CN101260391B

CN101260391B - 耐热型植酸酶基因及其应用

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Publication number: CN101260391B
Application number: CN2007100378250A
Authority: CN
Inventors: 李钢; 牛冬云; 王小行; 蒋彦; 杨滔
Original assignee: SICHUAN HEBEN BIOENGINEERING CO Ltd
Current assignee: SICHUAN HEBEN BIOENGINEERING CO Ltd
Priority date: 2007-03-06
Filing date: 2007-03-06
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2027-03-06
Also published as: CN101260391A

Abstract

本发明公开了一种新的PhyA-M蛋白及其应用，所述的PhyA-M蛋白是一种耐热型的植酸酶，可用于分解植酸或植酸盐。本发明还公开了编码PhyA-M蛋白的基因，含有所述基因的载体以及宿主细胞。所述的PhyA-M蛋白在饲料添加剂等领域具有广泛的应用前景。

Description

耐热型植酸酶基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体的，本发明涉及一种耐热型植酸酶及其应用。

背景技术

磷是动物机体必需的矿物元素，虽然存在于动物性饲料中的磷大部分能被动物体吸收利用，但由于其价格昂贵，限制了在饲料中的使用。存在于植物性饲料中的磷大部分以植酸(即肌醇六磷酸)或植酸盐的形式存在，而单胃动物体内缺乏分解植酸的植酸酶(Phytase，催化植酸及植酸盐水解的酶)，造成饲料中磷的利用率仅有1/3或更低，为了补充有效磷的不足，必须在饲料中添加无机磷酸盐，这样势必造成磷源的浪费，导致磷的过量排泄。单胃动物饲料中通过添加植酸酶，可以提高饲料中植酸磷的利用率，减少磷的排出对环境的污染。植酸酶属于磷酸单脂水解酶，是一种能降解植物性饲料中植酸及其盐类的磷酸酯酶。植酸酶能将植酸分解为肌醇和磷酸，大部分植酸酶(85％)在胃部发挥作用，小部分在小肠前端起作用，小肠后端无植酸酶活动。植酸酶只作用于植酸，只有当饲料中存在足量的植酸时，添加植酸酶才有实际价值。随着生物技术特别是采用DNA重组技术后，使植酸酶在生产中的大量应用成为可能。

植物性植酸酶的最适pH值在4.8-6.0之间，在pH值小于3.0时，活性显著下降，甚至失活。微生物植酸酶所耐受的pH值范围比大多数植物性植酸酶要宽，一般pH值在2.5-6.0之间。绝大多数植酸酶发挥酶活性的最适温度为45-55℃。

然而，目前植酸酶的温度耐受极限还远不能满足大多数生产颗粒饲料的要求。并且，某些植酸酶的酶活性也不够理想。因此，本领域需要进一步寻找新的耐高温且活性高的植酸酶，以提高动物对磷的吸收，有效地节省成本。

发明内容

本发明的目的在于提供新型耐热型植酸酶，该植酸酶具有耐高温的特性，并且具有高的酶活性。

在本发明的第一方面，提供一种分离的蛋白，该蛋白选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；或

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽同种功能(即具有分解植酸或植酸盐的功能)的由(a)衍生的多肽。

在本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组：

(i)编码所述的蛋白的多核苷酸；或

(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。

在本发明的另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

在本发明的另一优选例中，该多核苷酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，

它含有所述的载体；或

它的基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的第五方面，提供所述的蛋白的用途，用于分解植酸或植酸盐。

在本发明的第六方面，提供一种制备所述的蛋白的方法，该方法包括培养所述的宿主细胞，收集获得所述的蛋白。

在本发明的第七方面，提供一种组合物，所述组合物中含有有效量的所述的蛋白，以及食品学或饲料学上可接受的载体。

在本发明的另一优选例中，所述的组合物中含有Mg2+、Mn2+、或EDTA。

在本发明的另一优选例中，所述的组合物中不含有Zn2+、Al3+、Cu2+、或Fe3+。

在本发明的第八方面，提供一种制备含有所述的蛋白的转基因植物的方法，所述的方法包括步骤：将所述的多核苷酸导入植物细胞中，培养所述的植物细胞，再生成植物。

在本发明的另一优选例中，所述方法包括步骤：

(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的多核苷酸；

(s2)将植物细胞或组织或器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使所述的多核苷酸转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(s3)选择出转入所述的多核苷酸的植物细胞或组织或器官；以及

(s4)将步骤(s3)中的植物细胞或组织或器官再生成植物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现一种新的耐热型植酸酶，本发明人将之命名为PhyA-M。试验证实，该植酸酶具有很高的酶活性(在常温(37℃)下酶活达到1.3×103U/mg)，且即使在80℃的高温下酶活存留率也在75％以上。可见该植酸酶是一种耐热型的植酸酶，具有广泛的应用前景。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的PhyA-M蛋白或多肽”是指所述的PhyA-M蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化PhyA-M蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括PhyA-M蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然PhyA-M蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“PhyA-M蛋白”指具有PhyA-M蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与PhyA-M蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括PhyA-M蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与PhyA-M蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗PhyA-M蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含PhyA-M蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了PhyA-M蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有PhyA-M蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供PhyA-M蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然PhyA-M蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“PhyA-M蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。例如，这些保守性变异多肽可根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明PhyA-M蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码PhyA-M蛋白的多聚核苷酸。

本发明的PhyA-M蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或PhyA-M蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的PhyA-M蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码PhyA-M蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，PhyA-M蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含PhyA-M蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在一些宿主中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

作为本发明的一种实施方式，可利用本发明的PhyA-M蛋白的编码基因来制备转基因植物，获得的转基因植物表达PhyA-M蛋白。将所述的转基因植物作为动物的饲料成分，可以使饲料中具有稳定来源的，因而不需要额外添加植酸酶。

此外，也可在动物体内导入PhyA-M蛋白的编码基因，从而动物自身可表达PhyA-M蛋白，使PhyA-M蛋白成为一种内源酶。这就省去了很多外源的添加工作。

本发明还提供了一种组合物，它含有安全有效量的本发明的PhyA-M蛋白以及食品学上或饲料学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、乙酸、麦麸、玉米芯或它们的组合。组合物制剂应与给药方式相匹配。本发明的组合物可以被制成颗粒剂的形式，例如用玉米芯或麦麸以及其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。

在喂食动物时，通常将含有安全有效量的PhyA-M蛋白的组合物给予动物，在制备颗粒饲料时，通常调节饲料中PhyA-M蛋白的酶活在0.005-50U/g；优选的为0.05-5U/g；更优选的为0.1-1U/g。当然，具体给予剂量还应考虑饲料的其它营养成分配方、动物的自体状况等因素，这些都是本领域技术人员所熟知的。

作为本发明的一个实例，本发明提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。所述的多核苷酸是从高产耐热植酸酶的菌种中分离出的，并且根据酵母的密码子偏爱性进行了密码子优化。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1329个碱基，编码全长为442个氨基酸的PhyA-M蛋白(SEQ ID NO：2)。该蛋白可添加到动物饲料或其它需要补充植酸酶以分解植酸或植酸盐的物质中，用于分解植酸或植酸盐。

本发明的主要优点在于：

首次分离得到一种新的耐热型植酸酶，该植酸酶具有很高的酶活性，在发酵罐水平上，经甲醇诱导120h后表达量达到2.5mg/mL，植酸酶活性(发酵效价)达3.0×10³U/mL以上。并且，即使在80℃的高温下酶活存留率也在75％以上，具有广泛的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照以下文献中公布的方法：Carl W.Dieffenbach和Gabriela S.Devksler eds.PCRPrimer：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995。或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：耐热型植酸酶基因的克隆

1.样品的采集

从温泉等温热地域采集土壤或枯死植物的标本，这些地方由于具有大量植物性的植酸，因此可通过筛选获得对植酸具有很强代谢能力的菌群，而且环境温度很高，从而比较容易分离出具有耐热性的植酸酶的基因。

2.高产耐热植酸酶菌种的分离

通过对分离的样品进行富集培养，将这些菌悬液涂布于含有植酸钙的选择培养基中生长，待具有水解圈时，逐个分离所有菌落单独培养，然后再通过水解圈的大小筛选出具有高产性能的菌种。

通过微生物分类的方法，鉴定每个菌落的分类学地位，然后再通过不同液体培养基对每株菌在最适宜的条件下进行植酸酶的诱导发酵，筛选出可高产植酸酶的菌种。

3.植酸酶基因同源引物的设计

在确定所筛选的菌种所属的种类，通过生物信息学序列数据库提供的与该物种同源物种的植酸酶基因序列，采用多序列比对的方式，寻找这些基因相似的区域，然后将这些氨基酸序列反翻译成简并的核苷酸序列，根据这些序列设计具有同源性的同源引物。所述同源引物的序列为：

正向(phy5-1)：ctncgngagagwagntcwtc(SEQ ID NO：3)；

反向(phy3-1)：astcnacctahatsgtwgcg(SEQ ID NO：4)。

其中，n：a，t，g，或c；

w：a，或t；

s：g，或c；

h：c，t，或a。

4.菌体RNA的提取以及RT-PCR

使用Trizol方法提取菌体的RNA。

将粉末状细胞装入处理过的1.5mL EP管中，加入1mL TRIZOL用枪反复吹打，混匀，盖上EP管盖。室温下静置5分钟，以利于TRIZOL进一步处理细胞。

加入0.2mL氯仿到EP管中，盖上管盖，用手拿住EP管反复摇动15秒后，于室温下静置2-3分钟后，12,000rpm离心15分钟。

取出，吸上清到一新1.5mLEP管中，注意不要吸入蛋白质。加入0.5mL异丙醇。将EP管轻轻颠倒2，3次后。于-20℃沉淀1小时以上。12,000rpm离心10分钟。

去上清，加入1mL75％乙醇，将EP管轻轻颠倒2，3次后于8,000rpm离心5分钟。倒掉乙醇，将1.5mLEP管倒扣于滤纸上5-10分钟晾干。

最后用20-50uL无RNase酶的水溶解后，放入液氮或-20℃保存。

将总RNA于70℃水浴变性2分钟，立即置于冰上5分钟，然后使用Promega公司的如下反转录体系进行反转录：

Gold Buffer 7.4μL；

dNTP10mmol/L 0.15μL；

Oligo(dT)₁₅ 1.2μL；

rRNasin Ribonuclease Inhibitor 0.75μL；

AMV RT(20～25U/μL) 0.5μL。

加入20μL总RNA，于37℃反转录40分钟，完成后放置在95℃水浴中5分钟终止反应。取2.5μL前述反转录cDNA产物作为模板，按照如下体系进行第一轮的梯度PCR扩增：

去离子水 32μL；

10×PCR缓冲液 5μL；

MgCl₂ 4μL；

dNTP Mix(10mmol/L) 4μL；

phy5-1Primer(20μmol/L) 1μL；

phy3-1Primer(20μmol/L) 1μL；

Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL。

取1μL第一轮梯度PCR扩增产物作为模板，使用内侧巢式引物按照如下体系进行第二轮梯度PCR扩增，其中phy5-2引物序列为：5’cgaacagagccgctccggcg3’(SEQ ID NO：6)

去离子水 33.5μL；

10×PCR缓冲液 5μL；

MgCl₂ 4μL；

dNTP Mix(10mmol/L) 4μL；

phy5-2Primer(20μmol/L) 1μL；

phy3-1Primer(20μmol/L) 1μL；

Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL。

采用巢式PCR和梯度PCR的方法，对反转录cDNA进行多轮扩增，将特异性的扩增片断，通过胶回收和TA克隆的方法，克隆到载体中测序，获得携带植酸酶的EST序列的TA载体。

5.RACE的方法克隆植酸酶基因

GSP引物设计：要求引物长度在23～28bp之间，GC含量50～70％，Tm≥65℃，同时对于EST序列最好尽量靠近5’端，有利于扩增5’未知序列。使用PrimerPremi er5.0软件设计3’端引物，获得的3’端引物序列为：5’aacttcgtgcacacaccgtggtccagcg3’(SEQ ID NO：5)；另外5’端采用SMART^TMRACE cDNA Amplification Kit自带的通用引物。按SMART^TMMRACE cDNAAmplification Kit操作说明书完成全部克隆过程，获得基因的5’末端和3’末端。

通过生物信息学的手段将这条基因拼接成完整基因，再通过RT-PCR扩增出全长基因，TA克隆并测序，分析基因的核酸序列和蛋白质序列，找到与之同源的基因。

实验结果表明，在所获得的2个克隆子中均为同一条基因(确定是SEQ IDNO：1)，且该基因与曲霉的植酸酶基因具有较高相似性(同源性96％)。

实施例2：耐热植酸酶基因的改造及人工合成

根据编码植酸酶成熟蛋白的基因序列，按照毕赤酵母密码子的偏爱性，在不改变其氨基酸序列的前提下进行序列改造，同时在序列中避免富含AT序列(ATTTA、AATAA、AATTAA等)的出现。并按所用克隆载体的多克隆位点设计、添加合适的限制性内切酶位点，将全基因分为11个部分，再将每个部分分为长度不超过60个核苷酸的单链核苷酸片段进行人工合成，人工合成的方法是本领域人员熟知的。

基因去掉N-端66bp的信号肽编码序列后，全长1329bp。按毕赤酵母密码子偏向，在不改变氨基酸序列的前提下进行改造，共改变了36个碱基涉及20个密码子，基本符合毕赤酵母G+C的含量特征。

核酸序列(SEQ ID NO：1)：

tctgctggct ccaagtcctg cgatacggta gacctcgggt accagtgctc ccctgcgact 60

tctcatctat ggggcctgta ctcgccattc ttttcgctcg aggacgagct gtccgtgtcg 120

agtaagcttc ccaaggattg cagaatcacc ttggttcagg tgctatctag acatggagct 180

agatacccaa ccagctccgc gagcaaaaag tataagaagc ttgtgacggc gatccaggcc 240

aatgccaccg acttcaaggg caagtttgcc tttttgaaga cgtacaacta tactctgggt 300

gcggatgacc tcactccctt tggggagcag cagctggtga actcgggcat caagttctac 360

cagaggtaca aggctctggc tagaagtgtg gtgccattta ttagagcctc aggctcggac 420

agagttattg cttcgggaga gaagttcatc gaggggttcc agcaggcgaa gctggctgat 480

cctggcgcga cgaacagagc cgctccggcg attagtgtga ttattccgga gagcgagacg 540

ttcaacaata cgctggacca cggtgtgtgc acgaagtttg aggcgagtca gctgggagat 600

gaggttgcgg ccaatttcac tgcgctcttt gcacccgaca tcagagctag agccgagaag 660

catcttcctg gcgtgacgct gacagacgag gacgttgtca gtctaatgga catgtgttcg 720

tttgatacgg tagctagaac cagcgacgca agtcagctgt caccgttctg tcaactcttc 780

actcacaatg agtggaagaa gtacaactac cttcagtcct tgaagaagta ctacggccac 840

ggcgcaggca accctctggg accggctcag gggatagggt tcaccaacga gctgattgcc 900

agattgacta gatctccagt gcaggaccac accagcacta actcgactct agtctccaac 960

ccggccacct tcccgttgaa cgctaccatg tacgttgact tttcacacga caacagcatg 1020

gtttccatct tctttgcatt gggcctgtac aacggcactg aacccttgtc cagaacctcg 1080

gtggaaagcg ccaaggaatt ggatgggtat tctgcatcct gggtggtgcc tttcggcgct 1140

agagcctact tcgagacgat gcaatgcaag tcggaaaagg agcctcttgt tagagctttg 1200

attaatgaca gagttgtgcc actgcatggc tgcgatgtgg acaagctggg tagatgcaag 1260

ctgaatgact ttgtcaaggg attgagttgg gccagatctg ggggcaactg gggagagtgc 1320

tttagttga 1329

蛋白序列(SEQ ID NO：2)：

SAGSKSCDTV DLGYQCSPAT SHLWGLYSPF FSLEDELSVS SKLPKDCRIT LVQVLSRHGA 60

RYPTSSASKK YKKLVTAIQA NATDFKGKFA FLKTYNYTLG ADDLTPFGEQ QLVNSGIKFY 120

QRYKALARSV VPFIRASGSD RVIASGEKFI EGFQQAKLAD PGATNRAAPA ISVIIPESET 180

FNNTLDHGVC TKFEASQLGD EVAANFTALF APDIRARAEK HLPGVTLTDE DVVSLMDMCS 240

FDTVARTSDA SQLSPFCQLF THNEWKKYNY LQSLKKYYGH GAGNPLGPAQ GIGFTNELIA 300

RLTRSPVQDH TSTNSTLVSN PATFPLNATM YVDFSHDNSM VSIFFALGLY NGTEPLSRTS 360

VESAKELDGY SASWVVPFGA RAYFETMQCK SEKEPLVRAL INDRVVPLHG CDVDKLGRCK 420

LNDFVKGLSW ARSGGNWGEC FS 442

在基因(SEQ ID NO：1)的5′端添加EcoRI位点，3′端添加Not I和HindIII位点，以便于基因克隆到转移载体pUC19及表达载体pPIC9上。按照基因合成的常规方法，将合成基因各部分分别克隆于载体pUC19(华美生物工程公司)上，再进一步拼接得到完整的改造全基因phyA-m，重组质粒命名为pUC19-phyA-m。phyA-m基因经序列测定后证实该基因与设计的序列一致。

实施例3：耐热植酸酶基因在酵母中的高效诱导表达及其分析

1.合成片段的拼接及重组表达载体的构建

利用EcoR I/Not I酶切位点，将phyA-m从pUC19-phyA-m上切下，然后通过EcoR I/Not I位点克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9(Invitrogen)上，得到重组载体pPIC9-phyA-m。DNA的重组操作主要依据Sambrook等人，分子克隆：实验室指南进行。

2.酵母的电击转化及筛选

将重组载体pPIC9-phyA-m用BglII酶切使之线性化，电击转化毕赤酵母GS115(Invitrogen)。挑取阳性转化子。电转化及筛选方法参见Invitrogen公司操作手册。

3.重组酵母的诱导表达

重组酵母在5mL BMGY培养基中于30℃摇床培养48h，离心收集菌体，加入1mLBMMY甲醇诱导培养基悬浮菌体，继续在30℃下诱导培养48h，取样检测各菌株上清液中的植酸酶活性，从中筛选出表达植酸酶的转化子。

酶活性单位定义为：在一定条件下，每分钟释放出1μmol无机磷所需的酶量为一个酶活性单位(U)。

酶活性测定方法参见实施例5，酶测定体系pH值为5.0。

4.发酵罐水平植酸酶的表达

重组酵母在5L发酵罐(BIOSTAT B5型)中进行发酵。重组酵母的发酵为高细胞密度补料发酵，发酵过程分为菌株培养阶段、碳源饲喂阶段和诱导表达阶段，具体方法见Invitrogen操作手册。在诱导过程中每12h取样一次测定表达的植酸酶的积累量并进行表达蛋白的SDS-PAGE。

实验结果表明：选择摇床水平表达量高的毕赤酵母重组菌株P.pastorispPIC9-phyA-m26进行5L发酵罐发酵研究。在诱导之前的菌体生长阶段发酵上清中检测不到植酸酶活性。随着甲醇的诱导，上清液中植酸酶酶活力显著增加，酶蛋白不断积累。经甲醇诱导120h后表达量达到2.5mg/mL，植酸酶活性(发酵效价)达3.0×10³U/mL以上。

毕赤酵母表达的植酸酶纯化方法如下：首先进行脱盐处理，再经分子筛Superdex_75_HR_10/30纯化。分步收集洗脱峰，每管1mL，作为植酸酶酶学性质研究的样品。

实施例4：耐热性植酸酶的酶学性质检测

经纯化的植酸酶在不同pH及不同温度条件下进行酶促反应以测定其最适pH和最适温度。将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理1h及在不同温度(60℃、70℃、80℃)下分别处理30min，在37℃、pH5.0的条件下分别测定酶活性以测定酶的pH稳定性和酶的热稳定性。

酶的比活单位的定义为每mg酶蛋白所表现出的酶活性单位(U)。通过考马斯亮蓝法测定样品酶液中的蛋白含量，同时测得其植酸酶酶活性，由此得到酶的比活性，结果表明比活力为1.3×10³U/mg。

通过不同温度对植酸酶的耐热性做出研究，分别将酶液放置于55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃，85℃，90℃，95℃的水浴中温育10min。取出后在室温放置冷却，测定每个温度下处理的酶液酶活，以正常保存条件下的酶液酶活为对照，计算相对酶活及其耐热性。

在酶促反应体系中加入终浓度为1mM不同的金属离子及化学试剂，在37℃、pH5.0条件下测定酶活性，研究其对酶活性的影响。

实验结果表明：最适pH为5.5，当pH大于6时，酶活迅速降低；在pH2～10之间酶活具有双峰。在pH5.0，同温度下酶活性的测定结果表明，该酶的最适反应温度为55℃。80℃、10min的水浴处理，酶活存留率基本在75％以上。在酶促反应体系中加入不同的化学试剂，然后分别测定酶活性，结果表明，Mg2+、Mn2+和EDTA对phyA有激活作用；金属离子Zn2+、Al3+、Cu2+和Fe3+对phyA的酶促反应均有不同程度的抑制作用。

并且，经过测定，与曲霉的植酸酶相比较，本发明的耐热植酸酶的酶活提高了70％，且曲霉的植酸酶的植酸酶在80℃、10min的水浴处理后，酶活存留率仅为60％。

实施例5：植酸酶酶活测定

1.方法原理

植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的(NH₄)₃PO₄NH₄VO₃·16MoO₃复合物，在波长415nm下进行比色测定。

2.试剂和溶液

本方法中所用试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。并且，清洗试验用容器不要用含磷清洗剂。

2.1 0.25mol/L乙酸缓冲液(1)：

称取34.02g三水乙酸钠于1000ml容量瓶中，加入900ml水溶解，用盐酸调节pH至5.0±0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放2个月有效。

2.2 0.25mol/L乙酸缓冲液(2)：

称取34.02g三水乙酸钠，0.5g Triton X-100，0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000ml容量瓶中，加入900ml水溶解，用盐酸调节pH至5.0±0.01，并用蒸馏水定容至1000ml，室温下存放2个月有效。

2.3 7.5mmol/L植酸钠(底物)溶液

称取0.6929g肌醇六磷酸钠(C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂)于100ml容量瓶中，用0.25mol/L乙酸缓冲液(1)溶解并定容至刻度，调pH值到5.0，现用现配(实际反应液中的最终浓度为5.0mmol/L)。

2.4硝酸溶液：1:2水溶液。

2.5100g/L钼酸铵溶液：称取10g钼酸铵[(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O]于100ml容量瓶中，加入1.0ml氨水(25％)用水溶解定容至刻度。

2.6 2.35g/L钒酸铵溶液：称取0.235g钒酸铵(NH₄VO₃)于100ml棕色容量瓶中，加入2ml硝酸溶液，用水溶解定容至刻度。避光条件下保存1周有效。

2.7颜色终止液：移取2份硝酸溶液，1份钼酸铵溶液，1份钒酸铵溶液混合后使用，现用现配。

2.8磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：基准物。

3仪器和设备

3.1实验室常用仪器设备。

3.2恒温水浴：37±0.1℃。

3.3分光光度计；有10mm比色皿，可在415nm下测定吸光度。

3.4磁力搅拌器。

3.5涡流式混合器。

3.6酸度计：精确至小数点后2位。

3.7离心机：转速为4000r/min以上。

4.试样制备

取植酸酶样品，用常规的四分法将试样缩分至200g，植酸酶产品不需粉碎，配合饲料和添加剂预混合饲料需粉碎通过0.45mm标准筛，装入密封容器，防止试样成分变化。

5.测定步骤

5.1绝对法

5.1.1标准曲线

准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于100ml容量瓶中，用0.25mol/L乙酸缓冲液溶解，并定容至100ml，浓度为50.0mmol/L。按下面表2的比例稀释成不同浓度，与试样一起反应测定，以吸光值为横坐标，反应体系中无机磷的量(μmol)为纵坐标，列出直线回归方程(y＝ax+b)。

表2

标准序号	稀释量，ml	浓度，mol/ml	反应体系中无机磷的量，mol
				12345	0.5→10.5→20.5→40.5→80.5→16	2512.56.253.1251.5625	52.51.250.6250.3125

5.1.2试样溶液的制备：

称取试样两份，每份1.0000g，精确至0.0001g，置于100ml容量瓶中，加入约70ml乙酸缓冲液(2)，一个磁力棒，在磁力搅拌器上高速搅拌30min，用乙酸缓冲液(2)定容至刻度(减去磁力棒的体积)。摇匀，在离心机上以4000r/min离心10min。分取不同体积的上清液用乙酸缓冲液(2)稀释，使样液浓度保持在0.4U/ml左右，待反应。

前述植酸酶纯化后经使用乙酸缓冲液(1)按照以上步骤稀释。

5.1.3反应

取10ml试管按下面的反应顺序进行操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致，37℃水解30min。

反应步骤及试剂、溶液用量见表3。

表3

5.1.4样品测定

反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机以上4000rpm离心10min，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计415nm波长处测定样品空白(A₀)和样品溶液(A)的吸光值，A-A₀为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。

6结果计算和表示

6.1计算公式

试样中植酸酶的活性，用每克(或mL)试样中的活性单位“U”表示，计算公式如下。

式中：

c——根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的y值；

F——试样溶液反应前的总稀释倍数；

0.2——0.2ml酶稀释液(步骤5.1.2)；

M——样品质量；

30——反应时间(分钟)。

实施例6：蛋白变体

采用常规的方法，在本发明的PhyA-M蛋白的N端加上6个组氨酸标签(His-6)，在使用常规方法表达出N端携带组氨酸标签的PhyA-M蛋白后，使用Ni-NTA亲和层析将被组氨酸标签的靶肽进一步纯化。

洗脱并收集纯化产物，按实施例4和5所述的方法，测定所获得的PhyA-M蛋白的酶学活性和耐热性，结果表明所述的携带组氨酸标签的PhyA-M蛋白与不带组氨酸标签的PhyA-M蛋白活性相近，且也具有良好的耐热性。

实施例7：含有耐热型植酸酶的组合物

配制植酸酶组合物(5000型天然耐热型颗粒)如表4：

表4

成分	含量
		玉米淀粉	90wt％
微晶纤维素钠	2wt％
		植酸酶	5000U/g

水份

余量(<8wt％)

将上述各成分充分混合，根据常规的方法制成颗粒饲料产品。

按以下表5的配方，用常规方法制备肉鸡用饲料(含量：wt％)，采用的植酸酶组合物为上述制备的5000型天然耐热型颗粒：

表5

饲料原料	正对照组	负对照组	配方1
				玉米	65.4	65.4	65.4
豆粕	24.1	24.1	24.1
				次粉	3	3	3
玉米蛋白粉	4	4	4
				钙粉	1	1.38	1.38
磷酸氢钙	1.6	0.99	0.99
				沸石粉	0	0.23	0.219
赖氨酸	0.192	0.192	0.192
				蛋氨酸	0.15	0.15	0.15
食盐	0.25	0.25	0.25
				预混料	0.385	0.385	0.385
植酸酶组合物	0	0	0.011
				总计	100	100	100

将上述对照组和实验1组各原料充分混合，按照常规方法制成饲料。

实施例8：动物试验

将实施例7制备的配方1的饲料以及正对照组和负对照组的饲料分别喂食肉鸡，观察肉鸡的生长状况。

结果发现，与对照组相比，动物在食用实施例7制备的饲料组合物后，可使肉鸡的增重、采食量、料肉比达到正常(正对照组)的水平(P>0.05)，而负对照组的肉鸡表现出缺磷症状。说明配方1的饲料中包含的植酸酶经过饲料制粒(经过约蒸汽瞬间高温(最高温时为100℃)处理)后，仍保留足够的酶活，可以降解植酸磷释放出足够的无机磷，弥补磷酸氢钙不足所引起的钙磷失调，生产性能下降，满足肉鸡的生长对磷的需要。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>四川禾本生物工程有限公司

<120>耐热型植酸酶基因及其应用

<130>070927

<160>6

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>1329

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>植酸酶基因

<400>1

<210>2

<211>442

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>植酸酶蛋白

<400>2

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>n is a，c，g，or t

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>n is a，c，g，or t

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

<223>n is a，c，g，or t

<400>3

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>n is a，c，g，or t

<400>4

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

Claims

1.一种分离的蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组：

(i)编码权利要求1所述的蛋白的多核苷酸；或

(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

5.权利要求1所述的蛋白的用途，其特征在于，用于分解植酸或植酸盐。

6.一种制备权利要求1所述的蛋白的方法，其特征在于，培养权利要求5所述的宿主细胞，收集获得权利要求1所述的蛋白。

7.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有有效量的权利要求1所述的蛋白，以及食品学或饲料学上可接受的载体。

8.一种制备含有权利要求1所述的蛋白的转基因植物的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：将权利要求2所述的多核苷酸导入植物细胞中，培养所述的植物细胞，再生成植物。