CN103468668B - 一种固定脂肪酶的方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉一种固定脂肪酶的方法，具体的，涉及一种利用白炭黑载体固定脂肪酶的方法。其步骤包括提供白炭黑载体，使白炭黑和脂肪酶液接触，使脂肪酶固定于所述载体上；然后将固定化脂肪酶进行干燥。所得到的固定化脂肪酶具有良好的酯交换活力，并且在酯交换后的油脂中含有较低的皂含量。
Description
技术领域
本发明涉一种固定脂肪酶的方法及其用途，具体的，涉及一种利用白炭黑固定脂肪酶的方法及其用途。
背景技术
脂肪酶作为一种催化油脂水解，酯交换，酯化反应的一类酶，因其催化条件温和，选择性高等特点，在食品加工，医药，造纸，精细化工等行业有着广泛的应用。然而游离的酶因为稳定性差，且难以与产物分离，难以实现规模化的工业生产。固定化酶技术是将游离的酶通过各种手段将其束缚或限制于一定区域内，使其仍然能进行特有的催化反应并能回收重复使用的一种技术，由于上述优点，国内外许多科研工作者展开了对固定化酶的广泛研究。随着研究的深入，许多技术和产品已经被开发并且得到了广泛的应用。
WO8906278A1描述了一种固定化TL酶的方法，通过培养腐殖霉属的真菌或经过基因改造的腐殖霉属真菌获得含有脂肪酶的发酵液，以酚醛型或者丙烯酸型树脂为固定化载体，固定化过程为将一定量的一定pH值酶液加入处理好的弱碱性大孔型离子交换树脂中，在室温下震荡8h，然后水洗，室温真空干燥，得产品。
EP1239045A1描述了一种固定化TL酶的方法，具体为将脂肪酶粉末溶解在磷酸缓冲液中，加入乙醇和聚丙烯型树脂ACCUREL MP1001，室温下震荡过夜。通过过滤收集固定化酶，用缓冲液清洗，室温下进行干燥。
然而，到目前为止，市场上现有的TL固定化酶并不能满足生产要求。其催化的酯交换反应中发现产物中存在大量的皂，大量浪费原料，增加成本。因此目前固定化的TL需要大量的油脂洗脱，造成大量的原料浪费。同时为下游的分离提纯带来了巨大的困难，限制了其在油脂工业上的应用。
因此，本领域中迫切需要开发出新的固定化脂肪酶，使得脂肪酶保持较高活力且在反应中不产生大量的皂，从而扩大脂肪酶在食品工业的应用范围。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种固定脂肪酶的方法，使脂肪酶具有良好的反应活性，并且在酯交换的使用过程中减少皂的产生，降低了由于皂产生的后处理带来的成本上升。
该方法是对目前工艺进行改进，选择了一种新型的载体对脂肪酶进行固定化，产生了良好的酯交换活力，并且使用过程中产生了降低皂含量的效果，使油脂在酯交换的后处理过程中减少或简化了操作步骤。
本发明中的固定脂肪酶的方法包括：
（a）脂肪酶的固定化：将脂肪酶与白炭黑载体接触，使脂肪酶固定在白炭黑载体上；
（b）干燥：将固定有脂肪酶的白炭黑载体进行干燥。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的白炭黑选自比表面积200-1000m2/g，优选250-500m2/g。
在本发明的一个具体实施方式中，对固定有脂肪酶的载体进行干燥的方法包括：冷冻干燥、真空干燥、沸腾流化床干燥和室温干燥等常规干燥方法。
在本发明的一个具体实施方式中，在步骤(a)的脂肪酶的固定化过程过加入酶蛋白交联剂，酶蛋白交联剂选自戊二醛、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚乙烯胺、明胶和/或精胺中的一种或几种。
在本发明的一个具体实施方式中，在步骤(a)脂肪酶的固定化中不添加缓冲液，发明人意外发现，不添加缓冲液后会使得到的固定化脂肪酶具有更好的效果，一方面在酯交换活力方面有所提高，另一方面意外的减少了酯交换过程中皂的产生，给下游的分离提纯带来了好处。
在本发明的一个具体实施方式中，固定脂肪酶的载体优选为白炭黑与活性炭的混合物，利用该混合物作为载体提升了固定化酶的活力并且减少了酯交换中皂的产生，并且效果优于任何一种单独的载体的效果。
在本发明的一个具体实施例中，所述的脂肪酶和/或载体未经过任何前处理而用于步骤(a)的固定化中。而发明人发现未经过处理而直接进行本发明的脂肪酶固定化方法取得了良好的效果，本领域的技术人员应当可以理解，对本发明的白炭黑载体进行相应的前处理，应当会取得更好的技术效果。
在本发明的一个具体实施例中，所述经处理的载体与脂肪酶以g/ml计的重量/体积比为25:1~1:25，优选10:1~1:10，更优选1:1.5~1:0.5，最优选1:1。
本发明的第二目的在于提供一种固定化脂肪酶，其可以采用如上述任意一种固定化脂肪酶的方法制备。
本发明的第三目的在于提供如前所述的固定脂肪酶的白炭黑载体在酯交换中的应用。
具体地，TL脂肪酶是Thermomyces Lanuginosus中发现的一类脂肪酶，主要用于油脂的水解，三甘油酯的改性及单甘脂和甘二酯的生产。固定化的TL酶用来催化酯交换反应，其优点是酯交换活力高，可以重复使用从而降低生产成本。然而到目前为止，市场上现有的TL固定化酶并不能满足所有的生产要求。在一些反应中我们发现产物中存在大量的皂，为下游的分离提纯带来了巨大的困难，限制了其应用。因此本发明中的新的脂肪酶固定化方法，能够得到活力较高并且在反应中不产生皂的固定化酶，既扩大了脂肪酶在食品工业的应用范围，又克服了现有固定化酶在生产中产生皂的问题，并且扩大了白炭黑的应用范围，具有很大的应用潜力。
本发明人发现，采用本发明的固定方法，制备的固定化脂肪酶，比市场上出现的固定化脂肪酶具有更好的效果。
本发明还提供了一种固定化脂肪酶。
在本发明一个具体实施方式中，所述的固定化脂肪酶的载体为白炭黑。
在本发明的一个具体实施方式中，所述白炭黑的比表面积为200-1000m2/g，优选250-500m2/g。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的载体中还包括活性炭，白炭黑与活性炭的比例优选为20：1－3：4，更优选的为10：1－1：1，最优选的为8：1－3：1。
本发明还提供了一种制备白炭黑和活性炭的方法，该制备方法以稻壳灰为原料。
本发明中所使用的稻壳灰可以通过市购或常规的方法制备，特别的，本发明中所使用到的稻壳灰也可以通过以下方法制得：
（1）将稻壳置入锅炉中燃烧温度控制为500-800℃，使稻壳燃烧过程中受热均匀，控制燃烧的时间在20－60分钟，使含碳量稳定在10-40%之间，得到稻壳灰初料；(2)将经步骤（1）处理的得到的稻壳灰初料经过筛分，去除杂质后得到稻壳灰。
在本发明的一个具体的实施方式中所使用的白炭黑的制备方法，包括以下步骤：
（1）稻壳灰在反应器中与强碱水溶液混合，稻壳灰与强碱的重量比例为1:2-1:6，在反应器中反应2-6h，维持压力2-6公斤；所述的强碱包括可溶性的强碱，优选碱金属强碱，如氢氧化钠、氢氧化钾等，更优选氢氧化钠。
（2）将上述步骤得到的料浆过滤，滤饼用40-80℃的热水进行洗涤，得到的滤液；
（3）将步骤（2）得到的滤液调配到比重为1.000-1.200之间，定量加入反应罐中，将温度调整至60-70℃，以恒定的速度加入无机酸，将溶液的pH调整至4.0-7.0，熟化1－20分钟，优选熟化10分钟后，将浆料排入料浆罐中；此处的熟化，是指在一定的温度下保持一段时间的静置；所述的无机酸，包括硫酸、盐酸等强酸，优选硫酸。
(4)将上述步骤得到的浆料过滤并洗涤，滤饼进行打浆，干燥即得到白炭黑产品。
在本发明的一个具体实施方式中所使用到的活性炭的制备方法，包括以下步骤：
（1）稻壳灰在反应器中强碱水溶液混合，稻壳灰与强碱的比例控制在1:2-1:6之间，在反应器中反应2-6h，维持压力2-6公斤；
（2）将上述步骤得到的料浆过滤，得到洗涤后的滤饼；
（3）将得到的滤饼中加入水进行稀释搅拌，控制料浆的含碳量在10-30%之间，温度控制在40-80℃，以恒定的速度加入无机酸，将料浆pH值降低到2-6左右；
（4）将步骤（3）得到的料浆过滤，干燥后，得到活性炭产品。
利用该方法进行制备，可以得到二氧化硅与活性炭的混合物。通过调节步骤（2）中的滤饼的洗涤的用水量及过滤的压力等，可控制混合物中二者的比例。本领域内技术人员可通过常规手段的调节，以得到符合固定脂肪酶需要的二氧化硅与活性炭的混合物。在优选的方案中，通过技术参数的调整，可以减少对二氧化硅和活性炭两者进行配制的过程，直接得到二氧化硅与活性炭的配比合理的混合物。利用该方法得到的混合物中的二氧化硅与活性炭的比例可以达到通过白炭黑与活性炭混合而得到的配比，如8：1-1：1，或者其他的合适比例。
优选的，白炭黑和活性炭可以通过以下步骤分别制备：
（1）燃烧：稻壳放入锅炉中,燃烧温度控制在600-700℃，使稻壳燃烧过程中受热均匀，控制燃烧时间在20－60分钟，使含碳量稳定在10-30%之间，稻壳灰中含有的有机物杂质随锅炉引风系统除去，优选的，炉排底部排出的稻壳灰经检验含碳量为15－25%的为合格原料；
（2）筛分：将步骤（1）的稻壳灰原料经过1－5mm直线筛进行筛分，去除糙米石子等杂质后得到制备活性炭和白炭黑的稻壳灰原料；
（3）碱溶：将步骤（2）的稻壳灰通过计量罐称取一定量的稻壳灰输送至反应器中，与浓度为8%—20%的氢氧化钠溶液混合，稻壳灰与碱的比例控制在1:3-1:5之间，在反应器中反应3-5h，维持压力3-5公斤；
（4）活性炭过滤：将步骤（3）得到的料浆通过压滤机进行过滤，过滤压力控制在4-6kg，滤液即为水玻璃，滤饼使用热水进行洗涤，水温50-80℃，洗涤后的滤饼为制取活性炭的原料。
此处的水玻璃，俗称泡花碱，是一种水溶性硅酸盐的水溶液，硅酸盐的其化学式为R2O·n SiO2，式中R2O为碱金属氧化物，n为二氧化硅与碱金属氧化物摩尔数的比值，该比值称为水玻璃的模数，当碱液为氢氧化钠时，生成Na2O·n SiO2。
（5）活性炭酸化：将步骤（4）得到的滤饼送至酸化罐，加入一倍量的水稀释搅拌，控制料浆含碳量在10-20%之间，温度控制在40-60℃，以10m3-15m3/h的流速加入浓度为5%-10%稀硫酸，将料浆pH值降低到3-5左右；
（6）活性炭干燥：将步骤（5）得到的料浆通过板框压滤机进行过滤，并用温度为50-80℃的水进行洗涤，110-130℃下采用盘干机干燥后风送至打包罐进行打包，即得到活性炭成品；
（7）白炭黑酸沉：将步骤（4）得到的水玻璃调配到比重为1.100-1.140之间，定量加入反应罐中，将温度调整至60-70℃，设定流速为3m3-5m3/h向其中加入浓度为5-10%的稀硫酸，将溶液的pH调整至4.8-6.2，熟化1－20分钟，优选熟化10分钟后，将浆料排入料浆罐中；
（8）白炭黑干燥：将步骤（7）得到的料浆通过板框压滤机中过滤并洗涤，滤饼进行打浆，喷雾干燥即得到白炭黑产品。
由上述的方法制备的白炭黑和/或活性炭，均可作为脂肪酶固定化的载体。
本发明的技术构思如下：
本发明人经过广泛而深入的研究，通过脂肪酶的固定化方法，针对目前市购的固定脂肪酶在使用过程中容易产生皂的缺点，以及因皂的产生而导致的油脂难分离的问题，旨在实现脂肪酶在特殊载体上的固定化，提供了一种不产生皂或少产生皂的固定化脂肪酶。在此基础上完成了本发明。
本发明中，术语“含有”或“包括”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”或“包括”中。
以下对本发明的各个方面进行详述：
原料
本发明中，所采用的脂肪酶的来源为：
1.通过培养嗜热丝孢菌(Thermomyces Lanuginosus)获得的发酵液(例如参见文献Charlotte Pinholt,Mathias Fano,Charlotte Wiberg，Influence of glycosylationon the adsorption of Thermomyces lanuginosus lipase to hydrophobic andhydrophilic surfaces,European Journal of Pharmaceutical Sciences40(2010):273-281)；
2.通过培养从嗜热丝孢菌得到脂肪酶基因的，用基因改性米曲霉经过发酵生产获得的脂肪酶酶液(例如参见同上文献Charlotte Pinholt,Mathias Fano,CharlotteWiberg,European Journal of Pharmaceutical Sciences 40(2010):273-281)。
3.市售的商品TL液体脂肪酶，在本发明中称为酶液，例如诺维信公司的LipozymeTL100L。
4.通过在如上所述的脂肪酶液或酶粉的溶液中加入酸碱调节TL酶液到合适的pH值和/或加入水(如蒸馏水、去离子水或双蒸水)调节到合适的蛋白浓度的酶液(例如参见文献Daniel Otzen，Differential adsorption of variants of the Thermomyceslanuginosus lipase on a hydrophobic surface suggests a role for localflexibility,biointerfaces 2008 64：223-228)。
本发明中所采用的载体白炭黑，也称为二氧化硅，是白色粉末状无定型硅酸和硅酸盐产品的总称，为多孔性物质，其孔隙多，孔径小，比表面积巨大，不溶于水，溶剂，耐高温，这些性质使其具备成为固定化酶载体的条件。白炭黑来源广泛，可以是各种自制或市售的白炭黑，不作任何限定，所有来源的白炭黑均可实现固定脂肪酸的目的。特别的，来源于回收自稻壳灰中的白炭黑，由于其成本低，来源广，比其它的载体更容易得到，因此非常适合用于工厂等大规模使用，降低了相应的生产成本。
本发明采用白炭黑作为固定脂肪酶的载体，并不排除其它类型的载体的混入。如本发明中使用的白炭黑载体中可以加入活性炭，通过实验可以发现，混合了活性炭的固定化酶获得了协同效果，其联用的效果优于单用白炭黑或单用活性炭的固定化酶的效果。本发明中可选用的白炭黑比表面积为200-1000m2/g，优选250-500m2/g，白炭黑和活性炭的来源不限，市场上所购得的白炭黑和活性炭均可以用于脂肪酶的固定化。也可以来源于其它途径，例如可以包括但不限于从稻壳灰中提纯的白炭黑和/或活性炭。
脂肪酶固定化
称取一定量的载体于容器中，放入一定体积的TL酶液，于15～35℃(优选15～25℃，更优选室温)水浴摇床(可以采用气浴摇床，机械搅拌器和磁力搅拌器，涡流搅拌器的形式)中150rpm(10-200rpm)固定。固定完成后，取出吸附有酶的白炭黑吸去残留液体。
在本发明的一个优化的具体实施方式中，所采用的白炭黑载体与TL酶液的重量(g)/体积(ml)比可为：25:1~1:25，优选10:1~1:10，更优选1:1.5~1:0.5，最优选1:1。
在本发明的另一个具体实施方式中，也可在酶液中加入一定量的酶蛋白交联剂(即能起到交联酶蛋白作用的物质)，优选所述酶蛋白交联剂具有羟基或氨基，例如戊二醛、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚乙烯胺、明胶或精胺等。所述酶蛋白交联剂的用量为每毫升酶液中添加0.0～10%(v/v)。例如戊二醛的用量为酶液中加入0.01%－1%，优选为0.05%－0.5%的戊二醛。
在本发明的另一个具体实施方式中，还使用其他常规交联剂，如聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚乙烯胺、明胶、精胺等。
固定的方式，可采用水浴摇床或气浴摇床，搅拌机或磁力搅拌器等常规方式。固定期间，可每隔一定时间(例如5min～1h)取上清测剩余蛋白含量来判断酶蛋白的吸附/结合程度。剩余蛋白含量的测定可采用考马斯亮蓝法、lorry法、双缩脲法、BCA法等常规蛋白质定量检测方法进行。通常，在剩余蛋白含量低于0.1mg/ml～0.5ml/ml时，终止固定步骤。当然，本领域普通技术人员可根据具体的需要(如质量控制要求等)对固定程度进行调整和控制。
用于固定化的白炭黑载体可以经过前处理，也可以不经过前处理将白炭黑载体直接应用于所述的固定化过程中。将白炭黑载体进行的前处理包括：（1）将载体置于水中浸泡去杂，然后用溶剂浸泡1~24h以去除有机杂质和不溶物，再用水洗去所述溶剂，其中所述溶剂为：乙醇、正己烷、丙酮或石油醚；或（2）0.05mol/L～1mol/L的碱液和酸液交替浸泡或冲洗所述载体1-5次，然后仅用0.05mol/L～1mol/L的碱液再次浸泡或冲洗所述载体1次，再用水洗至水呈中性，所使用的酸选自：HCl、H2SO4或H3PO4，所述碱选自：NaOH、氨水或KOH，每次碱液和酸液浸泡或冲洗的时间为1-24小时；（3）对白炭黑载体进行改性处理。
干燥步骤
在固定化步骤进完成以后，通过干燥步骤去除体系中多余的水分，干燥的方式可选自：冷冻干燥、真空干燥、沸腾流化床干燥和室温干燥等常规干燥方法。
例如，冷冻干燥可在LABCNCO的冷冻干燥机(厂商：美国Labcnco公司，型号：freezone)上进行，参数可设置为(以下是各个步骤参数，这几个步骤构成一个降温过程)：
-20℃降温速率1.5℃/min，2h(0.5-5h)，
-10℃降温速率1.5℃/min，6h(3-10h)
5℃降温速率1.01℃/min，15h，(10-24h)
20℃降温速率1.16℃/min，20h(10-24h)
具体来说，其大概过程为，先以1.5℃/min的速度降温到-20℃，在-20℃保持2h(可以在0.5-5h内根据物料进行调整)，然后以1.5℃/min升温至-10℃，之后在-10℃保持6h（可以在3-10h内根据物料进行调整），再以1.01℃/min升温至5℃，之后在5℃保持15h（可以在10-24h内根据物料进行调整），再以1.16℃/min的速度升温至20℃，之后在20℃保持20h（可以在10-24h内根据物料进行调整）。
真空干燥可在例如Binder真空干燥箱(厂商：宾德亚太(香港)有限公司型号：VD23)中进行，参数设置为在真空度为6mbar下，40℃干燥48h(24-60h)。
流化床干燥可在流化床中进行(例如德国格拉特公司，型号：midi glatt)，参数设置为进风温度45～55℃(优选50℃)，干燥时间为0.5～5h(优选1.5h)。
室温干燥可为将样品放在通风干燥的地方放置3～5天自然干燥。
本领域普通技术人员可根据需要和条件对常规干燥方法进行选择。
本发明还可以含有其他本领域的常规后处理步骤。
其它步骤
根据具体的需要，本发明的方法中还可额外具有如下的一个或多个可选步骤，包括(但不限于)：
1将酶液经过过滤除去小分子，以消除酶液中的小分子对酶活的影响。过滤方法可为例如：在超滤膜器上进行超滤(厂商：美国密理博公司，型号：小型)，然后加入磷酸缓冲液(例如pH为5的0.1mol/L的磷酸缓冲液)，使得所得酶液与原酶液体系pH保持一致，并调整到适当的酶蛋白浓度。
2在固定化步骤中可以加入糊精、白蛋白、羧甲基纤维素钠和/或海藻糖等物质增强酶的稳定性，它们各自的优选添加量为：糊精1～20%(W/V)；白蛋白0.05～5%(W/V)；羧甲基纤维素钠0.1-10%(W/V)；海藻糖0.1-10%(W/V)。可添加一种或多种上述物质，以获得所需的稳定效果。
3对载体进行改性处理，通过化学手段接上活性基团。例如，可参考徐敬亮等，氨基功能载体固定化酶研究进展，化工进展，2010 29(3):494-496。
本发明的方法可以包括：
（a）脂肪酶的固定化：将脂肪酶与所提供的白炭黑接触，将脂肪酶固定在白炭黑载体上；
(b)干燥：将固定有脂肪酶的白炭黑载体进行干燥。
本发明的在一个优选的具体实施方式中，本发明所采用的技术方案为：
（a）脂肪酶的固定化：TL脂肪酶与白炭黑不进行前处理，直接将脂肪酶与所提供的白炭黑接触，使脂肪酶固定在白炭黑载体上；
（b）干燥：将固定有TL脂肪酶的白炭黑载体进行室温干燥。
本发明固定化脂肪酶的应用
可将本发明的固定化脂肪酶直接用于工业化生产中，也可将其制成包装产品以便于进行储藏、运输、销售和进一步使用。
包装时，优选在无菌干燥低温的条件下灌装在洁净的容器中。储藏条件优选为低温干燥条件储藏，储存最适温度为4～20℃。优选在4℃～25℃的温度下进行运输。
本发明的固定化脂肪酶或其包装产品可用于催化油脂发生水解、酯交换、酯化反应或催化酸解、醇解等，在食品、造纸、皮革、洗涤剂、制药等工业上有着巨大的应用。例如，本发明的固定化TL脂肪酶可用于水解、三甘油酯的改性及单甘脂和甘二酯的生产中，尤为优选用于催化酯交换反应。
优点
本发明获得的固定化脂肪酶，具有以下优点：
1.采用一种新型载体的固定化脂肪酶，得到了高活力的固定化脂肪酶。
2.解决了商品TL脂肪酶在油脂反应中产生皂的问题。
3.拓宽了白炭黑的应用范围，由于白炭黑成本低，非常适用规模化制备和使用。并且制得的固定化脂肪酶可以重复利用，从而降低了生产成本，提高了使用率。
4.本发明提供的从稻壳灰中提取白炭黑和活性炭的方法是利用采用碱溶法提取稻壳灰中的SiO2用于制备水玻璃，碱溶滤渣经过酸法活化，同时生产出高油脱色率的优质活性炭，同时又以所得水玻璃为原料，生产高品质白炭黑。而现在市场上销售的活性炭均以耶壳、竹茎、木本植物为原料，经碳化、活化等工序生产，这种方法成本高、污染大，有毒有害物质多等诸多缺点。并且本发明提供的从稻壳灰中提取白炭黑的方法不经氯化锌活化，避免了有毒有害物质的污染，所生产的活性炭对油中的色素有很好的吸附能力且没有重金属等有害物质。
5.本发明提供的活性炭的制备方法是对含有水玻璃的活性炭滤饼进行酸化，使所制得的吸附剂成分不仅含有活性炭而且还含有活性二氧化硅成分，活性二氧化硅同样具有较大的比表面积和孔隙率，和活性炭共同形成复效吸附剂，吸附能力更强。
具体实施方式
如无具体说明，本发明的各种原料均可以通过市售得到；或根据本领域的常规方法制备得到。除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
本发明中所指的“固定化脂肪酶”，在下述的实施例中简称为固定化酶。
本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下面结合具体实施例，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《生物化学与分子生物学实验教程》(梁宋平主编高等教育出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
原料的来源：
白炭黑与活性炭的制备原料均为稻壳灰。不作特别的限定，实施例中的白炭黑和活性炭也可以来源于其它途径，如市购。
本实施例中稻壳灰的制备：将稻壳放入锅炉中，燃烧温度控制在600-700℃，且使稻壳燃烧过程中受热均匀，控制燃烧时间在20-60分钟内，使含碳量稳定在10-30%之间，稻壳中含有的有机物杂质随锅炉引风系统除去，炉排底部排出的稻壳灰经检测碳含量在15%－25%范围内时为原料，将得到的稻壳灰经过1－5mm直线筛进行筛分，去除糙米石子等杂质得到制备白炭黑和活性炭的稻壳灰原料。
TL酶液购自丹麦诺维信公司，商品名为Lipozyme TL 100L(pH5.0)。
含碳量的测定采用GB/T 12496.3-1999的方法进行碳含量的测定。
水玻璃模数测定，采用《水玻璃模数的快速测定》（理化检验（化学分册），秦克刚，李淑珍，2000年10月第36卷第10期，第472页－473页）中记载的方法检测水玻璃的模数。
本文中所提到的压力公斤或kg的单位是指kg/cm2。
所使用到的其它材料均通过市场途径购得。
实施例1：从稻壳灰制备白炭黑与活性炭
1.活性炭1的制备：称取稻壳灰原料300g，96g氢氧化钠，加入高压反应釜中，再加入900mL水，反应压力控制在4kg，反应时间4h，过滤并洗涤，得到滤液和滤饼，得到的滤液即为水玻璃，水玻璃滤液模数为2.5，在所得滤饼加入一倍量水混合，控制碳含量在15%左右，搅拌并加热至50℃，向其中以流速为10m3/h的速度添加浓度为10%的稀硫酸，在10-30分钟内将体系pH调整至3.5，过滤并洗涤，干燥后即得到活性炭1。
白炭黑1的制备：先在反应器中加入300g过滤得到的模数为2.5，比重为1.140的水玻璃的滤液，将温度调整至70℃，在搅拌下按7g/min的流速向其中加7%的硫酸，待溶液产生白色沉淀后，停止入酸，等待5分钟后，再次加入稀硫酸，酸流速不变，将溶液的pH调整至8，同时在此期间将温度升至85℃，在这个温度下，加入稀硫酸的同时以1.5g/min流速向溶液中加上述的水玻璃滤液，保持pH在这个范围30分钟，此步骤完成后，停止加水玻璃，继续加稀硫酸，将溶液的pH调整至5.5，熟化10分钟后，过滤，滤饼进行打浆，喷雾干燥即可得成品白炭黑1。
2．活性炭2的制备：称取稻壳灰原料300g，70g氢氧化钠，加入高压反应釜中，再加入900mL的水，反应压力控制在4kg，反应时间4h，过滤并洗涤，得到滤液和滤饼，滤液为模数等于3.0的水玻璃，所得滤饼加入一倍量水混合，控制碳含量在15%左右，搅拌并加热至50℃，向其中以流速为10m3/h的速度添加浓度为10%的稀硫酸，在10-30分钟内将体系pH调整至3.5，过滤并洗涤，130℃烘干后即得到活性炭2。
白炭黑2的制备：先在反应器中加入过滤所得到的300g模数为3，比重为1.140的水玻璃滤液，将温度调整至70℃，按8g/min的流速向其中加7%的硫酸，待溶液产生白色沉淀后，停止入酸，等待5分钟，再次加入稀硫酸，酸流速不变，将溶液的pH调整至8，同时在此期间将温度升至85℃，在这个温度下，在加入稀硫酸的同时以2g/min流速向溶液中加入所述的水玻璃滤液，保持pH在这个范围30分钟，此步骤完成后，停止加水玻璃，将溶液的pH调整至5.5，熟化10分钟后，过滤，滤饼进行打浆，喷雾干燥即可得成品白炭黑2。
3.活性炭3的制备：称取稻壳灰原料300g，氢氧化钠96g，加入高压反应釜中，再加入900ml水，反应压力控制在4kg，反应时间4h，过滤并洗涤，得滤液和滤饼，滤液为模数为2.67的水玻璃，所得滤饼加入一倍量水混合，控制碳含量在15%左右，搅拌并加热至50℃，向其中以流速为7m3/h的速度添加浓度为10%的稀硫酸，在10-30分钟内将体系pH调整至3.5，过滤并洗涤，干燥后即得到活性炭3。
白炭黑3的制备：先在反应器中加入300g模数为2.67，比重为1.100的水玻璃，将温度调整至70℃，按3.7g/min的流速向其中加7%的硫酸，同时在此期间将温度恒定在70℃，将溶液的pH调整至5，熟化10分钟后，过滤，滤饼进行打浆，喷雾干燥即可得成品白炭黑3。
4.活性炭4的制备：称取稻壳灰原料300g，氢氧化钠70g，加入高压反应釜中，再加入900ml水，反应压力控制在4kg，反应时间4h，过滤并洗涤，得到滤液和滤饼，滤液为模数等于2.8的水玻璃，所得滤饼加入一倍量水混合，控制碳含量在15%左右，搅拌并加热至50℃，向其中以流速为10m3/h的速度添加浓度为7%的稀硫酸，在10-30分钟内将体系ph调整至3.5，过滤并洗涤，130℃烘干后即得到活性炭4。
白炭黑4的制备：先在反应器中加入300g模数为2.8，比重为1.130的水玻璃，将温度调整至60℃，按4.8g/min的流速向其中加7%的硫酸，同时在此期间将温度恒定在60℃，将溶液的pH调整至5，熟化10分钟后，过滤，滤饼进行打浆，喷雾干燥即可得成品白炭黑4。
5.活性炭5的制备：称取稻壳灰原料300g，氢氧化钠70g，加入高压反应釜中，再加入900ml水，反应压力控制在4kg，反应时间4h，过滤，得到滤液和滤饼，滤液为模数等于2.8的水玻璃，向所得滤饼中加入一倍量的水并混合，控制碳含量在15%左右，搅拌并加热至50℃，向其中以流速为10m3/h的速度添加浓度为7%的稀硫酸，在20-40分钟内将体系pH调整至3.5，过滤并洗涤，130℃烘干后即得到活性炭5。
实施例2：白炭黑与活性炭的检测实施例
将实施例1中制备得到的活性炭和白炭黑按国家检测方法GB/T12496-1999和HG/T3061-1999检测，其结果如下：
表1活性炭的检测指标
注：BET为比表面积，单位m2/g。
由该检测数据可以表明，通过本发明的方法制得的活性炭中还含有二氧化硅，制得的产品中是活性炭与二氧化硅的混合物。
表2白炭黑的检测指标
| 实例 | 水分 | 灼烧减量 | DBP | PH | 硫酸盐 | 堆积密度 | BET |
| 白炭黑1 | 4.48 | 4.48 | 2.5 | 6.81 | 1.96 | 0.20 | 135 |
| 白炭黑2 | 5.21 | 4.38 | 2.5 | 6.70 | 1.54 | 0.20 | 175 |
| 白炭黑3 | 5.48 | 4.48 | 2.8 | 6.81 | 1.96 | 0.18 | 280 |
| 白炭黑4 | 5.21 | 4.38 | 2.8 | 6.70 | 1.54 | 0.18 | 325 |
注：BET为比表面积，单位m2/g,DBP为吸油值，单位为重量%。
实施例3：用白炭黑固定化TL脂肪酶：
固定化酶1：称取40g白炭黑3于250ml三角瓶中，加入40ml TL酶液，在25℃摇床中150rpm振荡2h，然后将白炭黑取出放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥，干燥后得固定化酶1。
固定化酶2：称取40g白炭黑3于250ml三角瓶中，加入40ml TL酶液，25℃摇床中150rpm固定1h后加入0.1%的戊二醛交联1h后过滤放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥，干燥后得固定化酶2。
固定化酶3：称取40g白炭黑3于250ml三角瓶中，先加入40mlpH7.0的磷酸盐缓冲液平衡2h，再加入40mlTL酶液，25℃，摇床中150rpm固定1h后加入0.1%的戊二醛交联1h，然后过滤放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥，干燥后得固定化酶3。
固定化酶4（硅藻土载体）：称取40g硅藻土，加入40mlTL酶液于250ml三角瓶中，25℃，摇床中150rpm固定1h后加入0.1%的戊二醛交联1h，然后过滤放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥，干燥后得固定化酶4。
固定化酶5：称取20g白炭黑4和20g活性炭5于250ml三角瓶中，加入40mlTL酶液，25℃摇床中150rpm固定1h后加入0.1%的戊二醛交联1h后过滤放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥，干燥后得固定化酶5。
固定化酶6（活性炭载体）：称取40g活性炭5，加入40mlTL酶液于250ml三角瓶中，25℃，摇床中150rpm固定1h后加入0.1%的戊二醛交联2h，然后过滤放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥，干燥后得固定化酶6。
固定化酶7：称取40g白炭黑3于250ml三角瓶中，加入40ml TL酶液，25℃摇床中150rpm固定1h后加入0.05%的戊二醛交联1h后过滤放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥，干燥后得固定化酶7。
固定化酶8：称取40g白炭黑3于250ml三角瓶中，加入40ml TL酶液，25℃，摇床中150rpm固定1h后加入0.5%的戊二醛交联1h后过滤放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥，干燥后得固定化酶8。
固定化酶9：称取40g白炭黑4于250ml三角瓶中，加入40ml TL酶液，25℃，150rpm固定1h后加入0.1%的戊二醛交联1h后过滤放入干净的培养皿中，放入真空干燥箱内（德国宾得干燥箱型号VD-23），30℃抽真空进行干燥，干燥后得固定化酶9。
固定化酶10：称取40g白炭黑4于250ml三角瓶中，加入40ml TL酶液，25℃，摇床中150rpm固定1h后加入0.1%的戊二醛交联1h后过滤放入干净的培养皿中，放入冷冻干燥机（美国Labcnco公司，型号：freezone）的干燥室内，进行冷冻干燥，干燥后得固定化酶10。
固定化酶11：称取100g白炭黑4于流化床（midi格拉特流化床，德国产）中，在1L烧杯中加入100ml TL酶液和1g羧甲基纤维素钠，充分溶解后用蠕动泵泵入流化床床体内，流速为10ml/min（5-15ml/min）。设置床体的进风温度为50℃（30℃-60℃），风速为0.6m3/min（0.5-0.9m3/min），得固定化酶11。
固定化酶12：称取100g的白炭黑4于流化床（midi格拉特流化床 德国产）中，在1L烧杯中加入100mlTL酶液和1g羧甲基纤维素钠，1%戊二醛，充分溶解后用蠕动泵泵入流化床床体内，蠕动泵流速为10ml/min（5-15ml/min）。设置流化床床体内进风温度为50℃（30℃-60℃），风速为0.6m3/min（0.5-0.9m3/min），得固定化酶12。
固定化酶13：称取40g白炭黑1于250ml三角瓶中，加入40ml TL酶液，在25℃摇床中150rpm振荡2h，然后将白炭黑取出放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥，干燥后得固定化酶13。
固定化酶14：称取40g白炭黑2于250ml三角瓶中，加入40ml TL酶液，25℃摇床中150rpm固定1h后加入0.1%的戊二醛交联1h后过滤放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥，干燥后得固定化酶14。
固定化酶15：称取40g牌号为白炭黑4于250ml三角瓶中，加入60ml TL酶液，25℃摇床中150rpm固定1h后加入0.1%的戊二醛交联1h后过滤放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥，干燥后得固定化酶15。
固定化酶16：称取40g牌号为白炭黑4于250ml三角瓶中，加入20ml TL酶液，25℃摇床中150rpm固定1h后加入0.1%的戊二醛交联1h后过滤放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥，干燥后得固定化酶16。
固定化酶17：称取40g Al2O3于250ml三角瓶中，加入40ml TL酶液，25℃摇床中150rpm固定1h后加入0.1%的戊二醛交联1h后过滤放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥，干燥后得固定化酶17。
固定化酶18：称取20g白炭黑3和30g活性炭5于250ml三角瓶中，加入50mlTL酶液，25℃，150rpm摇床中固定1h后加入0.1%的戊二醛交联1h后过滤放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥，干燥后得固定化酶18。
固定化酶19：称取20g白炭黑4和10g活性炭5于250ml三角瓶中，加入30mlTL酶液，25℃，150rpm摇床中固定1h后加入0.1%的戊二醛交联1h后过滤放入干净的培养皿中，放入通风橱内进行干燥，干燥后得固定化酶19。
以上处理在固定化过程结束后对上清液进行蛋白含量的测定，测定方法为考马斯亮蓝法，其剩余蛋白含量均在0.1mol/L以下(如表1所示)。酶固定化效率计算公式如下：
表3.酶固定化效率
| 原酶液蛋白浓度 | 吸附后上清蛋白浓度 | 酶固定化效率 |
| 5.5mol/L | ＜0.1mol/L | ＞98% |
实施例4：固定化酶酯交换活力测定方法
采用精炼大豆油和极度氢化大豆油为底物（w/w,73:37），固定化酶1－19和底物质量比为1:20，在70℃反应30min，反应毕后取出产物测其40℃SFC含量。每次取出产物把固定化酶1-19留在反应器内，再加入底物进行反应，重复3次。40℃ SFC含量方法：将装有样品的固脂管分别放入100℃烘箱中15min，60℃水浴5min，0℃水浴60min，40℃水浴30min，然后用核磁共振仪测其固脂含量。酯交换活力(IUN)计算公式为：
酯交换活力＝(SFCBlank－SFC样品)/30×1260
其中，SFCBlank是指没有经过酶法酯交换反应的底物油脂在40℃下SFC值；
SFC样品是指40℃下酶反应产物样品的SFC值。
实验结果为3次平行实验的平均值。
本实验采用诺维信TL IM固定化酶的商品酶为对比（表格中简称为TLIM），该固定化酶是NOVO INDUSTRI公司出品。
实验结果及讨论
表4本发明固定化酶1-19的酯交换活力测定结果
从表2中采用不同制备方法得到的固定化酶的酯交换活力数值可以发现：固定化酶2的酶交换活力比市购的TM IM的酯交换活力有明显的提升，该数据表明，使用白炭黑作为固定化载体的固定化酶具有使TL酶活力增强的效果，并且在重复使用的过程中也能保持较高的酯交换活力，因此可以运用到连续的生产中去。
固定化脂肪酶2与使用缓冲液进行pH值调节的方法得到的固定化酶3相比，在固定化过程中不添加缓冲液调节pH值固定化酶2具有更好的酯交换活力。因此，该实验可以证明，在利用白炭黑作为脂肪酶固定化载体时，不加入缓冲液进行pH值调节具有更好的酯交换活力。
将固定化酶2与固定化酶4、固定化酶17的酯交换活力相比，可以发现，在相同的条件下，本发明所采用的白炭黑作为TL酶的载体比硅藻土、氧化铝作为载体具有更好的酯交换活力，该效果是发明人在实验之前未能预料到的。
采用白炭黑与活性炭的混合物作为载体的固定化酶5、固定化酶18、固定化酶19也具有优异的酯交换活力，与单纯采用白炭黑的固定化酶的效果相当。同时，与单独采用活性炭作脂肪酶载体的固定化酶6相比，采用白炭黑与活性炭的混合物作为载体效果均优于单独采用活性炭作为载体的固定化脂肪酶。
固定化酶2、固定化酶9、固定化酶10、固定化酶11的酯交换活力检测数据表明，不同的干燥方式，对于每种固定化酶的酯交换活力影响不大。
固定化酶1与固定化酶13相比，固定化酶2与固定化酶14相比，可以看出，作为载体使用的白炭黑载体的比表面积越大，其在酯交换反应中的酯交换活力越强。发明人通过进一步的实验发现，比表面积在200－1000m2/g,优选在250-500m2/g的白炭黑载体也具有类似的效果。
同时该表格中的检测结果也表明，在固定化脂肪酶的过程中，即使不对白炭黑进行前处理，也能获得良好的效果。
实施例5：产物含皂量测定
分别称取实施例2中的固定化酶1－19酯交换3次反应产物约40克(准确至0.01克)混匀油样，加于250毫升锥形瓶中。加入50毫升中和的溴苯酚蓝指示剂溶液，摇匀。在充分振摇下，用0.01mol/L盐酸－丙酮滴定至终点(颜色由绿色变成黄色)。记下所耗盐酸标准溶液体积。
含皂量（ppm）=V×C×30.44×10000/W
式中：C--盐酸-丙酮标准溶液的摩尔浓度（mol/L）
V--所耗盐酸-丙酮标准溶液体积(毫升)
30.44×10000--每摩尔酸相当于油酸钠的克数
W—所称取的油重(克)
表5本发明固定化酶1-19的酯交换产物含皂量测定结果
通过上述实验的检测结果可以发现，采用白炭黑或其与活性炭的混合物作为载体的固定化方法得到的固定化酶均获得了良好的效果，其在酯交换中产生的皂比市场上所获得的固定化酶有明显的降低，该方法制得的固定化酶简化或减少了酯交换反应的后处理步骤，产生了良好的技术效果。
将固定化酶1、固定化酶2的效果，与固定化酶3的效果对比，可以发现在使用白炭黑载体对TL酶固定化的过程中，不采用缓冲液进行pH调节的方法得到的固定化酶具有更好的效果。由上表可以发现采用固定化酶1和固定化酶2在酯交换的反应过程中的油脂中，产生的皂有明显的降低，这是技术人员在实验之前是无法预料得到的。
将单一载体固定化的固定化酶2、固定化酶6与采用混合载体的固定化酶5、固定化酶18、固定化酶19的效果进行对比，可以发现，利用白炭黑与活性炭的组合作为载体，起到了协同作用，其比单独使用白炭黑或单独使用活性炭的效果还要好。这是在实验结果中的意外发现，未有任何的技术教导指出这种最优的组合。
从上面的数据也表明，白炭黑或脂肪酶在未进行任何前处理就已经获得了更好的技术效果。
综合上述的结论，本发明所采用的固定化酶的方法得到的脂肪固定化酶比添加缓冲液的固定方法获得的固定化酶，其在酯交换中所形成的皂含量非常低，并且也具有良好的酶活力。在后续的反应过程中，采用本发明所制备的固定化酶的酯交换活力和减少皂含量方面的效果也非常好，因此可重复使用，特别是可以运用到连续的生产反应中去，一方面使酯交换的油脂品质得到了提升，另一方面降低了生产成本。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (33)
1.一种固定脂肪酶的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(a)脂肪酶的固定化：白炭黑载体和脂肪酶液接触；
(b)干燥：将固定脂肪酶的载体进行干燥，
其中，在步骤(a)中不添加缓冲液，
所述的白炭黑载体与脂肪酶以g/ml计的重量/体积比为25:1～1:25，
所述脂肪酶为市售的TL脂肪酶，
所述白炭黑是如下制备的：
(1)稻壳灰与强碱的水溶液混合，稻壳灰与强碱的比例为1:2-1:6，反应2-6h，维持压力2-6公斤，制备料浆；
(2)将上述步骤得到的料浆过滤，得到滤液；
(3)将步骤(2)得到的滤液调配到比重为1.100-1.140之间，加入反应器中，将温度调整至60-70℃，设定流速为3m3-5m3/h向其中加入浓度为5-10％的稀硫酸，将溶液的pH调整至4.8-6.2后熟化；
(4)将上述步骤得到的浆料过滤，打浆后干燥即得到白炭黑产品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白炭黑载体的比表面积为200-1000㎡/g。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白炭黑载体的比表面积为250-500㎡/g。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的干燥包括冷冻干燥、真空干燥、流化床干燥和/或室温干燥。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中加入酶蛋白交联剂。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述酶蛋白交联剂选自：戊二醛、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、聚乙烯胺、明胶和/或精胺。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的脂肪酶和/或白炭黑载体未经过任何前处理而用于步骤(a)中。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中加入活性炭。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，白炭黑与活性炭的比例为20：1－3：4。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，白炭黑与活性炭的比例为10：1－1：1。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，白炭黑与活性炭的比例为8：1－3：1。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的白炭黑载体与脂肪酶以g/ml计的重量/体积比为10:1～1:10。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的白炭黑载体与脂肪酶以g/ml计的重量/体积比为1:1.5～1:0.5。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的白炭黑载体来源于稻壳灰。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述强碱为可溶性的强碱。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述强碱为氢氧化钠或氢氧化钾。
17.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述活性炭是如下制备的：
(1)稻壳灰与强碱水溶液混合，稻壳灰与强碱的比例为1:2-1:6，反应2-6h，维持压力2-6公斤，制备料浆；
(2)将上述步骤得到的料浆过滤，得到滤饼；
(3)将得到的滤饼中加入水进行稀释搅拌，控制料浆含碳量在10-30％之间，温度控制在40-80℃，向浆料中加入无机酸，将料浆pH值降低到2-6；
(4)将步骤(3)得到的料浆过滤，干燥后，得到活性炭产品。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述强碱为可溶性的强碱。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述强碱为氢氧化钠或氢氧化钾。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述无机酸为强酸。
21.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述无机酸为硫酸或盐酸。
22.如权利要求1或17所述的方法，其特征在于，所述稻壳灰是如下制备的：
(1)将稻壳置入锅炉中燃烧，分别控制燃烧温度和燃烧时间，以使含碳量为10-40％，得到稻壳灰初料；
(2)将经步骤(1)处理的得到的稻壳灰初料经过筛分，去除杂质后得到稻壳灰。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述筛分为将步骤(1)的稻壳灰初料经过1－5mm筛进行筛分。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述1－5mm筛为1－5mm直线筛。
25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，控制燃烧温度为500-800℃、燃烧时间为20-60分钟。
26.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)制备的稻壳灰的碳含量为15％－25％。
27.一种固定化脂肪酶，其特征在于通过权利要求1－26中任意一项所述的方法制备。
28.如权利要求27所述的固定化脂肪酶，其特征在于所述固定化脂肪酶的固定化载体为白炭黑。
29.如权利要求28所述的固定化脂肪酶，其特征在于，所述白炭黑的比表面积为200-1000㎡/g。
30.如权利要求29所述的固定化脂肪酶，其特征在于，所述白炭黑的比表面积为250-500㎡/g。
31.如权利要求28-30中任一项所述的固定化脂肪酶，其特征在于，所述载体中还包括活性炭。
32.如权利要求27所述的固定化脂肪酶，其特征在于，固定化载体通过权利要求17-26中任一项所述的方法制备。
33.如权利要求29-32中任一项所述的固定化脂肪酶在酯交换中的应用。
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