CN105802936B - 一种耐高温中性植酸酶的制备方法和耐高温中性植酸酶及其应用 - Google Patents

一种耐高温中性植酸酶的制备方法和耐高温中性植酸酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐高温中性植酸酶的制备方法，包括以下步骤：将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的耐高温中性植酸酶基因克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)中；然后毕赤酵母活化，得到毕赤酵母单菌落；再将活化的毕赤酵母单菌落接入摇瓶中进行培养；接着将摇瓶培养的菌液移至种子罐中进行培养；再将种子罐培养的菌液移至发酵罐中进行发酵培养；最后将得到的发酵液离心过滤，加入稳定剂依次进行吸附、干燥，即得到所述的中性植酸酶。本发明制备的耐高温中性植酸酶能耐高温，并且可在pH为中性的肠道中起作用，提高了植酸酶在动物的胃肠道的效用，拓宽了植酸酶的应用范围。

Description

一种耐高温中性植酸酶的制备方法和耐高温中性植酸酶及其 应用
技术领域
本发明属于微生物领域，尤其涉及一种利用毕赤酵母菌生产耐高温中性植酸酶的方法和该耐高温中性植酸酶及其应用。
背景技术
植酸酶是催化植酸及植酸盐水解产生肌醇和磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称。植酸酶广泛地分布于植物、动物、微生物中。其中微生物来源的植酸酶是近来研究的热点，尤其是枯草芽孢杆菌来源的植酸酶。
谷物、豆类和油料等籽实作物中，磷的基本贮存形式是植酸磷，其含量高达1％-5％，占植物总磷的60％-80％。但猪、禽等单胃动物，由于体内缺乏能分解消化植酸磷的酶，植物性饲料中的植酸磷不能很好地被分解利用，为满足动物生长需要必须在饲料中添加大量磷酸二氢钙来补充磷和钙，这样，不但增加了饲料成本，且大量的磷随粪便排出，造成环境污染。
最适pH是各种酶的基本属性之一。根据最适pH，植酸酶可分为酸性植酸酶、碱性(或中性偏碱)植酸酶。目前我国市场上销售的大部分植酸酶均为酸性植酸酶，酸性植酸酶最适pH适应于畜禽胃肠酸性环境，能显著降低猪和家禽粪便的磷水平。研究表明，在猪、禽日粮中添加植酸酶，可使饲料中磷的利用率提高40％-60％，粪便中磷排出量减少30％-50％，因此，植酸酶已成为饲料添加剂研究的热点。而大多数鱼类胃肠呈中性偏碱，酸性植酸酶不能很好的在水产动物体内发挥作用。根据水产动物消化生理特性和水产养殖环境等因素，中性或碱性植酸酶则更为有效，近几年在水产业上受到重视。此外饲料制粒过程中，需要通入饱和蒸汽对饲料进行调质过程，一般调质后饲料温度在80-90℃，时间为30-45秒，而水产饲料由于投料环境特殊，对制粒要求更高，调质温度须达到90-140℃，因此对植酸酶有更高的热稳定性要求。因此，亟需开发出新的方法制备的中性植酸酶以满足水产养殖的需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种中性植酸酶的制备方法和该耐高温中性植酸酶及其应用。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种耐高温中性植酸酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的耐高温中性植酸酶基因克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)中；
(2)将步骤(1)后的毕赤酵母接种于培养基上，倒置于恒温培养箱中培养，得到活化的毕赤酵母单菌落；
(3)将活化的毕赤酵母单菌落接入摇瓶中进行培养；
(4)将摇瓶培养的菌液移至种子罐中进行培养；
(5)将种子罐培养的菌液移至发酵罐中进行发酵培养；
(6)将步骤(5)得到的发酵液离心过滤得到离心酶液，再在离心酶液中加入稳定剂依次进行吸附、干燥，即得到所述的中性植酸酶。
上述的制备方法，优选的，所述摇瓶培养为恒温培养，温度为30℃±0.2℃，培养的时间为30-36小时，摇瓶的转速为180-220r/min。
上述的制备方法，优选的，所述种子罐培养分为一级种子罐培养和二级种子罐培养；所述一级种子罐培养过程是指将摇瓶中培养的菌液移至一级种子罐中培养，其接种量为1-1.2％，搅拌速度为150-200rpm；一级种子罐培养为恒温培养，培养温度为30℃±0.2℃，通气比为1:1-1.2vvm，培养时间为20-24小时。
上述的制备方法，优选的，所述二级种子罐培养是指将一级种子罐培养的菌液以10-12％的接种量移种到二级种子罐中扩大培养，二级种子罐培养为恒温培养，培养温度为30℃±0.2℃，整个过程中用浓度为25％的氨水控制菌液的pH值为5.0±0.2，通气比为1:1-1.2vvm，培养时间为20-24小时。
上述的制备方法，优选的，整个发酵培养的时间为160-180小时；其中发酵过程中的前100个小时中pH为5.0±0.2；发酵时间达到100小时后，将pH值按每2小时上调0.2的速度进行调节，直至pH为6.0±0.2。
上述的制备方法，优选的，所述发酵培养过程中发酵罐中的菌液的搅拌速度为120-200rpm，同时向发酵罐内不断通入无菌空气，通气比为1:(1.2-2.0)vvm，保持发酵罐压为0.05±0.01MPa。
上述的制备方法，优选的，所述稳定剂主要由羧甲基纤维素钠和海藻糖组成，其中所述羧甲基纤维素钠的质量与离心酶液的体积比值为0.3％-0.4％，所述海藻糖的质量与离心酶液的体积比值为0.08％-0.1％，比值单位为Kg/L。虽然中性植酸酶基因来源于枯草芽孢杆菌，本身具有相当的耐热水平，仍然不能很好的满足水产饲料制粒要求；中性植酸酶的活性功能取决于其自身的分子结构的完整和严格的构象，当温度变化时酶的空间结构被破坏而丧失其生物活性；在酶制剂产品中加入羧甲基纤维素钠和海藻糖，可以发挥热稳定和热激活作用，保护中性植酸酶蛋白活性中心，可进一步提高中性植酸酶的耐热性能。
上述的制备方法，优选的，所述步骤(2)中采用的培养基为YPD斜面培养基，培养的温度为30℃±0.2℃，培养的时间为65-72小时。
作为一个总的发明构思，本发明还提供一种耐高温中性植酸酶，由上述的制备方法制备获得的。
作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的耐高温中性植酸酶在水产动物饲料中的应用。
本发明的制备方法过程主要是采用重组毕赤酵母发酵方法，包括三个阶段：甘油培养阶段、饥饿阶段和外源基因诱导表达阶段，其中甘油培养阶段，菌体利用甘油能快速生长，实现菌体高密度培养，缩短发酵时间，当菌体湿重达到150-170g/L左右，甘油消耗完毕，溶氧快速上升，因残留的碳源或者代谢中间产物乙醇会阻碍甲醇利用，影响中性植酸酶基因的诱导表达，维持饥饿状态15-30分钟，以保证阻碍甲醇利用的物质被充分消耗完毕。观测溶氧值上升至接近100％，pH值有上升的趋势时，开始补加含12ml/L PTM1(见表1)的100％甲醇进行诱导，通常甲醇营养型毕赤酵母生长pH范围为2.0～7.5，最适生长pH为4.8-5.2，但外源蛋白表达最佳pH要视蛋白而定，因为pH对蛋白酶的稳定性有作用。因此在发酵罐发酵时，发酵100小时前控制pH为5.0±0.2，适合菌体生长，诱导；当发酵100小时后，菌体已经逐步适用甲醇环境，生长速度基本稳定，将pH逐步上调至6.0±0.2，有利于酶的积累；发酵罐放罐后，将发酵液离心，收集离心清液，加入羧甲基纤维素钠和海藻糖作为稳定剂，可以进一步提高产品的耐温性。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明采用克隆自枯草芽孢杆菌的耐高温中性植酸酶基因，以毕赤酵母菌为生产菌种，通过液体深层发酵法生产耐高温中性植酸酶，发酵过程中通过对pH进行控制，前期使酵母得到最适的生长环境，后期又使外援蛋白酶得到最佳表达；在后处理中，添加羧甲基纤维素钠和海藻糖，进一步增加了酶的耐热性。
(2)本发明的生产工艺易于控制，生产周期短，产品质量稳定，且适宜于工业化生产，自动化程度高。
(3)本发明制备的耐高温中性植酸酶基因在70℃保温10min后酶活保存85％以上，85℃保温10min酶活保存80％以上，100℃保温10min酶活保存70％以上。
(4)本发明制备的耐高温中性植酸酶可在pH为中性的肠道中起作用，提高了植酸酶在动物的胃肠道的效用，从而弥补了酸性植酸酶性质上的不足，拓宽了植酸酶的应用范围。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于一下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下述实施例中所使用的培养基和原料的配方，见表1。
表1培养基和原料的配方
实施例1：
一种本发明的中性植酸酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)基因植入：将来源于枯草芽孢杆菌的耐高温中性植酸酶基因克隆至毕赤酵母中制备毕赤酵母菌体悬浮液，该过程为常规工艺过程；
(2)菌种冷冻保藏：将重组的毕赤酵母摇瓶发酵菌体用无菌方法制作悬浮液，经冷冻干燥处理，将冷冻后菌体装于充氮的密封安瓿瓶中，保藏于-80℃低温冰箱中保存；
(3)冷冻后的菌种的复壮及活化：将菌种按照无菌操作方法打开，溶于无菌生理盐水中，画线接种于YPD斜面培养基上，在30℃培养箱倒置培养70小时，直至长出单菌落；
(4)摇瓶培养：用灭菌的接种环挑取丰满的单菌落接摇瓶(500mL摇瓶装100mLYPD培养基)进行培养，转速220r/min、30℃恒温摇床培养31h，湿重60g/L；
(5)一级300L种子罐(YPD培养基150L，121℃灭菌30min)培养：将摇瓶中培养的菌液移至种子罐，接种量为1％，搅拌速度200rpm，恒温30℃，通气比1:1vvm，培养24小时，湿重80g/L；
(6)二级3000L种子罐(BSM培养基1500L)培养：将一级种子罐培养的菌液移种至二级种子罐，接种量为10％，搅拌速度180rpm，恒温30℃，通气比1:1vvm，培养20小时，湿重100g/L，整个二级种子罐培养过程用浓度为25％的氨水控制菌液的pH为5.0；
(7)30吨发酵罐(BSM培养基15吨，121℃灭菌30min)培养：将二级种子罐培养的菌液移至发酵罐中，接种量10％，发酵温度30℃，发酵前100小时，用浓度为25％的氨水控制菌液的pH5.0，发酵100小时后，pH值每2小时上调0.2，直至pH为6.0，发酵初期发酵罐中菌液的转速为120rpm，通气比1:1.2vvm，罐压0.05MPa，随着菌体增多，溶氧逐渐下降，逐步增加转速和通气，最大转速至180rpm，通气比达到1:2.0vvm，维持溶氧在30％以上；当培养基甘油消耗完毕后，溶氧快速上升，加入50％甘油补料液，直至湿重达172g/L停止补料，维持15-30分钟不补加任何碳源，当溶氧值上升至接近100％，pH值有上升的趋势时，开始补加甲醇溶液；整个发酵时间为180小时，最终获得的发酵液湿重为403g/L，植酸酶活力8120U/mL；
(8)发酵液预处理：将发酵罐培养后的发酵液经离心过滤，除去菌体，收集离心酶液；
(9)稳定剂添加：按照离心酶液体积，添加羧甲基纤维素钠和海藻糖(羧甲基纤维素钠的添加质量(Kg)与离心酶液的体积(L)比值为0.3％，海藻糖的添加质量(Kg)与离心酶液的体积(L)比值为0.1％)，充分搅拌均匀；
(10)干燥：用淀粉和玉米芯(质量比为1:2)载体适量吸附添加了稳定剂的离心酶液，于鼓风干燥箱中干燥，干燥温度为50℃，干燥时间约26小时，得到中性植酸酶产品，含水量为8.9％，酶活性为5059u/g。
测试本实施例制备的中性植酸酶耐热稳定性：称取中性植酸酶0.5克，按照国标测定方法，稀释10000倍后，分别取1.2mL待测样液装1.5mL离心管，将其放在浮板上，分别放入70℃、85℃、100℃温度水浴锅，立刻计时10分钟，热处理完毕立刻取出放入自来水中冷却备用，结果如表2所示。
表2中性植酸酶耐热稳定性
酶活u/g 保留率
对照 5059 /
70℃、10分钟 4386.1 86.7％
85℃、10分钟 4148.38 82％
100℃、10分钟 3743.66 74％
按照水产饲料中添加水平，每吨饲料中添加中性植酸酶400g，添加5059u/g中性植酸酶到饲料中后，测制粒后残存酶活结果，如表3所示。
表3中性植酸酶在不同制粒温度下的保留率
将本实施例制备的植酸酶按照400g/t添加到沉水饲料(粗蛋白28％，粗脂肪4.5％，制粒温度95～105℃)中，对某实验水产养殖场的草鱼进行实验，草鱼初始体重～25g，实验数据如表4所示。
表4耐高温中性植酸酶对草鱼生长、饲料效率及肥满度的影响
处理 对照组1 对照组2 对照组3 实验组
增重率％ 336.8<sup>b</sup> 283.5<sup>a</sup> 311<sup>a</sup> 341.7<sup>b</sup>
饲料系数 1.52<sup>a</sup> 1.73<sup>b</sup> 1.71<sup>b</sup> 1.46<sup>a</sup>
肥满度 1.82<sup>a</sup> 2.01<sup>b</sup> 1.99<sup>b</sup> 1.87<sup>a</sup>
注：1、饲料系数是指饲喂多少斤饲料长多少斤鱼；
2、字母a、b表示差异显著性，相同字母为差异不显著，不同字母为差异显著；
3、对照组1是指磷酸二氢钙不变，不加植酸酶饲料；
对照组2是减少磷酸二氢钙8kg，不加植酸酶饲料；
对照组3是减少磷酸二氢钙8kg，添加400g/t某市售中性植酸酶饲料；
实验组为减少磷酸二氢钙8kg，添加400g/t的本实施例制备的耐高温中性植酸酶饲料。
从表5中的实验结果中可以看出，本实施例制备的耐高温中性植酸酶制备成水产饲料，可以明显促进鱼对饲料的利用率。
实施例2：
一种本发明的中性植酸酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)基因植入：将来源于枯草芽孢杆菌的耐高温中性植酸酶基因克隆至毕赤酵母中制备毕赤酵母菌体悬浮液，该过程为常规过程；
(2)菌种冷冻保藏：将重组的毕赤酵母摇瓶菌体按照无菌方法制作悬浮液，经冷冻干燥处理，将冷冻后菌体装于充氮的密封安瓿瓶中，保藏于-80℃低温冰箱中保存；
(3)冷冻后的菌种的复壮及活化：将菌种按照无菌操作方法打开，溶于无菌生理盐水中，画线接种于YPD斜面培养基上，在30℃培养箱中倒置培养72小时左右，长出单菌落；
(4)摇瓶培养：用灭菌的接种环挑取丰满的单菌落接入摇瓶(500mL摇瓶装100mLYPD培养基)进行培养，转速220r/min、30℃恒温摇床培养30h，湿重58g/L；
(5)一级300L种子罐(YPD培养基150L)培养：将摇瓶中培养的菌液移至种子罐中，接种量为1％，搅拌速度200rpm，恒温30℃，通气比1:1vvm，培养22小时，湿重75g/L；
(6)二级3000L种子罐(BSM培养基1500L)培养：将一级种子罐培养的菌液移种至二级种子罐，接种量为10％，搅拌速度180rpm，恒温30℃，通气比1:1.1vvm，培养21小时，湿重110g/L，整个二级种子罐培养过程用25％氨水控制pH5.0；
(7)30吨发酵罐(BSM培养基15吨)培养：将二级种子罐培养的菌液移至发酵罐中，接种量10％，发酵温度30℃，发酵前100小时过程用25％氨水控制pH5.0，发酵100小时后，pH值每2小时上调0.2，直至pH为6.0，发酵初期转速120rpm，通气比1:1.2vvm，罐压0.05MPa，随着菌体增多，菌液中溶氧逐渐下降，逐步增加转速和通气，最大转速至160rpm，通风气比1:2.0vvm，维持溶氧在30％以上；当培养基中甘油消耗完毕，溶氧快速上升，加入50％甘油补料液，直至湿重达170g/L停止补料，维持15-30分钟不补加任何碳源，当溶氧值上升至接近100％、pH值有上升的趋势时，开始补加甲醇溶液；整个发酵时间为176小时，湿重396g/L，植酸酶活力8203U/ml；
(8)发酵液预处理：发酵液经离心过滤，除去菌体，收集离心酶液；
(9)稳定剂添加：按照离心酶液体积，添加羧甲基纤维素钠和海藻糖(羧甲基纤维素钠的添加质量(Kg)与离心酶液的体积(L)比值为0.3％，海藻糖的添加质量(Kg)与离心酶液的体积(L)比值为0.1％)，充分搅拌均匀。
(10)干燥：用淀粉和玉米芯(1:2)载体适量，吸附离心酶液，于鼓风干燥箱中干燥，干燥温度为50℃，干燥时间约24小时，得到中性植酸酶产品，含水量为9.3％，酶活5100u/g。
测试本实施例制备的中性植酸酶耐热稳定性：称取中性植酸酶0.5克，按照国标测定方法，稀释10000倍后，分别取1.2mL待测样液装1.5mL离心管，将其放在浮板上，分别放入70℃、85℃、100℃温度水浴锅，立刻计时10分钟，热处理完毕立刻取出放入自来水中冷却备用，结果如表5所示。
表5中性植酸酶耐热稳定性
酶活u/g 保留率
对照 5100 /
70℃、10分钟 4437 87％
85℃、10分钟 4233 83％
100℃、10分钟 3978 78％
按照水产饲料中添加水平，每吨饲料中添加中性植酸酶400g，添加5100u/g中性植酸酶到饲料中后，测制粒后残存酶活结果，如表6所示。
表6中性植酸酶在不同制粒温度下的保留率
将本实施例制备的植酸酶，按照400g/t添加到沉水饲料(粗蛋白28％，粗脂肪4.5％，制粒温度95～105℃)中，在某实验水产养殖场罗非鱼进行实验，罗非鱼初始体重～30g，实验数据如表7所示。
表7耐高温中性植酸酶对罗非鱼生长、饲料效率及肥满度的影响
注：1、饲料系数是指饲喂多少斤饲料长多少斤鱼。
2、字母a、b表示差异显著性，相同字母为差异不显著，不同字母为差异显著。
3、对照组1是指磷酸二氢钙不变，不加植酸酶饲料；
对照组2是减少磷酸二氢钙8kg，不加植酸酶饲料；
对照组3是减少磷酸二氢钙8kg，添加400g/t某市售中性植酸酶饲料；
实验组为减少磷酸二氢钙8kg，添加400g/t的本实施例制备的耐高温中性植酸酶饲料。
从表7中的实验结果中可以看出，本实施例制备的耐高温中性植酸酶制备成水产饲料，可以明显促进鱼对饲料的利用率，对鱼增重明显。

Claims (7)

1.一种应用于水产动物饲料中的耐高温中性植酸酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的耐高温中性植酸酶基因克隆至毕赤酵母(Pichia pastoris)中；
（2）将步骤（1）后的毕赤酵母接种于培养基上，倒置于恒温培养箱中培养，得到活化的毕赤酵母单菌落；
（3）将活化的毕赤酵母单菌落接入摇瓶中进行培养；
（4）将摇瓶培养的菌液移至种子罐中进行培养；
（5）将种子罐培养的菌液移至发酵罐中进行发酵培养；
（6）将步骤（5）得到的发酵液离心过滤得到离心酶液，再在离心酶液中加入稳定剂依次进行吸附、干燥，即得到所述的中性植酸酶；所述稳定剂由羧甲基纤维素钠和海藻糖组成，其中所述羧甲基纤维素钠的质量与离心酶液的体积比值为0.3%，所述海藻糖的质量与离心酶液的体积比值为0.1%，比值单位为Kg/L；前述干燥温度为50℃。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述摇瓶培养为恒温培养，温度为30℃±0.2℃，培养的时间为30-36小时，摇瓶的转速为180-220r/min。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述种子罐培养分为一级种子罐培养和二级种子罐培养；所述一级种子罐培养是指将摇瓶中培养的菌液移至一级种子罐中培养，其接种量为1-1.2%，搅拌速度为150-200rpm；一级种子罐培养为恒温培养，培养温度为30℃±0.2℃，通气比为1:1-1.2vvm，培养时间为20-24小时。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述二级种子罐培养是指将一级种子罐培养的菌液以10-12%的接种量移种到二级种子罐中扩大培养，二级种子罐培养为恒温培养，培养温度为30℃±0.2℃，整个过程中用浓度为25%的氨水控制菌液的pH值为5.0±0.2，通气比为1:1-1.2vvm，培养时间为20-24小时。
5.如权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，整个发酵培养的时间为160-180小时；其中发酵过程中的前100个小时中pH为5.0±0.2；发酵时间达到100小时后，将pH值按每2小时上调0.2的速度进行调节，直至pH为6.0±0.2。
6.如权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，发酵培养过程中发酵罐中的菌液的搅拌速度为120-200rpm，同时向发酵罐内不断通入无菌空气，通气比为1:(1.2-2.0)vvm，保持发酵罐压为0.05±0.01MPa。
7.如权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中采用的培养基为YPD斜面培养基，培养的温度为30℃±0.2℃，培养的时间为65-72小时。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110927154B (zh) * 2019-12-13 2023-02-03 武汉新华扬生物股份有限公司 一种体外评估耐热植酸酶作用效果的方法
CN111587959A (zh) * 2020-06-11 2020-08-28 浙江省农业科学院 改善猪胴体品质的生长育肥猪低蛋白饲料及饲料添加剂

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1405303A (zh) * 2001-09-14 2003-03-26 中国农业科学院饲料研究所 一种广谱、耐高温的高比活植酸酶及其编码基因和表达
CN1544622A (zh) * 2003-11-24 2004-11-10 华东理工大学 以重组甲醇营养型酵母发酵制备植酸酶的方法
CN101182499A (zh) * 2007-11-13 2008-05-21 沈阳市信利生物技术发展有限公司 一种以甘油为碳源的制备植酸酶的方法
CN101199319A (zh) * 2007-11-08 2008-06-18 江南大学 一种有广谱高效杀菌作用的酶组合杀菌制剂及其制备方法
WO2010054513A1 (en) * 2008-11-14 2010-05-20 Fujian Fuda Biotech Co. Ltd. A thermotolerant non-k12 escherichia coli phytase and its production

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103468668B (zh) * 2012-06-06 2017-10-24 益海(佳木斯)生物质能发电有限公司 一种固定脂肪酶的方法及其用途

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1405303A (zh) * 2001-09-14 2003-03-26 中国农业科学院饲料研究所 一种广谱、耐高温的高比活植酸酶及其编码基因和表达
CN1544622A (zh) * 2003-11-24 2004-11-10 华东理工大学 以重组甲醇营养型酵母发酵制备植酸酶的方法
CN101199319A (zh) * 2007-11-08 2008-06-18 江南大学 一种有广谱高效杀菌作用的酶组合杀菌制剂及其制备方法
CN101182499A (zh) * 2007-11-13 2008-05-21 沈阳市信利生物技术发展有限公司 一种以甘油为碳源的制备植酸酶的方法
WO2010054513A1 (en) * 2008-11-14 2010-05-20 Fujian Fuda Biotech Co. Ltd. A thermotolerant non-k12 escherichia coli phytase and its production

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization of a HAP–phytase from a thermophilic mould Sporotrichum thermophile;Bijender Singh et al.;《Bioresource Technology》;20090331;第100卷(第6期);第2046-2051页 *
Overexpression and Biochemical Characterization of a Thermostable Phytase from Bacillus subtilis US417 in Pichia pastoris;A&#305;¨da Hmida-Sayari et al.;《molecular Biotechnology》;20140524;第56卷(第9期);摘要，第840页左栏第1段至第843页右栏最后1段 *
耐高温植酸酶毕赤酵母工程菌发酵中试条件优化;黄魁英 等;《现代食品科技》;20111015;第27卷(第10期);摘要，第1240页右栏第1段至第1241页右栏最后1段 *

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