CN105821092A - 一种海南霉素发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种海南霉素发酵工艺，本方法以稠李链霉菌东方变种为发酵菌种，经过斜面培养基制备成出冻存孢子悬液，然后以冻存孢子出发制备成可以直接上罐使用的冻存菌丝管，经过种子培养转入发酵罐进行恒温培养，在发酵中前期补入液化玉米淀粉，经过该项工艺改进，不仅菌种活力增强，发酵水平得到大幅度的提升。相对于现有技术而言，该工艺解决了一支斜面只能制备少量菌种的局限，批量制备的冻存菌丝管数量大，活力强，在发酵罐上表现稳定而且产量高。发酵过程中被料解决了后期菌丝自、发酵单位滞涨的问题。

Description

一种海南霉素发酵工艺
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种海南霉素发酵工艺。
背景技术
海南霉素钠是一种多醚类抗生素，是从我国海南岛土壤中分离的一种稠李链霉菌东方变种(StreptomycespadanusVar.dangfangeusls)培养液中提取出的，对畜禽球虫有很强的杀虫作用，而且具有提高牛羊饲料利用率、作为“长肉素”促动物生长(增重)的作用。
海南霉素钠，分子以环状构象存在，在溶液状态下分子二个末端(羧酸羰基与叔羟基)形成H键，众多氧原子集中于中心位置，形成一个离子陷阱(Lontrapping)是一元羧酸离子载体抗生素，当进入细胞，干涉细胞膜离子转运，导致生命必须的K+等离子丢失，是抗生素杀球虫的生物活性的理化基础。
牛羊饲料中添加海南霉素钠，使瘤胃微生物菌群改变，瘤胃发酵提高了丙酸分子含量，饲料能量利用率提高，蛋白分解菌受抑制，瘤胃中饲料蛋白降解减少，增加微生物蛋白合成，促进牛羊体重增长。
我公司作为国内唯一一家生产该产品的厂家，该产品目前使用冻存孢子进罐，一支斜面制备的菌种数量较少，而且接种后种子生长过慢，活力较差。现有技术中，一级种子罐周期较长40h左右，既不利于生产安排，也不利于节能；发酵罐中基础料物料虽然较为丰富，但是其菌丝浓度较低，后期氨基氮回升较早，氨基氮回升后，发酵单位涨幅明显降低，即培养周期太短，后期发酵单位明显滞涨。因此，为了满足日益增长的市场容量，迫切需要开发新的生产工艺。
发明内容
针对背景技术中提到的现有技术中的不足，本发明提供一种海南霉素发酵的新工艺，其使用冻存菌丝进罐，接种后种子活力好、生长快，同时发酵过程中补料，极大提高了发酵单位。
本发明解决现有技术中的不足的具体技术方案为，一种海南霉素发酵工艺，包括以下步骤：
S1.制备冻存孢子悬液：将稠李东方链霉菌SDSL-HN1109CGMCCNO.5308的孢子接种到斜面培养基上，28±1℃下培养7天，用无菌水洗下斜面培养上的孢子，加入甘油水溶液配成冻存孢子悬液，在-80～-70℃下保存备用；
S2.制备冻存菌丝悬液：将S1中的冻存孢子悬液按照1～5vol‰的接种量接种到种子培养基中，28±1℃培养，培养40～45h，加入甘油水溶液配成冻存菌丝悬液，在-80～-70℃下保存备用；
S3.制备种子液：将S2中冻存菌丝悬液接种到种子培养基中，经过种子扩大培养，得到种子液；
S4.发酵：将S3得到的种子液按照1～5vol‰的接种量接入发酵培养基中，28±1℃下搅拌并通气，发酵培养130～150h，培养过程中补加液化淀粉。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以有如下进一步的具体要求或优化。
具体的，S1及S2中甘油水溶液的浓度为20wt％，S1制备的冻存孢子悬液中甘油水溶液与无菌水的体积比为1：1，S2制备的冻存菌丝悬液中甘油水溶液与种子培养基的体积比为1：1。
具体的，S3中的种子扩大培养包括两级扩大：将S1中的冻存孢子悬液按照10～25vol‰的接种量接种到种子培养基中，28±1℃下培养40～45h得中间种子液，将中间种子液按照1～5vol‰的接种量接种到种子培养基中，28±1℃下培养40～45h得种子液。
为了方便生产，实际生产中冻存孢子悬液及冻存菌丝悬液通常都使用5mL的冻存管封装后冻存，其方便取用和标准化生产，提高生产效率。
优选的，S4中发酵培养至发酵培养基中总糖低于5g/100ml时开始补加液化淀粉，每天补加量为发酵液总体积的2-3％，发酵培养结束前10h停止补加。
优选的，S4中补加液化淀粉的方式为流加。
具体的，S4中补加液化淀粉的浓度为30wt％。
具体的，S4中发酵培养时的搅拌转速为50-120r/min、通气量为0.5-1.2vvm。
具体的，S1中所述的斜面培养基由以下原料组成：玉米淀粉1.0wt％，酵母粉1.0wt％，碳酸钙0.6wt％，氯化钠0.2wt％，琼脂1.7wt％，黄豆饼粉1.0wt％，葡萄糖2.0wt％，蛋白胨0.2wt％，硫酸镁0.05wt％，磷酸氢二钾0.02wt％，余量为饮用水。
具体的，S2及S3中所述的种子培养基由下原料组成：玉米淀粉1.0wt％，酵母粉1.0wt％，碳酸0.8wt％，氯化钠0.3wt％，黄豆饼粉0.5wt％，葡萄糖1.0wt％，蛋白胨0.1wt％，硫酸镁0.05wt％，磷酸氢二钾0.02wt％，余量为饮用水。
与现有技术相比，本发明提供的海南霉素发酵工艺具有如下优点：
1)相比于现有技术中使用冻存孢子直接制备种子液后接入发酵培养基中的工艺，本发明提供的工艺使用冻存孢子批量制备出大量的冻存菌丝，冻存菌丝经种子扩大培养后接入发酵培养基中，本发明的工艺克服了一支斜面只能制备少量菌种的局限性，使用本发明的工艺一支斜面就可以批量产生较大量的冻存菌丝悬液备用；
2)相比于现有技术中使用冻存孢子，本发明提供的工艺使用的冻存菌丝活力更强，在发酵过程中表现更加稳定且产量更高；
3)发酵过程的中前期根据发酵培养基中总糖含量情况，补加液化淀粉，解决了后期菌丝自溶产生氨基氮而引起的发酵单位滞涨的问题。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
下述实施例中，所用菌种为streptomycespadanusvar.dangfangeusls稠李东方链霉菌，该菌种于2011年9月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏号为：CGMCCNo.5308。
下述实施例中，冻存菌丝悬液的制备方式为:
(1)在无菌条件下，用接种铲从母斜面上轻轻刮取全部的孢子，移入装有100mL20wt％甘油的三角瓶中，瓶中装有适量玻璃珠，摇动三角瓶将孢子打散使其均匀成孢子悬液。
(2)将5ml的冻存管灭菌(经取样检测无菌方可使用),分装孢子悬液，每只冻存管装量为2mL，保存于-80～-70℃的冰箱中备用。
(3)取冻存孢子悬液一支于种子培养基中，28±1℃培养，摇床转速220-240rpm振荡培养40-45小时，取2mL上述培养后的含菌丝培养基加入2mL20wt％甘油分装于5ml冻存管中,即为冻存菌丝悬液，保存于-80～-70℃的冰箱中备用。
母斜面用培养基组成为：玉米淀粉1.0wt％，酵母粉1.0wt％，碳酸钙0.6wt％，氯化钠0.2wt％，琼脂1.7wt％，黄豆饼粉1.0wt％，葡萄糖2.0wt％，蛋白胨0.2wt％，硫酸镁0.05wt％，磷酸氢二钾0.02wt％，余量为饮用水，pH7.4-7.9。
所用种子培养基组成为：玉米淀粉1.0wt％，酵母粉1.0wt％，碳酸钙0.8wt％，氯化钠0.3wt％，黄豆饼粉0.5wt％，葡萄糖1.0wt％，蛋白胨0.1wt％，硫酸镁0.05wt％，磷酸氢二钾0.02wt％，余量为饮用水，pH7.4-7.9。
实施例1
将稠李东方链霉菌(streptomycespadanusvar.dangfangeusls)冻存菌丝悬液一支接种于200mL装料种子瓶中，28℃培养40h后，接种于装有50L种子培养基的种子罐中(种子罐容量为100L)，28℃培养40h后，转入装有40m3发酵培养基的发酵罐中(发酵罐容量为60m3)，28℃培养。
发酵培养至发酵培养基中总糖含量约为5g/100ml时(离开始培养的时间大约为40h)开始补加液化淀粉，补料所用物料为30％液化玉米淀粉，流加的方式补入，补料至110-120hr，补料总量大约为发酵培养基总体积的2-3％，结束补料后继续培养至130hr。
种子罐培养40h用转子离心机在3500转，15分钟的检测菌浓为28％。
发酵结束，照抗生素微生物检定法二剂量法测定效价，放罐效价为5606μg/ml。
种子瓶及种子罐中所用的种子培养基组成均为：玉米淀粉1.0wt％，酵母粉1.0wt％，碳酸钙0.8wt％，氯化钠0.3wt％，黄豆饼粉0.5wt％，葡萄糖1.0wt％，蛋白胨0.1wt％，硫酸镁0.05wt％，磷酸氢二钾0.02wt％，饮用水余量，pH7.4-7.9。
发酵培养基组成为：玉米淀粉6-10wt％，黄豆饼粉2.0-3.0wt％，葡萄糖2.0wt％，碳酸钙0.5wt％，酵母粉0.5wt％，硫酸镁0.08wt％，磷酸氢二钾0.02wt％，氯化钠0.2wt％，饮用水余量，pH7.4-7.9。
液化淀粉制备方法：30wt％的玉米淀粉，0.03wt％耐高温淀粉酶，85-90℃糊化20分钟。
实施例2
将稠李东方链霉菌(streptomycespadanusvar.dangfangeusls)冻存菌丝一支接种于200ml装料种子瓶中，28℃培养40h后，接种于装有50L种子培养基的种子罐中(种子罐容量为100L)，28℃培养40h后，转入装有40m3发酵培养基的发酵罐中(发酵罐容量为60m3)，28℃培养。
发酵培养至发酵培养基中总糖含量约为4.5g/100ml时(离开始培养的时间大约为55h)开始补加液化淀粉，补料所用物料为30％液化玉米淀粉，流加的方式补入，补料至120-130hr，补料总量大约为发酵培养基总体积的2-3％，结束补料后继续培养至140hr。
种子罐培养40h用转子离心机在3500转，15分钟的检测菌浓为26％。
发酵结束，照抗生素微生物检定法二剂量法测定效价，放罐效价为5828μg/ml。
种子瓶及种子罐中所用的种子培养基组成均为：玉米淀粉1.0wt％，酵母粉1.0wt％，碳酸钙0.8wt％，氯化钠0.3wt％，黄豆饼粉0.5wt％，葡萄糖1.0wt％，蛋白胨0.1wt％，硫酸镁0.05wt％，磷酸氢二钾0.02wt％，饮用水余量，pH7.4-7.9。
发酵培养基组成为：玉米淀粉6-10wt％，黄豆饼粉2.0-3.0wt％，葡萄糖2.0wt％，碳酸钙0.5wt％，酵母粉0.5wt％，硫酸镁0.08wt％，磷酸氢二钾0.02wt％，氯化钠0.2wt％，饮用水余量，pH7.4-7.9。
液化淀粉制备方法：30wt％的玉米淀粉，0.03wt％耐高温淀粉酶，85-90℃糊化20分钟。
实施例3
将稠李东方链霉菌(streptomycespadanusvar.dangfangeusls)冻存菌丝一支接种于200mL装料种子瓶中，28℃培养40h后，接种于装有50L种子培养基的种子罐中(种子罐容量为100L)，28℃培养40h后，转入装有40m3发酵培养基的发酵罐中(发酵罐容量为60m3)，28℃培养。
发酵培养至发酵培养基中总糖含量约为2.8g/100ml时(离开始培养的时间大约为88h)开始补加液化淀粉，补料所用物料为30％液化玉米淀粉，流加的方式补入，补料至130-140hr，补料总量大约为发酵培养基总体积的2-3％，结束补料后继续培养至150hr。
种子罐培养40h用转子离心机在3500转，15分钟的检测菌浓为28％。
发酵结束，照抗生素微生物检定法二剂量法测定效价，放罐效价为5422μg/ml。
种子瓶及种子罐中所用的种子培养基组成均为：玉米淀粉1.0wt％，酵母粉1.0wt％，碳酸钙0.8wt％，氯化钠0.3wt％，黄豆饼粉0.5wt％，葡萄糖1.0wt％，蛋白胨0.1wt％，硫酸镁0.05wt％，磷酸氢二钾0.02wt％，饮用水余量，pH7.4-7.9。
发酵培养基组成为：玉米淀粉6-10wt％，黄豆饼粉2.0-3.0wt％，葡萄糖2.0wt％，碳酸钙0.5wt％，酵母粉0.5wt％，硫酸镁0.08wt％，磷酸氢二钾0.02wt％，氯化钠0.2wt％，饮用水余量，pH7.4-7.9。
液化淀粉制备方法：30wt％的玉米淀粉，0.03wt％耐高温淀粉酶，85-90℃糊化20分钟。
对比例
将稠李东方链霉菌(streptomycespadanusvar.dangfangeusls)冻存孢子管一支接种于200mL装料种子瓶中，28℃培养40h后，接种于装有50L种子培养基的种子罐中(种子罐容量为100L)，28℃培养40h后，转入装有40m3发酵培养基的发酵罐中(发酵罐容量为60m3)，28℃培养。在发酵培养的过程中不补料，直到130h放罐。
种子瓶及种子罐中所用的种子培养基组成均为：玉米淀粉1.0wt％，酵母粉1.0wt％，碳酸钙0.8wt％，氯化钠0.3wt％，黄豆饼粉0.5wt％，葡萄糖1.0wt％，蛋白胨0.1wt％，硫酸镁0.05wt％，磷酸氢二钾0.02wt％，饮用水余量，pH7.4-7.9。
发酵培养基组成为：玉米淀粉6-10wt％，黄豆饼粉2.0-3.0wt％，葡萄糖2.0wt％，碳酸钙0.5wt％，酵母粉0.5wt％，硫酸镁0.08wt％，磷酸氢二钾0.02wt％，氯化钠0.2wt％，饮用水余量，pH7.4-7.9。
液化淀粉制备方法：30wt％的玉米淀粉，0.03wt％耐高温淀粉酶，85-90℃糊化20分钟。
种子罐培养40h用转子离心机在3500转，15分钟的检测菌浓为18％。
发酵结束，照抗生素微生物检定法二剂量法测定效价，放罐效价为4581μg/mL。
从对比例和3个实施例的对比可以看出，本发明在发酵过程中通过冻存菌丝进罐，可以明显增大种子罐的菌丝量，实施例1至3种子罐培养40h时转子离心机在3500转，15分钟的检测菌浓平均为27.3％，而对比例中仅为18％，菌浓提高了51.9％；在发酵培养过程中补料，可以大幅度的提高发酵单位，实例例1至3中发酵结束时测定的放罐效价平均为5618.7μg/mL，对比例中仅为4581μg/mL，放罐效价提高了22.7％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种海南霉素发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1.制备冻存孢子悬液：将稠李东方链霉菌SDSL-HN1109CGMCCNO.5308的孢子接种到斜面培养基上，28±1℃下培养7天，用无菌水洗下斜面培养上的孢子，加入甘油水溶液配成冻存孢子悬液，在-80～-70℃下保存备用；
S2.制备冻存菌丝悬液：将S1中的冻存孢子悬液按照1～5vol‰的接种量接种到种子培养基中，28±1℃培养，培养40～45h，加入甘油水溶液配成冻存菌丝悬液，在-80～-70℃下保存备用；
S3.制备种子液：将S2中冻存菌丝悬液接种到种子培养基中，经过种子扩大培养，得到种子液；
S4.发酵：将S3得到的种子液按照1～5vol‰的接种量接入发酵培养基中，28±1℃下搅拌并通气，发酵培养130～150h，培养过程中补加液化淀粉。
2.根据权利要求1所述的一种海南霉素发酵工艺，其特征在于，S1及S2中甘油水溶液的浓度为20wt％，S1制备的冻存孢子悬液中甘油水溶液与无菌水的体积比为1：1，S2制备的冻存菌丝悬液中甘油水溶液与种子培养基的体积比为1：1。
3.根据权利要求1所述的一种海南霉素发酵工艺，其特征在于，S3中的种子扩大培养包括两级扩大：将S2中的冻存菌丝悬液按照10～25vol‰的接种量接种到种子培养基中，28±1℃下培养40～45h得中间种子液，将中间种子液按照1～5vol‰的接种量接种到种子培养基中，28±1℃下培养40～45h得种子液。
4.根据权利要求1所述的一种海南霉素发酵工艺，其特征在于，S4中发酵培养至发酵培养基中总糖低于5g/100ml时开始补加液化淀粉，每天补加量为发酵液总体积的2-3％，发酵培养结束前10h停止补加。
5.根据权利要求1所述一种海南霉素发酵工艺，其特征在于，S4中补加液化淀粉的方式为流加。
6.根据权利要求1所述一种海南霉素发酵工艺，其特征在于，S4中补加液化淀粉的浓度为30wt％。
7.根据权利要求1所述的一种海南霉素发酵工艺，其特征在于，S4中发酵培养时的搅拌转速为50-120r/min、通气量为0.5-1.2vvm。
8.根据权利要求1至7任一项所述的一种海南霉素发酵工艺，其特征在于，S1中所述的斜面培养基由以下原料组成：玉米淀粉1.0wt％，酵母粉1.0wt％，碳酸钙0.6wt％，氯化钠0.2wt％，琼脂1.7wt％，黄豆饼粉1.0wt％，葡萄糖2.0wt％，蛋白胨0.2wt％，硫酸镁0.05wt％，磷酸氢二钾0.02wt％，余量为饮用水。
9.根据权利要求1至7任一项所述的一种海南霉素发酵工艺，其特征在于，S2及S3中所述的种子培养基由下原料组成：玉米淀粉1.0wt％，酵母粉1.0wt％，碳酸0.8wt％，氯化钠0.3wt％，黄豆饼粉0.5wt％，葡萄糖1.0wt％，蛋白胨0.1wt％，硫酸镁0.05wt％，磷酸氢二钾0.02wt％，余量为饮用水。
10.根据权利要求1至7任一项所述的一种海南霉素发酵工艺，其特征在于，S4中所述的发酵培养基由以下原料组成：玉米淀粉6-10wt％，黄豆饼粉2.0-3.0wt％，葡萄糖2.0wt％，碳酸钙0.5wt％，酵母粉0.5wt％，硫酸镁0.08wt％，磷酸氢二钾0.02wt％，氯化钠0.2wt％，余量为饮用水。
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