, NY beschrieben, kloniert werden.
Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kann auch durch allgemeine Verfahren kloniert werden, die einbeziehen

– Klonieren einer DNA-Bibliothek in geeigneten Vektoren aus einem Organismus, z.B. Dictyoglomus, von dem erwartet wird, dass er die interessierende Endoglucanase produziert,
– Transformieren geeigneter Wirtszellen mit diesen Vektoren,
– Kultivieren der Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen, um jegliches Enzym des Interesses, das von dem Klon in der DNA-Bibliothek kodiert wird, zu exprimieren,
– Screenen auf positive Klone durch Bestimmen jeglicher cellulolytischer Aktivität des Enzyms, das von solchen Klonen hergestellt wird, und
– Isolieren der Enzym-kodierenden DNA aus solchen Klonen.

Alternativ kann die DNA, die eine erfindungsgemäße Cellulase kodiert, in Einklang mit gut bekannten Vorgehensweisen einfach aus einer geeigneten Quelle kloniert werden, wie zum Beispiel einem beliebig unten genannten Organismus durch Verwenden synthetischer Oligonukleotidsonden, die auf Grundlage der DNA-Sequenz hergestellt werden, die aus dem Plasmid erhältlich ist, das in Escherichia coli DSM 11201 vorhanden ist.
Homologie von DNA-Sequenzen
Die DNA-Sequenzhomologie, auf die oben Bezug genommen wird, wird bestimmt als der Grad der Identität zwischen zwei Sequenzen, wodurch eine Ableitung der ersten Sequenz von der zweiten Sequenz angezeigt wird. Die Homologie kann geeigneter Weise mittels Computerprogrammen, die im Stand der Technik bekannt sind, wie zum Beispiel GAP, das in dem GCG-Programmpaket (Needleman, S.B. und Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453) bereitgestellt wird, bestimmt werden. Unter Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen für den DNA-Sequenzvergleich: „GAP-Creation-Penalty" von 5,0 und „GAP-Extension-Penalty" von 0,3 zeigt die (partielle) DNA-Sequenz einen Identitätsgrad von mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 75 %, weiter bevorzugt mindestens 80 %, weiter bevorzugt mindestens 90 %, weiter bevorzugt mindestens 95 %, weiter bevorzugt mindestens 97 % mit der DNA-Sequenz, die dem Endoglucanase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz entspricht, die aus dem Plasmid erhältlich ist, das in Escherichia coli DSM 11201 vorhanden ist.
Hybridisierung
Von der Hybridisierung, auf die oben Bezug genommen wird, ist beabsichtigt, dass sie anzeigt, dass die analoge DNA-(Teil)-Sequenz mit einer Oligonukleotidsonde, die dem Endoglucanase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz entspricht, die aus dem Plasmid erhältlich ist, das in Escherichia coli DSM 11201 vorhanden ist, unter bestimmten spezifischen Bedingungen hybridisiert, die unten im Detail beschrieben sind.
Geeignete Bedingungen zum Bestimmen der Hybridisierung zwischen einer Nukleotidsonde und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz bezieht ein das Voreinweichen des Filter, der die DNA-Fragmente oder RNA, die zu hybridisieren sindlist, enthält, in 5 × SSC („Standard Saline Citrate") für 10 Minuten und Vorhybridisieren des Filters in einer Lösung von 5 × SSC (Sambrook et al., 1989), 5 × Denhardt-Lösung (Sambrook et al., 1989), 0,5 % SDS und 100 μg/ml denaturierter Ultraschall-behandelter Lachsspermien-DNA (Sambrook et al., 1989), gefolgt von der Hybridisierung für 12 Stunden bei ca. 45 °C in der gleichen Lösung, die eine zufällig geprimte (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13), ³²P-dCTP-markierte (spezifische Aktivität > 1 × 10⁹ cpm/μg) Sonde enthält. Der Filter wird dann zweimal für 30 Minuten in 2 × SSC, 0,5 % SDS bei vorzugsweise nicht mehr als 55 °C, weiter bevorzugt nicht mehr als 60 °C, noch weiter bevorzugt nicht mehr als 65 °C, sogar noch weiter bevorzugt nicht mehr als 70 °C, insbesondere nicht mehr als 75 °C, gewaschen.
Die Moleküle, an die die Oligonukleotidsonde unter diesen Bedingungen hybridisiert, werden durch einen Röntgenfilm nachgewiesen.
Homologie der Aminosäuresequenzen
Die Polypeptidhomologie, auf die oben Bezug genommen wird, wird als Grad der Identität zwischen den zwei Sequenzen bestimmt, was eine Ableitung der ersten Sequenz von der zweiten Sequenz anzeigt. Die Homologie kann geeigneter Weise mittels Computerprogrammen bestimmt werden, die im Stand der Technik gekannt sind, wie zum Beispiel GAP, was in dem GCG-Programmpaket (Needleman, S.B. und Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453) bereitgestellt wird. Unter Verwendung von GAP mit den folgenden Einstellungen für Polypeptidsequenzvergleich: „GAP-Creation-Penalty" von 3,0 und „GAP-Extension-Penalty" von 0,1 zeigt das Polypeptid, das von einer analogen DNA-(Teil)-Sequenz kodiert wird, einen Grad an Identität von mindestens 60 %, vorzugsweise von mindestens 70 %, vorzugsweise von mindestens 80 %, vorzugsweise von mindestens 85 %, weiter bevorzugt mindestens 90 %, weiter bevorzugt mindestens 95 %, insbesondere mindestens 97 %, mit dem Polypeptid, das von dem Glucanase-kodierenden Teil der DNA-Sequenz kodiert wird, die aus dem Plasmid erhältlich ist, das in Escherichia coli DSM 11201 vorhanden ist.
Immunologische Kreuzreaktivität
Die zur Bestimmung der immunologischen Kreuzreaktivität verwendeten Antikörper können durch Verwendung eines gereinigten cellulolytischen Enzyms hergestellt werden. Genauer gesagt kann das Antiserum gegen die erfindungsgemäße Endoglucanase erzeugt werden, indem Kaninchen (oder andere Nager) nach der von N. Axelsen et al. in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder A. Johnstone und R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (genauer S. 27-31) beschriebenen Vorgehensweise immunisiert werden. Die gereinigten Immunglobuline können aus den Antiseren, zum Beispiel durch Salzpräzipitation ((NH₄)₂SO₄), gefolgt von Dialyse und Ionenaustauschchromatographie, zum Beispiel auf DEAE-Sephadex, erhalten werden. Die immunchemi sche Charakterisierung der Proteine kann entweder durch Doppeldiffusionsanalyse nach Ouchterlony (O. Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Hrsg.), Blackwell Scientific Publications, 1967, S. 655-706), durch gekreuzte Immunelektrophorese (N. Axelsen et al., supra, Kapitel 3 und 4) oder durch Rocket-Immunelektrophorese (N. Axelsen et al., Kapitel 2) durchgeführt werden.
Mikriobielle Quellen
Die unten angewandte Taxonomie ist in Übereinstimmung mit Maidak et al. 1996 (The Ribosomal Database Project. Nucl. Acids Res. 24: 82-85).
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „erhalten von" oder „erhältlich von" – wie er hierin verwendet wird – im Zusammenhang mit einer spezifischen Quelle, dass das Enzym von einer spezifischen Quelle oder einer Zelle, in welcher ein Gen aus der Quelle insertiert wurde, hergestellt wird oder hergestellt werden kann. Es wird gegenwärtig in Erwägung gezogen, dass die erfindungsgemäße Cellulase aus einem Bakterium erhalten werden kann, insbesondere einem Gram-positiven Bakterium, vorzugsweise aus dem Unterstamm Clostridia, insbesondere einem Stamm des Genus Dictyoglomus.
Es wird gegenwärtig in Erwägung gezogen, dass eine DNA-Sequenz, die ein Enzym kodiert, das homolog zu dem erfindungsgemäßen Enzym ist, aus anderen Bakterienstämmen erhalten werden kann, insbesondere Stämmen, die zu dem Genus Dictyoglomus gehören.
Ein Isolat eines Stammes von Dictyoglomus sp., aus dem die erfindungsgemäße Cellulase erhalten werden kann, ist öffentlich von der „Deutschen Sammlung von Mikroorganismen", DSM 6262, erhältlich.
Darüber hinaus wurde das Plasmid pSJ1678, das die DNA-Sequenz enthält, die die erfindungsgemäße Endoglucanase kodiert, in einen Stamm von Escherichia coli transformiert, der von den Erfindern nach dem Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei der „Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland am 11. Oktober 1996 unter der Hinterlegungsnummer DSM 11201 hinterlegt wurde.
Rekombinante Expressionsvektoren
Ein rekombinanter Vektor, der ein DNA-Konstrukt umfasst, das das erfindungsgemäße Enzym kodiert, kann ein beliebiger Vektor sein, der in geeigneter Weise rekombinanten DNA-Vorgehensweisen unterzogen werden kann und die Wahl des Vektors wird von der Wirtszelle abhängen, in welche er einzuführen ist. Daher kann der Vektor ein autonom replizierender Vektor sein, d.h. ein Vektor der als extrachromosomale Einheit existiert, deren Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation ist, z.B. ein Plasmid. Alternativ kann der Vektor ein solcher sein, der, wenn er in eine Wirtszelle eingeführt wird, in das Wirtszellgenom teilweise oder vollständig integriert wird und zusammen mit dem/den Chromosom(en), in welche(s) er integriert worden ist, repliziert wird.
