CN114317488A

CN114317488A - 一种比活力提高的植酸酶突变体

Info

Publication number: CN114317488A
Application number: CN202111546394.7A
Authority: CN
Inventors: 程斯达; 康丽华; 李宾; 张静静; 郭瑞; 葛菁华; 单凯
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Guizhou Liupanshui Houquan Ecological Agriculture Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2021-12-17
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2041-12-17
Also published as: CN114317488B

Abstract

本发明涉及基因工程与蛋白质改造技术领域，具体涉及一种比活力提高的植酸酶突变体及其应用。申请人通过蛋白质工程技术，筛选到显著提高植酸酶比活力的突变位点R121A和G342F，从而有利于降低植酸酶的生产成本。所述植酸酶突变体的比活力高达348U/mg，比野生型提高了143.4%，可广泛应用于饲料领域。

Description

一种比活力提高的植酸酶突变体

技术领域

本发明涉及基因工程与蛋白质工程技术领域，具体涉及一种比活力提高的植酸酶突变体。

背景技术

植酸(肌醇六磷酸)，由一个肌醇环和六个磷酸基团组成的，其分子式是C₆H₁₈O₂₄P₆，分子量为660.09，是自然界中肌醇磷酸的最常见的形式。

植酸主要在植物成熟时期合成并富集于植物种子，是磷和肌醇的主要贮藏形式。主要的经济作物如谷物、玉米等中植酸磷含量约占总磷含量的60-80%。磷是动物生长、繁殖及代谢所必需的矿物质因素之一，由于单胃或水产动物缺少能够利用植酸的植酸酶，因此，为了满足动物正常的生长、代谢需要，必须在动物的饲料中添加无机磷替代饲料中低生物利用率的植酸磷。而没有被动物利用的无机磷和植酸磷以粪便的形式排出体外，造成磷源的大量浪费及环境污染，如水体表面富营养化以及海藻的过度繁殖等严重的环境问题。

此外，植酸具有的六个磷酸基团带有极高的负电荷，是一种极强的螯合剂，在单胃动物的肠道环境下，植酸螯合能力强于EDTA，能够与氨基酸(赖氨酸、组氨酸、精氨酸等)、淀粉、矿物质元素结合形成复合物，从而影响这些营养物质的溶解与吸收，主要表现为以三个方面：第一，植酸与生物体必需的金属离子如K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺和Fe²⁺等形成不溶性的金属-植酸复合物，影响动物肠道对金属离子的吸收；第二，植酸与蛋白质形成难溶的络合物影响蛋白质活性，溶解性及解蛋白作用，从而降低动物肠道对蛋白质消化率。在饲养肉鸡的过程中，饲料中添加植酸钠显著增加氨基酸和矿物质内源性损失。许多体外实验显示植酸不仅抑制蛋白质的酶解作用，还对一些蛋白水解酶活性有明显的抑制作用如胃蛋白酶、胰淀粉酶和淀粉酶等。蛋白水解酶活性受植酸抑制一方面是植酸与蛋白质非特异性结合的本质有关，另一方面可能是螯合了对蛋白水解酶有激活作用的金属离子如Ca²⁺、Mg²⁺等，导致其活性间接受到抑制；第三，植酸还能降低维生素、脂类和淀粉利用率。在水产动物养殖过程中，食物的植酸含量高会影响生长性能和使饲料转化效率降低。

植酸酶是能够水解植酸中磷酸单酯键而生成无机磷和磷酸肌醇衍生物的一类酶的总称。单胃动物的饲料中添加植酸酶能够有效地提高植酸磷的利用效率、降低动物排泄物中的磷污染，并能通过去除植酸的抗营养作用来提高氨基酸、蛋白质和矿物质元素等营养物质的消化吸收，提高饲料的营养价值。

在过去二十多年来，由于植酸酶良好的作用效果，植酸酶在家禽、猪和鱼等单胃动物饲料中的添加有了显著的增加。许多研究结果表明，在各种动物中添加植酸酶都可以提高植酸磷的利用。植酸酶的添加也可以提高如Zn²⁺、Mg²⁺和Fe²⁺等矿物质的利用。同时，家禽饲料中添加植酸酶与动物的生产性能、鸡蛋产量和质量等呈正相关。我国是一个畜牧养殖大国，植酸酶的研究与推广使用，在降低动物生产成本、提高动物生产性能和减少环境污染等方面都具有重大意义。

尽管从自然界中获得了很多植酸酶基因并进行了性质研究，但没有一个植酸酶具有完美的酶学性质。对具有高比活力、良好热稳定性和酸稳定性植酸酶的需求，促进了新酶资源的开发以及酶的催化机制研究和蛋白质工程研究新基因或性质优良的植酸酶的发现。利用基因工程技术构建高表达、高活性植酸酶基因工程菌，以及在分子水平上改造植酸酶基因，从而改变植酸酶酶学性质如耐热性、比活力等，提高其使用有效性，是植酸酶研究的主要发展方向。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种植酸酶突变体，提高其比活力，从而有利于降低植酸酶的生产成本，促进其在饲料领域的广泛应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明一方面提供了一种植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

本发明一方面提供了一种植酸酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的植酸酶的第121位氨基酸由Arg变为Ala，第342位氨基酸由Gly变为Phe。

上述植酸酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其编码基因的核酸序列为SEQID NO：4。

本发明还提供了携带有上述植酸酶突变体编码基因的重组质粒。

本发明还提供了携带有上述重组质粒的毕赤酵母重组菌株。

本发明还提供了上述植酸酶突变体在饲料中的应用。

本发明提供的R121A和G342F两个突变位点能显著提高植酸酶PHY01的比活力，从而有利于降低植酸酶的生产成本。所述突变体PHY01-M的比活力高达348U/mg，比野生型提高了143.4%，取得了意料不到的技术效果。所述植酸酶突变体可广泛应用于饲料领域。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

菌株与载体：大肠杆菌DH5α本公司保藏，毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、pPICZA、Amp、G418、Zeocin购自Invitrogen公司。

酶与试剂盒：DNA聚合酶购买自Takara公司，T4连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。

培养基配方：

LB培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；

LB+Amp培养基：LB培养基加100μg/ml氨苄青霉素；

酵母培养基（YPD培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；

YPD+Zeocin培养基：YPD培养基加100μg/ml Zeocin；

酵母筛选培养基（MD培养基）：1.34% YNB，4×10^-5%生物素，1%甘油、2%琼脂糖；

BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10^-5%生物素，1%甘油；

BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10^-5%生物素，0.5%甲醇。

下面结合具体实施方式，对本发明作进一步阐述。

实施例1、植酸酶基因的克隆

申请人将来源于耶尔森菌（Yersinia sp.）的野生型植酸酶基因，命名为PHY01，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。根据毕赤酵母（Pichia pastoris）的密码子偏好性，对PHY01基因进行密码子优化，优化后基因由华大基因公司全基因合成，其核苷酸序列为SEQID NO:2，

采用PCR反应克隆植酸酶基因PHY01片段，引物和反应条件如下：

引物2(F)：GCGCGAATTCATGTCCGTCGCTAAGAGAAACCTTC；

引物2(R)：TAAAGCGGCCGCTTAAATATGACAAGCAGGCTCGATA。

PCR条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min30s，35个循环后，72℃保温10min，基因全长1326bp。

实施例2、比活力提高的植酸酶突变体的筛选

为了进一步提高植酸酶PHY01的比活力，通过定向进化技术对该酶的基因进行了大量突变的筛选。

以优化后的植酸酶基因为模板，利用引物2(F)和引物2(R)用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（Stratagene）进行PCR扩增；胶回收PCR产物，EcoRI、Not I进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养；待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150 ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃、220 rpm培养6 h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有植酸酶的大肠杆菌细胞裂解液。离心去除菌体，将上清液分别进行植酸酶活力和蛋白含量测定，计算各突变体的比活力。

实验结果表明，有些突变对植酸酶PHY01的比活力没有影响，有些突变甚至使其比活力变得更低了。最终，申请人获得比活力显著提高的突变位点的组合：R121A和G342F的两点突变。

将含R121A和G342F两点突变的植酸酶突变体基因命名为PHY01-M，用引物2(F)和引物2(R)对PHY01-M进行PCR扩增，PCR条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min30s，35个循环后，72℃保温10min。PHY01-M基因长度与PHY01基因相同，全长1326bp。

实施例3、重组表达植酸酶基因的毕赤酵母工程菌的构建

1、重组质粒的构建

将克隆得到的野生型植酸酶基因PHY01以及突变体基因PHY01-M分别用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，100 μl酶切体系如下：植酸酶基因的 PCR产物40 μl、10×H buffer 10 μl、10×BSA 10 μl、EcoR I 5 μl、Not I 5 μl、ddH₂O 30 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将表达载体pPIC9K先用限制性内切酶EcoR I进行单酶切，100 μl酶切体系如下：表达载体pPIC9K 20 μl、10×H buffer 10 μl、EcoR I 5 μl、ddH₂O 65 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。将回收片段再用限制性内切酶Not I进行单酶切，100 μl酶切体系如下：pPIC9K回收片段20 μl、10×H buffer 10 μl、10×BSA 10 μl、10×Triton 10 μl、Not I 5 μl、ddH₂O 45 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将经EcoR I和Not I双酶切的植酸酶基因片段与表达载体pPIC9K连接，分别构建得到表达载体pPIC9K-PHY01、pPIC9K-PHY01-M。连接体系如下：表达载体pPIC9K双酶切产物5 μl、植酸酶基因双酶切产物3 μl、10×T₄ ligase buffer 1 μl、T₄ ligase 1 μl。22℃连接过夜，转化到大肠杆菌DH5α，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到LB+Amp液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒pPIC9K-PHY01、pPIC9K-PHY01-M。

2、转化与筛选

将重组酵母表达质粒pPIC9K-PHY01、pPIC9K-PHY01-M分别用Sal I进行线性化，线性化产物用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板。在MD平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株，然后涂布含不同浓度遗传霉素G418的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。

实施例4、摇瓶发酵验证

挑取实施例3获得的单个多拷贝转化子分别接入BMGY培养基中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入BMMY培养基中，30℃、220rpm振荡培养，每24小时添加0.5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，将上清液分别进行植酸酶酶活测定和蛋白含量测定，计算比活力。

（1）植酸酶酶活单位的定义

在温度为37℃、pH为5.5的条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

（2）植酸酶酶活测定方法

取甲、乙两支25mL比色管，各加入1.8mL乙酸缓冲液（PH 5.0）、0.2mL样品反应液，混匀，37℃预热5min。在甲管中加入4mL底物溶液，乙管中加入4mL终止液，混匀，37℃反应30min，反应结束后甲管中加入4mL终止液，乙管中加入4mL底物溶液，混匀。静置10min，分别在415nm波长处测定吸光值。每种样品作3个平行，取吸光值的平均值，通过标准曲线用回归直线方程计算植酸酶活性。

酶活X＝F×C/(m×30)。

其中：X——酶活力单位，U/g(mL)；

F——试样溶液反应前的总稀释倍数；

C——根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U；

m——试样质量或体积，g/mL；

30——反应时间。

（3）蛋白含量测定方法

考马斯亮蓝（Bradford）结合法测定蛋白质含量是比色法与色素法结合的复合方法。考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈棕红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。在3～5分钟即成大量吸收，至少稳定1小时。在10～1000μg/mL范围内，吸光值与蛋白质浓度成正比。

按照酶液和考马斯亮蓝溶液体积比1：5的比例进行混合，静置10mim，考马斯亮蓝（Bradford）结合法测定蛋白质含量。

（4）比活力的计算

“比活力 (Specific Activity)”是指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用U/mg蛋白质来表示。一般来说，酶的比活力越高，酶越纯。

比活力计算公式：比活力（U/mg）=酶活（U/mL）/ 蛋白含量（mg/mL）。

结果显示，在摇瓶水平下，表达植酸酶PHY01的转化子中发酵上清液的比活力最高达到143U/mg；而表达植酸酶突变体PHY01-M的转化子中发酵上清液的比活力最高达到348U/mg，比野生型提高了143.4%，取得了意料不到的技术效果。

本发明提供的R121A和G342F两个突变位点能显著提高植酸酶PHY01的比活力，从而有利于降低植酸酶的生产成本，促进其在饲料领域的广泛应用。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种比活力提高的植酸酶突变体

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Val Ala Lys Arg Asn Leu His Leu Ser Ala Leu Thr Leu Ile

