CN109694858B - 一种植酸酶突变体 - Google Patents

一种植酸酶突变体 Download PDF

Info

Publication number
CN109694858B
CN109694858B CN201710994129.2A CN201710994129A CN109694858B CN 109694858 B CN109694858 B CN 109694858B CN 201710994129 A CN201710994129 A CN 201710994129A CN 109694858 B CN109694858 B CN 109694858B
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
ala
thr
gln
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710994129.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109694858A (zh
Inventor
李宾
黄亦钧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Original Assignee
Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd filed Critical Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority to CN201710994129.2A priority Critical patent/CN109694858B/zh
Publication of CN109694858A publication Critical patent/CN109694858A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109694858B publication Critical patent/CN109694858B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及蛋白质工程改造技术领域，具体提供了一种植酸酶突变体。所述植酸酶突变体与野生型相比，在中性条件下的相对酶活水平得到显著提高，有助于其在水产饲料中的应用。

Description

一种植酸酶突变体
技术领域
本发明涉及蛋白质改造技术领域，具体涉及一种植酸酶突变体及其应用。
背景技术
植酸（phytate, myo-inositol hexaiisphosphate）是一种广泛存在于植物籽实中的有机复合物，具有极强的螯合能力。磷是动物生长繁殖、骨骼矿化及代谢必需的矿物元素之一。作为饲料主要来源的谷物类、豆科类、油料作物等饲料原料及其加工产品中，虽然含有大量的磷，但其中60%-80%的磷以植酸磷（六磷酸肌醇）形式存在，而畜禽及鱼类消化道内缺乏水解植酸磷的酶类，磷的利用率仅有0-40%，从而造成磷源浪费、饲料成本增加和动物生产性能的降低。同时，未被消化的植酸磷被直接排出体外后易造成有机磷蓄积，形成的高磷粪便严重污染环境。为了满足动物对磷的需要，又必须在饲料中额外添加无机磷，从而提高了饲料成本。此外，植酸还是一种重要的抗营养因子，它在动物胃肠道的消化吸收过程中与Fe2+等多种金属离子以及蛋白质强烈地螯合形成不溶性复合物，从而降低了动物对这些营养成分的消化利用率。研究还发现植酸是动物消化道中的消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶等的强抑制剂，使其活性降低，导致蛋白质、淀粉及脂类等营养物质利用率下降等。所以植酸的存在不仅使多种常量和微量元素的利用率下降，同时还降低了动物对蛋白质、淀粉、脂类物质等营养因子的消化吸收。因此，植酸的降解不仅是饲料、食品与医药领域的重要课题，而且也是环境保护的重要措施之一。
植酸酶（phytase, myo-inositol hexakisphosphase）是一类可以将植酸水解为磷酸和肌醇的水解酶的总称，广泛存在于植物、动物和微生物中，在饲料、食品、医药和环境保护等领域中具有重要的应用价值。以往植酸酶的研究主要集中在酸性植酸酶上，酸性植酸酶适用于胃pH呈酸性的单胃动物以及少数鱼类如虹鳟等，但不适用于消化道为中性的淡水鲤科鱼类和畜禽。来源于芽孢杆菌的植酸酶属于中性植酸酶，不仅具有较好的热稳定性，有助于抵抗饲料制粒过程中高温引起的酶失活，而且其酶促反应的pH值有效作用范围在7.0-7.5之间，可以有效弥补酸性植酸酶的不足，拓宽了植酸酶的应用范围。目前已分离出多种产中性植酸酶的芽孢杆菌(Bacillus)，主要是枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)及其他菌株(Bacillus sp.)等。
目前市售的中性植酸酶比较少，而且其在应用过程中还存在一些问题，其中较为突出的就是该酶在近中性的应用环境中酶活损失过大，因此筛选高活性的中性植酸酶是近年来的研究热点和难点。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种新型植酸酶突变体及其应用。所述植酸酶突变体与野生型相比，在中性条件下的相对酶活水平得到显著提高，有助于其在水产饲料中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种植酸酶突变体，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或（Ⅲ）所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ) 与植酸酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少98%同源性的序列；
(Ⅱ) 具有所述(Ⅰ)中所述的植酸酶的至少一个免疫表位，且所述植酸酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
（Ⅲ）由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列；
在本发明的一些实施例中，所述的取代包括氨基酸序列为SEQ ID NO:1的植酸酶的第4，30，84，89，91，140，179，181，187，204，206，212，219，308位氨基酸中任意一个或两个或两个以上氨基酸发生了取代。