Der Vektor ist vorzugsweise ein Expressionsvektor, in welchem die DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Enzym kodiert, funktionsfähig mit zusätzlichen Abschnitten, die für die Transkription der DNA benötigt werden, verknüpft ist. Im Allgemeinen ist der Expressionsvektor von einem Plasmid oder viraler DNA abgeleitet oder er kann Elemente von beiden enthalten. Der Begriff „funktionsfähig verknüpft" zeigt an, dass die Abschnitte so angeordnet sind, dass sie zusammen für ihre beabsichtigten Zwecke funktionieren, z.B. beginnt die Transkription in einem Promotor und schreitet über die DNA-Sequenz, die für das Enzym kodiert, fort.
Der Promotor kann jede DNA-Sequenz sein, die transkriptionale Aktivität in der gewählten Wirtszelle zeigt und kann von Genen abgeleitet sein, die Proteine kodieren, die entweder homolog oder heterolog für die Wirtszelle sind.
Beispiele geeigneter Promotoren für die Verwendung in bakteriellen Wirtszellen schließen die Promotoren des maltogenen Amylasegens von Bacillus stearothermophilus, das alpha-Amylasegen von Bacillus licheniformis, das alpha-Amylasegen von Bacillus amyloliquefaciens, das alkalische Proteasegen von Bacillus subtilis oder das Xylosidasegen von Bacillus pumilus oder die P_R- oder P_L-Promoteren des Phagen Lambda oder die lac-, trp- oder tac-Promoteren von E. coli ein.
Die DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße Enzym kodiert, kann auch, falls erforderlich, funktionsfähig mit einem geeigneten Terminator verbunden sein. Der erfindungsgemäße rekombinante Vektor kann zusätzlich eine DNA-Sequenz enthalten, die die Replikation des Vektors in der in Frage stehenden Wirtszelle ermöglicht.
Der Vektor kann auch einen Selektionsmarker, z.B. ein Gen, dessen Produkt eine Defizienz in der Wirtszelle ausgleicht, oder ein Gen, das eine Resistenz gegen, z.B. Antibiotika wie Kanamycin, Chloramphenicol, Erythromycin, Tetracyclin, Spectinomycin oder ähnlichem oder Resistenz gegenüber Schwermetallen oder Herbiziden kodiert, umfassen.
Um ein Enzym der vorliegenden Erfindung in den sekretorischen Weg der Wirtszellen zu steuern, kann in dem rekombinanten Vektor eine Sekretionssignalsequenz (auch bekannt als eine Leadersequenz, Präprosequenz oder Präsequenz) bereitgestellt werden. Die Sekretionssignalsequenz wird mit der DNA-Sequenz, die das Enzym kodiert, in dem korrekten Leserahmen verbunden. Sekretionssignalsequenzen werden im Allgemeinen 5' zu der DNA-Sequenz positioniert, die das Enzym kodiert. Die Sekretionssignalsequenz kann diejenige sein, die normalerweise mit dem Enzym verbunden ist, oder kann von einem Gen sein, das ein anderes sezerniertes Protein kodiert.
Die Vorgehensweisen, die zur Ligation der DNA-Sequenzen, die für das vorliegende Enzym kodieren, des Promotors und gegebenenfalls des Terminators und/oder der Sekretionssignalsequenz oder zum Zusammenfügen dieser Sequenzen durch geeignete PCR-Amplifikationsschemata und zum Insertieren dieser in geeignete Vektoren, die die zur Replikation oder Integration notwendige Information enthalten, verwendet werden, sind dem Fachmann gut bekannt (vgl. zum Beispiel Sambrook et al., op. cit.).
Wirtszellen
Die DNA-Sequenz, die das vorliegende Enzym kodiert und in die Wirtszelle eingeführt wird, kann entweder homolog oder heterolog zu der in Frage stehenden Wirtszelle sein. Wenn sie homolog für die Wirtszelle ist, d.h. in der Natur von der Wirtszelle produziert wird, wird sie typischerweise funktionsfähig mit einer anderen Promotorsequenz oder, soweit anwendbar, mit einer anderen Sekretionssignalsequenz und/oder Terminatorsequenz als in ihrer natürlichen Umgebung verbunden sein. Von dem Begriff „homolog" ist beabsichtigt, dass er eine DNA-Sequenz einschließt, die ein Enzym kodiert, das für den in Frage stehenden Wirtsorganismus nativ ist. Von dem Begriff „heterolog" ist beabsichtigt, dass er eine DNA-Sequenz einschließt, die von der Wirtszelle in der Natur nicht exprimiert wird. Folglich kann die DNA-Sequenz von einem anderen Organismus sein oder sie kann eine synthetische Sequenz sein.
Die Wirtszelle, in welche das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt oder der erfindungsgemäße rekombinante Vektor eingeführt wird, kann jede beliebige Zelle sein, die in der Lage ist, das vorliegende Enzym zu produzieren, und schließt Bakterien, Hefe, Pilze und höhere eukaryontische Zellen ein. Eine bevorzugte Wirtszelle schließt prokaryontische Zellen, archaebakterielle Zellen- und filamentöse Pilzzellen ein.
Beispiele von Pilzwirtszellen, die bei Kultivierung in der Lage sind, das erfindungsgemäße Enzym zu produzieren, sind Zellen filamentöser Pilze wie zum Beispiel Stämme, die zu einem beliebigen der Genera Aspergillus, Fusarium und Trichoderma gehören, genauer die Stämme, die zu den Spezies Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium graminerarum und Trichoderma reesei gehören.
Beispiele von Bakterienwirtszellen, die bei Kultivierung in der Lage sind, das erfindungsgemäße Enzym zu produzieren, sind Gram-positive Bakterien wie zum Beispiel Stämme von Bacillus, wie zum Beispiel Stämme von B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. liquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium oder B. thuringiensis, oder Stämme von Streptomyces, wie zum Beispiel S. lividans oder S. murinus, oder Gram-negative Bakterien, wie zum Beispiel Escherichia coli. Die Transformation des Bakteriums kann durch Protoplastentransformation, Elektroporation, Konjugation oder durch Verwendung kompetenter Zellen in einer an sich bekannten Weise bewirkt werden (vgl. Sambrook et al., supra).
Bei Expression des Enzyms in dem Bakterium, wie zum Beispiel E. coli kann das Enzym in dem Cytoplasma, typischerweise als unlösliche Körnchen (bekannt als Einschlusskörper), einbehalten werden oder kann in den periplasmatischen Raum durch eine bakterielle Sekretionssequenz gelenkt werden. In dem ersten Fall werden die Zellen lysiert und die Körnchen werden gewonnen und denaturiert, wonach das Enzym durch Verdünnen in dem Denaturierungsmittel zurückgefaltet wird. In dem letzteren Fall kann das Enzym aus dem periplasmatischen Raum durch Zerstören der Zellen, zum Beispiel durch Ultraschallbehandlung oder osmotischen Schock, zur Freisetzung des Inhalts des periplasmatischen Raums und Gewinnung des Enzyms gewonnen werden.
Bei Expression des Enzyms in Gram-positiven Bakterien, wie zum Beispiel Bacillus- oder Streptomyces-Stämmen kann das Enzym im Cytoplasma einbehalten werden oder kann in das extrazelluläre Medium durch bakterielle Sekretionssequenzen gelenkt werden. In dem letzteren Fall kann das Enzym aus dem Medium, wie oben beschrieben, gewonnen werden.
Verfahren zum Herstellen eines cellulolytischen Enzyms
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen eines erfindungsgemäßen isolierten Enzyms bereit, wobei eine geeignete Wirtszelle, die mit einer DNA-Sequenz transformiert wurde, die das Enzym kodiert, unter Bedingungen kultiviert wird, die die Herstellung des Enzyms erlauben, und das resultierende Enzym aus der Kultur gewonnen wird.
Wie hierin definiert, ist ein isolieres Polypeptid (z.B. ein Enzym), ein Polypeptid, das im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden ist, z.B. mindestens ungefähr 20 % rein, vorzugsweise mindestens ungefähr 40 % rein, weiter bevorzugt ungefähr 60 % rein, sogar noch weiter bevorzugt ungefähr 80 % rein, am meisten bevorzugt ungefähr 90 % rein und sogar am meisten bevorzugt ungefähr 95 % rein, was durch SDS-PAGE bestimmt wird.
Der Begriff „isoliertes Polypeptid" kann alternativ mit „gereinigtes Polypeptid" bezeichnet werden.
Wenn ein Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz umfasst, die das Enzym kodiert, in eine heterologe Wirtszelle transformiert wird, ist es möglich, die heterologe rekombinante Herstellung des erfindungsgemäßen Enzyms zu ermöglichen.
Hierdurch ist es möglich, eine hochgereinigte oder einkomponentige cellulolytische Zusammensetzung herzustellen, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie frei von homologen Verunreinigungen ist.
In diesem Zusammenhang bedeutet homologe Verunreinigungen jegliche Verunreinigungen (z.B. von dem erfindungsgemäßen Enzym verschiedene Polypeptide), die von der homologen Zelle stammen, von der das erfindungsgemäße Enzym ursprünglich erhalten wurde.
In der vorliegenden Erfindung kann die homologe Wirtszelle ein Stamm von Dictyoglomus sp. sein.
Das zur Kultivierung der transformierten Wirtszellen verwendete Medium kann jedes beliebige übliche Medium sein, das für das Wachstum der in Frage stehenden Wirtszellen geeignet ist. Das exprimierte cellulolytische Enzym kann geeigneter Weise in das Kulturmedium sezerniert werden und kann hieraus durch gut bekannte Vorgehensweisen einschließlich Trennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration, Präzipitieren der Proteinbestandteile des Mediums mittels eines Salzes wie zum Beispiel Ammoniumsulfat, gefolgt von chromatographischen Verfahren wie zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder ähnlichem gewonnen werden.
Enzymzusammensetzungen
In einem noch weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Enzymzusammensetzung, die ein Enzym enthält, das eine wie oben beschriebene cellulolytische Aktivität aufweist.
Die erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung kann zusätzlich zu der erfindungsgemäßen Cellulase ein oder mehrere andere Enzymarten enthalten, zum Beispiel Hemi-Cellulase wie zum Beispiel Xylanase und Mannanase, andere Cellulase- oder Endoglucanase-Bestandteile, Chitinase, Lipase, Esterase, Pectinase, Cutinase, Phytase, Oxidoreductase, Protease oder Amylase.
Die Enzymzusammensetzung kann gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren hergestellt werden und kann in Form einer flüssigen oder trockenen Zusammensetzung sein. Beispielsweise kann die Enzymzusammensetzung in Form eines Granulats oder Mikrogranulats sein. Das in die Zusammensetzung einzuschließende Enzym kann gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren stabilisiert sein.
Thermostabile Cellulasen finden potentielle Verwendungen in einer Vielzahl verschiedener Industrien und Anwendungen. Beispiele von bevorzugten Verwendungen der Enzymzusammensetzung sind unten angegeben. Die Dosierung der erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzung und andere Bedingungen, unter welchen die Zusammensetzung verwendet wird, können auf Grundlage in der Technik bekannter Verfahren bestimmt werden.
Die erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung kann für mindestens einen der folgenden Zwecke verwendet werden.
Verwendungen
In der Textilindustrie werden Cellulasen für die Behandlung von Baumwolle oder anderen Cellulosematerialien verwendet, um eine Oberflächenbehandlung der Fasern zu erhalten, die in Geweben mit veränderten Eigenschaften wie zum Beispiel erniedrigter Tendenz zum Pillen, Fusselentfernung, weicherem Gewebe, besserer Wirkung auf der Hand oder besserer visueller Wirkung resultieren. Insbesondere Cellulasen werden zum Herstellen eines „stone-washed"-Aussehen von Denim verwendet. Die Verwendung von Cellulasen bei hohen Temperaturen ermöglicht es, neue Looks von Denim- und Nicht-Denim-Baumwoll/Cellulosegeweben zu schaffen. Die thermostabilen Cellulasen können in die Behandlung des Gewebes bei hohen Temperaturen eingeschlossen werden, was vorher nicht möglich war; Cellulasewaschen über 80 °C oder unter Dampfbedingungen mit sehr niedrigem Flüssigkeitsanteil ist möglich, was die Möglichkeit zur Schaffung von neuen Looks schafft.
Die Verwendung von thermostabilen Cellulasen bei industriellen Reinigungsverfahren ermöglicht es, ein einfacheres Reinigungsverfahren zu schaffen, wenn das unerwünschte Material, das entfernt werden soll, auf Cellulosematerial basiert. Beispiele sind das Reinigen von Ultrafiltrationsmembranen, Rohren und ähnlichen in der Lebensmittel/Futter-Industrie.
Die Aufnahme von thermostabiler Cellulase in wärmeextrudierte Plastik- und Polymermaterialien mit Cellulosefüllmaterial wird in einer höheren Abbaubarkeit dieser Materialien in der Natur resultieren.
Lignocellulosematerialien stellen einen großen Teil des Abfalls in Land- und Forstwirtschaft und bei Papier, das bei kommunalem Abfall sehr dominant ist, dar. Dieser Abfall wird typischerweise verbrannt, was von einem energetischen Gesichtspunkt aus eine enorme Verschwendung von Ressourcen ist. Große Anstrengungen wurden hinsichtlich der Aufgabe der Entwicklung eines effektiven und ökonomischen Verfahrens zur Umwandlung dieser Biomasse in Zucker, die fermentiert werden können, unternommen, um zum Beispiel Alkohol zur Verwendung als Brennstoff herzustellen. Die vorgeschlagenen Verfahren zur Umwandlung von Lignocellulosen in Zucker schließen die Verwendung von Cellulasen ein, wobei aber sehr hohe Dosen benötigt werden, die sie im großindustriellen Maßstab von einem ökonomischen Gesichtspunkt aus unrealistisch machen. Die Verwendung von thermostabilen Cellulasen mit verflüssigenden Eigenschaften macht einen solchen biologischen Umwandlungsprozess realistischer. Die Verarbeitung bei hoher Temperatur öffnet die Zellwandstruktur in einer Großzahl von Pflanzenmaterialien und macht die Cellulose einem enzymatischen Angriff besser zugänglich.
In der industriellen Herstellung von Alkohol aus verschiedenen Arten von Getreiden schließt das traditionelle Verfahren die Verflüssigung mit alpha-Amylase bei Temperaturen um 80 bis 100 °C ein. Das Einschließen von Cellulase in diesem Schritt wird die Ausbeute der fermentierbaren Zucker erhöhen. Diese Vorverflüssigung von Cellulose wird auch den Einschluss traditioneller Cellulasen aufgrund einer höheren Hydrolysegeschwindigkeit im Vergleich zu ohne Vorverflüssigung in das anschließende Verfahren realistisch machen.
Vorverdauung von Getreiden; Roggen, Gerste, Mais usw. für die Futtermittelherstellung ist eine weitere potentielle Verwendung von thermostabiler Cellulase, um die Verdaubarkeit des Futters in dem Tier zu erhöhen.
Die Kaffeeextraktion zur Herstellung von Instantkaffee wird bei Temperaturen von 85 bis 150 °C in einer Batterie von Durchflusssäulen durchgeführt. Wasser passiert im Gegenstrom von der am stärksten extrahierten Zelle zu derjenigen, die gerade mit frischem Kaffee gefüllt wurde. Die Betriebstemperatur für diese Zellen mit frischem Kaffee ist ungefähr 100 °C. Der Einschluss von thermophilen Cellulasen an diesem Punkt wird die Kapazität der Säulen erhöhen, da das lösliche Material einfacher freigesetzt wird, wenn die Zellwandstruktur geöffnet ist.
Der Einschluss von Cellulasen in andere traditionelle Hochtemperaturverfahren zur Extraktion von Öl oder Geruchs-/Geschmacksverbindungen aus natürlichen Pflanzenquellen wird auf die gleiche Weise wie für die Kaffeeextraktion die Kapazität oder Ausbeute erhöhen. Ein Beispiel ist die Extraktion von Palmöl oder Palmkernöl, welches ein wässriges Hochtemperaturverfahren ist.
Materialien und Methoden
Hinterlegte Organismen:
Escherichia coli DSM 11201, das das Plasmid enthält, das die DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße cellulolytische Enzym kodiert, in dem Klonierungsvektor pSJ1678 enthält.
Andere Stämme:
E. coli Stamm: Zellen von E. coli SJ2 (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjøholm, C. (1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol., 172, 4315-4321), wurden hergestellt für und wie beschrieben durch Elektroporation unter Verwendung eines Gene Pulser^TM Elektroporators von BIO-RAD vom Hersteller transformiert.
Plasmid:
pSJ1678 wie in der Internationalen Anmeldung, die als WO 94/19454 veröffentlicht wurde, offenbart.
Allgemeine molekularbiologische Verfahren
DNA-Manipulationen und Transformationen wurden unter Verwendung von Standardverfahren der Molekularbiologie (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.) „Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C. R., und Cutting, S. M. (Hrsg.) „Molecular Biological Methods for Bacillus". John Wiley and Sons, 1990) durchgeführt.
Die Enzyme für die DNA-Manipulationen wurden entsprechend der Spezifikationen des Zulieferers verwendet.
Isolation der DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße cellulolytische Enzym kodiert: Die DNA-Sequenz, die die erfindungsgemäße Endoglucanase kodiert, kann von dem hinterlegten Organismus E. coli, DSM 11201 durch Extraktion der Plasmid-DNA durch im Stand der Technik bekannte Verfahren (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY) erhalten werden.
Klonieren des Endoglucanasegens
Präparation der genomischen DNA:
Der Stamm Dictyoglomus sp., DSM 6262 wurde in einer Glasflasche von 1 l für 2 Tage bei 70 °C auf dem Medium, das wie unten beschrieben war, vermehrt.
Zusammensetzung des streng anaeroben Mediums für Stamm DSM 6262:

1,0 g NH₄Cl, 0,1 g NaCl, 0,1 g MgCl₂, 0,05 g CaCl₂, 0,4 g K₂HPO₄·3H₂O, 0,75 g Hefeextrakt, 4,0 g Buchenxylan (Lenzing), 0,5 mg Resazurin, 1,0 ml Spurenelemente^#, 1,0 ml Vitaminlösung, 3,0 g NaHCO₃, H₂O auf 1 l.

^#Spurenelementlösung:

2,0 g FeCl₂·4H₂O, 0,05 g ZnCl₂, 0,05 g MnCl₂, 0,05 g AlCl₃, 0,05 g NiCl₂, 0,1 g Na₂SeO₃·5H₂O, 0,05 g H₃BO₃, 0,03 g CuCl₂, 0,05 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 0,05 g CoCl₂·6H₂O, 0,5 g EDTA, 1,0 ml konz. HCl, H₂O auf 1 l.

Spülen und Abgeben von 10 ml pro Flasche unter N₂/CO₂ (4:1). Verschluss mit O₂-undurchlässigen Gummistopfen und Autoklavieren bei 140 °C für 20 Minuten. Zufügen von 0,1 ml DSM-Vitaminlösung #141 aus Filter-sterilisierter anaerober Lösung und 0,2 ml 2,5 g/l Na₂S·9H₂O aus autoklavierter Stocklösung unmittelbar vor Inokulation mittels steriler anaerober Spritzentechnik.
Die Zellen wurden geerntet und die genomische DNA durch Verfahren isoliert, die von Pitcher et al. (Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. (1989). Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett. Appl. Microbiol. 8: 151-156) beschrieben wurden, isoliert.
Konstruktion der genomischen Bibliothek:
Die genomische DNA wurde partiell mit Restriktionsenzym Sau3A verdaut und durch Elektrophorese auf 0,7 %-igem Agarosegel größenfraktioniert. Die Fragmente zwischen 2 und 7 kb Größe wurden durch Elektrophorese auf DEAE-Cellulosepapier isoliert (Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corsi, P., Chambon, P. (1981) A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and acrylamide gels. Anal. Biochem., 112, 295-298).
Die isolierten DNA-Fragmente wurden mit BamHI-verdauter pSJ1678 Plasmid-DNA ligiert und das Ligationsgemisch zur Transformation von E. coli SJ2 verwendet.
Die Zellen wurden auf LB-Agar-Platten, die 0,1 % CMC (Natrium-Carboxy-Methyl-Cellulose, Aqualon, Frankreich) und 9 μg/ml Chloramphenicol enthielten, zum Erhalt von 500-1000 c.f.u./Platte ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
Identifikation positiver Klone mittels Aktivität:
Nach Inkubation wurden die Kolonien auf einen Satz von LB+CAM-Agar-Platten replikaplattiert und dann weiter bei 37 °C für ungefähr 20 Stunden inkubiert. Eine Überschichtung, die 0,1 % CMC, 1 % HSB-Agarose in einem geeigneten Puffer, pH 7 enthielt, wurde auf die Replikaplatten geschüttet und für ungefähr 20 Stunden bei 65 °C inkubiert. Endoglucanase-positive Kolonien wurden durch Färben mit 0,1 % wässriger Lösung von Kongo-Rot (SIGMA, USA), gefolgt von Waschen in 2 M NaCl identifiziert. Gelbliche Höfe erschienen an Positionen, wo Endoglucanase-positive Klone vorhanden waren.
Zellen aus Enzym-positiven Kolonien wurden zur Isolation einzelner Kolonien auf Agar verteilt und eine Enzym-produzierende einzelne Kolonie wurde für jede der Endoglucanase-produzierenden Kolonien, die identifiziert wurde, ausgewählt.
Charakterisierung positiver Klone:
Aus den Platten mit erneuter Ausstreichung wurden Endoglucanase-positive Kolonien als einzelne Kolonien erhalten und die Plasmide wurden extrahiert. Die Phänotypen wurden durch Retransformation von E. coli SJ2 bestätigt und die Plasmide durch Restriktionsverdauung charakterisiert.
Medien

TY- und LB-Agar (wie beschrieben in Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.) „Current protocols in Molecular Biology". John Wiley und Sons, 1995).

Hybridisierungsbedingungen (zur Beurteilung der Eigenschaft ii) des erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt zu verwenden):
Geeignete Bedingungen zum Bestimmen der Hybridisierung zwischen einer Nukleotidsonde und einer homologen DNA- oder RNA-Sequenz beziehen ein das Voreinweichen des Filters, der die DNA-Fragmente oder RNA enthält, die zu hybridisieren ist/sind, in 5 × SSC („Standard Saline Citrate") für 10 Minuten und Vorhybridisieren des Filters in einer Lösung von 5 × SSC (Sambrook et al. 1989), 5 × Denhardt-Lösung (Sambrook et al. 1989), 0,5 % SDS und 100 μg/ml denaturierter Ultraschall-behandelter Lachsspermien-DNA (Sambrook et al. 1989), gefolgt von Hybridisierung in der gleichen Lösung, die eine zufällig geprimte (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13), ³²P-dCTP-markierte (spezifische Aktivität > 1 × 10⁹ cpm/μg) Sonde enthält, für 12 Stunden bei ca. 45 °C. Der Filter wird dann zweimal für 30 Minuten in 2 × SSC, 0,5 % SDS bei vorzugsweise nicht mehr als 55 °C, weiter bevorzugt nicht mehr als 60 °C, weiter bevorzugt nicht mehr als 65 °C, sogar noch weiter bevorzugt nicht mehr als 70 °C, insbesondere nicht mehr als 75 °C gewaschen.
Die Nukleotidsonde, die in der Hybridisierung zu verwenden ist, ist der Endoglucanasekodierende Teil der DNA-Sequenz, die aus dem Plasmid erhältlich ist, das in Escherichia coli DSM 11201 vorhanden ist.
Immunologische Kreuzreaktivität:
Antikörper, die bei der Bestimmung immunologischer Kreuzreaktivität zu verwenden sind, können unter Verwendung einer gereinigten Endoglucanase hergestellt werden. Genauer gesagt kann ein Antiserum gegen die erfindungsgemäße Glucanase durch Immunisieren von Kaninchen (oder anderen Nagern) nach den von Axelsen et al. in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Kapitel 23, oder A. Johnstone und R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (genauer S. 27-31) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Die gereinigten Immunglobuline können aus den Antiseren, zum Beispiel durch Salzpräzipitation ((NH₄)₂SO₄), gefolgt von Dialyse und Ionenaustauschchromatographie, z.B. auf DEAE-Sephadex erhalten werden. Die immunchemische Charakterisierung von Proteinen kann entweder durch Doppeldiffusionsanalyse nach Ouchterlony (O. Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Hrsg.), Blackwell Scientific Publications, 1967, S. 655-706), durch gekreuzte Immunelektrophorese (N. Axelsen et al., supra, Kapitel 3 und 4) oder durch Rocket-Immunelektrophorese (N. Axelsen et al., Kapitel 2) durchgeführt werden.
Die folgenden nicht beschränkenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
BEISPIEL 1
Klonierung und Expression einer Endoglucanase aus Dictyoglomus sp. DSM 6262
Eine Bibliothek von Dicryoglomus sp., DSM 6262 wurde in E. coli konstruiert und wie in Material und Methoden beschrieben gescreent. Eine isolierte positive Transformante war DSM 11201, die das Plasmid pSJ1678 enthielt, das die DNA-Sequenz umfasst, die das erfindungsgemäße cellulolytische Enzym kodiert.
Der isolierte E. coli-Klon wurde gleichzeitig auf LB+CAM-Agarplatten, die 0,1 % AZCL-beta-Glucan, AZCL-Xyloglucan, AZCL-HE-Cellulose, AZCL-Xylan, AZCL-Kurdlan oder AZCL-Galactomannan enthielten, getestet. Die Platten wurden für ungefähr 48 Stunden bei 37 °C, gefolgt von einer Inkubation von 65 °C inkubiert. Die Enzymaktivität wurde durch blaue Höfe, die die Kolonien umgaben, identifiziert. Der Klon wurde auf AZCL-beta-Glucan, AZCL-Xyloglucan und AZCL-HE-Cellulose für positiv befunden.
Herstellung einer Enzymlösung aus dem E. coli-Klon DSM 11201
DSM 11201 wurde als eine Vorkultur in einer Schüttelflasche inokuliert, die 200 ml Superbrühemedium mit der folgenden Zusammensetzung (pro Liter) enthielt: Trypton 32 g, Hefeextrakt 20 g, NaCl 5 g, CMC 5 g, pH 7,2-7,3, eingestellt mit 1 M NaOH. Autoklaviert 121 °C, 20 Minuten. Nach Sterilisation Chloramphenicol auf eine Endkonzentration von 6 mg/ml zugefügt.
Die Schüttelflasche wurde auf einen Rundschüttler mit 280 Upm, 37 °C, für 16 Stunden inkubiert. 1 ml der Kultur wurde zu 100 Schüttelflaschen mit 200 ml Superbrühemedium inokuliert und bei 37 °C, 280 Upm 16 bis 18 Stunden inkubiert. Zentrifugation der 20 Liter E. coli-Kultur bei 3000 Upm, Resuspension des Pellets in 800 ml 50 mM Tris-Maleatpuffer, pH 7,0. Die Zellen wurden bei 800 bar mit einem „Rannie High Pressure Laboratory Homogeniser" aufgebrochen. Zentrifugation für 1 Stunde, 10.000 Upm und Sammeln des klaren Überstands.
BEISPIEL 2
Reinigung und Charakterisierung der aus Dictyoglomus sp. DSM 6262 klonierten Endoglucanase
600 ml E. coli-Zellextrakt wurde erst bei 70 °C für 5 Minuten hitzebehandelt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 5000 Upm für 20 Minuten. Der Überstand wurde durch Whatman-Filter D filtriert und insgesamt wurden 200 ml mit einer Aktivität von 11 CMCU pro ml (Bestimmung von CMCU, siehe unten) erhalten.
Die Lösung wurde über eine S-Sepharosesäule, die mit 0,05 M Natriumacetatpuffer pH 5,0 äquilibriert war, laufen gelassen. Die gebundene Endoglucanase wurde mit 0,5 M Natriumchlorid eluiert und insgesamt wurde ein Volumen von 300 ml mit 2 CMCU/ml erhalten. Diese Lösung wurde auf pH 9,0 eingestellt und mit 20 mM Ethanolaminpuffer bei pH 9,0 auf einer Ultrafiltrationszelle von Amicon mit einer Membran mit einem Cut-Off von 10 kD äquilibriert. Danach wird die Lösung, wenn die Leitfähigkeit ungefähr 250 mikroS/cm beträgt, auf eine Q-Sepharosesäule, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert ist, aufgetragen. Die Endoglucanase wird binden und dann unter Verwenden eines Natriumchloridgradienten eluiert werden können. Auf Grund zu hoher Leitfähigkeit in dem ersten Versuch erhielten wir nur 2 ml mit 65 CMCU/ml.
Schließlich wurde die Lösung konzentriert und auf eine Größensäule Superdex 200 in 0,1 M Natriumacetat pH 6,0 aufgetragen und die reine Glucanase in einem Volumen von 22 ml eluiert, die unter Verwendung einer Ultrafiltrationszelle von Amicon mit einer Membran mit einem Cut-Off von 6 kD konzentriert wurde. 1 ml mit 40 CMCU pro ml wurde erhalten. Diese Probe zeigte eine einzelne Bande bei SDS-PAGE mit einem MW von 30 kD und einem pI von 6,5. Das Protein wurde elektrogeblottet und zur N-terminalen Sequenzierung unter Verwendung eines Sequenzierers Modell 473A von Applied Biosystems aufgetragen. Der Proteinsequenzierer wurde nach den Anweisungen des Herstellers laufen gelassen und die folgende Sequenz wurde erhalten:
QTPKYKDAFILKAPSSGDVTTKNLPLTLELNFFNIAAY-
Die reine Endoglucanase hat auf p-Nitrophenyl-beta-D-cellobiosid (Sigma), CMC, HE-Cellulose (Megazyme) und Säure-gequollener Cellulose eine Aktivität.
Eine CMCU-Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die das Äquivalent von 1 mMol Glucose pro Minute unter Standardbedingungen freisetzt.
Standardbedingungen: CMC-Test bei 70 °C
Das Enzym wird für 20 Minuten in einer 0,75 %-igen CMC-(7 L von Hercules)-Lösung in einem 0,1 M Natriumbarbituratpuffer pH 8,5 inkubiert. Nach Inkubation wird der Anstieg der reduzierenden Endgruppen unter Verwendung von PHBAH (SIGMA H-988253H7704 (p-HYDROXYBENZOESÄUREHYDRAZID)) bestimmt und mit einem Glucosestandard wird die Bildung von glucoseäquivalenten Endgruppen pro Minute berechnet (Lever, M. (1972) A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Anal. Biochem. Band 47, Seite 273-279).
Die Endoglucanase zeigt 137 CMCU/mg Protein bei 70 °C und pH 8,5 (50 CMCU pro A₂₈₀).
Temperatur-Aktivitätsprofil der Endoglucanase
Die Endoglucanase wurde in dem CMCU-Test bei pH 8,5 bei verschiedenen Temperaturen inkubiert und die Aktivität nach 20 min. Inkubation wurde wie oben beschrieben bestimmt.
Inkubationen über 90 °C wurden nicht durchgeführt. Die Menge an reduzierendem Zucker, der bei dieser Temperatur erhalten wurde, war am höchsten und wurde zur Berechnung der relativen Aktivität bei niedrigeren Temperaturen verwendet.

Temp. Rel. Aktivität

90 °C 100 %

80 °C 76 %

70 °C 40 %

60 °C 26 %

50 °C 14 %

40 °C 7 %
pH-Aktivitätsprofil
Die Endoglucanase wurde in dem CMCU-Test bei 70 °C unter Verwendung verschiedener Puffer in dem pH-Intervall von 4,5 bis 11 inkubiert und die Aktivität nach 20 min. Inkubation wurde wie oben beschrieben bestimmt.
Puffer:

pH 4,5, 5,0 und 5,5; 0,1 M Na-Acetat
pH 6,0; 0,1 M Na-MES
pH 6,5, 7,0 und 7,5; 0,1 M Na-MOPS
pH 8,0 und 8,5; 0,1 M EPPS
pH 9,0, 9,5, 10,0, 10,5 und 11,0; 0,1 M Na-Glycin

Mehr als 50 % relativer Aktivität wurde in dem Bereich von pH 5,5 bis 11 erhalten.
p-Nitrophenyl-beta-D-cellobiosid-Test
Eine PNPU-Einheit ist definiert als die Menge Enzym, die ein mMol p-Nitrophenol pro Minute aus p-Nitrophenyl-beta-D-cellobiosid (Sigma) unter Standardbedingungen freisetzt.
Methode: Gleichgewichtskinetik, direkter Nachweis des Produkts p-Nitrophenol, es ergibt eine gelbe Farbe, die bei 405 nm nachgewiesen wird. Die Aktivität wird als der Anstieg des Absorptionsvermögens gemessen, wobei der lineare Teil der Kurve zum Bestimmen der Steigung (AU/sek) verwendet wird. Die Aktivität wird unter Verwendung eines Absorptionsvermögens von p-Nitrophenol in Phoshatpuffer pH 7,5 berechnet: Absorptionsvermögen in 1 cm Küvette, 1 mM 0,018 bei 405 nm (0,014 bei 420 nm).
Test-Bedingungen:

475 ml 10 mM p-NP-beta-D-cellobiosid in 0,1 M Na-Phosphatpuffer, pH 7,5 25 ml Enzymlösung

Vorgehensweise:
Die Messung wird auf einem „HP 8452A Diode Array Spectrophotometer", das thermostatisch auf 70 °C kontrolliert wird, in einer 0,75 ml Küvette, 1 cm Breite durchgeführt.
Das Absorptionsvermögen bei 405 nm wird in 300 Sekunden mit einer Messung alle 20 Sekunden gemessen.
Die Endoglucanase zeigte 170 PNPU pro A₂₈₀ bei 70 °C und pH 7,5.
Säure-gequollene Cellulose
Eine PASC-Stocklösung wurde unter Verwendung eiskalten Acetons und Phosphorsäure wie folgt hergestellt. 5 g Cellulose (Avicel^®) wurden mit Wasser angefeuchtet und 150 ml eiskalte 85 %-ige Ortho-Phosphorsäure wurden zugefügt. Das Gemisch wurde unter langsamem Rühren 1 Stunde in ein Eisbad gesetzt. Dann wurden 100 ml eiskaltes Aceton unter Rühren zugefügt. Die Aufschlämmung wurde auf einen Buchner-Filter mit Sinterscheibe Nummer 3 von Pyrex übertragen und dann dreimal mit 100 ml eiskaltem Aceton gewaschen und nach jedem Waschschritt so trocken wie möglich gesaugt. Schließlich wurde der Filterkuchen zweimal mit 500 ml Wasser gewaschen und nach jedem Waschschritt so trocken wie möglich gesaugt. Das PASC wurde mit deionisiertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 300 ml gemischt, zur Homogenität (unter Verwendung des „Ultra Turrax Homogenizers") vermischt und im Kühlschrank (bis zu einem Monat) gelagert.
Substratäquilibrierung mit Puffer: 20 g Phosphorsäure-gequollene Cellulose-PASC-Stocklösung wurde für 20 Minuten bei 5000 Upm zentrifugiert, der Überstand wurde abgegossen; das Sediment wurde in 30 ml Puffer resuspendiert und für 20 Minuten bei 5000 Upm zentrifugiert, der Überstand wurde abgegossen und das Sediment wurde in Puffer auf eine Gesamtmenge von 60 g resuspendiert, was einer Substratkonzentration von 5 g Cellulose/Liter entsprach.

Puffer für pH 8,5-Bestimmung: 0,1 M Barbital.

Vorgehensweise:
1. Verdünnung der Enzymproben
Die Enzymlösung wird in dem gleichen Puffer wie das Substrat verdünnt.
2. Enzymreaktion
Das Substrat in Pufferlösung wird für 5 Minuten auf 80 °C (2 ml) vorerwärmt.
Dann wird die Enzymlösung (verdünnt) 0,5 ml zugefügt und für 5 Sekunden gemischt. Enzymleerproben werden durch Zufügen des Stoppreagenz vor der Enzymlösung erhalten. Inkubieren für 20 Minuten bei 80 °C. Die Reaktion wird durch Zufügen von 0,5 ml 2 % NaOH-Lösung und Mischen für 5 Sekunden gestoppt.
Die Proben werden für 20 Minuten bei 5000 Upm zentrifugiert. 1 ml Überstand wird mit 0,5 ml PHBAH-Reagenz gemischt und für 10 Minuten gekocht. Die Teströhrchen werden in einem Eiswasserbad abgekühlt.
3. Bestimmung der reduzierenden Endgruppen
Das Absorptionsvermögen bei 410 nm wird unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen. Eine Standardglucosekurve wurde durch Verwenden von Glucosekonzentrationen von 5, 10, 15 und 25 mg/l in dem gleichen Puffer und Zufügen von PHBAH-Reagenz vor dem Kochen erhalten. Die Freisetzung von reduzierenden Glucoseäquivalenten wird unter Verwendung dieser Standardkurve berechnet.
Bestimmung von k_cat und K_m:
Die katalytische Aktivität auf Säure-gequollener Cellulose wird unter Verwendung des wie oben beschriebenen Tests unter Standardbedingungen bei pH 8,5 und 80 °C mit verschiedenen Substratkonzentrationen bestimmt. Die kinetischen Konstanten wurden unter Verwendung des Computerprogramms „Grafit" für Michaelis-Menten-Kinetik berechnet. Auf Grundlage der Aminosäurezusammensetzung der Endoglucanase wurde der molare Extinktionskoeffizient auf 85630 bestimmt. Folglich wurden die folgenden Daten erhalten:
k_cat = 77 pro Sekunde
K_m = 2,5 g Säure-gequollene Cellulose pro Liter.
BEISPIEL 3
Expression einer thermostabilen Endoglucanase in Bacillus subtilis
Der Stamm von Bacillus subtilis, der unten beschrieben ist, der das Expressionsplasmid beherbergt, das die thermostabile Endoglucanase kodiert, die aus Dictyoglomus sp. DSM 6262 kloniert ist, wurde von den Erfindern nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei der „Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, am 16. Dezember 1997 unter der Hinterlegungsnummer DSM 11903 hinterlegt.
Materialien:
Stämme
E. coli SJ2 (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjøholm, C. (1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol., 172, 4315-4321)
Elektrokompetente Zellen hergestellt und transformiert unter Verwendung eines „Bio-Rad GenePulser^TM" wie vom Hersteller empfohlen.
B. subtilis A164. Dieser Stamm ist ein Derivat von B. subtilis ATCC 6051a, der sporulationsdefizient ist und bei dem die apr- und npr-Gene unterbrochen wurden. Die Unterbrechungen wurden im Wesentlichen durchgeführt, wie beschrieben in (Hrsg. A.L. Sonenshein, J.A. Hoch und Richard Losick (1993) Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria, American Society for microbiology, S.618). Kompetente Zellen wurden wie von Yasbin, R.E., Wilson, G.A. und Young, F.E. (1975) Transformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis: evidence for selective induction of prophage in competent cells. J. Bacteriol, 121: 296-304 beschrieben, hergestellt und transformiert.
Plasmide
pUB110: Plasmid beschrieben in (McKenzie, T., Hoshino, T., Tanaka, T. und Sueoka, N. The nucleotide sequence of pUB 110: some salient features in relation to replication and its regulation Plasmid 15 (2), 93-103 (1986)) und (McKenzie, T., Hoshino, T., Tanaka, T. und Sueoka, N. Correction. A revision of the nucleotide sequence and functional map of pUB110 Plasmid 17 (1), 83-85 (1987)).
pMUTIN-4-MCS: Das Plasmid kann von den „Laboratoire de Genetique Microbienne", Institut National de la Recherche Agronomique, 78352 Jouy en Josas – CEDEX, Frankreich, erhalten werden.
Medium
LB-Agar (wie beschrieben in Ausubel, F. M. et al. (Hrsg.) „Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995).
LBPG ist LB-Agar, der mit 0,5 % Glucose und 0,05 M Kaliumphosphat, pH 7,0, supplementiert ist.
AZCL-HE-Cellulose wird zu LBPG-Agar auf 1 % zugefügt. AZCL-HE-Cellulose ist von Megazyme, Australien.
BPX-Medium ist in der internationalen Anmeldung, die als WO 91/09129 veröffentlicht ist, beschrieben.
Methoden:
Das Plasmid wurde konstruiert und der Klon wurde im Wesentlichen wie folgt etabliert: pMUTIN4MCS ist ein E. coli-Plasmid mit einem Hybridpromotor SPAC (Yansura et al. (1984) Use of E. coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis, PNAS, Band 81, S. 439-443) und einem lacZ-Gen unter der transkriptionellen Kontrolle dieses Promotors. Darüber hinaus enthält das Plasmid das lacI-Gen unter der Kontrolle eines pen P-Promoters von Bacillus spe. Wenn folglich in B. subtilis das lacI exprimiert wird und an den Operator des SPAC-Promotor-Operators bindet, dann wird dies die Transkription der stromabwärts gelegenen Sequenz inhibieren. Der Promotor ist der gleiche wie in Yansura et al., allerdings wurde der Promotor in ein perfektes Palindrom modifiziert. Eine HindIII-Stelle unmittelbar stromabwärts der Promotor-Operator-Region ermöglichte es, das lacZ-Gen durch Insertion eines anderen Gens, nämlich des erfindungsgemäßen Endoglucanasegens, zu unterbrechen, wodurch die Expression der Endoglucanase unter der Kontrolle des SPAC-Promoter-Operators gelassen wurde.
In dem E. coli-Plasmid pMUTIN4MCS wurde eine Ribosombindestelle (RBS) und ein Signalpeptid mit einer SacII-Stelle für Klonierungszwecke als ein HindIII-SacI-Fragment kloniert, wodurch die folgende Ribosombindestelle und Signalpeptid-kodierende DNA-Sequenz etabliert wurden:
Die DNA-Sequenz, die ein Bacillus sp.-Signalpeptid kodiert, das wenn es an eine weitere DNA-Sequenz fusioniert ist, die den reifen Teil eines Proteins kodiert, diese von der Bacillus sp.-Zelle nach außen lenken wird, ist kursiv geschrieben.
Die obige Sequenz kodiert die HindIII-Stelle von pMUTIN4MCS unmittelbar gefolgt von einer RBS aus Bacillus subtilis und einer DNA-Sequenz, die ein Bacillus spe.-Signalpeptid kodiert, das mit einer künstlich eingeführten SacII-Stelle endet, auf die eine NotI- und eine SacI-Restriktionsschnittstelle folgen. Das Plasmid wurde in E. coli SJ2 durch Elektroporation und Plattieren auf LB-Agarplatten mit 100 μg/ml Ampicilin und Inkubieren der Zellen über Nacht bei 37 °C etabliert. Das resultierende Plasmid wurde mit pMUTIN4-Signal-SacII-NotI bezeichnet.
Das thermostabile Endoglucanasegen wurde als ein SacII-EagI-verdautes PCR-Fragment kloniert.
Das PCR-Fragment wurde unter Verwendung des „HiFi Expand PCR"-Kits von Boehringer Mannheim erhalten und die Reaktion wurde wie vom Hersteller empfohlen durchgeführt. Das DNA-Fragment wurde aus dem Plasmid pDSM11201 amplifiziert. Das thermostabile Endoglucanasegen wurde ursprünglich aus Dicryoglomus spe. DSM6262 kloniert und als ein E. coli-Klon (DSM 11201) hinterlegt, der ein Plasmid mit dem Endoglucanasegen beherbergt. Die zwei PCR-Primer, die verwendet wurden, waren wie folgt:
Das PCR-Fragment und das pMUTIN4-Signal-SacII-NotI wurden mit SacII-EagI verdaut, zusammen ligiert und zur Transformation von E. coli SJ2 durch Elektroporation und Ausplattieren auf LB-Agarplatten mit 100 μg/ml Ampicillin und Inkubieren der Zellen über Nacht bei 37 °C verwendet. Das resultierende Plasmid in SJ2 wurde mit pMB447A bezeichnet.
Nach erfolgter Klonierung des Endoglucanasegens in Fusion mit dem Signalpeptid von oben (in der SacII-Not/EagI-Stelle) resultierte der folgende offene Leserahmen unter der transkriptionalen Kontrolle des SPAC-Promotor-Operators.

und das abgeleitete Protein:
Um in der Lage zu sein, das pMB447A in Bacillus subtilis zu propagieren, wurde das E. coli-Plasmid an ein Derivat von pUB 110 (einem Plasmid, das in B. subtilis vermehrbar ist) fusioniert: In die NciI-Stelle von pUB110 wurden eine SacI- und NotI-Stelle unter Verwendung eines Polylinkers insertiert, wobei das resultierende Insert die folgende Sequenz hatte:
CCCGGGAGCTCGCGGCCGCCCCGG
Die beiden NciI-Stellen sind unterstrichen; zwischen ihnen sind die SacI- und EagI-(NotI-)-Stellen.
Dieses Plasmid wurde dann mit SacI und EagI verdaut und mit SacI-EagI-verdautem pMB447A ligiert, wobei die Ligation verwendet wurde, um Bacillus subtilis A164 zu transformieren. Die Klone wurden etabliert und über Nacht auf LBPG-10-Kana-AZCL-HE-Cellulose-Platten wachsen gelassen. Am nächsten Tag wurden diese Platten bei 70 °C für 5 Stunden inkubiert und das Auftreten von blauen Höfen zeigte die positive Expression der thermostabilen Endoglucanase an.
Bei der Analyse der aus dem Klon MB505 (DSM 11903) isolierten Plasmid-DNA wurde offensichtlich, dass das Plasmid eine Rekombination eingegangen war und das resultierende Plasmid kleiner war als die erwartete Plasmidgröße von 12,5 kb. Folglich schien es, dass das Plasmid das meiste des E. coli-Plasmid pMUTIN-4-Signal-SacII-NotI verloren hatte, was in einem Plasmid der ungefähren Größe von 5,5 kb resultierte.
Das resultierende Plasmid hatte die folgenden wesentlichen Merkmale:
Die auf dem Plasmid von DSM 11903 kodierte Endoglucanase wurde positiv exprimiert ohne IPTG zufügen zu müssen und das Plasmid verlieh Resistenz gegenüber 10 μg/ml Kanamycin.
Das MB505 wurde 5 Tage in 500 ml Schüttelflaschen mit zwei Einbuchtungen und 100 ml BPX-Medium bei 37 °C und 300 Upm kultiviert.
Reinigung und Charakterisierung:
5000 ml Flüssigkeit einer Schüttelflaschenkultur von Bacillus mit dem Klon MB 505 wurden erhalten und die Kulturflüssigkeit wurde durch Erhitzen auf 70 °C wärmebehandelt und für 5 Minuten unter Rühren bei dieser Temperatur gehalten. Sie wurde dann abgekühlt und mit 9000 Upm für 20 Minuten zentrifugiert. 4000 ml klarer Überstand wurden erhalten, der 2,4 CMCU pro ml enthielt.
Das CMCU wurde bei 70 °C und pH 8,5 bestimmt.
6000 CMCU wurden auf 3000 ml DEAE A-50 Sephadex aufgetragen, das in 50 mM Mes-Puffer pH 6,2 äquilibriert war. Das nicht-gebundene Material enthielt insgesamt 5700 CMCU.
Das nicht-gebundene Material wurde auf eine 1000 ml Q-Sepharosesäule aufgetragen, die mit 20 mM Ethanolaminpuffer pH 9,5 äquilibriert war. Das gebundene Enzym wurde unter Verwendung eines NaCl-Gradienten eluiert.
Das partiell gereinigte Produkt wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationszelle von Amicon mit einer Membran mit einem Cut-Off-Wert von 6 kDa konzentriert.
Die konzentrierte Fraktion wurde mit 40 % Nonopropylenglykol formuliert.
Insgesamt wurden 250 ml mit einer Konzentration von 9,7 CMCU pro ml (2425 CMCU insgesamt) erhalten und für Anwendungsversuche verwendet.
Immunologische Methoden:
Hochgereinigte Cellulase aus Dicryoglomus (aus Beispiel 2) wurde zur Herstellung von Antiserum verwendet.
Die Immunisierungsvorgehensweise wurde bei DAKO unter Verwendung von Kaninchen durchgeführt. Jedes Kaninchen wurde mit 100 μl Cellulase (0,4 mg Protein pro ml) gemischt mit 100 μl Adjuvanz immunisiert. Jedes Kaninchen wurde 15-mal mit einwöchigen Intervallen immunisiert. Das Kaninchenserum wurde gesammelt und das gamma-Globulin aus dem Serum gereinigt.
Mancini-Platten, zum Beispiel 25 ml 1 % Agarosegel (15 × 10 cm) mit 50 μl gamma-Globulin (A280 = 106,5) und mit 4 mm Vertiefung, in welche 10 μl Probe eingebracht und für einen Tag bei Raumtemperatur in einer Feuchtkammer inkubiert wurden.
Die Platte wurde in 0,95 NaCl-Wasser einige Male gewaschen und mit Coomassie-Blau nach Standardvorgehensweisen gefärbt.
Die folgenden Durchmesser wurden entweder von der hochgereinigten Dictyoglomus-Cellulase bzw. des formulierten partiell gereinigten MB505 erhalten:
Hochgereinigte Dictyglomus-Cellulase:

40 CMCU ergaben 11,5 mm im Durchmesser.
20 CMCU ergaben 9,5 mm im Durchmesser.
10 CMCU ergaben 7 mm im Durchmesser.

Formulietes MB505:

10 CMCU 8 mm im Durchmesser.

12 Cellulasen anderer Familien (z.B aus den Pilzgenera Trichoderma, Humicola, Aspergillus) bildeten unter diesen Bedingungen keine Immunpräzipitate. BEISPIEL 4 Biopolishing von Dictyoglomus-Cellulase bei 90°C Experimenteller Teil Material und Ausrüstung:

Gerät:	„Mathis Pad-steam Range", Typ: PSA-HTF
Gewebe:	Gebleichtes Interlock-gestricktes Baumwollgewebe (Test fabrics Inc.): N.O. weiß, 100 % Baumwolle, Stil 460. Das Gewebe wurde in Stücke einer Größe von 20 × 30 cm (jeweils ungefähr 12,5 g) geschnitten.

Enzym:	Dictyoglomus, Charge MB505, 9,7 CMCU/ml
Puffer:	15 mM Phosphatpuffer pH 6,0 15 mM Phosphatpuffer pH 8,1

Vorgehensweise zur Füllung;
Stoffproben des Gewebes wurden für mindestens 24 Stunden in einem Standard-AATCC-(American Association of Textile Chemists and Colourists)-Klimaraum (65 ± 2 % relative Luftfeuchtigkeit und 70 ± 3 °F Temperatur) aufbereitet. Ihr Gewicht wurde erhalten.
Enzymlösungen wurden durch Mischen des Enzyms mit Puffer hergestellt. Der pH wurde eingestellt und die Enzymaktivität in den Lösungen wurde unten in Tabelle 1 gezeigt. Stoffproben wurden in Enzymlösungen für weniger als 45 Sekunden eingetaucht und dann gefüllt. Nach dem Füllen wurden die Stoffproben gewogen und sofort in den Mathis-Dämpfer gehängt. Der Prozentsatz an Lösung auf dem Gewebe, gezeigt als Feuchtigkeitsaufnahme auf den Stoffproben des Gewebes, wurde auch in Tabelle 1 dargestellt: Tabelle 1
Biopolishing im Dämpfer:
Die Stoffproben des Gewebes wurden in einem Dämpfer bei den folgenden Bedingungen behandelt:

Temperatur: 90 °C

Zeit: 90 Minuten

Relative Luftfeuchtigkeit: 100 %

Alle Stoffproben wurden übertragen und für mindestens 5 Minuten in deionisiertem Wasser gespült. Sie wurden luftgetrocknet und dann in dem AATCC-Klimaraum für mindestens 24 Stunden vor der Beurteilung aufbereitet. Beurteilung:

Festigkeitsverlust:	Die Gewebefestigkeit wurde auf einem Mullen-Burst-Tester Modell C gemäß den ASTM D786 – 87 gemessen. Die Daten sind Mittelwerte von mindestens 8 Messungen.
Pillingkennung:	Gemessen nach ASTM D 4970 – 89 unter Verwendung eines „Matindale Pilling Testers" bei 500 Umdrehungen. Pillen auf der Faser wurde optisch mit Werten von 1 bis 5 beurteilt, wobei 1 sehr ernsthaftes Pillen und 5 kein Pillen ist. Die Daten sind Mittelwerte von mindestens 2 Messungen.

Ergebnisse und Schlussfolgerungen:
Die Ergebnisse sind unten zusammengefasst und die Daten sind in Tabelle 2 und 3 gezeigt.

1. Mit steigender Enzymkonzentration steigt die Pillingkennung (in Tabelle 3),
2. Dictyoglomus-Cellulase ergibt bessere Pillingkennung bei pH 8,1 als bei pH 6,0 (Tabelle 3),
3. Bei den vorliegenden Bedingungen ergibt das Biopolishing wenig Festigkeitsverlust des Gewebes bei pH 6,0 (weniger als 5 %), aber es wurde kein Festigkeitsverlust bei pH 8,1 nachgewiesen.

Es kann gefolgert werden, dass das Biopolishing von Baumwollgewebe mit Dictyoglomus-Cellulase die Widerstandsfähigkeit gegen Gewebepillen bei den Bedingungen dieser Studie signifikant verbessert. Bei bevorzugten Bedingungen wie zum Beispiel pH ungefähr 8 wurde eine gute Pilling-Widerstandsfähigkeit ohne nachweisbaren Festigkeitsverlust erhalten. Tabelle 2
Tabelle 3
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Enzymzubereitung mit Endo-1,4-β-Glucanase-Aktivität, wobei die Zubereitung enthält a) ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 2 oder b) ein Polypeptid, das mindestens 70 % Identität mit SEQ ID NR. 2 aufweist, wobei das Polypeptid von a) oder b) eine optimale Aktivität über 85 °C und mehr als 50 % relative Aktivität in dem Bereich von pH 5,5 bis 11 besitzt.
Enzymzubereitung gemäß Anspruch 1, wobei das Polypeptid kodiert wird durch a) ein Polynukleotid mit der Sequenz von SEQ ID NR. 1 oder b) ein Polynukleotid mit mindestens 70 % Identität mit der Sequenz SEQ ID NR. 1.
Enzymzubereitung gemäß Anspruch 1 oder 2, die eine optimale Aktivität bei einer Temperatur über 85 °C besitzt.
Zubereitung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Enzymzubereitung aus einem Stamm, der zu dem Stamm Gram-positive Bakterien gehört, erhältlich ist oder in diesem endogen ist.
Zubereitung gemäß Anspruch 4, wobei der Stamm zu dem Unterstamm Clostridia, vorzugsweise zu der Gattung Dictyoglomus gehört.
Zubereitung gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1-5, welche bei einem pH zwischen ungefähr 4 und ungefähr 11, vorzugsweise zwischen ungefähr 5,5 und ungefähr 10, aktiv ist.
Enzymzubereitung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Aktivität gegenüber Carboxymethylcellulose (CMC-Test) bei 70 °C und pH 10 größer als 50 % in Bezug auf die Aktivität bei 70 °C und optimalem pH ist.
Zubereitung gemäß Anspruch 7, wobei die relative Aktivität größer als 55 %, vorzugsweise größer als 60 %, weiter bevorzugt größer als 65 %, insbesondere größer als 70 %, ist.
Zubereitung gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei die Enzymzubereitung aus einem Stamm, der zu dem Stamm Gram-positive Bakterien gehört, erhältlich ist oder in diesem endogen ist.
Zubereitung gemäß Anspruch 9, wobei der Stamm zu dem Unterstamm Clostridia, vorzugsweise zu der Gattung Dicryoglomus gehört.
DNA-Konstrukt, das eine Endoglucanase mit optimaler Aktivität über 85 °C und mehr als 50 % relativer Aktivität in dem Bereich von pH 5,5 bis 11 besitzt, wobei das Konstrukt enthält a) ein Polynukleotid mit der Sequenz von SEQ ID NR. 1 oder b) ein Polynukleotid mit mindestens 70 % Identität mit der Sequenz von a).
DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 11, in welchem die DNA-Sequenz aus einer DNA-Bibliothek von einem Prokaryonten oder einem Archae-Bakterium, vorzugsweise aus einem Bakterium, isoliert ist oder auf deren Grundlage hergestellt ist.
DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 12, in welchem die DNA-Sequenz aus einer DNA-Bibliothek aus einem Stamm, der zu dem Stamm Gram-positive Bakterien, vorzugsweise dem Unterstamm Clostridia, insbesondere einem Stamm von Dictyoglomus, gehört, isoliert ist oder auf deren Grundlage hergestellt ist.
DNA-Konstrukt gemäß einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 13, in welchem die DNA-Sequenz aus Escherichia coli, DSM 11201 isoliert ist.
DNA-Konstrukt gemäß einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 14, welches zusätzlich eine DNA-Sequenz enthält, die eine Cellulose-Bindedomäne (CBD) kodiert.
DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 15, das zusätzlich eine DNA-Sequenz enthält, die eine Cellulose-Bindedomäne (CBD) kodiert, wobei die Cellulose-Bindedomäne und der Enzymkern (katalytisch aktive Domäne) des Enzyms, das von der DNA-Sequenz des DNA-Konstrukts kodiert wird, funktionsfähig verknüpft sind.
Rekombinanter Expressionsvektor enthaltend ein DNA-Konstrukt gemäß einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 16.
Zelle enthaltend ein DNA-Konstrukt gemäß einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 16 oder einen rekombinanten Expressionsvektor gemäß Anspruch 17.
Zelle gemäß Anspruch 18, die eine prokaryontische Zelle, insbesondere eine Bakterienzelle, oder eine endogene Zelle ist, aus der die DNA-Sequenz, die ein Endoglucanase-Aktivität-aufweisendes Enzym kodiert, stammt.
Zelle gemäß Anspruch 19, wobei die Zelle zu einem Stanzen von Bacillus gehört, vorzugsweise einem Stamm gehörend zu der Gruppe bestehend aus Bacillus subtilis, Bacillus lentus, Bacillus liquefaciens und Bacillus licheniformis.
Zelle gemäß Anspruch 19, wobei die Zelle zu einem Stamm eines filamentösen Pilzes gehört, vorzugsweise einem Stamm gehörend zu der Gruppe bestehend aus der Gattung Aspergillus, Fusarium und Trichoderma, weiter bevorzugt einem Stamm gehörend zu der Gruppe bestehend aus den Arten Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium graminerarum und Trichoderma reesei.
Zelle gemäß Anspruch 19, wobei die Zelle zu einem Stamm von Dictyoglomus gehört.
Zelle gemäß Anspruch 18, wobei die Zelle zu einem Stamm von Saccharomyces gehört, vorzugsweise einem Stamm von Saccharomyces cerevisiae.
Verfahren zum Herstellen eines Enzyms mit Endoglucanase-Aktivität und optimaler Aktivität über 85 °C, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Zelle gemäß einem beliebigen der Ansprüche 18 bis 23 unter Bedingungen, die die Herstellung des Enzyms erlauben, und das Gewinnen des Enzyms aus der Kultur umfasst.
Enzym mit thermostabiler Endoglucanase-Aktivität und optimaler Aktivität über 85 °C und mehr als 50 % relativer Aktivität in dem Bereich von pH 5,5 bis 11, wobei das Enzym von einem DNA-Konstrukt gemäß einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 16 kodiert wird.
Enzymzubereitung, welche hinsichtlich des Enzyms gemäß Anspruch 25 angereichert ist.
Zubereitung gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 10 und 26, welche zusätzlich ein oder mehrere Enzyme ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mannanasen, Galactanasen, Xylanasen, Arabinanasen, Pektin-Acetylesterasen, Polygalacturonasen, Rhamnogalacturonasen, Pektinlyasen, Pektatlyasen, Pektin-Methylesterasen, Endoglucanasen, Proteasen, Lipasen, Amylasen, Cutinasen, Peroxidasen, Laccasen, Cellobiohydrolasen und Transglutaminasen enthält.
Isolierte im wesentlichen reine biologische Kultur des Stamms Escherichia coli, DSM 11201.
Verwendung des Enzyms gemäß Anspruch 25 oder der Enzymzubereitung gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 10, 26 und 27 in der Textilindustrie zur Verbesserung der Eigenschaften von Cellulosefasern oder -gewebe oder zur Bereitstellung eines "stone-washed" Aussehens von Denim; oder in industriellen Reinigungsverfahren; oder in Wärme-extrudiertem polymerem Material; oder in der Umwandlung von Biomasse zu Zuckern; oder bei der Herstellung von Alkohol; oder zur Vorverdauung von z.B. Getreiden, die in der Futterherstellung verwendet werden; oder in der Herstellung von Instant-Kaffee oder ähnlichen Extraktionsverfahren.