CN102854158B - 一种快速测定植酸酶耐温性能的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种快速测定植酸酶耐温性能的方法。首先，该方法直接对植酸酶产品进行耐温性能测定，一方面大大降低了由于将其添加到饲料中存在的混合不均匀现象而导致的层层抽样误差；另一方面也避免了饲料中的其它物质对植酸酶检测准确性造成的干扰。其次，模拟实际颗粒饲料生产中的制粒温度和水分，并采取水浴加热方式保证各个样品受热均匀。第三，对样品数量和操作细节进行了规定，保证测定具有良好的可重复性。

Description

一种快速测定植酸酶耐温性能的方法

技术领域

本发明涉及一种快速测定植酸酶耐温性能的方法。

背景技术

目前，植酸酶已经广泛应用于单胃动物的饲料生产中，其大大降低了饲料成本和排泄磷对环境造成的污染，具有非常显著的经济效益、社会效益和生态效益。然而，在中国的饲料工业中，70％以上的饲料是颗粒饲料，而植酸酶的化学本质是蛋白质，对热非常敏感，所以在饲料制粒过程中非常容易失活。随着现代生物技术和酶工程技术的不断进步，植酸酶生产工艺也取得了很大发展，各种耐高温植酸酶产品应运而生，但由于缺乏简便有效的耐高温性能评价方法，使用户在选择耐高温植酸酶时陷入困境。有人试图通过测定实际制粒过程中植酸酶的存留率来评价植酸酶的耐高温性能，但常因混合不匀、抽样误差以及饲料中其它成分对植酸酶检测的干扰，以及试验条件难以控制等问题，而使评价效果及可重复性都很差，因此迫切期待有更加快捷准确的评价方法产生。

每吨全价配合饲料中添加5000U/g的耐高温植酸酶150g制粒后，分别抽取五组样品，检测其植酸酶活性(U/g)，结果如表1所示：

表1同种饲料配方添加植酸酶制粒后酶活检测结果(U/g)

样品编号	一组	二组	三组	四组	五组
						1	290	341	216	909	45
2	1860	444	851	267	249
						3	350	203	300	280	239
4	310	404	760	664	457
						5	530	508	398	545	118
6	360	550	1092	275	790
						7	710	289	497	615	684
8	630	78	15	494	338

样品编号	一组	二组	三组	四组	五组
						9	370	140	155	189	922
10	410	321	569	926	107
						平均值	582	327.8	485.3	516.4	394.9
变异系数(％)	80.82	47.27	69.68	51.57	77.92

同样，在不同动物种类的饲料配方中每吨全价配合饲料中添加5000U/g的耐高温植酸酶150g制粒后，测定其酶活(U/g)，结果如表2所示：

表2不同动物种类饲料配方添加植酸酶制粒后酶活检测结果(U/g)

由上述结果可以看出，无论是在同种饲料或不同种饲料中添加植酸酶制粒后，样品的检测结果变异系数都很高，平均存留活性变化也很大，并且无规律可循。因此，通过测定实际制粒过程中植酸酶的存留率的实际制粒法不是评价植酸酶耐温性的理想方法。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供了一种快速测定植酸酶耐温性能的方法，该方法包括以下步骤：

1)将植酸酶产品制成具有一定含水量的植酸酶待测样品，并且将所述植酸酶待测样品按等份用袋封装成(m+1)×n份植酸酶样品，其中，所述植酸酶待测样品的含水量可为16％～18％，用以模拟颗粒饲料生产工艺中调质器内饲料的水分，优选的含水量可为18％，并且其中，m为根据实际制粒温度要求设定的加热温度点的个数且为大于或等于1的整数，以及n为每个温度点处理的植酸酶样品的个数且为大于或等于2的整数；

2)将步骤1)中的m×n份植酸酶样品以每种温度条件下n份分别放入处于75℃～95℃的m个具有不同加热温度点的水浴中加热处理3～10分钟，加热处理后立即冷却，测定植酸酶的酶活，记录结果；另取未经加热处理的步骤1)中的n份植酸酶样品同时进行酶活测定，作为初始对照，记录结果；

3)根据步骤2)中记录的结果计算酶活存留率，

酶活存留率＝存留酶活/初始酶活×100％

其中，将每个温度点处理的n份样品的测定结果取算术平均值作为该温度点存留酶活，未加热的n份样品的测定结果的算术平均值作为初始酶活；以及

4)根据计算结果，评价植酸酶产品的耐温性能。

本发明中，可以设定多个温度点，从而更加全面地反映植酸酶产品的耐温范围和性能。优选地，m为2或3，且n为3。

本发明中，步骤1)中所述的含水量可优选为18％。具体地，含水量为18％的植酸酶待测样品可以通过如下方法得到：取适量植酸酶产品放入塑料封口袋中，使用下述公式计算将含水量补充到18％时的蒸馏水用量；然后准确称量蒸馏水，加入到塑料封口袋中，密封袋口，充分混匀；最后称取适量植酸酶样品，装入铝箔袋中，用塑封机密封。其中，补水量计算公式为：

补水量(mL)＝取样量×(1-a)/0.82-取样量

“取样量”指用来评价耐温性的植酸酶产品的样品量(单位以克计，取样方法参照国家标准《饲料采样》GB/T14699.1-2005执行)。a表示植酸酶产品初始水分的百分含量。

本发明中，优选地，步骤2)中所述的加热处理时间可为5～10分钟，以5分钟为最佳时间，并根据实际制粒温度要求设定加热温度点，其中，所述加热温度点可选自75℃、80℃、85℃、90℃和95℃中的一个或多个。

本发明中，可以将步骤2)中热处理后的样品袋立即冷却至25℃以下，测定样品酶活。

本发明中，步骤1)中所述的样品袋可为铝箔袋。

步骤2)中所述加热温度可为75～95℃，该温度可以以经校准的水银温度计测定为准。并且为确保水浴温度的一致，水浴锅的水位可保持在水浴锅2/3处。

可以按照GB/T18634-2009方法测定步骤2)中所述的植酸酶的酶活。

本发明中，加热处理后的样品应马上测定酶活。如果不能马上测定，可将未测样品放于冷藏室保存待测。

本发明中，测定过程所用试剂、仪器、测定人应尽量保持一致。

本发明中，铝箔袋内容规格可为8cm×6cm。

与现有技术相比，本发明提供的快速测定植酸酶耐温性能的方法具有以下优点：

首先，该方法直接对植酸酶产品进行耐温性能测定，一方面大大降低了由于将其添加到饲料中存在的混合不均匀现象而导致的层层抽样误差；另一方面也避免了饲料中的其它物质对植酸酶检测准确性造成的干扰。

其次，模拟实际颗粒饲料生产中的制粒温度和水分，并采取水浴加热方式保证各个样品受热均匀。

第三，对样品数量和操作细节进行了规定，保证测定具有良好的可重复性。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分优选的实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1对同一耐高温植酸酶样品进行多次重复测定

(1)试验材料和设备：植酸酶样品(昕洋磷包衣微丸植酸酶，批次号0106021009)(5000U/g)200g；铝箔袋：外沿长12cm×宽10cm；水浴锅(HH-601A)；塑封封口机(GK9-69M)。

(2)酶活测定方法：按照GB/T18634-2009方法测定。

(3)试验方案：

试验条件：水浴测定温度85℃，90℃(注：温度以经校准的水银温度计测定为准)。

试验方法：

(3.1)取植酸酶产品100g放入7号塑料封口袋中，使用下述补水量计算公式计算将含水量补充到18％时的蒸馏水用量为14.6g，然后准确称量蒸馏水，加入到塑料封口袋中，密封袋口，充分混匀。称取9等份该植酸酶样品(分为初始、85℃处理和90℃处理3组，每组三个重复)，每份10g，分别装入铝箔袋中，用塑封机密封。补水量公式如下：

补水量(mL)＝取样量×(1-a)/0.82-取样量

其中，a表示植酸酶产品初始水分的百分含量，补水可用适当刻度的移液管吸取添加。

(3.2)首先调节水浴锅至85℃，待恒温后，同时放入3份上述植酸酶样品(组2)，放入后立即开始计时，水浴5分钟以后取出样品，将样品袋立即放入凉水中冷却；然后再将水浴温度调节为90℃，温度恒定后，同时放入另外三份样品(组3)，进行加热处理，过程同前。最后将样品充分混匀，测定植酸酶的酶活，记录结果。同时测定剩余的3份植酸酶样品(组1)的酶活，作为处理前的初始对照。

(4)结果计算：

(4.1)将该温度点处理的三个样品的测定结果取算术平均值作为该温度点存留酶活，未加热的三个样品测定结果平均值作为初始酶活。

(4.2)按公式：该温度点的酶活存留率＝存留酶活/初始酶活×100％计算酶活存留率。

(5)将上述试验再重复两次，结果如表3所示。

表3对同一植酸酶样品的多次耐温性测定结果

由表3可以看出，对于同一样品进行多次重复测定，存留率基本保持稳定，说明该测定方法具有良好的再现性。

实施例2对不同植酸酶样品进行耐温性测定

(1)试验材料和设备：规格均为5000U/g的两个耐高温植酸酶样品(耐高温A：昕洋磷耐高温颗粒植酸酶批次号0311021010；和耐高温B：昕洋磷微丸植酸酶批次号0208011009；)和一个普通粉状植酸酶(昕洋磷粉状植酸酶批次号0302011008)各200g；铝箔袋：外沿长12cm×宽10cm；水浴锅(HH-601A)；塑封封口机(GK9-69M)。

(2)酶活测定方法：按照GB/T18634-2009方法测定。

(3)试验方案：

试验条件：水浴测定温度85℃，90℃，95℃(注：温度以经校准的水银温度计测定为准)。

试验方法：

(3.1)分别取上述三种待测植酸酶样品150g放入7号塑料封口袋中，使用下述补水量计算公式计算将含水量补充到18％时的蒸馏水用量，然后准确称量蒸馏水，加入到塑料封口袋中，密封袋口，充分混匀。三种待测植酸酶样品各称取12等份(分为初始、85℃处理、90℃处理和95℃处理4组，每组三个重复)，每份10g，分别装入铝箔袋中，用塑封机密封。补水量公式如下：

补水量(mL)＝取样量×(1-a)/0.82-取样量

其中，a表示植酸酶产品初始水分的百分含量，补水可用适当刻度的移液管吸取添加。

(3.2)首先调节水浴锅至85℃，待恒温后，同时放入3份上述植酸酶样品(组2)，放入后立即开始计时，水浴5分钟以后取出样品，将样品袋立即放入凉水中冷却；然后再将水浴温度调节为90℃，温度恒定后，再放入另外三份样品(组3)，进行加热处理，过程同前；最后再取3份样品(组4)同样进行95℃处理。将所有以上处理好的样品充分混匀，测定植酸酶的活性，记录结果。同时测定剩余的3份植酸酶样品(组1)，作为处理前的初始对照。

(4)结果计算

(4.1)分别将每种样品中该温度点处理的三个样品的测定结果取算术平均值作为该温度点存留酶活，未加热的三个样品测定结果平均值作为初始酶活。

(4.2)按公式：该温度点的酶活存留率＝存留酶活/初始酶活×100％计算酶活存留率(结果如表4所示)。

表4对不同植酸酶样品进行的耐温性测定结果

表4结果表明，利用该测定方法能够较好区分不同植酸酶产品的耐温性能。

Claims (3)

1.一种快速测定植酸酶耐温性能的方法，该方法包括以下步骤：

1)将植酸酶产品制成具有一定含水量的植酸酶待测样品，并且将所述植酸酶待测样品按等份用铝箔袋封装成(m+1)×n份植酸酶样品，其中，所述植酸酶待测样品的含水量为18％，并且其中，m为根据实际制粒温度要求设定的加热温度点的个数且为大于或等于1的整数，以及n为每个温度点处理的植酸酶样品的个数且为大于或等于2的整数；

2)将步骤1)中的m×n份植酸酶样品以每种温度条件下n份分别放入75℃、80℃、85℃、90℃和95℃中的一个或多个具有不同加热温度点的水浴中加热处理5分钟，加热处理后立即冷却至25℃以下，测定植酸酶的酶活，记录结果；另取未经加热处理的步骤1)中的n份植酸酶样品同时进行酶活测定，作为初始对照，记录结果；

3)根据步骤2)中记录的结果计算酶活存留率，

酶活存留率＝存留酶活/初始酶活×100％

其中，将每个温度点处理的n份样品的测定结果取算术平均值作为该温度点存留酶活，未加热的n份样品的测定结果的算术平均值作为初始酶活；以及

4)根据计算结果，评价植酸酶产品的耐温性能；

所述植酸酶待测样品可以通过如下方法得到：取适量植酸酶产品放入塑料封口袋中，使用下述公式计算将含水量补充到18％时的蒸馏水用量；然后准确称量蒸馏水，加入到塑料封口袋中，密封袋口，充分混匀；最后称取适量植酸酶样品，装入铝箔袋中，用塑封机密封，

其中，补水量计算公式为：

补水量(mL)＝取样量×(1－a)/0.82－取样量

a表示植酸酶产品初始水分的百分含量。

2.根据权利要求1所述的快速测定植酸酶耐温性能的方法，其中，按照GB/T18634-2009方法测定步骤2)中所述的植酸酶的酶活。

3.根据权利要求1所述的快速测定植酸酶耐温性能的方法，其中，m为2或3，且n为3。