1 5 10 15

Met Gly Cys Phe Thr Ala Ser Ala Ala Pro Ile Ala Thr Ala Pro Ala

20 25 30

Gly Tyr Thr Leu Glu Arg Val Val Ile Leu Ser Arg His Gly Ile Arg

35 40 45

Ser Pro Thr Lys Gln Thr Gln Leu Met Asn Asp Ile Thr Pro Asp Lys

50 55 60

Trp Pro Gln Trp Pro Val Lys Ala Gly Tyr Leu Thr Pro Arg Gly Ala

65 70 75 80

Glu Leu Val Thr Leu Met Gly Gly Phe Tyr Gly Asp Tyr Phe Arg Ser

85 90 95

Gln Gly Leu Leu Ser Ala Gly Cys Pro Val Asp Gly Ser Val Tyr Ala

100 105 110

Gln Ala Asp Val Asp Gln Arg Thr Arg Leu Thr Gly Gln Ala Phe Leu

115 120 125

Asp Gly Ile Ala Pro Asp Cys Gly Leu Lys Val His Tyr Gln Ala Asp

130 135 140

Leu Lys Lys Val Asp Pro Leu Phe His Thr Val Glu Ala Gly Val Cys

145 150 155 160

Lys Leu Asp Ser Ala Lys Thr His Gln Ala Val Glu Glu Arg Leu Gly

165 170 175

Gly Pro Leu Ser Asp Leu Ser Gln Arg Tyr Ala Lys Pro Phe Ala Gln

180 185 190

Met Asp Glu Val Leu Asn Phe Ala Ala Ser Pro Tyr Cys Lys Ser Leu

195 200 205

Gln Gln Asn Gly Lys Thr Cys Asp Phe Ala Thr Phe Ala Ala Asn Glu

210 215 220

Ile Lys Val Asn Glu Glu Gly Thr Lys Val Ser Leu Ser Gly Pro Leu

225 230 235 240

Ala Leu Ser Ser Thr Leu Gly Glu Ile Phe Leu Leu Gln Asn Ser Gln

245 250 255

Ala Met Pro Asp Val Ala Trp His Arg Leu Ser Gly Glu Glu Asn Trp

260 265 270

Val Ser Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu Met Ala Lys

275 280 285

Thr Pro Tyr Ile Ala Arg His Lys Gly Thr Pro Leu Leu Gln Gln Ile

290 295 300

Asp Thr Ala Leu Val Leu Gln Arg Asn Ala Gln Gly Gln Thr Leu Pro

305 310 315 320

Leu Ser Pro Gln Thr Lys Leu Leu Phe Leu Gly Gly His Asp Thr Asn

325 330 335

Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met Leu Gly Val Asn Trp Gln Leu Pro Gln

340 345 350

Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Gly Leu Val Phe Glu Leu Trp

355 360 365

Gln Asn Pro Asp Asn His Gln Arg Tyr Val Ala Val Lys Met Phe Tyr

370 375 380

Gln Thr Met Asp Gln Leu Arg Asn Ala Glu Lys Leu Asp Met Lys Asn

385 390 395 400

Asn Pro Ala Lys Ile Val Pro Ile Thr Ile Glu Gly Cys Glu Asn Glu

405 410 415

Gly Asp Asn Lys Leu Cys Gln Leu Glu Thr Phe Gln Lys Lys Val Ala

420 425 430

Gln Val Ile Glu Pro Ala Cys His Ile

435 440

<210> 2

<211> 1326

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtccgtcg ctaagagaaa ccttcatttg tccgctttga ccttgatcat gggttgcttc 60

actgcctctg ctgccccaat tgctactgct ccagctggat acaccttgga gcgtgtcgtc 120

attttgtcca gacatggaat cagatcccca accaagcaga cccagttgat gaacgacatc 180

actcctgaca aatggccaca gtggccagtt aaagccggtt acttgacccc acgtggtgct 240

gaacttgtta ccttgatggg tggtttttac ggtgactact tccgttccca gggtcttttg 300

tctgctggat gcccagttga tggttccgtt tacgctcagg ctgacgtcga ccagagaact 360

agattgaccg gtcaggcctt tttggacggt attgctcctg actgcggttt gaaggtccac 420

taccaggccg acttgaaaaa ggtcgaccct ttgttccaca ctgttgaggc tggtgtctgt 480

aagttggact ctgccaagac tcaccaggcc gttgaagaga gattgggagg tccattgtcc 540

gacttgtccc aacgttacgc caagcctttc gctcaaatgg atgaagtctt gaactttgcc 600

gcctccccat actgcaaatc cttgcagcag aacggtaaga cctgcgactt cgccaccttc 660

gccgccaatg agattaaggt caacgaggaa ggtactaagg tctctttgtc cggtcctttg 720

gctttgtcct ccaccttggg agagatcttc ttgttgcaaa actctcaagc tatgccagat 780

gtcgcctggc acagactttc tggagaggag aactgggtct ccttgttgtc tttgcacaat 840

gctcaatttg atttgatggc caagactcca tacatcgcca gacacaaggg aaccccattg 900

ttgcaacaga tcgacaccgc tttggtcttg caacgtaacg ctcagggtca gaccttgcca 960

ttgtctccac agaccaagtt gcttttcttg ggtggacacg acactaacat cgccaacatc 1020

gctggtatgt tgggtgtcaa ctggcagttg cctcaacagc cagacaatac cccaccaggt 1080

ggaggtttgg tcttcgagtt gtggcaaaac cctgataacc accagcgtta cgtcgccgtc 1140

aagatgttct accagaccat ggaccaattg agaaacgctg agaaattgga tatgaagaac 1200

aatccagcta agattgttcc tatcaccatt gagggatgcg agaacgaggg tgacaataag 1260

ttgtgccagt tggaaacttt ccagaagaag gtcgcccagg ttatcgagcc tgcttgtcat 1320

atttaa 1326

<210> 3

<211> 441

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ser Val Ala Lys Arg Asn Leu His Leu Ser Ala Leu Thr Leu Ile

1 5 10 15

Met Gly Cys Phe Thr Ala Ser Ala Ala Pro Ile Ala Thr Ala Pro Ala

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Gly Tyr Thr Leu Glu Arg Val Val Ile Leu Ser Arg His Gly Ile Arg

35 40 45

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50 55 60

Trp Pro Gln Trp Pro Val Lys Ala Gly Tyr Leu Thr Pro Arg Gly Ala

65 70 75 80

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Gln Gly Leu Leu Ser Ala Gly Cys Pro Val Asp Gly Ser Val Tyr Ala

100 105 110

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130 135 140

Leu Lys Lys Val Asp Pro Leu Phe His Thr Val Glu Ala Gly Val Cys

145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Ile Lys Val Asn Glu Glu Gly Thr Lys Val Ser Leu Ser Gly Pro Leu

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Ala Leu Ser Ser Thr Leu Gly Glu Ile Phe Leu Leu Gln Asn Ser Gln

245 250 255

Ala Met Pro Asp Val Ala Trp His Arg Leu Ser Gly Glu Glu Asn Trp

260 265 270

Val Ser Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu Met Ala Lys

275 280 285

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Asp Thr Ala Leu Val Leu Gln Arg Asn Ala Gln Gly Gln Thr Leu Pro

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Leu Ser Pro Gln Thr Lys Leu Leu Phe Leu Gly Gly His Asp Thr Asn

325 330 335

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Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Gly Leu Val Phe Glu Leu Trp

355 360 365

Gln Asn Pro Asp Asn His Gln Arg Tyr Val Ala Val Lys Met Phe Tyr

370 375 380

Gln Thr Met Asp Gln Leu Arg Asn Ala Glu Lys Leu Asp Met Lys Asn

385 390 395 400

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420 425 430

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435 440

<210> 4

<211> 1326

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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gaacttgtta ccttgatggg tggtttttac ggtgactact tccgttccca gggtcttttg 300

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gctttgaccg gtcaggcctt tttggacggt attgctcctg actgcggttt gaaggtccac 420

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aagttggact ctgccaagac tcaccaggcc gttgaagaga gattgggagg tccattgtcc 540

gacttgtccc aacgttacgc caagcctttc gctcaaatgg atgaagtctt gaactttgcc 600

gcctccccat actgcaaatc cttgcagcag aacggtaaga cctgcgactt cgccaccttc 660

gccgccaatg agattaaggt caacgaggaa ggtactaagg tctctttgtc cggtcctttg 720

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ttgcaacaga tcgacaccgc tttggtcttg caacgtaacg ctcagggtca gaccttgcca 960

ttgtctccac agaccaagtt gcttttcttg ggtggacacg acactaacat cgccaacatc 1020

gcttttatgt tgggtgtcaa ctggcagttg cctcaacagc cagacaatac cccaccaggt 1080

ggaggtttgg tcttcgagtt gtggcaaaac cctgataacc accagcgtta cgtcgccgtc 1140

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aatccagcta agattgttcc tatcaccatt gagggatgcg agaacgaggg tgacaataag 1260

ttgtgccagt tggaaacttt ccagaagaag gtcgcccagg ttatcgagcc tgcttgtcat 1320

atttaa 1326

Claims

1.一种植酸酶，其特征在于，所述植酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种植酸酶突变体，其特征在于，所述突变体是权利要求1所述植酸酶的第121位氨基酸由Arg变为Ala，第342位氨基酸由Gly变为Phe。

3.如权利要求2所述的植酸酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO：3。

4.编码权利要求2或3所述植酸酶突变体的DNA分子。

5.如权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的编码核苷酸序列为SEQ IDNO:4。

6.包含权利要求4或5所述DNA分子的重组表达质粒。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求6所述的重组表达质粒。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。

9.权利要求2或3所述的植酸酶突变体在饲料领域中的应用。