KR101336213B1

KR101336213B1 - 열내성 비 ｋ12 에스체리치아 콜리 피타아제 및 그 제조

Info

Publication number: KR101336213B1
Application number: KR1020117012872A
Authority: KR
Inventors: 시우연 예; 렌쿠안 리; 웨이강 진; 카이팡 첸
Original assignee: 후지안 후다 바이오테크 코퍼레이션 리미티드
Priority date: 2008-11-14
Filing date: 2008-11-14
Publication date: 2013-12-05
Also published as: CN102209785B; EP2356237A4; CA2743711A1; EP2356237A1; BRPI0823236A2; CN102209785A; US8652820B2; KR20110086584A; US20120021488A1; MX2011005074A; MX307031B; WO2010054513A1; CA2743711C; EP2356237B1

Abstract

본 발명은 비-K12 에스체리치아 콜리 균주, ATCC 9637 유래 열내성 피타아제 유전자의 클로닝 및 시퀀싱, 에스체리치아 콜리 발현 시스템에서 피타아제 유전자 발현, 최적화된 코돈 사용 그리고 피치아 파스토리스, 피치아 메타놀리카 및 클루예로마이세스 락티스에서의 발현에 관한 것이다. 피타아제 유전자의 최적화된 코돈으로 피치아 파스토리스의 발효로부터 높은 레벨의 수율 및 열내성 효소가 얻어진다.

Description

열내성 비 Ｋ12 에스체리치아 콜리 피타아제 및 그 제조 {A THERMOTOLERANT NON-K12 ESCHERICHIA COLI PHYTASE AND ITS PRODUCTION}

본 발명은 분자 생물학, 생화학, 발효 및 피타아제의 후 처리의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 열내성 피테이트 히드라타아제 효소(피테이트 hydratase enzyme), 피타아제를 위한 신규 비-K12 에스체리치아 콜리 유전자 코딩의 클로닝 및 발현에 관한 것이다.

피타아제 (미오이노시톨 헥사키스포스페이트 포스포히드롤라아제, myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase: EC 3.1.3.8)는 피테이트(미오이노시톨 헥사키스포스페이트)를 미오이노시톨과 무기 인산염으로 가수분해하는 효소이다. 이 효소는 유효한 사료 첨가제로 알려져 있다. 20세기말에, 동물 사료 첨가제로서 피타아제의 연간 판매는 1억5천불을 넘는 것으로 집계되며 증가하고 있다.

현재 가금류 및 돼지의 식이는 주로 시리얼, 콩과식물(legumes), 종유 산물을 기반으로 한다. 이들 사료에 존재하는 인(P)의 약 2/3는 피트산의 염, 피테이트로서 생긴다. 식물 중의 피트산 인은 킬레이트로 존재하는 피트산의 칼슘-마그네슘-칼륨염의 혼합이며 그 용해도는 매우 낮다. 이러한 형태의 인은 인간, 돼지, 가금류처럼 단일 위장을 갖는 동물에서 소화가 좋지 않다.

피트산 인 및 피트산 착물에 결합된 미네랄 및 미량원소의 이용을 위해, 피타아제에 의해 피트산의 에스테르형 결합된 인산염기의 가수분해가 필요하다. 피타아제는 피테이트를 미오인노시톨과 인산염의 저급 인산 에스테르 시리즈로 가수분해할 수 있는 포스파타아제의 특정 군에 속한다.

감수성 있는 인산 에스테르 결합의 최초 공격을 가리키는 3-피타아제 및 6-피타아제의 2 종류의 피타아제가 알려져 있다. 단위 동물은 효과적으로 피테이트를 이용하기에 충분한 피타아제가 결여되어 있지만, 많은 진균, 박테리아, 효모는 동물의 할당량을 보충하는데 사용될 수 있는 피타아제를 생산한다. 인 소화능력 및 동물 기능에 있어서 보충의 피타아제의 유용한 효과는 공지문헌에 잘 기재되어 있다(Mroz et al, 1994; Kornegay et al, 1996; Rao et al, 1999; Ravindran et al., 1999). 효소 생산의 효율은 종류, 포접율 및 현존 활성 레벨뿐만 아니라, 위장관을 통해 마주치는 상이한 환경하 및 사료 및 사료 제형의 전처리를 위해 적용되는 조건하에서 그 활성을 유지할 수 있는 효소능에 달려 있다.

많은 피타아제가 보충제로서 적용가능하지만, 많은 효소는 소정의 단점을 갖고 있다. 예를 들어, 현재 사용되는 피타아제 다수는 사료 펠렛화 과정 중 열 처리로 인해 활성을 잃는다. 더욱이, 현재 사용되는 피타아제의 다수는 펩신 및 키모트립신과 같은 동물 소화 시스템의 프로테아제에 불안정하여 적합하지 않다. 동물 사료 및 식품 처리에서의 사용에 개선된 특성을 갖는 피타아제가 요구되고 있다.

따라서, 한 측면에서 본 발명은, a) 서열번호 3(SEQ ID NO: 3)으로 표시되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; b) 스트린젠트 혼성화 조건 하에서 a)와 혼성화하며, 비-K12 에스체리치아 콜리 피타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 c) a) 및 b) 중 어느 하나에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 단리된 핵산 분자는 a) 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 67-1296로 이루어진 뉴클레오티드 서열; b) 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 1-1230으로 이루어진 뉴클레오티드 서열; c) 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열; d) 스트린젠트 조건 하에서 a) 내지 c) 중 어느 하나와 혼성화하고 비-K12 에스체리치아 콜리 피타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 또는 e) a) 내지 d) 중 어느 하나에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하며 바람직하게는 상기 벡터는 발현 벡터이다. 예를 들어 상기 벡터는 pTrcHis2-PhE, pPIC9K-PhE, pMET-PhE 및 pKLAC-PhE로 이루어진 군에서 선택되는 것이어도 좋다.

다른 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자를 포함하는 단리된 세포를 제공하며, 바람직하게는 상기 단리된 핵산 분자는 발현 벡터에 포함된다. 바람직하게는, 상기 세포는 효모 세포이다. 예를 들어, 상기 세포는 에스체리치아 콜리(Escherichia coli .), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica) 및 클루예로마이세스 락티스(Kluyeromyces lactis)로 이루어진 군에서 선택되어도 좋다. 보다 구체적으로, 상기 세포는 에스체리치아 콜리 MG1655, 피치아 파스토리스 GS115, 피치아 메타놀리카 PMAD16 및 클루예로마이세스 락티스 GG799로 이루어진 군에서 선택되는 균주로부터 유래될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 세포는 pTrcHis2-PhE로 형질변환된 에스체리치아 콜리 MGl655, pPIC9K-PhE로 형질변환된 피치아 파스토리스 SMD1168, pMET-PhE로 형질변환된 피치아 메타놀리카 PMD16 및 pKLAC-PhE로 형질변환된 클루예로마이세스 락티스 GG799로 이루어진 군에서 선택되는 균주이다.

다른 관점에서 본 발명은 a) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열; 또는 b) 서열번호 3과 적어도 99%의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서 비-K12 에스체리치아 콜리 피타아제의 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.

다른 관점에서, 본 발명은 발현에 효과적인 조건 하에서 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 세포를 배양하여 비-K12 에스체리치아 콜리 피타아제의 활성을 갖는 폴리펩티드를 얻는 단계를 포함하는, 발효에 의한 비-K12 에스체리치아 콜리 피타아제의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 세포는 pTrcHis2-PhE로 형질변환된 에스체리치아 콜리 MGl655, pPIC9K-PhE로 형질변환된 피치아 파스토리스 SMD1168, pMET-PhE로 형질변환된 피치아 메타놀리카 PMD16 및 pKLAC-PhE로 형질변환된 클루예로마이세스 락티스 GG799로 이루어진 군에서 선택되는 균주이다.

본 발명의 피타아제는 사료 제형 중 상업적 펠렛 밀(pellet mill)에서 마주치는 열 조절 단계에서 견딜 수 있으므로, 본 발명은 예를 들어 열내성 피타아제를 포함하는 고형 알갱이(hard granular) 사료 펠렛과 같은 동물 사료를 만드는 방법을 제공한다. 사료 제조를 위해, 제형화된 피타아제는, 사료 성분인 적어도 전-열처리된 효소 활성의 적어도 60%가 유지되도록 펠렛 밀 내 조정된 혼합 스팀 및 펠렛 다이를 통해 사출된 사료와 혼합되어도 좋다. 따라서 피타아제는 동물 사료 중 비타민, 미네랄, 다른 사료 효소, 농업적 연산품(예: 밀미들링 또는 옥수수 글루텐박)에 추가하여 그 자체로서 또는 이들과 함께 보충제로서 사용되어도 좋다. 또한 본 발명의 피타아제는 매쉬 식이(mash diets), 즉 펠리타이저를 통하지 않은 식이에 첨가되어도 좋다.

현재 상업적으로 입수가능한 피타아제 효소는 열내성이 아니므로, 이들은 종종 펠렛화된 사료의 표면상에 피타아제 용액을 일반적으로 분무하는 것을 통해, 펠렛화 후에 적용된다. 분무 방법에서 발견되는 문제점은 낮은 퍼센티지의 펠렛만이 효소와 접촉하고 효소가 코팅된 펠렛의 표면에만 존재하며, 사료 분쇄기(feel mills)는 복잡한 분무 기계에 투자하고 작동해야 할 필요가 있다는 것이다. 반면, 3146 U/mg의 높은 특이 활성을 갖는 본 발명의 열내성 피타아제는 펠렛화 전에 첨가되어도 좋으므로, 개선된 효소 분포로 사료의 생산을 가능하게 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에서 에스체리치아 콜리 ATCC 9637 균주에서 단리된 비-K12 에스체리치아 콜리 피타아제를 코딩하는 핵산 서열(서열번호 1) 및 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 신호 펩티드는 밑줄로 나타낸다. 성숙 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 뉴클레오티드 67 내지 뉴클레오티드 1296이다. 정지 코돈 TAA는 "*"로 표시된다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에서 효모 시스템에서의 유전자 발현에 최적화된 코돈으로서 비-K12 피타아제를 코딩하는 핵산 서열(서열번호 2)를 나타낸다. 성숙 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 1230이다. 정지 코돈 TAA는 "*"로 표시된다.
도 3은 본 발명의 실시예에 있어서 본 발명의 핵산 분자의 클로닝에 사용되는 프라이머의 서열을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 비-K12 피타아제와 공지의 두 피타아제 간의 아미노산 서열을 비교한 것을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 여러 실시예에서 구축한 재조합 발현 플라스미드의 구조 맵을 나타낸다. 플라스미드 pTrcHis2-PhE에서, 삽입 "피타아제"는 서열번호 1의 서열을 갖고, pPIC9k-PhE, pMET-PhE 및 pKL AC-PhE에서 삽입 "피타아제"는 서열번호 2의 서열을 갖는다.
도 6은 서로 다른 pH에서 비-K12 피타아제 활성을 나타낸다.
도 7은 서로 다른 온도에서 비-K12 피타아제 활성을 나타낸다.
도 8은 서로 다른 발효시간에서 비-K12 피타아제 활성을 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 서로 다른 발효시간 지점에 있어서 샘플의 SDS-PAGE상의 비-K12 피타아제 산물을 나타낸다.
도 10은 표시된 프로테아제 처리 후 비-K12 피타아제 활성을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 실시예에서 피치아 파스토리스에 의해 분비된 피타아제의 분자량을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 실시예에서 발현된 피타아제의 pH 내성을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 실시예에서 발현된 피타아제의 온도 내성을 나타낸다.
도 14는 본 발명의 건조 제형화된 피타아제의 온도내성을 나타낸다.
도 15는 본 발명의 비-K12 피타아제와 에스체리치아 콜리 K12 피타아제 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래 진균 피타아제 사이의 온도내성을 비교한 것이다.
도 16은 본 발명의 비-K12 피타아제와 에스체리치아 콜리 K12 피타아제 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래 진균 피타아제 사이의 pH 내성을 비교한 것이다.

본 명세서에서 다수의 용어 및 약어가 사용된다. 특별히 다르게 기재되지 않는 한 하기 정의가 적용된다.

여기서 사용되는 "포함하는"이란 청구항에 기재된 특징, 정수, 단계 또는 성분이 존재함을 의미하나, 다른 특징, 정수, 단계, 성분 또는 그 조합이 1 이상 추가 존재하는 것을 배제하는 것은 아니다.

용어 "열내성"은 주어진 온도 노출에도 활성을 유지하는 효소를 특징짓는 것이다. 여기서 사용되는 용어 "pTrcHis2-PhE"는 LacO 프로모터 및 pBR322 오리진, 그리고 DNA 복제를 위한 bla(Apm) 유전자 및 도 5에 나타낸 형질전환 선택의 조절 하에서 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pTrcHis2 (Invitrogen Biotechnology Co., Ltd)를 가리킨다.

여기서 사용되는 용어 "pPIC9K-PhE"는 도 5에 나타낸 배향(orientation)에 있어서 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pPIC9K (Invitrogen Biotechnology Co., Ltd)를 가리킨다.

여기서 사용되는 용어 "pMET-PhE" 는 도 5에 나타낸 배향에 있어서 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pMETalphaA (Novagen, Inc.)를 가리킨다.

여기서 사용되는 용어 "pKLAC-PhE"는 도 5에 나타낸 배향에 있어서 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pKLAC(New England Biolabs, Inc.)를 가리킨다.

여기서 "단리된 핵산 단편" 또는 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 선택적으로 합성, 비-천연 혹은 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함하는, 단일 또는 이중가닥의 RNA 또는 DNA 폴리머이다. DNA 폴리머 형태의 단리된 핵산 단편은 cDNA, 게놈 DNA, 또는 합성 DNA의 1 이상의 단편으로 이루어져도 좋다.

"코돈 축퇴성(Codon degeneracy)"은 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 영향을 주지 않고 뉴클레오티드 서열의 변이를 허용하는 유전 코드의 속성을 가리킨다. 따라서, 본 발명은 도 1 및 2에 나타낸 본 미생물 폴리펩티드를 코딩하는 아미노산 서열의 전부 또는 실질적인 부분을 코딩하는 임의의 핵산 단편에 관한 것이다. 당업자에게 있어서, 주어진 아미노산을 특정하는 뉴클레오티드 코돈의 사용에 있어서 특정 숙주세포에 의해 나타나는 "코돈 편향(codon-bias)"은 잘 알려져 있다. 따라서, 숙주 세포에서 개선된 발현을 위해 유전자를 합성할 때, 그 코돈 사용 빈도가 숙주세포의 바람직한 코돈 사용 빈도에 접근하도록 유전자를 설계하는 것이 바람직하다.

용어 "서열 분석 소프트웨어"는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 유용한 임의의 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 가리킨다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 입수가능하거나 독립적으로 개발된 것이어도 좋다. 전형적인 서열 분석 소프트웨어는 GCG 프로그램 세트 (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al, J. MoI. Biol. 215:403 410 (1990), 및 DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, Wis. 53715 USA), 및 스미스-워터맨 알고리즘(Smith- Waterman algorithm)을 포함한 FASTA 프로그램 (W R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111 20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, N. Y)을 포함하나 이들에 한정되지는 않는다. 용어 "MEME"는 숨겨진 마르코브 모델(hidden Markov model) (Timothy L. Bailey and Charles Elkan, Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers, Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28 36, AAAI Press, Menlo Park, Calif. (1994))에 기초한 보존된 진단 모티프를 동정하는데 사용되는 소프트웨어 프로그램을 가리킨다. "MAST" (Timothy L. Bailey and Michael Gribskov, "Combining evidence using p-values: application to sequence homology searches" Bioinformatics, Vol. 14, pp. 48 54 (1998))는 MEME 프로그램으로부터의 출력을 취하여 EMBL 및 SwissProt과 같은 단백질 데이타베이스에 대해 동정된 모티프를 서치하는 프로그램이다. 본 출원의 내용 중 서열 분석 소프트웨어가 분석에 사용될 때, 다르게 특정되지 않으면, 분석의 결과는 해당 프로그램의 "디폴트 값"에 기초할 것이다. 여기서 사용되는 "디폴트 값"은 처음 초기화시 소프트웨어에 원래 로드된 값 또는 파라미터의 임의의 세트를 의미할 것이다.

여기서 사용되는 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 테크닉은 공지이며, 예를 들면 Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) (이하 "Maniatis"); 및 Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Press Spring Harbor, N.Y. (1984) (이하 "Silhavy"); 및 Ausubel, F. M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc, and Wiley-Interscience (1987) (이하 "Ausubel")에 기재되어 있다.

본 발명은 에스체리치아 콜리 ATCC 9637 (American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA20108, USA) 로부터 단리된 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 합성 핵산 서열을 제공한다. 단리된 폴리펩티드는 비-K12 에스체리치아 콜리 피타아제이다. 발현시, 피타아제는 피테이트를 대응하는 미오-이노시톨 및 무기 인산염으로 수화시킨다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드를 발현하는 형질변환된 미생물 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 형질변환된 미생물을 사용하여 폴리펩티드 촉매를 제조하는 방법 및 상기 촉매를 이용하여 피테이트를 미오-이노시톨 및 무기 인산염으로 변환하는 방법을 제공한다.

본 발명의 내용 중, 용어 "비-K12 에스체리치아 콜리 피타아제", "비-K12 이 콜리 피타아제", "비-K12 피타아제 " 및 "열내성 피타아제"는 동물 소화 기관내 산 환경 및 프로테아제에 대한 위장관 안정성을 갖는 피타아제로서, 80까지 온도에서 1시간 동안 적어도 17% 활성, 바람직하게는 90까지 온도에서 1시간 동안 33% 활성, 더 바람직하게는 100까지 온도에서 1시간 동안 적어도 26% 활성을 유지하는 열내성 피타아제를 가리키는 것으로 호환가능하게 사용된다.

일 실시예에서, 본 발명은 열내성 피타아제를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 열내성 피타아제를 코딩하는 핵산 분자에 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 미생물 숙주 세포 내에서 발현하는 것을 포함한다.

미생물 숙주 세포는 박테리아 세포(예를 들어 에스체리치아 또는 바실러스), 효모(예를 들어 사카로마이세스, 스키조사카로마이세스, 피치아 또는 클루예로마이세스 락티스) 세포와 같은 원핵 세포이어도 좋다. 바람직한 일 실시예에서, 재조합 열내성 피타아제의 제조에 적용되는 미생물 세포는 재조합 열내성 피타아제의 글리코실화된 형태를 이끌어낸다.

본 발명은 22 아미노산의 신호 펩티드를 포함하는 432 아미노산을 위한 1296 핵산 코딩을 갖는 열내성 피타아제를 코딩하는 핵산 분자를 클로닝 및 시퀀싱하는 방법을 제공한다. 서열 대비(도 4, W-피타아제는 본 발명의 비-K12 피타아제를 가리킨다)는 본 발명이 신규 피타아제 폴리펩티드를 제공함을 보여준다.

열내성 피타아제(제1 폴리뉴클레오티드)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 증폭자, 종결 서열 또는 이들 중 임의의 조합과 같은 1 이상의 조절 서열에 그리고 선택적으로 제1 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 피타아제를 특정 세포 위치, 예를 들어 세포밖의 위치에 향하게 하는 신호 서열을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 프로모터는 구성 프로모터 또는 유도성(조건성) 프로모터일 수 있다.

모체 폴리뉴클레오티드는 박테리아 또는 진균 핵산을 포함하는 임의의 소스로부터 얻어도 좋고, 예를 들어 조합 돌연변이유발(combinatorial mutagenesis), 반복 돌연변이유발(recursive mutagenesis) 및/또는 DNA 셔플링(DNA shuffling) 등 임의의 방법이 선택된 모체 폴리뉴클레오티드로부터 본 발명의 합성 폴리뉴클레오티드를 제조하는데 적용되어도 좋다.

일 실시예에서, 본 발명은 스트린젠트 혼성화 조건 하에서 서열번호 1 또는 서열번호 2와 같은 지시된 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다.

"스트린젠트 혼성화 조건"은 분자 클로닝(Molecular Cloning), 연구실 매뉴얼(A Laboratory Manual), 제2판 (1989), 샘브룩 등(Sambrook et al.), 콜드 스프링 하버 래버러토리 프레스(Cold Spring Harbor Laboratory Press), 콜드 스프링 하버 뉴욕(Cold Spring Harbor, N. Y.)와 같은 종래 참고문헌에 기재된 것과 같은 공지의 것일 수 있다. 예를 들어, 스트린젠트 혼성화 조건은 0.1. 번. SSC, 0.1% SDS, 65 이어도 좋다. 그리고 다른 혼성화 조건의 예는 (1) 고 스트린젠시: 0.1.번. SSPE, 0.1% SDS, 65; (2) 중 스트린젠시: 0.2.번.SSPE, 0.1% SDS, 50; 및 (3) 저 스트린젠시: 1.0.번. SSPE, 0.1% SDS, 50. 동등한 스트린젠시는 대체가능한 버퍼, 염 및 온도를 사용하여 달성되어도 좋음이 분명하다.

따라서, 본 발명의 일 실시예에서, 열내성 피타아제는 대응하는 (관련) 피타아제에 대해 60 이상의 온도에서 활성 유지와 관련된 1 또는 그 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 바람직하게는, 열내성 피타아제는 80에서 1시간 동안 유지되는 적어도 17% 활성, 보다 바람직하게는 90에서 1시간 동안 적어도 33% 활성, 더욱 바람직하게는 100에서 1시간 동안 적어도 26% 활성을 갖는다. 본 발명의 열내성 피타아제의 예는 서열번호 3(도 1 참조)의 아미노산 서열을 갖는 비-K12 에스체리치아 콜리 피타아제이다.

또한 일 실시예에서, 본 발명은 비-K12 에스체리치아 콜리 피타아제의 활성을 갖는 폴리펩티드로서 서열번호 3에 소정의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 용어 "상동성"은 본 발명의 폴리펩티드와 관련하여 사용시, 후보 서열과 대상 서열을 정렬하여 최대의 상동성 퍼센트를 이룬 다음, 대상 서열(예를 들어 서열번호 3)과 동등한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의 퍼센티지로 정의된다. 아미노산 서열 상동성은 니들만 및 원취의 정렬법(J. MoI. Biol. 48:443-453 (1970))과 같은 많은 공지 방법에 의해 또는 상업적으로 입수가능한 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 상동성의 많은 레벨은 연관 폴리펩티드 서열을 동정하는데 유용하다는 점이 잘 알려져 있다. 본 발명에서 고려된 바에 따르면, 유용한 상동성은 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 및 이들 사이의 값을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

또한 본 발명에 따르면 발현 카세트 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 형질전환된 미생물 세포가 제공된다. 본 발명의 벡터는 1 이상의 열내성 피타아제를 포함하는 1 이상의 폴리펩티드를 코딩할 수 있거나 본 발명의 열내성 피타아제를 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하여도 좋고, 형질전환된 미생물 세포는 1 이상의 본 발명의 벡터를 포함하여도 좋다. 본 발명의 형질전환된 세포는 본 발명의 재조합 열내성 피타아제를 제조하는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 합성 제조된 피타아제 뿐만 아니라 본 발명의 형질전환된 미생물 세포로부터 단리된 열내성 피타아제를 제공한다.

또한, 본 발명은 비-K12 에스체리치아 콜리 피타아제 유전자를 포함하는 효모 균주의 발효를 통해 열내성 피타아제의 제조를 제공한다. 피타아제의 생산을 위해 제공되는 발효 공정에 의하면, 단백질의 수율은 2.7 g/L에 달한다. 부분적으로 글리코실화된 것으로 추정되는 피타아제는, SDS-PAGE에서 52 kD의 분자량을 나타낸다(실시예 7). 본 발명의 파타아제를 위한 최적 pH 범위는 pH 2-7.5, 바람직하게는 pH 3-6이다.

또한, 본 발명의 피타아제는 사료 제형 중 상업적 펠렛 밀(pellet mill)에서 마주치는 열 조절 단계에서 견딜 수 있으므로, 본 발명은 예를 들어 열내성 피타아제를 포함하는 고형 알갱이(hard granular) 사료 펠렛과 같은 동물 사료를 만드는 방법을 제공한다. 사료 제조를 위해, 제형화된 피타아제는, 사료 성분인 적어도 전-열처리된 효소 활성의 적어도 60%가 유지되도록 펠렛 밀 내 조정된 혼합 스팀 및 펠렛 다이를 통해 사출된 사료와 혼합되어도 좋다. 따라서 피타아제는 동물 사료 중 비타민, 미네랄, 다른 사료 효소, 농업적 연산품(예: 밀미들링 또는 옥수수 글루텐박)에 추가하여 그 자체로서 또는 이들과 함께 보충제로서 사용되어도 좋다. 또한 본 발명의 피타아제는 매쉬 식이(mash diets), 즉 펠리타이저를 통하지 않은 식이에 첨가되어도 좋다.

미생물 재조합 발현

본 서열의 유전자 및 유전자 산물은 이종의 숙주 세포, 특히 미생물 숙주의 세포 내에서 제조되어도 좋다. 재조합 미생물 숙주 내 발현은 다양한 경로 중간체의 발현을 위해, 예를 들어 숙주 내 이미 존재하는 경로의 조절을 위해 또는 숙주를 사용하여 이전에는 불가능하였던 새로운 산물의 합성을 위해, 유용할 수 있다.

본 유전자 및 핵산 단편의 발현을 위해 바람직한 이종 숙주 세포는 진균 또는 박테리아과 내에 광범위하게 발견되고 넓은 범위의 온도, pH값 및 용제 허용범위에서 성장하는 미생물 숙주이다. 예를 들어, 박테리아, 효모 및 진균 중 어느 것이 본 핵산 단편의 발현을 위한 적합한 숙주일 것으로 생각된다. 세포 공급원료에 관계 없이 전사, 번역 및 단백질 생합성 장치가 동일하므로, 세포 바이오매스를 발생시키는데 사용되는 탄소 공급원료에 관계 없이 기능 유전자가 발현된다. 대규모 미생물 생장 및 기능 유전자 발현은 광합성 또는 화학자가영양 숙주의 경우에 넓은 범위의 단일 또는 복합 탄수화물류, 유기산 및 알코올, 메탄과 같은 포화 탄화수소 또는 이산화탄소를 이용하여도 좋다. 그러나 기능 유전자는 질소, 인, 황, 산소, 탄소 또는 작은 무기 이온을 포함하는 미량 원소의 형태 및 양을 포함하여도 좋은, 특정 생장 조건에 의해 조절되고, 억제되어도(repressed or depressed) 좋다. 더욱이 기능 유전자의 조절은 배지에 첨가되며 일반적으로 영양이나 에너지원으로 고려되지는 않는 특정 조절 분자의 존재 또는 부존재에 의해 달성되어도 좋다.

숙주 균주의 예는 아스퍼질러스(Aspergillus), 트리코데르마(Trichoderma), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia), 캔디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 살로넬라(Salmonella), 바실러스(Bacillus), 아시네토박터(Acinetobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 아그로박테리움(Agrobacterium), 에리스로박터(Erythrobacter), 클로로비움(Chlorobium), 크로마티움(Chromatium), 플라보박테리움(Flavobacterium), 사이토파가(Cytophaga), 로도박터(Rhodobacter), 로도코커스(Rhodococcus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리아(Corynebacteria), 미코박테리움(Mycobacterium), 데이노코커스(Deinococcus), 에스체리치아(Escherichia), 에르위니아(Erwinia), 판토에아(Pantoea), 슈도모나스(Pseudomonas), 스핀고모나스(Sphingomonas), 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로시너스(Methylosinus), 메틸로미크로비움(Methylomicrobium), 메틸로사이스티스(Methylocystis), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 알칼리게네스(Alcaligenes), 시네쵸사이스티스(Synechocystis), 시네쵸코커스(Synechococcus), 아나바에나(Anabaena), 티오바실러스(Thiobacillus), 메타노박테리움(Methanobacterium), 클렙시엘라(Klebsiella), 믹소코커스(Myxococcus) 및 스타필로코커스(Staphylococcus)와 같은 박테리아, 진균 또는 효모를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

다른 실시예에서, 적합한 숙주 균주는 아스퍼질러스(Aspergillus), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia), 캔디다(Candida), 한수엘라(Hansuela), 바실러스(Bacillus), 로도코커스(Rhodococcus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리아(Corynebacteria), 에스체리치아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 메틸로모나스(Methylomonas), 시네쵸사이스티스(Synechocystis) 및 클렙시엘라(Klebsiella)로 이루어진 군에서 선택된다. 또 다른 실시예에서, 적합한 숙주 균주는 바실러스(Bacillus), 로도코커스(Rhodococcus), 에스체리치아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 클렙시엘라(Klebsiella), 및 메틸로모나스(Methylomonas)로 이루어진 군에서 선택된다.

외래 단백질의 고레벨 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 발현 벡터 및 미생물 발현 시스템은 당업자에게 공지이다. 이들 중 임의의 것이 본 발명의 피타아제의 발현을 위한 키메라 유전자 구축에 사용될 수 있다. 그 후 이들 키메라 유전자는 형질변환을 통해 적절한 숙주에 도입되어 효소의 고레벨 발현을 제공한다.

따라서, 예를 들어, 적절한 프로모터의 조절 하에서 본 박테리아 피타아제를 코딩하는 키메라 유전자의 도입은 증가된 피테이트를 인산염 및 미오-이노시톨 변환으로 입증할 것임이 예상된다. 본 유전자를 이종 숙주뿐만 아니라 천연 숙주 세포 내에서 발현시키는 것이 유용할 것으로 생각된다. 천연 숙주로의 본 유전자의 도입은, 존재하는 피타아제 활성에 변화된 레벨을 가져올 것이다.

적합한 숙주 세포의 형질변환을 위해 유용한 벡터 또는 카세트는 당업계에 공지이다. 일반적으로 벡터 또는 카세트는 관련 유전자의 전사 및 번역을 지시하는 서열, 선택가능한 마커, 및 자가복제 또는 염색체 통합을 가능하게 하는 서열을 포함한다. 적합한 벡터는 전사 개시 조절을 포함하는 유전자의 영역 5' 및 전사 종결을 조절하는 DNA 단편의 영역 3'을 포함한다. 그러한 조절 영역은 생산 숙주로서 선택된 특정 종에 고유한 유전자로부터 유도될 필요는 없다는 것을 이해할 수 있을 것이나, 양 조절 영역은 형질전환된 숙주세포에 상동적인 유전자로부터 유도된 것임이 가장 바람직하다.

소망하는 숙주 세포 내에서 해당 ORF의 발현을 유도하는데 유용한 개시 조절 영역 또는 프로모터는 다양하며 당업자에게 자명하다. 사실상 이들 유전자를 유도할 수 있는 어떠한 프로모터라도 본 발명에 적합하며, 바실러스 내 발현에 유용한 amy, apr, npr 프로모터 및 다양한 파지 프로모터 뿐만 아니라 CYCl, HIS3, GALl, GALlO, ADHl, PGK, PHO5, GAPDH, ADCl, TRPl, URA3, LEU2, ENO, TPI (사카로마이세스 내 발현에 유용); AOXl (피치아 내 발현에 유용); 및 lac, ara, tet, trp, IP.sub.L, IP.sub.R, T7, tac, 및 trc (에스체리치아 콜리 내 발현에 유용)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가로 데옥시-자일루로스 포스페이트 신타아제 (deoxy-xylulose phosphate synthase) 또는 메탄올 디히드로게나아제 오페론 프로모터 (Springer et al, FEMS Microbiol Lett 160: 119 124 (1998)), 폴리히드록시알칸산 합성에 유용한 프로모터(Foellner et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 40:284 291 (1993)), 메틸영양세균 내 천연 플라스미드로부터 동정되는 프로모터 (EP 296484), 메탄영양세균으로부터 동정되는 프로모터(PCT/US03/33698), 및 항생물질 내성과 연관된 프로모터[e.g., kanamycin (Springer et al, supra; Ueda et al., Appl. Environ. Microbiol. 57:924 926 (1991)) 또는 테트라사이클린(U.S. Pat. No. 4,824,786)]이 특히 Cl 대사(metabolizers)에 있어서 본 코딩 서열의 발현에 적합하다.

종결 조절 영역 역시 바람직한 숙주에 고유한 다양한 유전자로부터 유래된 것이어도 좋다. 선택적으로, 종결 사이트는 필요하지 않아도 좋으나, 포함되어 있다면 더 바람직하다.

유전 경로를 조종하는 방법은 당업계에 일반적이며 공지이다. 특정 경로에서 선택된 유전자는 다양한 방법에 의해 상향조절(up-regulated) 또는 하향조절(down-regulated)되어도 좋다. 또한, 경쟁 경로(competing pathway)는 유전자 파괴 또는 유사한 기법에 의해 제거되거나 승화되어도 좋다. 키 유전자 경로가 동정되고 시퀀싱되면, 특정 유전자는 경로의 생산물을 증가시키도록 상향조절되어도 좋다. 예를 들어, 타겟 유전자의 추가적 복제가 pBR322와 같은 다중복제 플라스미드로 숙주 세포에 도입되어도 좋다. 혹은, 타겟 유전자가 비-천연 프로모터의 조절 하에 있도록 변형되어도 좋다. 경로가 세포 주기 또는 발효 가동 중 특정 지점에서 작동하는 것이 요구될 때, 조절된 또는 유도성 프로모터가 타겟 유전자의 천연 프로모터를 대체하도록 사용되어도 좋다. 유사하게, 몇몇 경우에 있어서 천연 또는 내인성 프로모터는 유전자 발현을 증가시키도록 변형되어도 좋다. 예를 들어, 내인성 프로모터는 변이, 결실 및/또는 치환에 의해 생체내에서 변형될 수 있다 (Kmiec, 미국특허 제5,565,350호; Zarling 등, PCT/US93/03868 참조). 혹은 에너지 또는 탄소의 경쟁 싱크(competing sinks)로 기능할 수 있는 경로 또는 경쟁 경로에서 소정의 유전자 발현을 감소시키거나 제거하는 것이 필요할 수 있다. 이러한 목적을 위한 하향조절의 방법이 연구된 바 있다. 파괴될 유전자 서열이 공지인 경우, 유전자 하향조절의 가장 유효한 방법은, 전사를 방해하도록 외래 DNA가 구조 유전자에 삽입되는 타겟 유전자 파괴이다. 이는 파괴될 유전자 부분과 높은 수준의 상동성을 갖는 서열이 인접한 삽입 DNA(종종 유전자 마커)를 포함하는 유전 카세트의 생성에 의해 이룰 수 있다. 숙주세포로 카세트를 도입함으로써 세포의 천연 DNA 복제 메커니즘을 통해 외래 DNA가 구조 유전자로 삽입되게 한다 (Hamilton et al., J. Bacteriol. 171 :4617 4622 (1989); Balbas et al., Gene 136:211 213 (1993); Gueldener et al., Nucleic Acids Res. 24:2519 2524 (1996); and Smith et al., Methods MoI. Cell. Biol. 5:270 277(1996)).

타겟 유전자의 서열이 공지인 경우에 있어서 하향조절 방법의 또다른 방법은 안티센스 기법이다. 이를 이루기 위해, 소망하는 유전자 유래의 핵산 단편은 복제되고 RNA의 안티센스 가닥이 전사되도록 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 그런 다음, 이러한 구조는 숙주세포로 도입되고 RNA의 안티센스 가닥이 생성된다. 안티센스 RNA는 목적 단백질을 코딩하는 mRNA의 축적을 방해함으로써 유전자 발현을 저해한다. 특정 유전자의 발현을 감소시키기 위한 안티센스 기법의 사용과 관련된 특정의 고려사항들은 당업자에게 공지이다. 예를 들어, 안티센스 유전자의 발현의 적절한 레벨은 당업자에게 공지인 상이한 조절 요소를 이용하는 상이한 키메라 유전자의 사용을 필요로 할 수 있다.

타겟 유전자 파괴 및 안티센스 기법이 서열이 공지인 경우 하향조절 유전자의 효과적인 수단을 제공하지만, 서열 기반이 아닌, 기타의, 보다 특이적이지 않은 방법이 개발되었다. 예를 들어, 세포는 UV 조사에 노출된 다음, 소망하는 표현형을 위해 스크리닝되어도 좋다. 화학물질에 의한 돌연변이유발 또한 돌연변이를 생성하기 위해 유효하며 일반적으로 사용되는 물질은 HNO. sub.2 및 NH. sub.2OH와 같이 비-복제 DNA에 작용하는 물질, 및 틀 이동 돌연변이(frameshift mutation)를 야기하는 것으로 공지인 아크리딘 염료와 같이 복제 DNA에 작용하는 물질을 포함한다. 방사선 또는 화학물질을 사용하여 돌연변이를 생성하는 특정 방법은 당업계 문헌에 공지이다 (예를 들어, Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass. (이하, "Brock"), or Deshpande, Mukund V, Appl. Biochem. Biotechnol, 36:227 (1992) (이하, "Deshpande").

또 다른 유전자 파괴의 비-특이적 방법은 전위인자 또는 트랜스포존의 사용이다. 트랜스포존은 DNA에 랜덤하게 삽입되나, 삽입이 일어난 부위를 결정하기 위해 서열을 기초로 후에 회수될 수 있는 유전인자이다. 생체내 및 생체외 전위 방법이 둘다 알려져 있다. 두 방법은 트랜스포사제 효소와 함께 전위인자의 사용을 포함한다. 전위인자 또는 트랜스포존이 트랜스포사제의 존재 하에 핵산 단편과 접촉할 때, 전위요소는 핵산 단편에 랜덤하게 삽입한다. 파괴된 유전자가 전위요소의 서열을 기초로 동정될 수 있으므로, 이 기법은 랜덤 돌연변이유발 및 유전자 단리에 유용하다. 생체외 전위(in vitro transposition)를 위한 키트는 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어 The Primer Island Transposition Kit, available from Perkin Elmer Applied Biosystems, Branchburg, NJ., based upon the yeast TyI element; The Genome Priming System, available from New England Biolabs, Beverly, Mass.; based upon the bacterial transposon Tn7; and the EZ::TN Transposon Insertion Systems, available from Epicentre Technologies, Madison, Wis., based upon the Tn5 bacterial transposable element).

피테이트의 인산염 및 미오-이노시톨로의 생체촉매적 전환

미오-이노시톨 헥사키스포스페이트와 적절한 피타아제 효소의 수용 현탁액을 혼합함으로써 피테이트를 포함하는 수용성 반응 혼합물이 제조된다.

피타아제 효소의 특정 활성(U/밀리그램 효소, "U/mg")은 피테이트 기질(소듐 피테이트)의 5.0 mmol/L 용액이 소망하는 인산염 및 미오-이노시톨 산물로 전환하는 비율을 측정함으로써 결정된다. 피타아제 활성의 결정은 컬러 시약으로 몰리브덴산암모늄을 사용하여 피테이트의 가수분해에 의해 방출된 유리 인을 700nm에서 비색 정량하는 것에 기초한다. U는 실험 조건(pH5.0; 온도 37℃; 및 기질 농도, 0.005 mol/L에서 소듐 피테이트) 하에서 분 당 1 μmol 무기 오르토인산염을 방출하는 피타아제의 양이다.

가수분해 반응의 온도는 반응율과 피타아제의 안정성 양자를 최적화하기 위해 선택된다. 반응 온도는 반응 혼합물의 어는점(ca. 0) 이상 내지 65의 범위이어도 좋고 5 내지 45의 반응온도가 바람직하다. 피타아제 용액은 증류수 중 또는 5.0~10.0 사이, 바람직하게는 6.0~8.0 사이의 반응 초기 pH를 유지할 수용성 반응 혼합물 버퍼 중 피타아제를 현탁시키거나, 또는 고정된 피타아제를 유사한 혼합물 중 현탁시키거나, 또는 세포 추출물의 용액, 부분 정제 또는 정제된 피타아제, 또는 유사한 혼합물 중 세포 배양 상청액의 가용 형태를 제조함으로써 제조되어도 좋다. 기질이 첨가된 후 반응이 진행함에 따라, 반응 혼합물의 pH는 생산물의 형성에 기인하여 변화할 수 있다. 반응은 pH 조절 없이 피테이트를 완전히 전환하도록 진행될 수 있고, 또는 소망하는 pH를 유지하도록 반응 과정 중에 적절한 산 또는 염기가 첨가될 수 있다.

실시예

본 발명은 본 발명의 바람직한 예를 나타내는 하기 실시예에서 더욱 구체적으로 기재된다. 상술한 내용 및 하기 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 필수적 특징을 이해할 수 있고, 그 범위 및 본질을 벗어나지 않고 다양한 조건 및 이용을 위해 적절히 변화 및 수정할 수 있다.

일반적 방법

피타아제 활성 분석의 표준적 방법이 상이한 에스체리치아 콜리 세포 균주로부터 열내성 피타아제 스크리닝을 위해 사용된다. 에스체리치아 콜리 세포 균주는 LB 배지에서 37℃에서 16시간 교반하여 성장된다. 세포는 프렌치 프레스(French press)를 사용하여 파쇄한된 다음 설계된 조건 하에서 피타아제 활성 분석을 위해 버퍼 내 현탁된다.

열내성 피타아제 스크리닝을 위한 다른 방법은 데이타베이스의 파타아제 유전자 서열에 따라 설계된 시퀀싱 프라이머를 사용한 유전체 DNA 시퀀싱 기법에 의해 신규 피타아제 유전자를 동정하는 것이다. 본 실시예에서 사용되는 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기법은 당업계에 공지이다. 예를 들어, 조작 및 조건에 대한 적절한 상세사항은 분자 클로닝 핸드북 3에서 찾아볼 수 있다(Joseph Sambrook & David W.Russell, Cold Spring Harbor Laboratory).

박테리아 배양의 유지 및 성장에 적합한 재료 및 방법은 당업계에 공지이다. 하기 실시예에서 사용되기에 적합한 기법은 일반 세균학을 위한 방법 매뉴얼(Manual of Methods for General Bacteriology)(Phillip Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, eds., American Society for Microbiology, Washington, D. C. (1994)) 또는 Brock에 기재된 것에서 찾아볼 수 있다.

본 명세서에서 하기 약어는 하기와 같이 측정, 기법, 특성 또는 화합물의 단위에 해당한다: "sec"는 초를 의미, "min"은 분을 의미, "h"는 시간을 의미, "d" 는 일을 의미, "mL"은 밀리리터를 의미, "L"은 리터를 의미, "mM"은 밀리몰러(millimolar)를 의미 , "M"은 몰(molar)을 의미, "mmol"은 밀리몰을 의미, "rpm"은 분당 회전을 의미, "slpm"은 분당 표준 리터를 의미, "psig"은 평방인치 당 파운드를 의미 및 "wt"은 중량을 의미. "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 의미, "ca"는 대략을 의미, "O.D."는 특정 파장에서 광학 밀도를 의미, "dew"는 건조 세포 중량을 의미, 및 "IU"는 국제 단위(International Units)를 의미.

실시예 1

비- K12 에스체리치아 콜리 피타아제의 클로닝

에스체리치아 콜리(ATCC 9637, ATCC에서 구입)는 LB 배지(LB Nutrient, Beijing Luqiao Technology Co. Ltd.)에서 37℃에서 밤새 교반하여 성장시켰다. 유전체 DNA는 제조사의 상세(Gentra Systems, Minneapolis, Minn.)에 따라 퓨어진 DNA 단리 키트(Puregene DNA Isolation Kit)를 사용하여 얻어졌다. PCR 프라이머(올리고 서열번호: 1-6, 도 3)는 비-K12 에스체리치아 콜리 피타아제의 게놈 서열을 클로닝하기 위해 설계되고 합성되었다(Invitrogen Biotechnology Co., Ltd). PCR 반응은 InsT/Aclone™ PCR 프로덕트 클로닝 키트 (Fermentas Life Sciences)를 사용하여 게놈 서열을 얻기 위해 구동되었다. PCR 반응 혼합물: 0.1 ml의 총 액체 부피에 대해, 0.1 mM dNTP, 0.05 mM 프라이머, 10 ng 유전체 주형 DNA(genomic template DNA), 2 유닛 Taq DNA 폴리메라제, 5 mM MgCl₂, 1OmM 트리스-HCl 버퍼 pH 7.5. 상기 반응물(0.1 ml)은 반응 튜브(0.2 ml)에서 혼합되고 하기 온도 조건에서 PCR에 적용되도록 DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer Thermocycler Type 2400)에 설치되었다: 95℃ 3분간, 그 다음 94℃에서 1분으로 35 사이클, 58℃에서 1분, 그 다음 94℃에서 7분으로 1사이클.

토우(Tow) 올리고머(Invitrogen Biotechnology Co., Ltd에 의해 합성)는 PCR에 의해 얻어진 에스체리치아 콜리 균주 ATCC 9637의 유전체 DNA 유래의 비-K12 피타아제 코딩 서열을 증폭하는데 사용되었다. 5' 프라이머는 성숙 펩티드, MQSEPELKL의 N-말단을 코딩하였고, 리보솜 결합 부위와 제한 부위 Ncol를 포함하였다(올리고 서열번호 7, 도 3). 3' 프라이머는 피타아제 펩티드, IPACSL의 C-말단을 코딩하였고, 정지 코돈 TAA 및 제한 부위 SnaBI를 포함하였다(올리고 서열번호 8, 도 3). 증폭된 산물은 1.4 kb의 DNA 단편으로 1.0% 아가로오스 겔 전기영동으로 동정되었다. 단편은 DNA 겔 정제 시스템(Qiagen Biochemical Co.)을 사용하여 단리되고 정제되었다. 정제된 PCR 산물은 NcoI/SnaBI (Fermentas Life Sciences)에 의해 분해되고 플라스미드 pTrcHis2(Invitrogen Biotechnology Co., Ltd)로 연결(ligate)되어 재조합 플라스미드 pTrcHis2-PhE 를 얻었다(도 5 참조). 얻어진 플라스미드 pTrcHis2-PhE의 시퀀싱은 서열번호 1로 표시되는 서열을 갖고 신호 펩티드에 관한 서열을 배제한 인서트의 정확한 삽입을 보여준다.

결찰 반응물(ligation reaction) 1 마이크로리터를 전기수용성(electrocompetent) 에스체리치아 콜리 MG1655 세포 (ATCC 700926, ATCC로부터 구입) 50 마이크로리터와 혼합하였다. 혼합물은 고전압 펄스에 적용되었다(Bio-Rad electroporation system). 그런 다음 반응물은 0.45 ml SOC 배지(0.5% 효모 추출물, 2.0% 트립톤, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄ 및 20 mM 글루코오스)에서 37℃, 1시간 동안 교반하면서 배양되었다. 그런 다음 배양물을 밤새 생장을 위해 100 mg/ml 암피실린 설페이트를 함유하는 LB 아가 플레이트에 스프레드시켰다. 그런 다음 형질전환된 콜로니(pTrcHis2-PhE/MG1655)를 선택하고 피타아제 유전자 발현을 위해 사용하였다.

실시예 2

에스체리치아 콜리 중 비- K12 에스체리치아 콜리 피타아제(W-PhE)의 발현

실시예 1에서 얻어진 에스체리치아 콜리 형질변환체는 배양 배지(1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride, 50 μg/ml ampicillin)에서 37℃, 20시간 교반하면서 배양되었다. 밤새 배양물을 1/100 부피의 비율로 상기와 동일한 새 배지에 첨가하고, 상기와 동일한 조건에서 배양하였다. 배양물이 OD₅₅₀ 0.5에 도달했을 때, 1 M IPTG가 1 mM의 최종 농도에 첨가되었다. 배양은 추가로 20시간 계속하여 피타아제 유전자 발현을 유도하였다. 원심분리에 의해 세포를 수득하고 증류수로 2회 세정한 다음 HAC-Na 버퍼 (0.1 M, pH 5.8) 중에서 100mg wet cells/ml에 현탁시켰다. 그런 다음 수득된 세포는 초음파 분쇄기(ultrasonic disintegrator, COSMO BIO CO., LTD)를 사용하여 분쇄되었다. 잔해로부터 상청액을 분리하고 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용하였다. 발현된 단백질은 전기영동에 의해 확인되었으며, 그 결과 예상대로 47 kD의 분자량을 갖는 단백질의 존재가 나타났다. 또한, Edman degradation에 의해 하기 실시예 7에 기재된 정제된 단백질의 N-말단 시퀀싱은 서열번호 3으로 표시되는 정확한 아미노산 서열을 나타냈다.

그런 다음 수득된 세포의 피타아제 활성이 분석되었다. 수득된 세포 (50 mg/mL), 소듐 피테이트 (0.3 M) 및 버퍼 (0.1 M HAC-Na, pH 5.8)가 실온에서 혼합되었다. 공지된 HPLC 분석(Chen QC, Li BW (2003) Separation of phytic acid and other related inositol phosphates by high-performance ion chromatography and its applications. J Chromatogr A 1018: 41-52)에서 피테이트 전환이 검출되었다.

실시예 3

에스체리치아 콜리의 발효를 통한 비- K12 에스체리치아 콜리 피타아제 (W-PhE)의 생산

14 L 브라운 바이오스타트 C(Braun Biostat C) 발효기(B. Braun Biotech International Gmbh, Melsungen, Germany)에서 비-K12 에스체리치아 콜리 피타아제의 생산은 글루코오스, 암모니아 및 효모 추출물을 포함하는 미네랄 배지를 사용하였다(OXOID LTD., BASINFSTOKE HAMPSHIRE, ENGLAND).

실시예 1에서 제조된 플라스미드 pTrcHis2-PhE를 포함하는 에스체리치아 콜리 균주 pTrcHis2-PhE/MG1655는 LB 배지에서 생장시켜 접종을 위한 종균 배양을 제조하였다. 500 mL 종균 배양은 OD (λ.=550) >2.0까지 37℃, 300rpm에서 2 L 플라스트 내 성장시켰다. 이는 약 10시간 걸릴 수 있다.

베슬(vessel) 배지는 초기 배치 부피 7.5L로 준비되었고, 증류수 중에 32 g KH₂PO₄, 8.0 g MgSO₄.7H₂O, 8.0 g (NH₄)₂SO₄, 50 g 효모 추출물, 및 10 mL Mazu DF204 거품억제제(BASF Corporation, Mount Olive, NJ.)를 포함한다. 그런 다음 배지로 채워진 발효기를 스팀 살균하였다. 살균 후 369 g 글루코오스 수용액(60% w/w), 160 mL 미량 원소 용액(표 1), 및 100 mg/L 암피실린이 첨가되었다. NH₄OH (40% w/v) 및 20% w/v H₂SO₄가 pH를 6.8로 맞추도록 사용되었다.

미량 원소 용액

미량원소	농도(g/L)	미량원소	농도(g/L)
MnSO₄·5H₂O	0.001	H₃BO₄	0.0005
CoCl₂·6H₂O	0.004	FeSO₄·7H₂O	0.02
Na₂MoO₄·2H₂O	0.002	CaCl₂·2H₂O	0.02
ZnCl₂	0.002	MgSO₄·7H₂O	0.3
CuSO₄·5H₂O	0.001

5%(v/v)의 비율로 상기 제조된 초기 배치 베슬 배지로 채워진 발효기에 종균배양을 첨가하였다. 교반, 공기공급(aeration), pH, 압력, 용존 산소 농도(DO) 및 온도의 조절은 하기 표 2에 기재되었다. 용존 산소 농도는 요구 산소의 변화에 따라 교반 및 공기공급을 조절함으로써 25%의 공기 포화로 조절되었다. 글루코오스 공급은 시간 0에서 <5 g/L로 시작되었고 공급율은 시간 당 약 10-35%로 특정 세포 생장율이 조절되도록 잘 조절되었다. 글루코오스 공급율은 글루코오스가 2 g/L 이상 축적될 때 감소시켰다.

발효의 여러 세팅

교반	200 rpm	압력	1 atm
공기공급	0.4 L/분	용존 산소 농도(DO)	85-90%
pH	6.8	온도	37℃

발효기 내 배양 밀도가 20-30의 OD.(λ=550)에 도달한 때, 암피실린의 추가 분취량을 100 mg/L의 최종 농도에 첨가하였다. 배양 밀도가 30-35의 OD.(λ=550)에 도달한 때, IPTG를 1 mM로 첨가하였다.

IPTG 첨가하고 약 5시간 후, 브로스를 5-10℃로 냉각하고 분비시켰다. 25000 g, 10℃, 10 분에서 원심분리하여 세포를 수득하였다. 490g의 웨트 세포가 수득되었다.

그런 다음 수득된 세포를 초음파 분쇄기(COSMO BIO CO., LTD)를 사용하여 분쇄하였다. 잔해로부터 상청액을 분리하고 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 적용하였다. 전기영동은 예상대로 47 kD 의 분자량을 갖는 단백질의 존재를 나타냈다.

실시예 4

효모 발현 시스템을 위한 코돈 최적화

비-K12 피타아제 아미노산 서열(도 2 참조, 서열번호 3)는 효모 시스템에서 바람직한 코돈(NCBI 데이타베이스)을 사용하여 다시 번역되었다. 낮은 사용율 (<10%)을 갖는 코돈은 보다 높은 빈도로 사용되는 코돈으로 대체되었다. 설계된 코딩 서열은 도 2에 나타내었고(서열번호 2), 인비트로젠 바이오테크날러지사(Invitrogen Biotechnology Co.)에 의해 합성되었다.

실시예 5

효모의 피타아제 유전자 발현 균주의 제조

피치아 파스토리스의 피타아제 유전자 발현 균주(S- Ph / Pp )의 제조

올리고 서열번호 9 및 10(도 3)의 합성 프라이머를 사용하여 실시예 4에서 제조된 합성 서열의 5' 및 3' 말단에, 두개의 제한 부위, EcoRI 및 Notl가 각각 부가되었다. 얻어진 서열은 EcoRI 및 Notl 효소로 분해된 다음 pPIC9K (Invitrogen Biotechnology Co., Ltd)에 연결되었다. 얻어진 플라스미드는 DNA 증폭을 위해 에스체리치아 콜리 균주(에스체리치아 콜리 균주 MG1655, ATCC 700926, ATCC로부터 구입)로 형질전환되었다. 형질전환된 에스체리치아 콜리 세포 콜로니는 50 mg/L 암피실린을 포함하는 LB 배지에서 밤새 배양함으로써 선택되었다. 재조합 플라스미드 DNA는 미니 스핀 DNA 제조 키트(Qiagen Biochemical Co.)를 사용하여 세포 배양물로부터 얻어졌다. 시퀀싱은 정확한 삽입을 나타냈다.

상기 얻어진 재조합 플라스미드(pPIC9K-PhE, 도 5)는 BgIII에 의해 분해되고 전기천공법을 통해 피치아 파스토리스 균주 SMDl 168 (Invitrogen Biotechnology Co., Ltd)로 형질전환되었다. 피타아제 유전자 발현 카세트의 다중 복제 인서트(multiple-copy inserts)를 갖는 형질전환체(S-Ph/Pp)는 공지된 것처럼 G418 내성 선택(G418 resistant selection)을 통해 스크리닝되었다(Scorer, C.A., Clare, JJ., McCombie, W.R., Romanos, M.A. and Sreekrishna, K. (1994) Rapid selection using G418 of high copy number transformants of Pichia pastoris for high-level foreign gene expression. Biotechnology 12, 181-184).

피치아 메타놀리카( Pichia methanolica )의 피타아제 유전자 발현 균주(S-Ph/Pm)의 제조

균주는 상기와 실질적으로 동일한 방법으로 제조되었다. 두개의 제한 부위, Pstl 및 Notl는 올리고 서열번호 11 및 12(도 3)의 합성 프라이머를 사용하여 실시예 4에서 제조된 합성 서열의 5' 및 3' 말단에 각각 부가되었다. 얻어진 서열은 Pstl 및 Notl 효소로 분해된 다음, 플라스미드 pMETalphaA (Novagen, Inc.)에 연결되었다. 얻어진 플라스미드는 에스체리치아 콜리 균주 MGl655에서 증폭되고 상술한 것처럼 회수되었다. 시퀀싱은 정확한 삽입을 나타낸다.

상기 제조된 재조합 프라스미드(pMET-PhE, 도 5)는 Ascl에 의해 분해되고 전기천공법을 통해 피치아 메타놀리카 PMD 16 (Novagen, Inc.)내로 형질전환되었다.형질전환체(S-Ph/Pm)는 상술한 것처럼 선택되었다.

클루예로마이세스 락티스( Kluyeromyces lactis )의 피타아제 유전자 발현 균주(S- Ph / Kill )의 제조

균주는 상기와 실질적으로 동일한 방법으로 제조되었다. 두개의 제한 부위, BgIII 및 Stul는 올리고 서열번호 13 및 14(도 3)의 합성 프라이머를 사용하여 실시예 4에서 제조된 합성 서열의 5' 및 3' 말단에 각각 부가되었다. 얻어진 서열은 BgIII 및 Stul 효소로 분해된 다음, 플라스미드 pKLACl(New England Biolabs, Inc.)에 연결되었다. 얻어진 플라스미드는 에스체리치아 콜리 균주 MGl655에서 증폭되고 상술한 것처럼 회수되었다. 시퀀싱은 정확한 삽입을 나타낸다.

상기 제조된 재조합 프라스미드(pKLAC-PhE, 도 5)는 SacII에 의해 분해되고 전기천공법을 통해 클루예로마이세스 락티스 GG799 (New England Biolabs, Inc.)내로 형질전환되었다. 형질전환체(S-Ph/Kill)는 상술한 것처럼 선택되었다.

실시예 6

피치아 파스토리스 균주의 발효 (S- Ph / Pp )

본 실시예는 본 발명의 형질전환된 피치아 파스토리스(S-Ph/Pp)의 5리터 발효기(Gaoji biotech Co. Ltd., Shanghai, China) 내에서의 고밀도 발효 공정을 나타낸다. 발효 공정은 3개의 주요 단계를 포함한다.

단계 I(세포 생장 단계)에서, YPD 배지 (글루코오스 2%, 펩톤 l%, 효모 추출물 0.5%, OD₅₅₀ 0.3-0.4까지 30℃에서 성장, 약 20시간) 중의 피치아 파스토리스의 배양물 200 mL을, 28% NH₃·H₂O를 사용하여 접종 전에 pH 5.0으로 조정된 베이슬 솔트(Basal salts) 배지 (2000ml) (인산 26.7 ml/L, 황산칼슘 0.93 g/L, 황산칼륨 18.2 g/L, 황산마그네슘 l4.9 g/L, 수산화칼륨 4.13 g/L, 글루코오스 40 g/L)에 접종했다(5 v/v%). PTMl (황산구리 24 mM, 요오드화나트륨 0.534 mM, 황산망간 17.8 mM, 몰리브덴산나트륨 0.827 mM, 붕산 0.323 mM, 염화코발트 2.1 mM, 염화아연 0.147 mM, 황산제일철 0.234 mM, 비오틴 1.64 mM, 황산 0.188 M)이 4.37 mL/L 배지의 부피 비율로 상기 배지에 첨가되었다. 배양은 교반 및 공기공급과 함께 약 18-24시간 실시되었다. 용존 산소는 세포의 생장에 기인하여 100% 미만으로 감소하였고 탄소원이 고갈되었을때 80% 초과로 증가하였다. 이때 세포 밀도는 90~110g/L(웨트 중량)에 도달했다.

단계 II(탄소 공급 단계)에서, 25% (w/v) 글루코오스 용액 및 증류수 중 12 mL/L PTMl이 28 mL /h의 속도로 4시간에 걸쳐 첨가되었다. 용존 산소는 공기공급을 조정함으로써 20% 초과하도록 유지되었다. 이 단계의 종료시 세포 밀도는 180~220g/L (wet weight)에 도달했다.

마지막으로, 단계 III(유도 단계)에서, 메탄올 중 12mL/L PTMl이 20~40ml/h의 속도로 첨가되었다. 메탄올의 농도는 0.3% (v/v)이하로 유지되었고 용존 산소는 20% 초과로 유지되었다. 유도 단계 중 효소 활성 분석 및 SDS-PAGE(도 9 참조)를 위해 배양물 샘플은 ~10시간마다 수집되었다.

세포 밀도는 194 시간에 약 150의 OD₆₀₀에 도달하였고, 피타아제 활성은 209 시간에 4,770 U/mL에 도달하였다(도 8 참조).

배양물 샘플은 25,000 g에서 10분간 원심분리되었다. 얻어진 상청액은 SDS-PAGE로 구동하고 단백질 농도를 분석하였다. 단백질 농도는 공지된 폴린 페놀(Folin-phenol) 방법(Lowry O H e/ al. PROTEIN MEASUREMENT WITH THE FOLIN PHENOL REAGENT. J Biol Chem. 1951,193(l):265-75)에 의해 측정되었다. 약 198 시간에서 최종 샘플의 단백질 농도는 2.7 g/L에 도달하였다. 종료 지점과 방출 시간(discharge time)은 당업계에 공지이고 상용인 것처럼 생장 및 생산율을 모니터링함으로써 결정되었다.

도 9에 나타낸 것처럼, 피타아제 활성 분석(실시예 7 참조)을 통해 SDS-PAGE(12% 겔)상 가장 풍부한 밴드가 배양물에 분비된 발현된 피타아제임이 확인되었다. 발현된 피타아제의 농도는 발효의 진행과 함께 증가했다. 단백질은 약 52 kDa의 분자량을 가졌다.

실시예 7

발현된 피타아제의 정제

하기 모든 조작은 4℃에서 수행되었다. 비-K12 피타아제가 피치아 파스토리스에서 발현되었다(실시예 6). 그런 다음 배양물은 25,000 g에서 10분간 원심분리되었다. 상청액은 75% 포화 황산암모늄과 교반 하에 2시간 동안 혼합하였고, 혼합물은 25,000 g에서 15분간 원심분리되었다. 그런 다음 펠렛을 20 ml 20 mM 아세트산염 버퍼 pH 5.0 에 재현탁시키고, 동일 버퍼에 대해 밤새 투석시켰다.

투석액은 20 mM 아세트산염 버퍼 pH 5.0 로 평형화된 CM-세파덱스 C-50 컬럼 (Pharmacia)에 로딩하였다. 컬럼을 동일 버퍼로 세척하여 비결합된 화합물을 제거한 다음, 결합된 피타아제를 출발 버퍼(pH 5.0 2OmM HAC-NaAC 버퍼) 내 0-500 mM NaCl의 선형 기울기로 용리시켰다.

가장 높은 피타아제 활성을 나타내는 분획(하기 참조)은 풀(pooled)되었고 탈이온수에 대해 밤새 투석되었다. 투석액은 하기 실험에 사용되었다.

정제된 단백질의 시퀀싱은 서열번호 3으로 표시된 것처럼 정확한 아미노산 서열을 나타냈다.

실시예 8

비- K12 피타아제 활성의 특징

피타아제 활성의 결정

피타아제의 단백질 농도는 공지된 방법으로 측정되었다(Lowry O H et al. PROTEIN MEASUREMENT WITH THE FOLIN PHENOL REAGENT. J Biol Chem. 1951,193(l):265-75).

피타아제 활성의 결정은 몰리브덴산 암모늄을 착색제로 사용하여 피테이트의 가수분해에 의해 유리된 자유 인의 700nm에서의 비색 정량법에 기초한다.

피타아제 활성의 결정은 컬러 시약으로 몰리브덴산암모늄을 사용하여 피테이트의 가수분해에 의해 방출된 유리 인을 700nm에서 비색정량하는 것에 기초한다. 1 U는 표준 분석 조건(pH5.0; 온도 37℃; 및 기질 농도, 0.005 mol/L에서 소듐 피테이트; GB/T 18634-2002, 및 Study On The Determination Condition Of Phytase Activity By Molybdenum Yellow And Molybdenum Blue Method, Zou DaQiong. CHINAFEED, 2005 (03) 참조) 하에서 분 당 1 μmol 무기 오르토인산염을 방출하는 효소의 양이다.

특정 효소 활성은 하기 식에 의해 계산되었다:

Uc=LVC

Uc 피타아제 특정 활성, U/mg;

U 피타아제 활성, U/ml;

C 피타아제의 단백질 농도, mg/ml

상기 정제된 실시예 6에서 얻어진 피타아제의 특정 활성은 3146 U/mg으로 측정되었다.

최적 pH 및 온도

피타아제 활성은 표준 분석 조건(상기 참조) 하에서 0.05 mol/L 아세트산나트륨/아세트산 버퍼 중 pH 3.0-6.0 및 0.04 mol/L 바르비탈산나트륨-HCl 버퍼 중 pH 6.0-9.0를 사용하여 서로 다른 pH에서 측정되었다. 피타아제 활성은 표준 분석 조건(상기 참조) 하에서 서로 다른 온도에서 측정되었다. 측정은 실시예 7의 정제된 피타아제로 수행되었다. 결과는 도 6 및 7에 나타내었다.

정제된 피타아제의 최적 pH는 3 내지 6이었다 (도 6 참조). 정제된 피타아제의 최적 온도는 약 55℃이었다 (도 7 참조).

발현된 피타아제에 있어서 pH 및 온도의 영향

실시예 7에서 정제된 비-K12 피타아제는 다양한 pH 값(pH 3.0-6.0, 0.05 mol/L HAC/NaAC 버퍼 및 pH6.0~9.0, 0.04mol/L Barbital Sodium-HCl 버퍼)으로 최종 농도 1.5 mg/ml로 버퍼 중 희석되었고, 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 피타아제는 pH 5.0에서 0.05mol/L HAC-NaAC 버퍼 중 희석되고 서로 다른 온도에서 1시간 동안 배양되었다. 피타아제 활성은 표준 분석 조건(상기 참조) 하에서 측정되었다. 결과는 도 12 및 13에 나타내었다.

도 12에 나타내었듯이, 본 발명의 비-K12 피타아제는 2-5.5의 낮은 pH에 대해 안정하였다(도 12 참조). 본 발명의 비-K12 피타아제의 열 안정성은 도 13에 나타내었고, 80℃까지의 온도에서 1시간 후 적어도 17% 활성이 유지되었고, 90℃까지의 온도에서 1시간 후 적어도 33% 활성, 그리고 100℃까지의 온도에서 1시간 후 적어도 26% 활성이 유지되었다(도 13 참조).

펩신 및 췌장 프로테아제에 대한 피타아제 내성

실시예 7에서 정제된 본 발명의 비-K12 피타아제는 각각 펩신(300 U/ml, pH2.5, 37℃, 2시간) 및 췌장 프로테아제(30 U/ml, pH7.0, 37℃, 2시간)와 함께 배양되었다. 각 처리에서, 정제된 비-K12 피타아제의 적어도 91% 활성이 유지되었다(도 10 참조). 대조군(100% 활성)은 프로테아제 처리 없이 별도 배양되었다.

발현된 피타아제의 크기

SDS-PAGE (12% 겔)은 피치아 파스토리스에서 발현된 피타아제(실시예 6)이 약 52 kDa의 분자량을 나타낸다는 것을 보여준다. 피치아 파스토리스에서 발현된 피타아제는 SDS-PAGE상 흐릿한 밴드로 나타낸 것처럼 부분적으로 글리코실화된 것으로 보인다(도 11 참조).

건조 피타아제 제형에 있어서 온도의 영향

실시예 7에서 정제된 비-K12 피타아제는 제형화되고(25% 전분, 12.5% 덱스트린, 5% 염화나트륨, 5% 소르빈산칼륨, 1.5% 아황산칼슘 (w/w)), 스프레이 건조되었다. 건조된 피타아제 제형은 서로 다른 온도에서 1시간 동안 배양되었다. 피타아제 활성은 표준 분석 조건(상기 참조) 하에서 측정되었다.

제형화된 동결건조된(lyophilized) 피타아제의 열 안정성은 도 14에 나타내었고 100℃로 높은 온도에서도 1시간 후 70% 활성이 유지되었다.

실시예 9

에스체리치아 콜리 K12 피타아제 및 아스퍼질러스 나이거 유래 진균 피타아제와 비- K12 피타아제의 비교

아스퍼질러스 나이거 유래 진균 피타아제(Robert F. M. Van Gorcom et al. Cloning and expression of phytase from aspergillus. 미국특허 제5436156호) 및 에스체리치아 콜리 K12 피타아제 (Jay M. Short et al. Recombinant bacterial phytases and uses thereof. 미국특허 제6855365호)를 상기(실시예 8 발현된 피타아제에 있어서 pH 및 온도의 영향)에서와 같은 다양한 pH값 및 온도 하에서 그 안정성에 대해 실험하였다. 얻어진 결과를 실시예 6에서 제조되고 실시예 7과 같이 정제된 본 발명의 비-K12 피타아제로 얻어진 결과와 비교하였다. 비교결과는 도 15 및 16에 나타내었다. 나타낸 것처럼, 본 발명의 비-K12 피타아제는 유의적으로 열에 더욱 안정하고(도 15 참조) 또한 산 환경에 더욱 내성이 있었다(도 16 참조).

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 3(SEQ ID NO: 3)으로 표시되는 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 핵산 분자.
제1항에 있어서,
a) 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 67-1296로 이루어진 뉴클레오티드 서열;
b) 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 1-1230으로 이루어진 뉴클레오티드 서열; 및
c) 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 핵산 분자.
제1항에 기재된 단리된 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제3항에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
제4항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pTrcHis2를 나타내는 pTrcHis2-PhE, 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pPIC9K를 나타내는 pPIC9K-PhE, 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pMETalphaA를 나타내는 pMET-PhE 및 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pKLAC를 나타내는 pKLAC-PhE로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제1항에 기재된 단리된 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 세포.
제6항에 있어서, 상기 단리된 핵산 분자는 발현 벡터에 포함되는 것을 특징으로 하는 세포.
제6항에 있어서, 상기 세포는 효모 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
제6항에 있어서, 상기 세포는 에스체리치아 콜리(Escherichia coli .), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica) 및 클루예로마이세스 락티스(Kluyeromyces lactis)로 이루어진 군에서 선택되는 종의 것임을 특징으로 하는 세포.
제6항에 있어서, 상기 세포는 에스체리치아 콜리 MG1655, 피치아 파스토리스 GS115, 피치아 메타놀리카 PMAD16 및 클루예로마이세스 락티스 GG799로 이루어진 군에서 선택되는 균주로부터 유래한 것임을 특징으로 하는 세포.
제6항에 있어서, 상기 세포는 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pTrcHis2를 나타내는 pTrcHis2-PhE로 형질변환된 에스체리치아 콜리 MGl655, 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pPIC9K를 나타내는 pPIC9K-PhE로 형질변환된 피치아 파스토리스 SMD1168, 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pMETalphaA를 나타내는 pMET-PhE로 형질변환된 피치아 메타놀리카 PMD16 및 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pKLAC를 나타내는 pKLAC-PhE로 형질변환된 클루예로마이세스 락티스 GG799로 이루어진 군에서 선택되는 균주인 것을 특징으로 하는 세포.
서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.
발현에 효과적인 조건 하에서 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 배양하여 피타아제의 활성을 갖는 폴리펩티드를 얻는 단계를 포함하는 발효에 의한 피타아제의 생산 방법.
제13항에 있어서, 상기 세포는 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pTrcHis2를 나타내는 pTrcHis2-PhE로 형질변환된 에스체리치아 콜리 MGl655, 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pPIC9K를 나타내는 pPIC9K-PhE로 형질변환된 피치아 파스토리스 SMD1168, 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pMETalphaA를 나타내는 pMET-PhE로 형질변환된 피치아 메타놀리카 PMD16 및 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 pKLAC를 나타내는 pKLAC-PhE로 형질변환된 클루예로마이세스 락티스 GG799로 이루어진 군에서 선택되는 균주인 것을 특징으로 하는 생산 방법.