CN115094050A - 一种中性植酸酶突变体及其应用 - Google Patents

一种中性植酸酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程与蛋白质改造技术领域，具体涉及一种中性植酸酶突变体及其应用。本发明以野生型植酸酶AN为基础，提供了包含F136T、S181D、F196D、N341Q中至少一个突变位点的突变体。与野生型相比，本发明提供的植酸酶单点突变体的比活力普遍提高了17.3%‑37.1%；而且本发明提供的包含F136T/N341Q、S181D/F196D/N341Q突变位点组合的植酸酶突变体，其比活力比对应单点突变体得到进一步提高，最高达992.2 U/mg，取得了意料不到的技术效果。

Description

一种中性植酸酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种中性植酸酶突变体及其应用。
背景技术
植酸又名肌醇六磷酸或环己六醇磷酸酯，广泛存在于植物籽实中，是植物性饲料中磷元素的主要储存形式，但植酸磷不能被动物直接吸收利用，必须在消化道内先水解为无机磷酸盐。水产动物尤其是鱼类消化系统中缺乏内源性植酸酶，无法利用饲料中的植酸磷，大部分随粪便排出，造成严重的水环境污染，同时造成磷的浪费。而水产动物对饲料中磷的需要量又高于畜禽，特别是鲤科鱼类属无胃鱼，没有胃酸分泌，通常采用饲料中添加磷酸氢钙或磷酸二氢钙等方法来满足水产动物机体对磷的营养需求。同时，植酸通常与一些二价或三价阳离子，如Ca 2+、Zn 2+、Fe2+等形成不溶性盐类，阻碍肠道对矿物元素的吸收。在酸性或近中性环境中植酸还可以与蛋白质形成络合物，影响蛋白质的吸收利用，与一些蛋白消化酶类等结合，降低了其活性。因此植酸也被认定为抗营养物质，它不仅造成饲料原料的浪费，无形中增加了养殖成本，还导致水产动物粪便中含有大量的氮磷和矿物质离子化合物，严重污染水环境。
随着饲料工业和养殖业的迅猛发展，饲料中未被消化利用的植酸磷对环境污染日益严重，能降解植酸磷的植酸酶已成为饲用酶制剂研究的热点。以往植酸酶的研究主要集中在酸性植酸酶上，酸性植酸酶适用于胃pH呈酸性的单胃动物以及少数鱼类，但不适用于消化道为中性的淡水鲤科鱼类和畜禽。
植酸酶广泛存在于动物、植物和微生物中，是一类能将植酸及其盐类催化水解成肌醇和磷酸的酶的总称，属磷酸单酯水解酶。植酸酶作为环保促生长型饲料添加剂，可提高水产动物饲料中磷的利用率，减少水产动物养殖中磷对水环境的污染和水产饲料中矿物质磷的添加量，同时能提高植物蛋白和植物饲料能量矿物质利用率，从而节约饲料资源，降低饲料成本，符合我国两型社会建设要求，其在水产健康养殖中具有广阔的应用前景。
当前植酸酶主要应用于猪用和禽用饲料，而水产饲料还未使用植酸酶。水产饲料大量使用磷矿石必然带来的磷污染，不利于环境保护。其原因是：（1）当前常用的酸性植酸酶耐温性不超过85℃，而水产饲料制粒温度超过90℃；因此制粒过程将使酶失活；（2）水体pH为中性或偏中性；而常用于饲料领域的酸性植酸酶pH作用范围4.0-5.0，在偏中性环境则几乎没有活性。过去二十多年来，经过多次的蛋白质工程改造，饲用植酸酶耐温性从不耐温提升到到耐受85℃的技术进步；但是还是不能满足水产饲料的制备工艺要求。 因此，开发耐高温（大于90℃）、作用pH中性且高产的植酸酶是开发水产植酸酶市场的关键。我国是水产养殖大国，每年生产水产饲料2000万吨以上，而且每年以10%速度增长。如果以每吨饲料添加2公斤植酸酶计算，其市场潜力为1万吨；以50元/kg价格计算，则潜在市场产值为5亿人民币，市场潜力巨大。
但是，目前水产用中性植酸酶面临产量低、成本高、耐温性及耐中性环境差等制约因素。因此，利用基因工程和蛋白质工程方法获得高产量、低成本适用于商业化的新型水产植酸酶酶成了亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种中性植酸酶突变体及其应用。所述突变体的比活力比野生型得到显著提高，有利于降低该酶的生产成本，促进其在水产饲料领域的广泛应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明涉及一种植酸酶突变体，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：136，181，196，341。
在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：F136T、S181D、F196D、N341Q。
在本发明的一些实施例中，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：
F136T；
S181D；
F196D；
N341Q；
F136T/S181D；
F136T/F196D；
F136T/N341Q；
S181D/F196D；
S181D/N341Q；
F196D/N341Q；
F136T/S181D/F196D；
F136T/S181D/N341Q；
F136T/ F196D/N341Q；
S181D/F196D/N341Q；
F136T/S181D/F196D/N341Q。
本发明还涉及编码上述植酸酶突变体的DNA分子。
本发明还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的植酸酶突变体的比活力得到显著提升。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
本发明还提供了上述植酸酶突变体在水产饲料领域中的应用。
本发明以野生型植酸酶AN为基础，提供了包含F136T、S181D、F196D、N341Q中至少一个突变位点的突变体。与野生型相比，本发明提供的植酸酶单点突变体的比活力普遍提高了17.3%-37.1%；而且本发明提供的包含F136T/N341Q、S181D/F196D/N341Q突变位点组合的植酸酶突变体，其比活力比对应单点突变体得到进一步提高，最高达992.2 U/mg，取得了意料不到的技术效果。从而说明F136T、S181D、F196D、N341Q这四个突变位点能显著提高植酸酶AN的比活力，有利于降低该酶的生产成本，促进其在水产领域中的广泛应用。
具体实施方式
本发明公开了一种植酸酶突变体、其制备方法及应用、编码该植酸酶突变体的DNA分子、载体、宿主细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECΜLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLSIN MOLECΜLAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。例如，本发明可选用如下实验材料和试剂：
菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、Amp、G418购自Invitrogen公司。
酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
培养基配方：
大肠杆菌培养基（LB培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；
酵母培养基（YPD培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；
酵母筛选培养基（MD培养基）：2%蛋白胨，2%琼脂糖；
BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10-5 %生物素，1%甘油；
BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10-5 %生物素，0.5%甲醇；
LB-AMP培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0；
LB-AMP平板：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，1.5%琼脂，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0；
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 重组质粒的构建
将来源于烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的植酸酶基因（GeneBankKAF4251155）根据毕赤酵母密码子偏好性进行优化，并在其起始密码子ATG前增加6个碱基GAATTC（EcoR I酶切位点），在其终止密码子TAA后增加GCGGCCGC（Not I酶切位点）。优化后的核苷酸序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成。将该植酸酶命名AN，其氨基酸序列为SEQID NO：1，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
用限制性内切酶EcoR I和Not I（Fermentas）对植酸酶AN基因进行酶切；同时，用限制性内切酶EcoR I和Not I对质粒pPIC9K进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4 DNA连接酶（Fermentas）将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进DH5α大肠杆菌（Invitrogen），用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序（Invitrogen）。
使用质粒小量制备试剂盒（Omega）从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒，获得1个重组质粒，将其命名为pPIC9K-AN。
实施例2 高比活中性植酸酶突变体的筛选
为了进一步提高植酸酶AN的酶活性，申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选。
1.1设计PCR引物AN-F1、AN-R1：
AN-F1：GGCGAATTCGCTCCATCTTCTGCTGGTTCTAAGTC（下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点）；
AN-R1：ATAGCGGCCGC TTAGGAGAAACATTCACCCCAG（下划线为限制性内切酶NotI识别位点）。
以AN基因（SEQ ID NO：1）为模板，利用上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（（博迈斯））进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150μl含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃、220rpm培养6 h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有植酸酶的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出40μL裂解液至两块新的96孔板，将其中一块96孔板于75℃处理5min；然后向两块96孔板中各加入80μL底物，于25℃反应30min后加入80μL终止液（钒酸铵：钼酸铵：硝酸=1：1：2），测定生成的无机磷含量。另一块板加入200ul考马斯亮蓝溶液，静置10min，考马斯亮蓝（Bradford）结合法测定蛋白质含量，分别计算不同突变子酶活水平及蛋白含量。最终，申请人从两万多个转化子中筛选出能显著提高植酸酶AN比活力，又不会影响其原有酶学性质的突变位点：F136T、S181D、F196D、N341Q。
在上述野生型植酸酶AN的基础上，本发明提供了分别包含F136T、S181D、F196D、N341Q单个突变位点的突变体。
本发明还提供了包含F136T/N341Q、S181D/F196D/N341Q多个位点组合的突变体。
实施例3 植酸酶在毕赤酵母中的表达
3.1表达载体的构建
依照毕赤酵母的密码偏爱性分别对植酸酶AN及其突变体的基因序列进行优化，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上EcoRI和NotI两个酶切位点。
按照实施例1中所述方法，将合成的植酸酶AN及其突变体的基因序列分别进行EcoRI和NotI双酶切，然后与经同样酶切后的pPIC-9K载体16℃过夜连接，并转化大肠杆菌DH5a，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，菌落PCR（反应体系：模板挑取的单克隆，rTaqDNA聚合酶 0.5μl，10×Buffer 2.0μL，dNTPs(2.5mM) 2.0μL，5’AOX引物（10mM）：0.5μL，3’AOX引物：0.5μL，ddH2O 14.5μL，反应程序：95℃预变性5min，30个循环：94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，72℃ 10min）。验证阳性克隆子，经测序验证后获得了正确的重组表达质粒。
3.2毕赤酵母工程菌株的构建
3.2.1酵母感受态制备
将毕赤酵母GS115菌株进行YPD平板活化，30℃培养48 h后接种活化的GS115单克隆于6 mL YPD液体培养基中，30℃、220 rpm，培养约12 h后转接菌液于装有30mL YPD液体培养基的三角瓶中，30℃、220 rpm培养约5h，经紫外分光光度计检测其菌体密度，待其OD600值在1.1–1.3范围后，4℃ 9000 rpm离心2 min分别收集4mL菌体至灭菌EP管中，轻轻弃上清，用灭菌的滤纸吸干残留的上清后用预冷的1 mL灭菌水重悬菌体，4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，重复用1mL灭菌水洗一遍后，4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，预冷的1mL山梨醇(1 mol/L)重悬菌体；4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，预冷的100-150μl山梨醇(1 mol/L)轻柔重悬菌体。
3.2.2转化和筛选
分别将3.1构建得到的重组表达质粒用Sac I进行线性化，线性化片段纯化回收后通过电穿孔法分别转化毕赤酵母GS115，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株，然后在含不同浓度遗传霉素的YPD平板（0.5mg/mL-8mg/mL）上筛选多拷贝的转化子。
将获得的转化子分别转接于BMGY培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入BMMY培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4 d；9000rpm离心10min去除菌体，即得到分别含 植酸酶AN和 植酸酶突变体的发酵上清液。
1、植酸酶酶活测定方法
（1）植酸酶酶活单位的定义
在温度为25℃、pH为6.0的条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
（2）植酸酶酶活测定方法
取甲、乙两支25mL比色管，各加入1.8mL乙酸缓冲液（pH 6.0）、0.2mL样品反应液，混匀，25℃预热5min。在甲管中加入4mL底物溶液，乙管中加入4mL终止液，混匀，25℃反应30min，反应结束后甲管中加入4mL终止液，乙管中加入4mL底物溶液，混匀。静置10min，分别在415nm波长处测定吸光值。每种样品作3个平行，取吸光值的平均值，通过标准曲线用回归直线方程计算植酸酶活性。
酶活X＝F×C/(m×30)。
其中：X——酶活力单位，U/g(mL)；
F——试样溶液反应前的总稀释倍数；
C——根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U；
m——试样质量或体积，g/mL；
30——反应时间。
（3）测定结果
按照上述方法进行酶活检测，结果显示：上述构建得到的重组表达植酸酶AN及其突变体的毕赤酵母重组菌株发酵上清液的酶活为430-677 U/mL。
2、蛋白含量测定方法
考马斯亮蓝（Bradford）结合法测定蛋白质含量是比色法与色素法结合的复合方法。考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈棕红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。在3～5分钟即成大量吸收，至少稳定1小时。在10～1000μg/mL范围内，吸光值与蛋白质浓度成正比。
按照酶液和考马斯亮蓝溶液体积比1：5的比例进行混合，静置10mim，考马斯亮蓝（Bradford）结合法测定蛋白质含量
按照上述方法进行蛋白含量的检测。结果显示：上述构建得到的重组表达植酸酶AN及其突变体的毕赤酵母重组菌株发酵上清液的蛋白含量为0.633-0.682mg/mL。
3、比活力计算
“比活力 (Specific Activity) ”是指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用U/mg蛋白质来表示。
比活力计算公式：比活力（U/mg）=酶活（U/mL）/ 蛋白含量（mg/mL）。
具体结果见表1。
表1 中性植酸酶突变体比活力比较
植酸酶AN及其突变体 比活力（U/mg）
野生型AN 679.6
F136T 931.6
S181D 835.1
F196D 797.1
N341Q 812.5
F136T/N341Q 981.3
S181D/F196D/N341Q 992.2
从表1的结果可以看出，与野生型植酸酶AN相比，本发明提供的中性植酸酶单点突变体的比活力普遍提高了17.3%-37.1%，从而说明F136T、S181D、F196D、N341Q这四个突变位点能显著提高植酸酶AN的比活力，其中F136T 的效果最好。
而且，与单点突变体相比，本发明提供的包含F136T/N341Q、S181D/F196D/N341Q突变位点组合的植酸酶突变体，其比活力得到进一步提高，最高达992.2 U/mg，取得了意料不到的技术效果。
综上，本发明提供的中性植酸酶突变体的比活力得到显著提高，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在水产领域中的广泛应用。
序列表
<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 一种中性植酸酶突变体及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 445
<212> PRT
<213> 烟曲霉(Aspergillus fumigatus)
<400> 1
Ala Pro Ser Ser Ala Gly Ser Lys Ser Cys Asp Thr Val Asp Leu Gly
1 5 10 15
Tyr Gln Cys Ser Pro Ala Thr Ser His Leu Trp Gly Leu Tyr Ser Pro
20 25 30
Phe Phe Ser Leu Glu Asp Glu Leu Ser Val Ser Ser Lys Leu Pro Lys
35 40 45
Asp Cys Arg Ile Thr Leu Val Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg
50 55 60
Tyr Pro Thr Ser Ser Lys Ser Lys Lys Tyr Lys Lys Leu Val Thr Ala
65 70 75 80
Ile Gln Ala Asn Ala Thr Asp Phe Lys Gly Lys Phe Ala Phe Leu Lys
85 90 95
Thr Tyr Asn Tyr Thr Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu
100 105 110
Gln Gln Leu Val Asn Ser Gly Ile Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Lys Ala
115 120 125
Leu Ala Arg Ser Val Val Pro Phe Ile Arg Ala Ser Gly Ser Asp Arg
130 135 140
Val Ile Ala Ser Gly Glu Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Gln Ala Lys
145 150 155 160
Leu Ala Asp Pro Gly Ala Thr Asn Arg Ala Ala Pro Ala Ile Ser Val
165 170 175
Ile Ile Pro Glu Ser Glu Thr Phe Asn Asn Thr Leu Asp His Gly Val
180 185 190
Cys Thr Lys Phe Glu Ala Ser Gln Leu Gly Asp Glu Val Ala Ala Asn
195 200 205
Phe Thr Ala Leu Phe Ala Pro Asp Ile Arg Ala Arg Ala Glu Lys His
210 215 220
Leu Pro Gly Val Thr Leu Thr Asp Glu Asp Val Val Ser Leu Met Asp
225 230 235 240
Met Cys Ser Phe Asp Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Ser Gln Leu
245 250 255
Ser Pro Phe Cys Gln Leu Phe Thr His Asn Glu Trp Lys Lys Tyr Asn
260 265 270
Tyr Leu Gln Ser Leu Glu Lys Tyr Tyr Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Pro
275 280 285
Leu Gly Pro Ala Gln Gly Ile Gly Phe Thr Asn Glu Leu Ile Ala Arg
290 295 300
Leu Thr Arg Ser Pro Val Gln Asp His Thr Ser Thr Asn Ser Thr Leu
305 310 315 320
Val Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ala Thr Met Tyr Val Asp
325 330 335
Phe Ser His Asp Asn Ser Met Val Ser Ile Phe Phe Ala Leu Gly Leu
340 345 350
Tyr Asn Gly Thr Glu Pro Leu Ser Arg Thr Ser Val Glu Ser Ala Lys
355 360 365
Glu Leu Asp Gly Tyr Ser Ala Ser Trp Val Val Pro Phe Gly Ala Arg
370 375 380
Ala Tyr Phe Glu Thr Met Gln Cys Lys Ser Glu Lys Glu Pro Leu Val
385 390 395 400
Arg Ala Leu Ile Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Asp Val
405 410 415
Asp Lys Leu Gly Arg Cys Lys Leu Asn Asp Phe Val Lys Gly Leu Ser
420 425 430
Trp Ala Arg Ser Gly Gly Asn Trp Gly Glu Cys Phe Ser
435 440 445
<210> 2
<211> 1338
<212> DNA
<213> 烟曲霉(Aspergillus fumigatus)
<400> 2
gctccatctt ctgctggttc taagtcctgt gacactgtcg acttgggtta ccaatgttct 60
ccagctactt ctcacttgtg gggtctgtac tctccattct tctcattgga ggacgagttg 120
tccgtttcct ccaagttgcc aaaggactgt agaatcacct tggtccaggt tttgtccaga 180
cacggtgcta gatacccaac ttcttccaag tccaagaagt acaagaagct ggttactgcc 240
atccaggcta acgctactga tttcaaggga aagttcgcct tccttaagac ctacaactac 300
actttgggtg ccgacgactt gactccattc ggtgaacaac aattggtcaa ctccggtatc 360
aagttctacc agagatacaa ggctttggcc agatccgtcg tgccttttat tagagcttct 420
ggttccgaca gagttatcgc ttctggtgag aagttcatcg agggtttcca acaggctaag 480
ttggctgatc caggtgctac taatagagct gctccagcta tctccgttat cattccagaa 540
tccgagactt tcaacaacac cttggatcac ggtgtctgca ctaagttcga agcttctcaa 600
ttgggtgacg aggttgctgc taacttcact gctttgttcg ctccagacat cagagctaga 660
gctgaaaagc acttgccagg tgttactttg actgacgagg acgttgtttc cctgatggac 720
atgtgttcct tcgatactgt tgctagaact tccgacgctt cccaattgtc cccattctgt 780
cagttgttca ctcacaacga gtggaaaaag tacaactacc tgcagtcctt ggagaagtac 840
tacggttacg gtgctggtaa tccattgggt ccagctcaag gtatcggttt cactaacgag 900
ttgatcgcca gactgactag atccccagtt caagatcaca cttccaccaa ctccaccttg 960
gtttctaacc ctgctacttt cccactgaac gccactatgt acgttgactt ctctcacgac 1020
aactccatgg tgtccatttt cttcgctctg ggactgtaca acggtactga gcctttgtct 1080
agaacctctg ttgagtccgc taaagagttg gacggttact ctgcttcttg ggttgttcca 1140
tttggtgcca gagcttactt cgagactatg caatgcaagt ccgagaaaga gccattggtc 1200
agagctttga tcaacgacag agtcgttcca ttgcacggtt gtgacgttga taagctgggt 1260
agatgcaagc tgaacgactt cgttaagggt ttgtcttggg ctagatccgg tggtaactgg 1320
ggtgaatgtt tctcctaa 1338

Claims (10)

1.一种植酸酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：136，181，196，341。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
3.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
4.如权利要求1-3任一所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：F136T、S181D、F196D、N341Q。
5.如权利要求4所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：
F136T；
S181D；
F196D；
N341Q；
F136T/S181D；
F136T/F196D；
F136T/N341Q；
S181D/F196D；
S181D/N341Q；
F196D/N341Q；
F136T/S181D/F196D；
F136T/S181D/N341Q；
F136T/ F196D/N341Q；
S181D/F196D/N341Q；
F136T/S181D/F196D/N341Q。
6.编码权利要求5所述植酸酶突变体的DNA分子。
7.包含权利要求6所述DNA分子的重组表达质粒。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求7所述的重组表达质粒。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）或里氏木霉（Trichoderma reesei）。
10.权利要求1-5任一所述植酸酶突变体在水产饲料领域中的应用。
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