CN105441406A - 植酸酶变体 - Google Patents

植酸酶变体 Download PDF

Info

Publication number
CN105441406A
CN105441406A CN201410381678.9A CN201410381678A CN105441406A CN 105441406 A CN105441406 A CN 105441406A CN 201410381678 A CN201410381678 A CN 201410381678A CN 105441406 A CN105441406 A CN 105441406A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phytase
phya
km71h
amino acid
site
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410381678.9A
Other languages
English (en)
Inventor
李峰
李凤梅
王忆平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rex Biomics Biotechnology (beijing) Co Ltd
Peking University
Original Assignee
Rex Biomics Biotechnology (beijing) Co Ltd
Peking University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rex Biomics Biotechnology (beijing) Co Ltd, Peking University filed Critical Rex Biomics Biotechnology (beijing) Co Ltd
Priority to CN201410381678.9A priority Critical patent/CN105441406A/zh
Priority to PCT/CN2015/085748 priority patent/WO2016019834A1/zh
Publication of CN105441406A publication Critical patent/CN105441406A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/165—Yeast isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/685—Aspergillus niger
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/84—Pichia

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明的发明名称是“植酸酶变体”，属于生物技术领域，所要解决的技术问题是提供编码植酸酶变体的氨基酸序列和编码植酸酶的核苷酸序列及其应用，解决该问题的技术方案是提供了相应的序列及其应用。

Description

植酸酶变体
技术领域
本发明涉及植酸酶变体，编码植酸酶变体的氨基酸序列和编码植酸酶的核苷酸序列及其应用。
背景技术
在谷物和豆类中，磷主要以植酸或植酸盐(Phytate)的形式储存。植酸又称肌醇六磷酸，含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，植酸是饲料中磷的重要贮存形式。植酸酶(EC3.1.3.8)即肌醇六磷酸水解酶，催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸。
磷是动物生长的必需元素。单胃动物如猪、家禽和鱼不能直接吸收植酸盐，导致大量植物来源的磷元素排放于环境中，造成环境富营养化。同时，动物吸收磷酸盐不足会影响生长，为了补偿这些动物的磷酸盐的缺乏，需在饲料中补充磷酸盐，增加了养殖成本并加剧了对环境的不利影响。通过在动物饲料中使用植酸酶，水解了植酸盐，可改善动物对磷的吸收，并降低磷排放。因此，植酸酶具备一举两得的功效，已在动物饲料中普遍应用，具有十分重大的经济价值。
自然界中植酸酶的来源多种多样。通过基因工程手段，特别是DNA重组技术的应用，使各种微生物来源的植酸酶大规模廉价生产和实际应用成为可能。现工业化生产的植酸酶主要有来源于黑曲霉的真菌植酸酶和来源于细菌的植酸酶两种。其中来源于黑曲霉的植酸酶PHYA具有高耐热性及良好的消化道稳定性等特点。目前主要通过在粉末饲料直接添加或颗粒饲料后喷涂的方法应用在饲料行业。
在颗粒饲料生产过程中有一个短暂的80-90℃的造粒过程。黑曲霉来源的植酸酶耐热性良好，能够抵抗住上述短时高温过程。但由于黑曲霉来源的植酸酶比活性较低，相比细菌来源的植酸酶比活性相差较大，因此进一步提高黑曲霉来源的植酸酶的比活性从而提升发酵活力，是饲用植酸酶的研究热点之一。同时，进一步提升耐热性，降低造粒时的酶活损失，也是饲用植酸酶的重要研究方向。
附图说明
图1显示含本发明所述植酸酶变体的重组载体pPHYA(即pPICZα-phyA)。
图2显示来源于黑曲霉的野生型植酸酶的氨基酸序列SEQIDNO:1。括号内为植酸酶的原始信号肽序列，不含在本发明范围之内，字母带框的为突变位点。
图3显示编码植酸酶氨基酸序列SEQIDNo:1的经密码子优化的核苷酸序列，所述植酸酶从第20位氨基酸开始，不含信号肽序列。
发明内容
本发明通过基因突变的方法对黑曲霉来源植酸酶的氨基酸序列进行改造，使改造后的植酸酶具有提高的比活性或者耐热性能。构建表达载体和菌株，使改造后的植酸酶高效表达，最终达到工业化生产的要求。
本发明是以黑曲霉植酸酶PHYA为起始植酸酶进行突变筛选。来源于黑曲霉的植酸酶PHYA基因全长1401bp(GeneBank号码:P34752)，编码467个氨基酸(参见例如SEQIDNO:1中所示)。N端的19个氨基酸为信号肽，去除信号肽的黑曲霉植酸酶可以利用毕赤酵母进行分泌表达获得具有植酸酶活性的成熟蛋白。
在一个实施方案中，本发明的植酸酶变体，相对于野生型植酸酶的氨基酸序列SEQIDNo:1而言，具有选自以下的至少一个位点的氨基酸修饰：位点51、84、86、91、126、165、202、211、和300。优选地，所述的氨基酸修饰选自：Y51S,T(Y51S,T表示第51位的氨基酸残基Y优选S或T进行替换，以下同)；A84R,S,G；Y86P,G,W；K91N,T,V,A,G,S,M；D126E,N；R165K,W；E202D,Q；D211K；和K300E,G,L,I,V,M。
在一个实施方案中，本发明还涉及上述植酸酶变体的保守取代变体。优选地，所述的保守取代变体保留本发明植酸酶变体的提高的比活性和/或耐热性。对于本领域的技术人员而言很明显，这种取代可以在上述位点以外的区域发生，而仍保留相应活性。优选地，所述保守取代变体具有至少一个位置的氨基酸保守取代。保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。最常见的氨基酸互换有氨基酸G至A；A至G,S；V至I,L,A,T,S；I至V,L,M；L至l,M,V；M至L,I,V；P至A,S,N；F至Y,W,H；Y至F,W,H；W至Y,F,H；R至K,E,D；K至R,E,D；H至Q,N,S；D至N,E,K,R,Q；E至Q,D,K,R,N；S至T,A；T至S,V,A；C至S,T,A；N至D,Q,H,S；Q至E,N,H,K,R的互换，以及它们的相反的互换。
在一个实施方案中，本发明还涉及与上述植酸酶变体的氨基酸序列具有一定的氨基酸同源性的植酸酶变体，例如，同源性至少约80％，更优选至少约81％，更优选至少约82％，更优选至少约83％，更优选至少约84％，更优选至少约85％，更优选至少约86％，更优选至少约87％，更优选至少约88％，更优选至少约89％，更优选至少约90％，更优选至少约91％，更优选至少约92％，更优选至少约93％，更优选至少约94％，最优选至少约95％，最优选至少约96％，最优选至少约97％，最优选至少约98％，最优选至少约99％，只要具有所述同源性的变体保留本发明植酸酶变体的提高的比活性和/或耐热性。
在本文中，“保留本发明植酸酶变体的提高的比活性和/或耐热性”是指，保留本发明植酸酶变体的比活性和/或耐热性的至少约20％，优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选100％。
本发明同时提供了一种提高比活性或者耐热性的方法，该方法包括：在野生型植酸酶或与野生型植酸酶氨基酸序列相似性超过90％以上植酸酶氨基酸序列中引入一个或多个氨基酸突变来提高比活性或者耐温性。例如，在植酸酶的第51、84、86、91、126、165、202、211、300位。优选Y51S,T；A84R,S,G；Y86P,G,W；K91N,T,V,A,G,S,M；D126E,N；R165K,W；E202D,Q；D211K；K300E,G,L,I,V(Y51S,T表示第51位的氨基酸残基Y优选S或T进行替换，以下同)。
另一方面，本发明提供了本发明所述植酸酶的编码基因。
在一个优选实施方案中，所述野生型植酸酶的编码基因具有SEQIDNo:2所示的核苷酸序列，其不包括野生型植酸酶的信号肽序列。该核苷酸序列根据表达宿主酵母偏爱密码子设计，有效提高该基因的表达效率。该序列在起始密码子后或蛋白表达系统正确阅读框内编码成熟的植酸酶。所有的位点突变优选在上述密码子优化后的基因序列基础上进行。
另一方面，本发明提供了一种改良的植酸酶的制备方法，该方法包括：编码基因的合成或克隆，重组载体的构建，受体细胞的转化，突变菌株的筛选，及最佳表达菌株大规模发酵表达。
作为本发明的一个最优选的实施方案，为了使植酸酶基因在毕赤酵母中高效表达，我们将黑曲霉PHYA原有的信号肽序列去除，使改造后植酸酶基因插入到带有alpha因子信号肽序列的酵母表达载体pPICZαA上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间。经转化酵母细胞，稳定整合到酵母染色体上。优选重组菌株是毕赤酵母菌株KM71H。用高浓度的零霉素(zeocin)平板筛选高拷贝的转化子，将筛选到的转化子进行摇瓶及发酵实验，最终筛选确定高表达菌株。
本发明的优化改良的植酸酶在饲料、食品行业具有巨大的应用潜力。
除另有说明外，本申请中的所有科技术语的都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本申请中描述类似或等同的方法及材料都可用于实施或检验本发明，但是下文仍还是对合适的方法和材料进行了描述。本申请中引用的全部出版物、专利申请、专利及其他参考文献其全部内容在此引入作为参考。如有抵触，包括定义，以本申请为准。
下列实施例旨在进一步举例说明实现本发明的具体方式，而决不构成对本发明的限制。本领域技术人员应该理解的是，在不违背本发明的精神和原则的前提下，对本发明进行改动得到的技术方案都将落入本发明的待批权利要求范围内。
实施例
实验材料和试剂：
1、菌株与载体
大肠杆菌菌株Top10、毕赤酵母KM71H,、载体pPICZα，均购自Invitrogen公司。
2、酶与试剂盒
PCR酶，质粒提取，胶纯化试剂盒购自天根，限制性内切酶、连接酶购自Thermo，零霉素抗生素均购自Invitrogen公司，点突变试剂盒购自全式金公司。
3、培养基
大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LB-零霉素
为LB培养基加50ug/mL零霉素。
酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)，酵母转化培养基为YPDS零霉素(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，100ug/ml零霉素)。酵母筛选培养基为YPD零霉素(YPD+100-5000ug/ml零霉素)。
酵母培养基BMGY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％生物素、1％
甘油(V/V))和改良诱导培养基BMMY(除以2％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。
实施例1
黑曲霉来源的野生型phyA基因(不含信号肽)的密码子优化及全基因合成
根据毕赤酵母最适密码子合成SEQIDNO:2的全基因序列，由北京英茂盛业提供全基因合成服务，基因两端引物分别含有EcoRI和NotI酶切位点，并克隆在TA载体上。用EcoRI和NotI双酶切，凝胶电泳纯化获得的条带。将扩增得到的片段克隆到pPICZα的EcoRI和NotI位点，得到的重组载体命名为pPHYA(即pPICZα-phyA)。测序确定其氨基酸序列的正确性。
实施例2
在实施例1中在合成的phyA基因基础上引入定点突变并转化酵母KM71H
根据结构信息，本发明认为氨基酸序列的第51、84、86、91、126、165、202、211、300位氨基酸残基具有重要功能，对上述位点实行定点突变。优选Y51S,T；A84R,S,G；Y86P,G,W；K91N,T,V,A,G,S,M；D126E,N；R165K,W；E202D,Q；D211K；K300E,G,L,I,V进行突变。该突变基于pPHYA质粒，使用全式金公司的定点突变试剂盒进行操作，所使用的引物列表如下：
引物名称 5’-3’序列
Y51S-for TCCCACTTGTGGGGTCAATCTGCCCCATTCTTCTCTTTG
Y51T-for TCCCACTTGTGGGGTCAAACTGCCCCATTCTTCTCTTTG
Y51-rev TTGACCCCACAAGTGGGAGGTC
A84R-for GTTTTGTCTAGACACGGAAGAAGATACCCTACTGACTCC
A84S-for GTTTTGTCTAGACACGGATCCAGATACCCTACTGACTCC
A84G-for GTTTTGTCTAGACACGGAGGTAGATACCCTACTGACTCC
A84-rev TCCGTGTCTAGACAAAACTTG
Y86P-for TCTAGACACGGAGCTAGACCACCTACTGACTCCAAGGGT
Y86G-for TCTAGACACGGAGCTAGAGGTCCTACTGACTCCAAGGGT
Y86W-for TCTAGACACGGAGCTAGATGGCCTACTGACTCCAAGGGT
Y86-rev TCTAGCTCCGTGTCTAGACAAAAC
R165K-for AGAAGTTCCGGTTCCTCTAAGGTGATTGCTTCCGGTAAG
R165W-for AGAAGTTCCGGTTCCTCTTGGGTGATTGCTTCCGGTAAG
R165-rev AGAGGAACCGGAACTTCTGATG
K91A-for AGATACCCTACTGACTCCGCTGGTAAGAAATACTCCGCTC
K91G-for AGATACCCTACTGACTCCGGTGGTAAGAAATACTCCGCTC
K91M-for AGATACCCTACTGACTCCATGGGTAAGAAATACTCCGCTC
K91N-for AGATACCCTACTGACTCCAACGGTAAGAAATACTCCGCTC
K91S-for AGATACCCTACTGACTCCTCTGGTAAGAAATACTCCGCTC
K91T-for AGATACCCTACTGACTCCACCGGTAAGAAATACTCCGCTC
K91V-for AGATACCCTACTGACTCCGTCGGTAAGAAATACTCCGCTC
K91-rev GGAGTCAGTAGGGTATCTAGC
D126E-for AACTACTCTTTGGGAGCCGAAGACTTGACTCCATTCGGTG
D126N-for AACTACTCTTTGGGAGCCAACGACTTGACTCCATTCGGTG
D126-rev GGCTCCCAAAGAGTAGTTGTAG
E202D-for ATCGACGTAGTCATCTCTGACGCTTCCTCCTCTAACAAC
E202Q-for ATCGACGTAGTCATCTCTCAAGCTTCCTCCTCTAACAAC
E202-rev AGAGATGACTACGTCGATCTTTG
D211K-for TCCTCTAACAACACCTTGAAGCCTGGTACTTGTACCGTC
D211-rev CAAGGTGTTGTTAGAGGAGGAAG
K300E-for GACTACTTGCAGTCCTTGGAGAAGTACTACGGTCACGGTGCC
K300G-for GACTACTTGCAGTCCTTGGGTAAGTACTACGGTCACGGTGCC
K300I-for GACTACTTGCAGTCCTTGATCAAGTACTACGGTCACGGTGCC
K300L-for GACTACTTGCAGTCCTTGTTGAAGTACTACGGTCACGGTGCC
K300M-for GACTACTTGCAGTCCTTGATGAAGTACTACGGTCACGGTGCC
K300V-for GACTACTTGCAGTCCTTGGTCAAGTACTACGGTCACGGTGCC
k300-rev CAAGGACTGCAAGTAGTCGTAG
以pPHYA为模板，使用全式金公司的定点突变试剂盒，转化TOP10，涂布LB-零霉素
平板。转化子测序正确后，用LB培养并用质粒提取试剂盒提取5ug以上质粒用SacI线性化，片段纯化后电击转化酵母KM71H，涂布YPDS-零霉素平板，每个转化收集10个转化子用于试管筛选。同时用pPHYA转化KM71H作为标准对照，命名为KM71H-PHYA。按照此方法，建立全部51、84、86、91、126、165、202、211、300位点突变体的酵母转化子，优选建立含有Y51S,T；A84R,S,G；Y86P,G,W；K91N,T,V,A,G,S,M；D126E,N；R165K,W；E202D,Q；D211K；K300E,G,L,I,V突变的酵母转化子。
可以经过多轮突变，获得两个及两个以上的突变位点组合。
实施例3
包含不同phyA突变的酵母转化子的摇瓶表达以及酶活性提高的转化子的测定
包含不同phyA突变的酵母转化子接入含有15mlBMGY培养基的250ml摇瓶中，30℃摇床250rpm培养24h，再加入15ml改良诱导BMMY培养基，继续培养24h。分别收集菌体和上清，上清根据中华人民共和国国家标准《GB/T18634-2002》检测植酸酶活性，以KM71H-PHYA的活性归一为100％，优选的植酸酶变体相对酶活如下表所示。
突变体 突变 相对酶活(％)
KM71H-PHYA —— 100
KM71H-PHYA-Y51S Y51S 122
KM71H-PHYA-Y51T Y51T 167
KM71H-PHYA-A84R A84R 118
KM71H-PHYA-A84S A84S 127
KM71H-PHYA-A84G A84G 115
KM71H-PHYA-Y86P Y86P 143
KM71H-PHYA-Y86G Y86G 108
KM71H-PHYA-Y86W Y86W 149
KM71H-PHYA-K91N K91N 133
KM71H-PHYA-K91T K91T 142
KM71H-PHYA-K91V K91V 142
KM71H-PHYA-K91A K91A 134
KM71H-PHYA-K91G K91G 127
KM71H-PHYA-K91S K91S 144
KM71H-PHYA-K91M K91M 135
KM71H-PHYA-D126E D126E 116
KM71H-PHYA-D126N D126N 161
KM71H-PHYA-R165K R165K 121
KM71H-PHYA-R165W R165W 147
KM71H-PHYA-E202D E202D 107
KM71H-PHYA-E202Q E202Q 123
KM71H-PHYA-D211K D211K 157
KM71H-PHYA-K300E K300E 138
KM71H-PHYA-K300G K300G 129
KM71H-PHYA-K300L K300L 133
KM71H-PHYA-K300I K300I 130
KM71H-PHYA-K300V K300V 133
KM71H-PHYA-K300M K300M 139
KM71H-PHYA-K91R.K300V K91R K300V 142
实施例4
耐热性提高的酵母转化子的筛选
由于耐热性也是植酸酶的一个重要指标，如果酶活提高但是耐热性降低了，那么其应用价值将大打折扣，因此找到酶活性和耐热性均提高的突变子。在实施例3中获得的酶活性提高的突变体酵母转化子，选取其中有代表性的进行耐热性鉴定。将摇瓶培养的上清用0.2MpH5.5的乙酸缓冲液稀释至2U/ml，一份置于85℃水浴中温育5min，立即置冰，另一份直接置冰作为对照。用国家标准《GB/T18634-2002》检测植酸酶活性，以未经热处理的酶稀释液归一为100％，测得残留酶活比例。该法即可反映不同突变体的耐热性。
突变体 突变 残留酶活(％)
KM71H-PHYA —— 61
KM71H-PHYA-Y51S Y51S 77
KM71H-PHYA-Y51T Y51T 81
KM71H-PHYA-A84R A84R 61
KM71H-PHYA-A84S A84S 59
KM71H-PHYA-A84G A84G 60
KM71H-PHYA-Y86P Y86P 43
KM71H-PHYA-Y86G Y86G 70
KM71H-PHYA-Y86W Y86W 68
KM71H-PHYA-K91N K91N 66
KM71H-PHYA-K91T K91T 80
KM71H-PHYA-K91V K91V 79
KM71H-PHYA-K91A K91A 70
KM71H-PHYA-K91G K91G 65
KM71H-PHYA-K91S K91S 84
KM71H-PHYA-K91M K91M 81
KM71H-PHYA-D126E D126E 72
KM71H-PHYA-D126N D126N 63
KM71H-PHYA-R165K R165K 65
KM71H-PHYA-R165W R165W 57
KM71H-PHYA-E202D E202D 63
KM71H-PHYA-E202Q E202Q 85
KM71H-PHYA-D211K D211K 77
KM71H-PHYA-K300E K300E 71
KM71H-PHYA-K300G K300G 59
KM71H-PHYA-K300L K300L 76
KM71H-PHYA-K300I K300I 73
KM71H-PHYA-K300V K300V 68
KM71H-PHYA-K300M K300M 75
KM71H-PHYA-K91R.K300V K91R K300V 72

Claims (9)

1.植酸酶变体，其与野生型氨基酸序列SEQIDNo:1相比，具有在选自以下的至少一个位点的氨基酸修饰：位点51、84、86、91、126、165、202、211、和300。
2.根据权利要求1的植酸酶变体，相对于SEQIDNo:1的氨基酸序列，所述植酸酶变体具有选自以下的至少一个修饰：Y51S,T；A84R,S,G；Y86P,G,W；K91N,T,V,A,G,S,M；D126E,N；R165K,W；E202D,Q；D211K；和K300E,G,L,I,V,M。
3.根据权利要求1或2的植酸酶变体，其进一步在其它位点具有保守取代。
4.根据前面权利要求1-3任一项的植酸酶变体，比SEQIDNo:1所示的植酸酶有增加的酶活性或者增加的热稳定性。
5.核苷酸序列，编码根据权利要求1-3任一项的植酸酶。
6.重组表达载体，其包含根据权利要求5的核苷酸序列。
7.重组宿主细胞，其包含根据权利要求5的核苷酸序列或者根据权利要求6的载体。
8.动物饲料添加剂，其包含根据权利要求1-3任一项的植酸酶中的至少一种。
9.动物饲料，其包含根据权利要求1-3任一项的植酸酶中的至少一种。
CN201410381678.9A 2014-08-05 2014-08-05 植酸酶变体 Pending CN105441406A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410381678.9A CN105441406A (zh) 2014-08-05 2014-08-05 植酸酶变体
PCT/CN2015/085748 WO2016019834A1 (zh) 2014-08-05 2015-07-31 植酸酶变体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410381678.9A CN105441406A (zh) 2014-08-05 2014-08-05 植酸酶变体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105441406A true CN105441406A (zh) 2016-03-30

Family

ID=55263142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410381678.9A Pending CN105441406A (zh) 2014-08-05 2014-08-05 植酸酶变体

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN105441406A (zh)
WO (1) WO2016019834A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017215218A1 (zh) * 2016-06-15 2017-12-21 昆明爱科特生物科技有限公司 一种植酸酶突变体及其制备方法和应用
WO2021233193A1 (zh) * 2020-05-22 2021-11-25 青岛蔚蓝生物集团有限公司 植酸酶突变体
CN114736886A (zh) * 2022-04-24 2022-07-12 南京益纤生物科技有限公司 植酸酶突变体及其制备方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110484521B (zh) * 2018-05-14 2022-09-23 广东溢多利生物科技股份有限公司 高热稳定性的植酸酶突变体KsPHY9及其基因和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1309699A (zh) * 1998-03-23 2001-08-22 诺维信公司 植酸酶变体
WO2004024885A2 (en) * 2002-09-13 2004-03-25 Cornell Research Foundation, Inc. Using mutations to improve aspergillus phytases

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0311287A (pt) * 2002-05-30 2005-03-29 Basf Ag Polipeptìdeo, polinucleotìdeo, vetor, célula hospedeira, processo para produzir um polipeptìdeo, e, composição

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1309699A (zh) * 1998-03-23 2001-08-22 诺维信公司 植酸酶变体
WO2004024885A2 (en) * 2002-09-13 2004-03-25 Cornell Research Foundation, Inc. Using mutations to improve aspergillus phytases

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREA TOMSCHY ET AL.: "Active site residue 297 of Aspergillus niger phytase critically a¡ects the catalytic properties", 《FEBS LETTERS》 *
施安辉 等: "目前国内外植酸酶研究进展", 《中国酿造》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017215218A1 (zh) * 2016-06-15 2017-12-21 昆明爱科特生物科技有限公司 一种植酸酶突变体及其制备方法和应用
WO2021233193A1 (zh) * 2020-05-22 2021-11-25 青岛蔚蓝生物集团有限公司 植酸酶突变体
CN114736886A (zh) * 2022-04-24 2022-07-12 南京益纤生物科技有限公司 植酸酶突变体及其制备方法
CN114736886B (zh) * 2022-04-24 2023-12-12 南京益纤生物科技有限公司 植酸酶突变体及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016019834A1 (zh) 2016-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9611469B2 (en) Thermostable phytase variants
EP1474508B1 (en) Phytase variants
CN101035892B (zh) 具有肌醇六磷酸酶活性的多肽及编码其的多核苷酸
DK2650364T3 (en) Hafniaphytase variants
CN102007211A (zh) 布丘氏菌属物种植酸酶变体
CN101679986A (zh) 哈夫尼菌属肌醇六磷酸酶
CN102392002B (zh) 一种改进的大肠杆菌植酸酶htp6m及其基因和应用
CN105441406A (zh) 植酸酶变体
KR101336213B1 (ko) 열내성 비 ｋ12 에스체리치아 콜리 피타아제 및 그 제조
DK3072962T3 (en) PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF PHYTASE VARIANT WITH IMPROVED THERMOSTABILITY AND A PHYTASE VARIANT AND APPLICATION THEREOF
CN101631855B (zh) 具有肌醇六磷酸酶活性且该酶活性的温度稳定性增强的多肽及编码所述多肽的核苷酸序列
Mi et al. Molecular cloning and characterization of a novel α-galactosidase gene from Penicillium sp. F63 CGMCC 1669 and expression in Pichia pastoris
Kumar et al. In silico characterization of histidine acid phytase sequences
Niño-Gómez et al. “In Silico” Characterization of 3‐Phytase A and 3‐Phytase B from Aspergillus niger
US20090029004A1 (en) Phytase variants
RU2712881C2 (ru) Новая фитаза, способ ее получения и ее применение
CN101260391A (zh) 耐热型植酸酶基因及其应用
CN117651709A (zh) 具有溶菌酶活性的修饰多肽
Boukhris et al. Cloning and characterization of the first actinomycete β‐propeller phytase from Streptomyces sp. US42
CN101260390B (zh) 高比活植酸酶基因及其应用
KR101816600B1 (ko) 흑염소 반추위 미생물 유래의 베타 글루코시다아제 cel3-KG92, cel3-KG93, cel3-KG96 또는 cel-KG94 유전자, 및 이의 용도
de Souza et al. Biofactories for the Production of recombinant phytases and their application in the animal feed industry
EP4119659A1 (en) Phytase variants
KR102010838B1 (ko) 흑염소 반추위 미생물 유래의 알파 갈락토시다아제 cel36-KG101 유전자 및 이의 용도
KR101816615B1 (ko) 흑염소 반추위 미생물 유래의 알파 아밀라아제 cel57-KG91 유전자 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160330

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication