CN115094049B - 耐高温中性植酸酶突变体 - Google Patents
耐高温中性植酸酶突变体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115094049B CN115094049B CN202210880762.XA CN202210880762A CN115094049B CN 115094049 B CN115094049 B CN 115094049B CN 202210880762 A CN202210880762 A CN 202210880762A CN 115094049 B CN115094049 B CN 115094049B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phytase
- mutant
- enzyme
- enzyme activity
- mutants
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 title claims abstract description 58
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 title abstract description 13
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 claims 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 38
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 38
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 abstract description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 17
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 8
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 7
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 7
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 7
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 7
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 7
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 description 3
- 235000019733 Fish meal Nutrition 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 3
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000004467 fishmeal Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 101150003244 AN gene Proteins 0.000 description 2
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 2
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 2
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 2
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 2
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 239000005996 Blood meal Substances 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 235000019735 Meat-and-bone meal Nutrition 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 235000019779 Rapeseed Meal Nutrition 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- FENRSEGZMITUEF-ATTCVCFYSA-E [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].OP(=O)([O-])O[C@@H]1[C@@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H]1OP(=O)([O-])[O-] Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].OP(=O)([O-])O[C@@H]1[C@@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H]1OP(=O)([O-])[O-] FENRSEGZMITUEF-ATTCVCFYSA-E 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 1
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 1
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000433 anti-nutritional effect Effects 0.000 description 1
- UNTBPXHCXVWYOI-UHFFFAOYSA-O azanium;oxido(dioxo)vanadium Chemical compound [NH4+].[O-][V](=O)=O UNTBPXHCXVWYOI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 108010089934 carbohydrase Proteins 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000021004 dietary regimen Nutrition 0.000 description 1
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- -1 glucanases Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019629 palatability Nutrition 0.000 description 1
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000467 phytic acid Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000004456 rapeseed meal Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940083982 sodium phytate Drugs 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/189—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
- C12Y301/03026—4-Phytase (3.1.3.26), i.e. 6-phytase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/84—Pichia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/885—Trichoderma
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Birds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及基因工程与蛋白质改造技术领域，具体涉及一种耐高温中性植酸酶突变体及其应用。本发明以野生型植酸酶AN为基础，提供了分别包含K121M、S181T和M241F单点突变的植酸酶突变体，其在80℃条件下处理5min后，酶活残留率比野生型提高了26.1%‑240.5%。从而说明，本发明提供的突变位点K121M、S181T、M241F能显著提高植酸酶的耐热性，有利于促进其在水产饲料领域的广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种耐高温中性植酸酶突变体及其应用。
背景技术
随着全球水产养殖业的快速发展，鱼粉等优质动物蛋白资源的紧缺已成为制约水产养殖业发展的重要因素。开发新的饲料资源，提高现有饲料资源的利用率，是饲料行业所面临的重大问题。近年来，许多动植物蛋白源被开发出来用以降低或取代鱼粉的使用量，比如豆粕、菜粕、棉粕、肉骨粉、血粉等，其中植物蛋白源因其资源量大，价格低而广泛应用于水产饲料中。然而与鱼粉相比，这些植物蛋白源通常具有一种或多种方面的不足，如氨基酸组成不平衡，存在抗营养因子(植酸、非淀粉多糖等)、适口性较差、消化率较低等，限制了植物蛋白源在水产饲料中的大量使用。为提高植物蛋白源的利用率，一些营养策略与技术已被开发并应用于饲料工业中。利用发酵工程和基因工程等生物技术手段开发出的酶制剂，能够提高饲料的利用率，在很大程度上缓解饲料资源紧缺的状况。酶制剂因高效、安全、环保，符合资源节约型社会的要求而受到高度重视。
饲用酶制剂是从微生物、动物、植物中提取的具有酶特性的一类物质，其中微生物来源的酶制剂应用最为广泛。饲用酶制剂的种类很多，按照动物自身能否合成，可分为消化酶和非消化酶。消化酶指动物体内能够合成并分泌到消化道进行消化的酶类，也称内源酶，主要包括淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶；非消化酶指动物体自身通常不能合成酶类，也称外源酶，包括植酸酶、纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶等。按照酶制剂的类型来分，可分为单一酶制剂和复合酶制剂。根据酶的作用底物，可分为蛋白酶、脂肪酶、碳水化合物酶、植酸酶等。
酶制剂应用于饲料中，最大的关注点是其稳定性，包括饲料加工中的温度、水分、压力对酶活性的影响，饲料贮存过程中酶活性的损失，酶进入动物消化道后，能否耐受胃酸的影响(有胃鱼类)而到达小肠的作用部位。开发稳定性的酶制剂一直是酶制剂工业努力的方向。可以采用稳定化技术来提高酶的耐热性，如物理包埋、化学修饰等方法；也可采用基因工程等生物技术手段，开发出稳定的酶制剂，或在极端环境中寻求耐高温微生物，产生耐高温的酶。过去二十多年来，经过多次的蛋白质工程改造，饲用植酸酶耐温性从不耐温提升到到耐受85℃的技术进步；但是还是不能满足水产饲料的制备工艺要求。 因此，开发耐高温（大于90℃）、作用pH中性且高产的植酸酶是开发水产植酸酶市场的关键。我国是水产养殖大国，每年生产水产饲料2000万吨以上，而且每年以10%速度增长。如果以每吨饲料添加2公斤植酸酶计算，其市场潜力为1万吨；以50元/kg价格计算，则潜在市场产值为5亿人民币，市场潜力巨大。
但是，目前水产用植酸酶面临耐温性及耐中性环境差等制约因素。因此，利用基因工程和蛋白质工程方法获得耐高温的商业化中性植酸酶成了亟待解决的问题。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种耐高温中性植酸酶突变体及其应用。所述突变体的耐热性得到显著提高，有利于促进其在饲料领域的广泛应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明涉及一种植酸酶突变体，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：121，181，241。
在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：K121M，S181T，M241F。
在本发明的一些实施例中，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：K121M；S181T；M241F；K121M/S181T；K121M/M241F；S181T/M241F；K121M/S181T/M241F。
在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:5所示。
本发明还涉及编码上述植酸酶突变体的DNA分子。
本发明还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的植酸酶突变体的耐热性得到显著提升。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
本发明还提供了上述植酸酶突变体在水产饲料领域中的应用。
本发明以野生型植酸酶AN为基础，提供了包含K121M、S181T和M241F单点突变的植酸酶突变体，其在80℃条件下处理5min后，酶活残留率比野生型提高了126.1%-240.5%。从而说明，本发明提供的突变位点K121M、S181T、M241F能显著提高植酸酶的耐热性。
综上所述，本发明提供的中性植酸酶突变体耐热性得到显著提高，有利于促进其在水产饲料领域中的广泛应用。
具体实施方式
本发明公开了一种植酸酶突变体、其制备方法及应用、编码该植酸酶突变体的DNA分子、载体、宿主细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECΜLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLSIN MOLECΜLAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。例如，本发明可选用如下实验材料和试剂：
菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、Amp、G418购自Invitrogen公司。
酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
培养基配方：
大肠杆菌培养基（LB培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；
酵母培养基（YPD培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；
酵母筛选培养基（MD培养基）：2%蛋白胨，2%琼脂糖；
BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10-5 %生物素，1%甘油；
BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10-5 %生物素，0.5%甲醇；
LB-AMP培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0；
LB-AMP平板：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，1.5%琼脂，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1 重组质粒的构建
将来源于烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的植酸酶基因（GeneBankKAF4251155）根据毕赤酵母密码子偏好性进行优化，并在其起始密码子ATG前增加6个碱基GAATTC（EcoR I酶切位点），在其终止密码子TAA后增加GCGGCCGC（Not I酶切位点）。优化后的核苷酸序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。将该植酸酶命名AN，其氨基酸序列为SEQID NO：1，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
用限制性内切酶EcoR I和Not I（Fermentas）对植酸酶AN基因进行酶切；同时，用限制性内切酶EcoR I和Not I对质粒pPIC9K进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4 DNA连接酶（Fermentas）将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进DH5α大肠杆菌（Invitrogen），用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序（Invitrogen）。
使用质粒小量制备试剂盒（Omega）从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒，获得1个重组质粒，将其命名为pPIC9K-AN。
实施例2 耐高温突变体的筛选
为了进一步提高植酸酶AN的耐热性，申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选。
设计PCR引物AN-F1、AN-R1：
AN-F1：GGCGAATTCGCTCCATCTTCTGCTGGTTCTAAGTC（下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点）；
AN-R1：ATAGCGGCCGC TTAGGAGAAACATTCACCCCAG（下划线为限制性内切酶NotI识别位点）。
以AN基因（SEQ ID NO：1）为模板，利用上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（（博迈斯））进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150μL含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃、220rpm培养6 h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有植酸酶的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出40μL裂解液至两块新的96孔板，将其中一块96孔板于75℃处理5min；然后向两块96孔板中各加入80μL底物，于25℃反应30min后加入80μL终止液（钒酸铵：钼酸铵：硝酸=1：1：2），测定生成的无机磷含量。不同的突变子高温处理后保持的活性不同。
实验结果表明，有些突变对植酸酶AN的耐热性没有影响，有些突变甚至使其耐热性或酶活变得更差了，另外还有些突变虽然能提高AN对温度的耐受性，但突变后其酶学性质发生了显著的变化，这些均不符合要求。最终，申请人得到既能显著提高AN耐热性，又不会影响其原有酶学性质的突变位点：K121M，S181T，M241F。
本发明在野生型AN的基础上，提供了分别包含K121M，S181T，M241F单个突变位点的突变体。其中：
将含K121M单点突变的淀粉酶突变体命名为AN-1，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3；
将含S181T单点突变的淀粉酶突变体命名为AN-2，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4；
将含M241F单点突变的淀粉酶突变体命名为AN-3，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5；
实施例3 植酸酶在毕赤酵母中的表达
3.1表达载体的构建
依照毕赤酵母的密码偏爱性分别对植酸酶AN及其突变体的基因序列进行优化，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上EcoRI和NotI两个酶切位点。
按照实施例1中所述方法，将合成的植酸酶AN及其突变体的基因序列分别进行EcoRI和NotI双酶切，然后与经同样酶切后的pPIC-9K载体16℃过夜连接，并转化大肠杆菌DH5a，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，菌落PCR（反应体系：模板挑取的单克隆，rTaqDNA聚合酶 0.5μL，10×Buffer 2.0μL，dNTPs(2.5mM) 2.0μL，5’AOX引物（10mM）：0.5μL，3’AOX引物：0.5μL，ddH2O 14.5μL，反应程序：95℃预变性5min，30个循环：94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，72℃ 10min）。验证阳性克隆子，经测序验证后获得了正确的重组表达质粒。
3.2毕赤酵母工程菌株的构建
3.2.1酵母感受态制备
将毕赤酵母GS115菌株进行YPD平板活化，30℃培养48 h后接种活化的GS115单克隆于6 mL YPD液体培养基中，30℃、220 rpm，培养约12 h后转接菌液于装有30mL YPD液体培养基的三角瓶中，30℃、220 rpm培养约5h，经紫外分光光度计检测其菌体密度，待其OD600值在1.1–1.3范围后，4℃ 9000 rpm离心2 min分别收集4mL菌体至灭菌EP管中，轻轻弃上清，用灭菌的滤纸吸干残留的上清后用预冷的1 mL灭菌水重悬菌体，4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，重复用1mL灭菌水洗一遍后，4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，预冷的1mL山梨醇(1 mol/L)重悬菌体；4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，预冷的100-150μL山梨醇(1 mol/L)轻柔重悬菌体。
3.2.2转化和筛选
分别将3.1构建得到的重组表达质粒用Sac I进行线性化，线性化片段纯化回收后通过电穿孔法分别转化毕赤酵母GS115，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株，然后在含不同浓度遗传霉素的YPD平板（0.5mg/mL-8mg/mL）上筛选多拷贝的转化子。
将获得的转化子分别转接于BMGY培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入BMMY培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4 d；9000rpm离心10min去除菌体，即得到分别含 植酸酶AN和 植酸酶突变体的发酵上清液。
（1）植酸酶酶活单位的定义
在温度为25℃、pH为6.0的条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
（2）植酸酶酶活测定方法
取甲、乙两支25mL比色管，各加入1.8mL乙酸缓冲液（pH 6.0）、0.2mL样品反应液，混匀，25℃预热5min。在甲管中加入4mL底物溶液，乙管中加入4mL终止液，混匀，25℃反应30min，反应结束后甲管中加入4mL终止液，乙管中加入4mL底物溶液，混匀。静置10min，分别在415nm波长处测定吸光值。每种样品作3个平行，取吸光值的平均值，通过标准曲线用回归直线方程计算植酸酶活性。
酶活X＝F×C/(m×30)。
其中：X——酶活力单位，U/g(mL)；
F——试样溶液反应前的总稀释倍数；
C——根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U；
m——试样质量或体积，g/mL；
30——反应时间。
采用上述方法分别对构建得到的毕赤酵母重组菌株发酵上清液进行植酸酶酶活测定。
（3）测定结果
按照上述方法进行酶活检测，结果显示：上述构建得到的重组表达野生型植酸酶AN及其突变体的毕赤酵母重组菌株发酵上清液的酶活为200-377 U/mL。
实施例4 耐热性分析
用预热10min、pH6.0的0.25M乙酸钠缓冲液将上述获得的表达植酸酶突变体的重组菌株发酵上清液各稀释10倍；然后将稀释后的样品80℃处理5min，结束时取样并冷却至室温；分别测定热处理后样品的植酸酶酶活，以未处理样品的酶活计100%，计算酶活残留率。
酶活残留率（%）=未处理样品的酶活/热处理后样品的酶活×100%。
表1 中性植酸酶突变体在80℃条件下的耐热性分析
| 植酸酶突变体 | 80℃处理5min后酶活残留率 |
| AN | 13.27% |
| K121M | 30.00% |
| S181T | 51.30% |
| M241F | 45.18% |
从表1的结果可知，与野生型植酸酶AN相比，本发明提供的包含K121M、S181T和M241F单点突变的植酸酶突变体在80℃条件下处理5min后，酶活残留率提高了126.1%-240.5%。从而说明，本发明提供的突变位点K121M、S181T、M241F能显著提高植酸酶的耐热性。
综上所述，本发明提供的中性植酸酶突变体耐热性得到显著提高，有利于促进其在水产饲料领域中的广泛应用。
Claims (6)
1.一种植酸酶突变体，其特征在于，所述突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的植酸酶的第181位氨基酸由Ser突变为Thr。
2.编码权利要求1所述植酸酶突变体的DNA分子。
3.包含权利要求2所述DNA分子的重组表达质粒。
4.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求3所述的重组表达质粒。
5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）或里氏木霉（Trichoderma reesei）。
6.权利要求1所述植酸酶突变体在水产饲料生产中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210880762.XA CN115094049B (zh) | 2022-07-26 | 2022-07-26 | 耐高温中性植酸酶突变体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210880762.XA CN115094049B (zh) | 2022-07-26 | 2022-07-26 | 耐高温中性植酸酶突变体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115094049A CN115094049A (zh) | 2022-09-23 |
| CN115094049B true CN115094049B (zh) | 2024-05-28 |
Family
ID=83299804
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210880762.XA Active CN115094049B (zh) | 2022-07-26 | 2022-07-26 | 耐高温中性植酸酶突变体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115094049B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1194305A (zh) * | 1997-03-25 | 1998-09-30 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 修饰的植酸酶 |
| CN107287176A (zh) * | 2016-04-12 | 2017-10-24 | 武汉新华扬生物股份有限公司 | 一种耐高温中性植酸酶Physh-A及其基因和应用 |
| CN112626048A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-04-09 | 江南大学 | 一种耐热植酸酶突变体及其应用 |
-
2022
- 2022-07-26 CN CN202210880762.XA patent/CN115094049B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1194305A (zh) * | 1997-03-25 | 1998-09-30 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 修饰的植酸酶 |
| CN107287176A (zh) * | 2016-04-12 | 2017-10-24 | 武汉新华扬生物股份有限公司 | 一种耐高温中性植酸酶Physh-A及其基因和应用 |
| CN112626048A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-04-09 | 江南大学 | 一种耐热植酸酶突变体及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115094049A (zh) | 2022-09-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107236717B (zh) | 植酸酶突变体 | |
| CN109402091B (zh) | 木聚糖酶突变体 | |
| EP3222714B1 (en) | Phytase mutants | |
| CN112094834B (zh) | 比活力提高的木聚糖酶突变体 | |
| CN110607291B (zh) | 耐热木聚糖酶突变体 | |
| CN112204136B (zh) | 植酸酶突变体 | |
| CN110607292B (zh) | 一种高比活木聚糖酶突变体 | |
| CN110029120B (zh) | 一种植酸酶高产菌株及其应用 | |
| CN110042092B (zh) | 一类稳定性提高的木聚糖酶突变体及其编码基因和应用 | |
| EP3929284A1 (en) | Phytase mutant | |
| CN111057694B (zh) | 一种来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶及其基因 | |
| EP4155396A1 (en) | Phytase mutant | |
| CN115094049B (zh) | 耐高温中性植酸酶突变体 | |
| CN110656100A (zh) | 一种解淀粉芽胞杆菌来源的耐热酸性β-甘露聚糖酶及其编码基因 | |
| EP2393925B1 (en) | Protein and DNA sequence encoding a cold adapted xylanase | |
| CN111218436B (zh) | 一种植酸酶突变体 | |
| CN109694858B (zh) | 一种植酸酶突变体 | |
| WO2020063268A1 (zh) | 植酸酶突变体 | |
| CN110724676B (zh) | 一种植酸酶突变体及其载体与应用 | |
| CN115094050A (zh) | 一种中性植酸酶突变体及其应用 | |
| CN116121222A (zh) | 一种中性植酸酶突变体及其应用 | |
| CN118222549A (zh) | 耐高温木聚糖酶突变体及其应用 | |
| CN118240804A (zh) | 一种木聚糖酶突变体及其应用 | |
| CN117106753A (zh) | 一种木聚糖酶XynZT-2突变体及其应用 | |
| WO2021233193A1 (zh) | 植酸酶突变体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |