CN102634553A - 一种海南霉素的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海南霉素的发酵方法，步骤为：将冷藏的稠李东方链霉菌SDSL-HN1109沙土孢子接种到斜面培养基上，28℃培养7天；洗下斜面培养所得的孢子，加入甘油配成孢子悬浮液，在-70℃～-80℃下保存备用；将孢子悬浮液0.2ml接种到45-60ml种子培养基中，28℃培养40～42小时，得种子液；将种子液按照10～20%的接种量接种到发酵培养基中，28℃培养90～144小时，得发酵液。本发明利用高产量的稠李东方链霉菌变异菌株制备海南霉素，发酵结果稳定，重复性好，产量高。此外，在制备发酵种子时仅需要一次斜面培养，保证了菌种的纯度，避免了菌种污染，简化了操作。

Description

一种海南霉素的发酵方法
技术领域
本发明涉及一种抗生素的发酵方法，具体涉及一种采用微生物菌种发酵海南霉素的方法，属于生物医药技术领域。 
背景技术
海南霉素是白色或类白色粉末，无臭无味，英文名Hainanmycin，分子式C47H80O15H2O，分子量884。海南霉素是中国自主开发的单价离子载体类抗生素兽药，在防止鸡球虫感染和提高反刍动物饲料转化率上具有显著效果，为高效抗球虫药物。它对革兰氏阳性菌如杆菌、球菌有广泛的抗菌谱，对厌氧及某些植物病原菌、水稻纹枯病和油菜菌核病等真菌也有抗菌作用；对革兰氏阴性菌不显活性。南海霉素还能提高饲料转化率，增进肉鸡体重，改善鸡肉品质，促进牛、羊等反刍动物的增长，被称为长肉素。 
海南霉素是从我国海南岛土壤中分离的一种稠李链霉菌东方变种(Streptomyces padanus Var dangfangeusls)培养液中提取出的，现今制备方法是取沙土管中的孢子, 接种于斜面, 28℃培养7天, 接种2～3代斜面, 备用, 采用挖块法接种，发酵主要原料为淀粉、鱼粉。此方法孢子需在斜面上培养2-3代，难以保持菌种稳定，发酵单位无法达到生产要求。 
发明内容
本发明针对背景技术中提到的现有发酵海南霉素的不足，提供了一种海南霉素的发酵方法，该方法海南霉素发酵单位稳定，较现有发酵工艺发酵单位高，具备生产要求。 
本发明采用发酵法生产海南霉素，所用的稠李东方链霉菌（Streptomyces padanus var. dangfangeusls）SDSL-HN1109已于2011年9月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC NO.5308。 
该SDSL-HN1109菌株是通过以下几个阶段选育出来的： 
一、从稠李东方链霉菌（Streptomyces padanus var. dangfangeusls）HN1菌株出发，经连续亚硝基胍诱变得到比出发菌株产量提高20 %的SDSL-HN337号高产菌株。
二、将SDSL-HN337号高产菌株经氮离子注入诱变，得到较SDSL-HN337菌株产量提高15%的SDSL-HN1109菌株，产量在5210ug/ml左右。 
本发明采用上述菌种生产海南霉素，其技术方案如下： 
一种海南霉素的发酵方法，其特征是：以稠李东方链霉菌（Streptomyces padanus var. dangfangeusls）SDSL-HN1109 CGMCC NO.5308为菌种进行发酵制备，包括以下步骤：
（1）    将冷藏的稠李东方链霉菌（Streptomyces padanus var. dangfangeusls）SDSL-HN1109 CGMCC NO.5308沙土孢子接种到斜面培养基上，在28℃下培养7天；
（2）    用无菌水洗下步骤（1）斜面培养所得的孢子，加入甘油配成孢子悬浮液，在-70℃～-80℃下保存备用；
（3）    将孢子悬浮液0.2ml接种到45-60ml种子培养基中，在28℃培养40～42小时，得种子液；
（4）    将种子液按照10～20%的接种量接种到发酵培养基中，在28℃培养90～144小时，得发酵液。
上述方法中，稠李东方链霉菌（Streptomyces padanus var. dangfangeusls）HN1109沙土孢子的制备方法是：将菌种进行斜面培养，用接种针将所得孢子刮下，送入灭菌的沙土管中，搅动沙土，使粘附在接种针上的孢子与沙土充分混合，塞紧棉塞，敲松沙土，将沙土管放入真空干燥器内，常温下保持真空度0.08～0.1Mpa连续抽干40～60分钟，然后敲松沙土，将沙土管放入盛有变色硅胶的干燥器中，置于0～8℃冰箱中保藏备用。 
上述方法中，斜面培养基组分包括：玉米淀粉1.0wt%，酵母粉1.0wt%，碳酸钙0.8wt%，氯化钠0.3wt%，黄豆饼粉0.5wt%，葡萄糖1.0wt%，蛋白胨0.1wt%，硫酸镁0.05wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，琼脂2.0wt%，饮用水余量。在配制斜面培养基时，玉米淀粉在70～80℃糊化10分钟再与其他成分混合。 
上述方法中，种子培养基组分包括：玉米淀粉1.0wt%，酵母粉1.0wt%，碳酸钙0.8wt%，氯化钠0.3wt%，黄豆饼粉0.5wt%，葡萄糖1.0wt%，蛋白胨0.1wt%，硫酸镁0.05wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，饮用水余量，pH7.4～7.9。 
上述方法中，发酵培养基组分包括：豆油6～10wt%，黄豆饼粉2.0～3.0wt%，葡萄糖2.0wt%，碳酸钙0.5wt%，酵母粉0.5wt%，硫酸镁0.08wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，氯化钠0.2 wt%，饮用水余量，pH7.4～7.9。 
上述步骤（2）中，制得的孢子悬浮液中，每毫升孢子悬浮液含有1×108～1×1010个孢子。 
上述步骤（2）中，甘油的浓度为20wt%，甘油与无菌水的体积比为1:1。 
上述步骤（3）中，优选的，孢子悬浮液0.2ml接种到50ml种子培养基中。 
本发明通过诱变选育得到了高产量的稠李东方链霉菌变异菌株，利用此菌株发酵制备海南霉素，发酵结果稳定，重复性好，海南霉素产量大大提高。此外，与现有工艺相比，本发明在制备发酵种子时仅需要一次斜面培养，避免了传2～3代斜面，保证了菌种的纯度，避免了菌种污染，简化了操作，并且优化了发酵培养基组成及接种量，进一步的提高了海南霉素的产量。 
菌种保藏信息
稠李东方链霉菌（Streptomyces padanus var. dangfangeusls）SDSL-HN1109已于2011年9月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC NO.5308。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步阐述，应该明白的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。 
本发明的变异菌株是由我国海南岛土壤中分离的稠李东方链霉菌 (Streptomyces padanus var. dangfangeusls)诱变选育得来的，主要经两步得到。第一步，从稠李东方链霉菌（Streptomyces padanus var. dangfangeusls）HN1菌株出发，经连续亚硝基胍诱变得到比出发菌株产量提高20 %的SDSL-HN337号高产菌株；第二步，将SDSL-HN337号高产菌株经氮离子注入诱变，得到较SDSL-HN337菌株产量提高15%的SDSL-HN1109菌株，产量在5000 ug/ml左右，随着工艺条件的变化发酵产量有所不同，尤其是发酵时间的变化对发酵产量具有重要影响，在一定范围内，发酵量随发酵时间的增加而变大。 
本发明在生产时，将选育所得海南霉素产生菌种放入沙土管中进行保存，其保存方法是：将菌种进行斜面培养，用接种针将所得孢子刮下，送入灭菌的沙土管中，搅动沙土，使粘附在接种针上的孢子与沙土充分混合，塞紧棉塞，敲松沙土，将沙土管放入真空干燥器内，常温下保持真空度0.08～0.1Mpa连续抽干40～60分钟，然后敲松沙土，将沙土管放入盛有变色硅胶的干燥器中，置于0～8℃冰箱中保藏备用。 
所用斜面培养基为：玉米淀粉1.0wt%，酵母粉1.0wt%，碳酸钙0.8wt%，氯化钠0.3wt%，黄豆饼粉0.5wt%，葡萄糖1.0wt%，蛋白胨0.1wt%，硫酸镁0.05wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，琼脂2.0wt%。 
下面以上述制得的沙土孢子为菌种，进行发酵生产海南霉素，通过下列实施例进一步的解释、详述本发明。若无特别说明，下述实施例中所用培养基的组分含量均为重量百分比。 
实施例1
1、孢子斜面培养
在无菌条件下，用接种勺在沙土管内取出一勺沙土均匀散布在空白茄瓶斜面上，然后涂布均匀，瓶口用棉塞塞紧，外扎纱布，在28℃下培养7天；
所用斜面培养基为：玉米淀粉1.0wt%，酵母粉1.0wt%，碳酸钙0.8wt%，氯化钠0.3wt%，黄豆饼粉0.5wt%，葡萄糖1.0wt%，蛋白胨0.1wt%，硫酸镁0.05wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，琼脂2.0wt%，饮用水余量。
2、孢子悬浮液制备 
使用50ml无菌水洗下培养所得的斜面孢子，然后加入等体积无菌的20wt%甘油，混合均匀后，制得孢子悬浮液，每毫升悬浮液中约含109个孢子，将悬浮液分装与5ml耐低温带盖塑料管中，在-70℃～-80℃保存备用。
3、种子液制备 
按50ml种子液接种0.2ml孢子悬浮液的比例接种种子培养基，在28℃培养40小时，得种子液。
种子培养基为：玉米淀粉1.0wt%，酵母粉1.0wt%，碳酸钙0.8wt%，氯化钠0.3wt%，黄豆饼粉0.5wt%，葡萄糖1.0wt%，蛋白胨0.1wt%，硫酸镁0.05wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，饮用水余量，pH7.4～7.9。 
4、发酵培养 
将种子液按发酵培养基体积的10%接入发酵培养基中, 在28℃下培养90小时，发酵单位为3852u/ml。所用配方为：豆油6wt%，黄豆饼粉2.0wt%，葡萄糖2.0wt%，碳酸钙0.5wt%，酵母粉0.5wt%，硫酸镁0.08wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，氯化钠0.2 wt%，饮用水余量，pH7.4～7.9。
实施例2
1、孢子斜面培养
在无菌条件下，用接种勺在沙土管内取出一勺沙土均匀散布在空白茄瓶斜面上，然后涂布均匀，瓶口用棉塞塞紧，外扎纱布，在28℃下培养7天；
所用斜面培养基为：玉米淀粉1.0wt%，酵母粉1.0wt%，碳酸钙0.8wt%，氯化钠0.3wt%，黄豆饼粉0.5wt%，葡萄糖1.0wt%，蛋白胨0.1wt%，硫酸镁0.05wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，琼脂2.0wt%，饮用水余量。
2、孢子悬浮液制备 
使用50ml无菌水洗下培养所得的斜面孢子，然后加入等体积无菌的20wt%甘油，混合均匀后，制得孢子悬浮液，每毫升悬浮液中约含109个孢子，将悬浮液分装与5ml耐低温带盖塑料管中，在-70℃～-80℃保存备用。
3、种子液制备 
按50ml种子液接种0.2ml孢子悬浮液的比例接种种子培养基，在28℃培养40小时，得种子液。
种子培养基为：玉米淀粉1.0wt%，酵母粉1.0wt%，碳酸钙0.8wt%，氯化钠0.3wt%，黄豆饼粉0.5wt%，葡萄糖1.0wt%，蛋白胨0.1wt%，硫酸镁0.05wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，饮用水余量，pH7.4～7.9。 
4、发酵培养 
将种子液按发酵培养基体积的10%接入发酵培养基中,所用配方为：豆油8wt%，黄豆饼粉2.5wt%，葡萄糖2.0wt%，碳酸钙0.5wt%，酵母粉0.5wt%，硫酸镁0.08wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，氯化钠0.2 wt%，饮用水余量，pH7.4～7.9。在28℃下培养120小时，发酵单位为5063u/ml。
实施例3
1、孢子斜面培养
在无菌条件下，用接种勺在沙土管内取出一勺沙土均匀散布在空白茄瓶斜面上，然后涂布均匀，瓶口用棉塞塞紧，外扎纱布，在28℃下培养7天；
所用斜面培养基为：玉米淀粉1.0wt%，酵母粉1.0wt%，碳酸钙0.8wt%，氯化钠0.3wt%，黄豆饼粉0.5wt%，葡萄糖1.0wt%，蛋白胨0.1wt%，硫酸镁0.05wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，琼脂2.0wt%，饮用水余量。
2、孢子悬浮液制备 
使用50ml无菌水洗下培养所得的斜面孢子，然后加入等体积无菌的20wt%甘油，混合均匀后，制得孢子悬浮液，每毫升悬浮液中约含109-1010个孢子，将悬浮液分装与5ml耐低温带盖塑料管中，在-70℃～-80℃保存备用。
3、种子液制备 
按50ml种子液接种0.2ml孢子悬浮液的比例接种种子培养基，在28℃培养40小时，得种子液。
种子培养基为：玉米淀粉1.0wt%，酵母粉1.0wt%，碳酸钙0.8wt%，氯化钠0.3wt%，黄豆饼粉0.5wt%，葡萄糖1.0wt%，蛋白胨0.1wt%，硫酸镁0.05wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，饮用水余量，pH7.4～7.9。 
4、发酵培养 
将种子液按发酵培养基体积的20%接入发酵培养基中,所用配方为：豆油10wt%，黄豆饼粉3wt%，葡萄糖2.0wt%，碳酸钙0.5wt%，酵母粉0.5wt%，硫酸镁0.08wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，氯化钠0.2 wt%，饮用水余量，pH7.4～7.9。在28℃下培养144小时，发酵单位为6770u/ml。
实施例4
1、孢子斜面培养
在无菌条件下，用接种勺在沙土管内取出一勺沙土均匀散布在空白茄瓶斜面上，然后涂布均匀，瓶口用棉塞塞紧，外扎纱布，在28℃下培养7天；
所用斜面培养基为：玉米淀粉1.0wt%，酵母粉1.0wt%，碳酸钙0.8wt%，氯化钠0.3wt%，黄豆饼粉0.5wt%，葡萄糖1.0wt%，蛋白胨0.1wt%，硫酸镁0.05wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，琼脂2.0wt%，饮用水余量。
2、孢子悬浮液制备 
使用50ml无菌水洗下培养所得的斜面孢子，然后加入等体积无菌的20wt%甘油，混合均匀后，制得孢子悬浮液，每毫升悬浮液中含108-109个孢子，将悬浮液分装与5ml耐低温带盖塑料管中，在-70℃～-80℃保存备用。
3、种子液制备 
按45ml种子液接种0.2ml孢子悬浮液的比例接种种子培养基，在28℃培养40小时，得种子液。
种子培养基为：玉米淀粉1.0wt%，酵母粉1.0wt%，碳酸钙0.8wt%，氯化钠0.3wt%，黄豆饼粉0.5wt%，葡萄糖1.0wt%，蛋白胨0.1wt%，硫酸镁0.05wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，饮用水余量，pH7.4～7.9。 
4、发酵培养 
将种子液按发酵培养基体积的20%接入发酵培养基中,所用配方为：豆油8wt%，黄豆饼粉2.5wt%，葡萄糖2.0wt%，碳酸钙0.5wt%，酵母粉0.5wt%，硫酸镁0.08wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，氯化钠0.2 wt%，饮用水余量，pH7.4～7.9。在28℃下培养144小时，发酵单位为6870u/ml。
实施例5
按照实施例2的方法发酵生产海南霉素钠，不同的是：种子培养时，按60ml种子液接种0.2ml孢子悬浮液的比例接种种子培养基，最终发酵单位为4876u/ml。

Claims (9)

1.一种海南霉素的发酵方法，其特征是：以稠李东方链霉菌（Streptomyces padanus var. dangfangeusls）SDSL-HN1109 CGMCC NO.5308为菌种进行发酵制备，包括以下步骤：
（1）将冷藏的稠李东方链霉菌（Streptomyces padanus var. dangfangeusls）SDSL-HN1109 CGMCC NO.5308沙土孢子接种到斜面培养基上，在28℃下培养7天；
（2）用无菌水洗下步骤（1）斜面培养所得的孢子，加入甘油配成孢子悬浮液，在-70℃～-80℃下保存备用；
（3）将孢子悬浮液0.2ml接种到45-60ml种子培养基中，在28℃培养40～42小时，得种子液；
（4）将种子液按照10～20%的接种量接种到发酵培养基中，在28℃培养90～144小时，得发酵液。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征是稠李东方链霉菌（Streptomyces padanus var. dangfangeusls）沙土孢子的制备方法是：将菌种进行斜面培养，用接种针将所得孢子刮下，送入灭菌的沙土管中，搅动沙土，使粘附在接种针上的孢子与沙土充分混合，塞紧棉塞，敲松沙土，将沙土管放入真空干燥器内，常温下保持真空度0.08～0.1Mpa连续抽干40～60分钟，然后敲松沙土，将沙土管放入盛有变色硅胶的干燥器中，置于0～8℃冰箱中保藏备用。
3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征是，斜面培养基组分包括：玉米淀粉1.0wt%，酵母粉1.0wt%，碳酸钙0.8wt%，氯化钠0.3wt%，黄豆饼粉0.5wt%，葡萄糖1.0wt%，蛋白胨0.1wt%，硫酸镁0.05wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，琼脂2.0wt%，饮用水余量。
4.  根据权利要求3所述的发酵方法，其特征是斜面培养基在配制时，玉米淀粉在70～80℃糊化10分钟再与其他成分混合。
5.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征是，种子培养基组分包括：玉米淀粉1.0wt%，酵母粉1.0wt%，碳酸钙0.8wt%，氯化钠0.3wt%，黄豆饼粉0.5wt%，葡萄糖1.0wt%，蛋白胨0.1wt%，硫酸镁0.05wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，饮用水余量，pH7.4～7.9。
6.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征是，发酵培养基组分包括：豆油6～10wt%，黄豆饼粉2.0～3.0wt%，葡萄糖2.0wt%，碳酸钙0.5wt%，酵母粉0.5wt%，硫酸镁0.08wt%，磷酸氢二钾0.02wt%，氯化钠0.2 wt%，饮用水余量，pH7.4～7.9。
7.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征是：制得的孢子悬浮液中，每毫升孢子悬浮液含有1×108～1×1010个孢子。
8.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征是：步骤（2）中，甘油的浓度为20wt%，甘油与无菌水的体积比为1:1。
9.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征是：步骤（3）中，孢子悬浮液0.2ml接种到50ml种子培养基中。
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