在本发明的一些实施例中，所述取代包括第187位和/或第219位氨基酸发生了取代。
作为实施例的一种具体记载，所述取代包括第187位氨基酸由S变为A，和/或第219位氨基酸由E变为G。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第4位、第204位或第271位氨基酸中的任意一个氨基酸发生了取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第4位氨基酸由P变为H，第204位氨基酸由N变为Y，或第271位氨基酸由L变为H。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第89位和第91位氨基酸同时发生了取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第89位氨基酸由V变为T，第91位氨基酸由E变为Q。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第30位和第212位氨基酸同时发生了取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第30位氨基酸由Q变为H，第212位氨基酸由S变为G。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第140位和第179位氨基酸同时发生了取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第140位氨基酸由V变为I，第179位氨基酸由L变为F。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第84位，第181位和第206位氨基酸同时发生了取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第84位氨基酸由A变为V，第181位氨基酸由R变为C，第206位氨基酸由S变为F。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第84位，第181位和第308位氨基酸同时发生了取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第84位氨基酸由A变为V，第181位氨基酸由R变为C，第308位氨基酸由A变为T。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第84位，第181位，第206位和第308位氨基酸同时发生了取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第84位氨基酸由A变为V，第181位氨基酸由R变为C，第206位氨基酸由S变为F，第308位氨基酸由A变为T。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第89位，第91位和第204位氨基酸同时发生了取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第89位氨基酸由V变为T，第91位氨基酸由E变为Q，第204位氨基酸由N变为Y。
在本发明的另一些实施例中，所述植酸酶突变体具有如SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
本发明还提供了编码上述植酸酶突变体的DNA分子。
本发明还提供了携带上述DNA分子的重组表达载体。
本发明还提供了一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
本发明还提供了上述植酸酶突变体在水产饲料中的应用。
与野生型植酸酶相比，本发明提供的植酸酶突变体在pH6.5条件下的相对酶活普遍提高了10.15%-36.79%，效果显著。其中：与含E219G单点突变的突变体APPA-1相比，增加S187A单点的突变体APPA-2的相对酶活提高了4.86%；与含S187A/E219G两点突变的突变体APPA-2相比，增加P4H、N204Y或L271H任意一个单点突变，或增加V89T/E91Q、Q30H/S212G、V140I/L179F任意一组两点突变组合，或增加A84V/R181C/S206F、A84V/R181C/A308T任意一组三点突变组合，或增加A84V/R181C/S206F/A308T四点突变组合的突变体APPA-3，APPA-4，APPA-5，APPA-6，APPA-7，APPA-8，APPA-9，APPA-10，APPA-11，其在pH6.5条件下的相对酶活进一步提高了12.74%-21.78%，取得了显著的技术效果。
与植酸酶突变体APPA-4和APPA-6相比，组合突变体APPA-46在pH7.0条件下的相对酶活分别提高了5.66%和6.8%，取得了意料不到的技术效果。
所述植酸酶突变体可广泛应用于水产饲料领域，前景广阔。
具体实施方式
发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。例如，本发明可选用如下实验材料和试剂 ：
菌株与载体：大肠杆菌DH5a、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、Amp、G418购自Invitrogen公司。
酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司。
本发明所用到的实验材料和试剂如下：
培养基：
大肠杆菌培养基为LB（1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0），LB-Amp为LB 培养基加100ug/mL氨苄青霉素；
酵母培养基为YPD（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖）；
酵母培养基BMGY（1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油（V/V））；
诱导培养基BMMY（1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇（V/V））。
但对于上述的试剂或材料，本领域的技术人员可以根据其所实现的功能在市场上出售的产品中进行选择，而不仅限于本说明书实施例的具体记载。
实施例1 植酸酶基因的获得与表达载体的构建
将公共基因数据库中公开的来源于大肠杆菌的（E. coli）的野生型植酸酶基因APPA的基因序列，按照毕赤酵母的偏爱性进行密码子优化，并人工合成植酸酶基因APPA，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
将上述合成的野生型植酸酶基因APPA进行PCR扩增，分别通过EcoR I和Not I位点与表达载体pPIC9K相连接，构建得到重组表达载体pPIC9K-APPA。
实施例2 植酸酶突变体基因的扩增及合成
为了提高植酸酶APPA的耐热性，申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物APPA-F1、APPA-R1如下：
APPA-F1：AATGAATTCCAGAGTGAGCCTGAGTTG（下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点）
APPA-R1：AATGCGGCCGCCTACAAGGAACAAGCTGG（下划线为限制性内切酶Not I识别位点）
以APPA基因（SEQ ID NO：2）为模板，利用上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（Stratagene）进行PCR扩增。
PCR反应体系反应条件：94℃ 5min，94℃ 30s，63℃ 30s，72℃延伸1.5min，30个循环，72℃延伸7min。胶回收PCR产物，EcoRI、Not I进行酶切处理后与经同样酶切后的pPIC9K载体连接，转化至大肠杆菌DH5a中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入400ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，30℃ 220 rpm培养5h左右，离心取上清。分别测定上清液在pH 6.5条件下的植酸酶活力。选择酶活水平高于野生型对照组的转化子转接96孔板，重复发酵验证其在pH6.5条件下的酶活力。
申请人从两万多个转化子中筛选出在pH6.5条件下的酶活力明显提升的转化子，分别将其进行测序分析。经比对发现，所述转化子中包含的突变位点及组合分别为：E219G单点突变，S187A/E219G两点组合突变，P4H/S187A/E219G 、N204Y/S187A/E219G和L271H/S187A/E219G三点组合突变，V89T/E91Q/S187A/E219G、Q30H/S212G/S187A/E219G和V140I/L179F/S187A/E219G四点组合突变， A84V/R181C/S206F/S187A/E219G和A84V/R181C/A308T/S187A/E219G五点组合突变，A84V/R181C/S206F/A308T/S187A/E219G六点组合突变。
将含E219G单点组合突变的植酸酶突变体命名为APPA-1，其氨基酸序列为SEQ IDNO：3；
将含S187A/E219G两点组合突变的植酸酶突变体命名为APPA-2，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4；
含P4H/S187A/E219G 三点组合突变的植酸酶突变体命名为APPA-3，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5；
含N204Y/S187A/E219G三点组合突变的植酸酶突变体命名为APPA-4，其氨基酸序列为SEQ ID NO：6；
含L271H/S187A/E219G三点组合突变的植酸酶突变体命名为APPA-5，其氨基酸序列为SEQ ID NO：7；
含V89T/E91Q/S187A/E219G四点组合突变的植酸酶突变体命名为APPA-6，其氨基酸序列为SEQ ID NO：8；
含Q30H/S212G/S187A/E219G四点组合突变的植酸酶突变体命名为 APPA-7，其氨基酸序列为SEQ ID NO：9；
含V140I/L179F/S187A/E219G四点组合突变的植酸酶突变体命名为APPA-8，其氨基酸序列为SEQ ID NO：10；
含A84V/R181C/S206F/S187A/E219G五点组合突变的植酸酶突变体命名为APPA-9，其氨基酸序列为SEQ ID NO：11。
含A84V/R181C/A308T/S187A/E219G五点组合突变的植酸酶突变体命名为APPA-10，其氨基酸序列为SEQ ID NO：12。
含A84V/R181C/S206F/A308T/S187A/E219G六点组合突变的植酸酶突变体命名为APPA-11，其氨基酸序列为SEQ ID NO：13。
上述突变体的编码核苷酸序列由上海捷瑞生物公司合成。
用引物APPA-F1、APPA-R1对上述11个突变体进行PCR扩增，引物两端分别引入EcoRI和Not I位点。通过上述同样的PCR方法扩增得到野生型植酸酶APPA的基因片段。
实施例3 毕赤酵母工程菌株的构建
1、表达载体的构建
将上述克隆得到的植酸酶突变体基因片段，通过EcoRI和Not I位点与表达载体pPIC9K相连接，构建表达载体pPIC9K-APPA-1、pPIC9K-APPA-2、pPIC9K- APPA-3、pPIC9K-APPA-4、pPIC9K-APPA-5、pPIC9K-APPA-6、pPIC9K-APPA-7、pPIC9K-APPA-8、pPIC9K-APPA-9、pPIC9K-APPA-10和pPIC9K-APPA-11。
2、酵母感受态细胞的制备
将宿主菌毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115菌株进行YPD平板活化，30℃培养48h后接种活化的GS115单克隆于6mL YPD液体培养基中，30℃、220rpm，培养约12h后转接菌液于装有30mLYPD液体培养基的三角瓶中，30℃、220rpm培养约5h经紫外分光光度计检测其菌体密度，待其OD600值在1.1–1.3范围后，4℃，9,000rpm离心2min分别收集4mL菌体至灭菌EP管中，轻轻弃上清，用灭菌的滤纸吸干残留的上清后用预1mL灭菌水重悬菌体，4℃、9000rpm离心2min，轻轻弃上清，重复用1mL灭菌水洗一遍后4℃、9000rpm离心2min，轻轻弃上清，预冷的1mL山梨醇(1mol/L)重悬菌体；4℃、9000rpm离心2min，轻轻弃上清，预冷的100-150μl山梨醇 (1mol/L) 轻柔重悬菌体。
3、转化
将上述突变体表达质粒用BglII进行线性化，表达质粒线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，在MD平板上分别筛选得到表达植酸酶的毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-APPA-1、GS115/pPIC9K-APPA-2、GS115/pPIC9K- APPA-3、GS115/pPIC9K-APPA-4、GS115/pPIC9K-APPA-5、GS115/pPIC9K-APPA-6、GS115/pPIC9K-APPA-7、GS115/pPIC9K-APPA-8、GS115/pPIC9K-APPA-9、GS115/pPIC9K-APPA-10和GS115/pPIC9K-APPA-11。然后分别在含不同浓度遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。
将筛选得到的重组表达植酸酶突变体APPA-1、APPA-2、APPA-3、APPA-4、 APPA-5、APPA-6、APPA-7、APPA-8、APPA-9、APPA-10和APPA-11的阳性转化子分别命名为毕赤酵母APPA-1（Pichia pastoris APPA-1）、毕赤酵母APPA-2（Pichia pastoris APPA-2）、毕赤酵母APPA-3（Pichia pastoris APPA-3）、毕赤酵母APPA-4（Pichia pastoris APPA-4）毕赤酵母APPA-5（Pichia pastoris APPA-5）、毕赤酵母APPA-6（Pichia pastoris APPA-6）、毕赤酵母APPA-7（Pichia pastoris APPA-7）、毕赤酵母APPA-8（Pichia pastoris APPA-8）、毕赤酵母APPA-9（Pichia pastoris APPA-9）、毕赤酵母APPA-10（Pichia pastoris APPA-10）和毕赤酵母APPA-11（Pichia pastoris APPA-11），然后分别转接于BMGY培养基中，30℃、250 rpm振荡培养1 d；再转入BMMY培养基中，30℃、250 rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4 d；9000rpm离心去除菌体，分别得到含植酸酶突变体APPA-1、APPA-2、APPA-3、APPA-4、 APPA-5、APPA-6、APPA-7、APPA-8、APPA-9、APPA-10和APPA-11的发酵上清液；将其进行SDS-PAGE电泳检测分析，结果显示上述发酵上清液中植酸酶突变体的分子量大小约为45 kDa。
通过上述同样的酶切连接方法将野生型植酸酶APPA克隆到毕赤酵母GS115宿主中，构建得到重组表达野生型植酸酶APPA的毕赤酵母工程菌，命名为毕赤酵母APPA（Pichia pastoris APPA）。摇瓶水平发酵毕赤酵母APPA，30℃、250 rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4 d；离心去除菌体，得到含野生型植酸酶APPA的发酵上清液。
实施例4 植酸酶突变体在pH6.5条件下的酶活水平
将上述实施例3获得的毕赤酵母重组菌株的发酵上清液分别在pH2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0条件下进行植酸酶活力检测，以最高酶活计100%，计算所述发酵上清液在pH6.5条件下的相对酶活。具体结果见表1。
植酸酶酶活测定方法：
（1）酶活定义：
在37℃、pH值为6.5的条件下，每分钟从浓度为5 mg/ml的植酸钠溶液中释放1 μmol无机磷所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
（2）酶活测定方法
取4 ml浓度为7.5mmol/L的植酸钠溶液（pH6.5 0.25mol/L乙酸缓冲液配制），加入到比色管中，37℃平衡5 min，再加入2 ml经pH6.5 0.25mol/L乙酸缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的植酸酶酶液，混匀于37℃精确保温反应30 min。反应结束后，加入4 ml 终止液（2份硝酸溶液（硝酸：水=1:2）、1份100g/L钼酸铵溶液、1份2.35g/L钒酸铵溶液），混匀以终止反应。然后室温放置10 min显色，分光光度计415 nm处测定吸光值。
酶活计算公式：U=（A-A0-0.0016）×F/（0.0415×30）
式中：A为样品的吸光值；A0为空白样品的吸光值；F为实际样液反应前的总稀释倍数；30为酶解反应时间，min。
表1 植酸酶突变体在pH6.5条件下的相对酶活水平
样品 突变位点 pH6.5相对酶活
野生型 无 20.4%
APPA-1 E219G 30.55%
APPA-2 S187A/E219G 35.41%
APPA-3 P4H/S187A/E219G 50.14%
APPA-4 N204Y/S187A/E219G 55.8%
APPA-5 L271H/S187A/E219G 48.15%
APPA-6 V89T/E91Q/S187A/E219G 53.92%
APPA-7 Q30H/S212G/S187A/E219G 54.08%
APPA-8 V140I/L179F/S187A/E219G 48.8%
APPA-9 A84V/R181C/S206F/S187A/E219G 48.76%
APPA-10 A84V/R181C/A308T/S187A/E219G 51.11%
APPA-11 A84V/R181C/S206F/A308T/S187A/E219G 57.19%
从表1的结果可以看出，与野生型植酸酶相比，本发明提供的植酸酶突变体在pH6.5条件下的相对酶活普遍提高了10.15%-36.79%，效果显著。其中：
与含E219G单点突变的突变体APPA-1相比，增加S187A单点的突变体APPA-2的相对酶活提高了4.86%；
与含S187A/E219G两点突变的突变体APPA-2相比，增加P4H、N204Y或L271H任意一个单点突变，或增加V89T/E91Q、Q30H/S212G、V140I/L179F任意一组两点突变组合，或增加A84V/R181C/S206F、A84V/R181C/A308T任意一组三点突变组合，或增加A84V/R181C/S206F/A308T四点突变组合的突变体APPA-3，APPA-4，APPA-5，APPA-6，APPA-7，APPA-8，APPA-9，APPA-10，APPA-11，其在pH6.5条件下的相对酶活进一步提高了12.74%-21.78%，取得了显著的技术效果。
实施例5 植酸酶突变位点的组合筛选
进一步地，申请人利用定点突变的方法，将实施例2中获得的突变位点进行优化组合，以期得到在中性条件下酶活力进一步提高的突变体。经过随机组合和筛选，申请人发现突变体APPA-4和APPA-6中的突变位点组合后得到的新突变体，其在pH7.0条件下的相对酶活水平有明显提高，命名为APPA-46，其包含的突变位点组合为V89T/E91Q/N204Y/S187A/E219G，其氨基酸序列为SEQ ID NO：14。
突变体APPA-46的编码核苷酸序列由上海捷瑞生物公司合成。
采用实施例3所述方法构建重组表达突变体APPA-46的毕赤酵母工程菌株，进行摇瓶发酵，收集发酵上清液，分别检测其在pH2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0条件下的植酸酶活力，以最高酶活计100%，计算所述发酵上清液在pH7.0条件下的相对酶活，同时以植酸酶突变体APPA-4 和APPA-6作为对照，具体结果见表2。
表2 植酸酶突变体在pH7.0条件下的相对酶活水平
样品 突变位点 pH7.0相对酶活
野生型 - 3.5%
APPA-4 N204Y/S187A/E219G 15.96%
APPA-6 V89T/E91Q/S187A/E219G 14.82%
APPA-46 V89T/E91Q/N204Y/S187A/E219G 21.62%
从表2的结果可以看出，与野生型相比，本发明提供的植酸酶突变体APPA-4，APPA-6以及组合突变体APPA-46在pH7.0条件下的相对酶活普遍提高了11.32%-18.12%，取得了显著的效果。进一步地，与植酸酶突变体APPA-4和APPA-6相比，组合突变体APPA-46在pH7.0条件下的相对酶活分别提高了5.66%和6.8%，取得了意料不到的技术效果，有利于其在水产饲料中的广泛应用，市场前景广阔。
此外，申请人以野生型植酸酶APPA为基础，通过定点突变的方法，分别获得了实施例2中所述突变位点的单点突变体，即P4H，Q30H，A84V，V89T，E91Q，V140I，L179F，R181C，S187A，N204Y，S206F，S212G，L271H，A308T单点突变体，并分别构建重组表达所述单点突变体的毕赤酵母菌株，检测所述单点突变体在pH6.5 条件下的相对酶活。结果表明，与野生型相比，所述单点突变体在pH6.5 条件下的相对酶活普遍有所提高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 一种植酸酶突变体
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 410
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 2
<211> 1233
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
cagagtgagc ctgagttgaa actggaatcc gttgtcatcg tctctagaca tggtgttaga 60
gcaccaacca aggccaccca acttatgcaa gatgtcaccc cagacgcttg gccaacctgg 120
ccagtcaagc tgggttggtt gacacctaga ggtggtgagc tcattgctta cttgggtcac 180
taccaaagac agcgtcttgt tgccgacgga ttgttggcca agaagggttg tccacaacca 240
ggtcaagtag ctattattgc tgacgtcgac gaaagaaccc gtaagacagg tgaagccttc 300
gccgccggtc ttgctcctga ctgtgccatt accgttcaca cccaagctga cacttcttct 360
ccagatccat tgttcaaccc tttgaagact ggtgtttgcc aattggacaa cgctaacgtt 420
actgacgcta tcttgtccag agctggagga tccattgctg acttcaccgg tcacagacag 480
actgccttca gagagttgga aagagttctt aacttcccac aatccaactt gtgccttaac 540
cgtgagaagc aagacgaatc ctgttccttg actcaagcat taccatctga gttgaaggtc 600
tccgccgaca acgtctcttt gaccggtgct gtcagcttgg cttccatgtt gactgaaatc 660
tttcttctgc aacaagctca aggtatgcct gagccaggtt ggggtagaat caccgactct 720
caccaatgga acaccttgtt gtccttgcac aacgctcaat tctacttgct gcagagaact 780
ccagaggttg ctagatccag agccacccca ttgttggact tgatcatggc tgctttgact 840
cctcacccac ctcaaaagca agcctacggt gttaccttgc ccacttctgt cttgttcatt 900
gccggtcacg atactaactt ggcaaatctc ggcggtgctt tggagttgaa ctggactctt 960
cctggtcaac ctgataacac tccaccaggt ggtgagctcg ttttcgaaag atggcgtaga 1020
ctatctgata actctcaatg gattcaggtt tcgttggtct tccaaacttt gcagcagatg 1080
agagacaaga ctccactgtc tttgaacacg cctccaggag aagtcaaatt gaccttggct 1140
ggatgtgaag agagaaatgc tcagggtatg tgttccttgg ctggtttcac tcaaatcgtt 1200
aacgaagcta gaatcccagc ttgttccttg tag 1233
<210> 3
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Gly Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 4
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ala Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Gly Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 5
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Ser Glu His Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ala Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Gly Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 6
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ala Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Tyr Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Gly Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 7
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ala Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Gly Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro His Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 8
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ala Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Gly Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 9
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met His Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ala Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Gly Leu Ala Ser Met Leu Thr Gly Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 10
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Ile Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Phe Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ala Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Gly Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 11
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Val Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Asn Cys Glu Lys Gln Asp Glu Ala Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Phe Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Gly Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 12
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Val Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Asn Cys Glu Lys Gln Asp Glu Ala Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Gly Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Thr Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 13
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Val Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Asn Cys Glu Lys Gln Asp Glu Ala Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Phe Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Gly Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Thr Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 14
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Arg Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ala Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Tyr Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Gly Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Tyr Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410

Claims (3)

1.一种植酸酶突变体，其特征在于，所述植酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示。
2.编码如权利要求1所述的植酸酶突变体的DNA分子。
3.包含权利要求1所述的植酸酶突变体的饲料添加剂。
CN201710994129.2A 2017-10-23 2017-10-23 一种植酸酶突变体 Active CN109694858B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710994129.2A CN109694858B (zh) 2017-10-23 2017-10-23 一种植酸酶突变体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710994129.2A CN109694858B (zh) 2017-10-23 2017-10-23 一种植酸酶突变体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109694858A CN109694858A (zh) 2019-04-30
CN109694858B true CN109694858B (zh) 2022-10-28

Family

ID=66225903

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710994129.2A Active CN109694858B (zh) 2017-10-23 2017-10-23 一种植酸酶突变体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109694858B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110484455B (zh) * 2019-06-10 2022-05-24 潍坊康地恩生物科技有限公司 一种稳定高产植酸酶的木霉突变菌株

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3222714B1 (en) * 2014-11-21 2019-10-16 Qingdao Vland Biotech Group Co. Ltd. Phytase mutants
CN104450643B (zh) * 2014-12-19 2020-07-28 青岛蔚蓝生物集团有限公司 植酸酶突变体及其应用
CN104911160B (zh) * 2015-07-10 2017-06-20 青岛玛斯特生物技术有限公司 一种中性植酸酶突变体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109694858A (zh) 2019-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3222714B1 (en) Phytase mutants
CN107236717B (zh) 植酸酶突变体
CN110029120B (zh) 一种植酸酶高产菌株及其应用
CN110577946B (zh) 酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用
CN101080491B (zh) 具有植酸酶活性的多肽和编码多肽的核苷酸序列
DK3072962T3 (en) PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF PHYTASE VARIANT WITH IMPROVED THERMOSTABILITY AND A PHYTASE VARIANT AND APPLICATION THEREOF
CN113832126A (zh) 一种提高植酸酶热稳定性的方法及融合植酸酶
CN109694858B (zh) 一种植酸酶突变体
CN111218436B (zh) 一种植酸酶突变体
CN114761549B (zh) 一种亲本植酸酶变体
CN114317488A (zh) 一种比活力提高的植酸酶突变体
CN110904082B (zh) 盐耐受的木糖苷酶突变体t326dh328d及制备和用途
CN113717958B (zh) 比活力提高的植酸酶突变体
CN115094050B (zh) 一种中性植酸酶突变体及其应用
WO2020063268A1 (zh) 植酸酶突变体
WO2020063267A1 (zh) 植酸酶突变体
CN114736886B (zh) 植酸酶突变体及其制备方法
CN115094049B (zh) 耐高温中性植酸酶突变体
KR101437491B1 (ko) 흑염소 반추위 미생물 유래의 자일라나아제 활성 효소 cel10-CBM6-KG61 유전자 및 이의 용도
CN116121222A (zh) 一种中性植酸酶突变体及其应用
KR101479696B1 (ko) 흑염소 반추위 미생물 유래의 엔도글루카나아제 ｃｅｌ－ＫＧ３５ 유전자 및 이의 용도
KR101479704B1 (ko) 흑염소 반추위 미생물 유래의 엔도글루카나아제 ｃｅｌ９－ＫＧ１０ 유전자 및 이의 용도
KR101479693B1 (ko) 흑염소 반추위 미생물 유래의 엔도글루카나아제 ｃｅｌ８－ＫＧ４７ 유전자 및 이의 용도
CN110862976A (zh) 一种盐耐受性改良的木糖苷酶突变体k321dh328d及其应用
KR20130068006A (ko) 흑염소 반추위 미생물 유래의 베타 글루코시다아제 ｃｅｌ３－ＫＧ３９ 유전자 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant