CN104450643B - 植酸酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种植酸酶突变体及其应用，是在植酸酶HTP6M的基础上通过大量的突变筛选，最终获得耐热性得到显著提高的植酸酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。本发明以植酸酶突变体HTP6M为基础，提供了包含D35Y单点突变的植酸酶突变体HTP6M1，包含D35Y和F254Y两点突变的植酸酶突变体HTP6M2和包含D35Y、F254Y、Q184E、Y289K、I405L五点突变的植酸酶突变体HTP6M5。与植酸酶HTP6M相比，突变体HTP6M1、HTP6M2和HTP6M5的最适作用温度和pH没有发生改变，但其耐热性得到显著提升。

Description

植酸酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于酶基因改造技术领域，具体涉及一种植酸酶突变体及其应用。

背景技术

植酸酶(Phytase)即肌醇六磷酸水解酶(EC3.1.3.8)，是催化植酸以及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称。

植酸酶作为一种优良的饲料添加剂目前被广泛地应用于畜牧业生产中，它能够提高动物对磷元素的利用率，以及蛋白质、氨基酸、各种矿物元素的利用率，解除动物植物性饲料中植酸的抗营养作用，提高植物性饲料的营养价值，同时降低动物排泄物对环境的污染，在动物生产以及在环境保护中，是极为有效的一种添加剂，具有重要的应用价值。

植酸酶可作为一种单胃动物的饲料添加剂，它的饲喂效果已在世界范围内得到了确证。它可使植物性饲料中磷的利用率提60％，粪便中磷排泄量减少40％，同时还可降低植酸的抗营养作用。因此在饲料中添加植酸酶对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。

因为目前在颗粒饲料生产过程中有一个短暂的80-90℃的高温阶段。细菌植酸酶APPA热稳定性较差，其水溶液在70℃下保温5分钟剩余酶活性低于30％，直接添加到动物饲料中进行制粒后存留酶活一般低于20％，使APPA植酸酶在颗粒饲料的应用受到限制。采用饲料制粒后植酸酶液体喷涂到饲料上的方法不仅增加设备投入，而且对酶制剂的稳定性、饲料中分布均一性都无法很好的保证。因此，提高植酸酶热稳定性对目前饲料用植酸酶具有重要的现实意义。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种植酸酶突变体及其应用；是在植酸酶HTP6M的基础上通过大量的突变筛选，最终获得耐热性得到显著提高的植酸酶突变体，为其在饲料领域的广泛使用奠定了基础。

本发明一方面提供了一种植酸酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的植酸酶的第35位氨基酸由Asp变为Tyr。

上述植酸酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:4。

本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:4的植酸酶突变体基因的质粒。

本发明另一方面提供了一种植酸酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:3的植酸酶的第254位氨基酸由Phe变为Tyr。

上述植酸酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:6。

本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:6的植酸酶突变体基因的质粒。

本发明还提供了一种植酸酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:5的植酸酶的第184位氨基酸由Gln变为Glu，第289位氨基酸由Tyr变为Lys，第405位氨基酸由Ile变为Leu。

上述植酸酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:8。

本发明还包括携带有编码序列为SEQ ID NO:8的植酸酶突变体基因的质粒。

本发明还提供了一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。

所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)。

本发明以植酸酶突变体HTP6M为基础，提供了包含D35Y单点突变的植酸酶突变体HTP6M1，包含D35Y和F254Y两点突变的植酸酶突变体HTP6M2和包含D35Y、F254Y、Q184E、Y289K、I405L五点突变的植酸酶突变体HTP6M5。与植酸酶HTP6M相比，突变体HTP6M1、HTP6M2和HTP6M5的最适作用温度和pH没有发生改变，其最适作用温度均为75℃，其最适作用pH均为5.0，但其耐热性得到显著提升；80℃处理5min后，植酸酶HTP6M的残留酶活仅剩17％，而突变体HTP6M1、HTP6M2和HTP6M5的残留酶活比植酸酶HTP6M分别提高12.31％、21.31％和30.06％，从而有利于其在饲料中的广泛应用。

附图说明

图1为重组质粒pPIC9K-HTP6M图谱；

图2为植酸酶HTP6M及其突变体HTP6M1、HTP6M2和HTP6M5耐热性比较图。

具体实施方式：

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验材料和试剂：

菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、Amp、G418购自Invitrogen公司。

酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。

培养基配方：

大肠杆菌培养基(LB培养基)：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCL，pH7.0)；

LB-AMP培养基：LB培养基加100μg/mL氨苄青霉素；

酵母培养基(YPD培养基)：1％酵母提取物、2％蛋白胨2％葡萄糖；

酵母筛选培养基(MD培养基)：2％蛋白胨、2％琼脂糖；

BMGY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10-5生物素，1％甘油；

BMMY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10-5生物素，0.5％甲醇。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：大肠杆菌植酸酶突变体基因的合成与重组质粒的获得

以SEQ ID NO：2所示植酸酶(命名为HTP6M)基因序列为参考，在上海捷瑞生物工程有限公司人工合成该基因，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

根据基因5’端设计PCR引物含有EcoRI内切酶位点，3’端设计PCR引物含NotI内切酶位点，引物序列如下：

5’端引物HTP6M-F：CGCGAATTCCAGTCAGAACCAGAGTTGAAGTT

3’端引物：HTP6M-R：CGCGAATTCCAGTCAGAACCAGAGTTGAAGTT

以合成的植酸酶HTP6M基因为模板，用上述引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：模板1.0μL,上游引物PHYTH-F 1.0μL,下游引物PHYTH-F 1.0μL,5×PSBuffer 10.0μL,dNTPs(2.5mM)4.0μL,Primer-StarDNA聚合酶1.0μL，ddH₂O32.0μL，反应总体系为50μL。PCR循环程序为：95℃预变性5min，30cycles:94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，72℃10min；胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pPIC-9k载体16℃过夜连接并转化大肠杆菌DH5a，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，菌落PCR(反应体系：模板挑取的单克隆，rTaqDNA聚合酶0.5ul，10×Buffer2.0μL,dNTPs(2.5mM)2.0μL,5’AOX引物(10M)：0.5μL,3’AOX引物：0.5μL，ddH₂O14.5μL，反应程序：95℃预变性5min，30cycles:94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，72℃10min)验证阳性克隆子，经测序验证后最后获得了正确的重组质粒pPIC9K-HTP6M。

实施例2植酸酶突变体全长及重组质粒的获得

为了进一步提高植酸酶HTP6M的热稳定性，对合成的植酸酶HTP6M基因进行蛋白结构分析，该蛋白有两个结构域：N端的134个氨基酸残基与C端的152个氨基酸残基共同组成结构域1，剩余中间124氨基酸残基组成结构域2，保守序列和活性中心均位于结构域1中，在不破坏蛋白二级结构与活性中心的前提下，进一步对该基因进行了大量突变位点的筛选，并通过实验进行效果验证：

设计PCR引物HTP6M-F1、HTP6M-R1：

HTP6M-F1：GGCGAATTCCAGTCAGAACCAGAGTTGAAGTT(下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点)，

HTP6M-R1：ATAGCGGCCGCTTACAAGGAACAAGCAGGGAT(下划线为限制性内切酶NotI识别位点)，

以植酸酶基因HTP6M为模板，以上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有植酸酶的大肠杆菌细胞裂解液。

分别取出40ul裂解液至两块新的96孔板，其中一块板于80℃处理10min后，两块96孔板都加入80ul底物，于37℃反应30min后加入80ul终止液(钒酸铵：钼酸铵：硝酸＝1:1:2)测定生成的无机磷含量，不同的突变子高温处理后保持的活性不同。

实验结果表明，有些突变对植酸酶HTP6M蛋白耐热性没有影响，有些突变甚至使其耐热性或酶活变得更差了；另外还有些突变，虽然能提高植酸酶HTP6M蛋白对温度的耐受性，但突变后其酶学性质发生了显著的变化，这些均不符合要求。最终，得到既能显著提高植酸酶HTP6M的耐热性，又不会影响其酶活及原有酶学性质的突变位点及位点的组合：D35Y单点突变，D35Y和F254Y两点突变，以及D35Y、F254Y、Q184E、Y289K、I405L五点突变。

将上述含D35Y单点突变的植酸酶突变体命名为HTP6M1，其氨基酸序列为SEQ IDNO:3，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

将上述含D35Y和F254Y两点突变的植酸酶突变体命名为HTP6M2，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO:6。

将上述含D35Y、F254Y、Q184E、Y289K、I405L五点突变的植酸酶突变体命名为HTP6M25，其氨基酸序列为SEQ ID NO:7，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ IDNO:8。

2.1突变体基因的合成及扩增

由上海捷瑞生物工程有限公司依照毕赤酵母的密码偏爱性分别优化合成SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8这三条突变体的基因序列，并且在合成序列5’和3’两端分别加上EcoRI和NotI两个酶切位点。

2.3突变体基因表达载体的构建

将2.1合成的3条基因序列分别进行EcoRI和NotI双酶切，然后与经同样酶切后的pPIC-9k载体16℃过夜连接，并转化大肠杆菌DH5a，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，菌落PCR(反应体系及程序同实施例1)验证阳性克隆子，经测序验证后最后获得了正确的重组表达质粒，3个重组表达质粒分别命名为pPIC9K-HTP6M1、pPIC9K-HTP6M2和pPIC9K-HTP6M5。

实施例3毕赤酵母工程菌株的构建

3.1酵母感受态制备

将毕赤酵母GS115菌株进行YPD平板活化，30℃培养48h后接种活化的GS115单克隆于6mL YPD液体培养基中，30℃、220rpm，培养约12h后转接菌液于装有30mlYPD液体培养基的三角瓶中，30℃、220rpm培养约5h经紫外分光光度计检测其菌体密度，待其OD600值在1.1–1.3范围后，4℃9,000rpm离心2min分别收集4ml菌体至灭菌EP管中，轻轻弃上清，用灭菌的滤纸吸干残留的上清后用预冷的1mL灭菌水重悬菌体，4℃、9,000rpm离心2min，轻轻弃上清，重复用1ml灭菌水洗一遍后4℃、9,000rpm离心2min，轻轻弃上清，预冷的1mL山梨醇(1mol/L)重悬菌体；4℃、9,000rpm离心2min，轻轻弃上清，预冷的100-150μl山梨醇(1mol/L)轻柔重悬菌体。

3.2转化和筛选

分别将表达质粒pPIC9K-HTP6M、pPIC9K-HTP6M1、pPIC9K-HTP6M2和pPIC9K-HTP6M5用Sac I进行线性化，线性化片段纯化回收后通过电穿孔法分别转化毕赤酵母GS115，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-HTP6M、GS115/pPIC9K-HTP6M1、pPIC9K-HTP6M2和GS115/pPIC9K-HTP6M5，然后在含不同浓度遗传霉素的YPD平板(0.5mg/mL-8mg/mL)上筛选多拷贝的转化子。

将毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-HTP6M的一个阳性转化子命名为毕赤酵母HTP6M(Pichia pastoris HTP6M)，重组菌株GS115/pPIC9K-HTP6M1的一个阳性转化子命名为毕赤酵母HTP6M1(Pichia pastoris HTP6M1)，重组菌株GS115/pPIC9K-HTP6M2的一个阳性转化子命名为毕赤酵母HTP6M2(Pichia pastoris HTP6M2)，重组菌株GS115/pPIC9K-HTP6M5的一个阳性转化子命名为毕赤酵母HTP6M5(Pichia pastoris HTP6M5)。将毕赤酵母HTP6M、HTP6M1、HTP6M2和HTP6M5分别转接于BMGY培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入BMMY培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5％的甲醇，诱导表达4d；9000rpm离心10min去除菌体，即得到分别含植酸酶HTP6M及其突变体HTP6M1、HTP6M2和HTP6M5的发酵上清液。

(1)植酸酶酶活单位的定义

在温度为37℃、pH为5.0的条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

(2)植酸酶酶活测定方法

取甲、乙两支25mL比色管，各加入1.8mL乙酸缓冲液(PH 5.0)、0.2mL样品反应液，混匀，37℃预热5min。在甲管中加入4mL底物溶液，乙管中加入4mL终止液，混匀，37℃反应30min，反应结束后甲管中加入4mL终止液，乙管中加入4mL底物溶液，混匀。静置10min，分别在415nm波长处测定吸光值。每种样品作3个平行，取吸光值的平均值，通过标准曲线用回归直线方程计算植酸酶活性。

酶活X＝F×C/(m×30)

其中:X——酶活力单位，U/g(mL)；

F——试样溶液反应前的总稀释倍数；

C——根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U；

m——试样质量或体积，g/mL；

30——反应时间；

按照上述方法测定毕赤酵母HTP6M、HTP6M1、HTP6M2和HTP6M5发酵上清液的酶活分别为146U/ml、135U/mL、175U/mL、158U/mL。

3.2发酵验证

在10升发酵罐上分别进行毕赤酵母HTP6M、HTP6M1、HTP6M2和HTP6M5的发酵，发酵使用的培养基配方为：硫酸钙1.1g/L、磷酸二氢钾5.5g/L、磷酸二氢铵55g/L、硫酸镁16.4g/L、硫酸钾20.3g/L、氢氧化钾1.65g/L、消泡剂0.05％。

发酵生产工艺：pH5.0、温度30℃、搅拌速率300rpm、通风量1.0-1.5(v/v)、溶氧控制在20％以上。

整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7％比例接入种子，30℃培养24-26h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％以上表明该阶段结束，为期约30-60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，培养时间在150-180h之间；发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。

采用实施例3中3.1所述植酸酶酶活测定方法对上述粗酶液进行检测，毕赤酵母HTP6M最终的发酵酶活为10372U/mL，毕赤酵母HTP6M1最终的发酵酶活为10327U/mL，毕赤酵母HTP6M2最终的发酵酶活为11001U/mL，毕赤酵母HTP6M5最终的发酵酶活为10832U/mL。

实施例4酶学特性分析

4.1最适作用温度

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃，pH5.5条件下测定上述毕赤酵母HTP6M、HTP6M1、HTP6M2和HTP6M5发酵所得粗酶液的酶活，以最高酶活力为100％，计算相对酶活。结果显示：植酸酶HTP6M及其突变体HTP6M1、HTP6M2和HTP6M5的最适作用温度均为75℃。

4.2最适作用pH值

分别用pH2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液对上述毕赤酵母HTP6M、HTP6M1、HTP6M2和HTP6M5发酵所得粗酶液进行稀释，在37℃条件下测定酶活，以最高酶活力为100％，计算相对酶活。结果显示：植酸酶HTP6M及其突变体HTP6M1、HTP6M2和HTP6M5的最适作用pH均为5.0。

4.3耐热性分析

用预热10min的pH 0.25M乙酸钠缓冲液分别将上述毕赤酵母P HTP6M、HTP6M1、HTP6M2和HTP6M5发酵所得粗酶液稀释10倍，混合均匀，80℃处理5min，结束时取样并冷却至室温，然后测定稀释后的酶活，以未处理样品的酶活计100％，计算残留酶活。

结果如图2所示：80℃处理5min后，植酸酶HTP6M的残留酶活仅剩17％，而突变体HTP6M1、HTP6M2和HTP6M5的残留酶活比植酸酶HTP6M分别提高12.31％、21.31％和30.06％，从而说明突变导致植酸酶HTP6M的耐热性得到显著提升。

综上所述，本发明以植酸酶突变体HTP6M为基础，提供了包含D35Y单点突变的植酸酶突变体HTP6M1，包含D35Y和F254Y两点突变的植酸酶突变体HTP6M2和包含D35Y、F254Y、Q184E、Y289K、I405L五点突变的植酸酶突变体HTP6M5。与植酸酶HTP6M相比，突变体HTP6M1、HTP6M2和HTP6M5的最适作用温度和最适作用pH均没有发生改变，但其耐热性得到显著提升，从而有利于植酸酶在饲料中的广泛应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种植酸酶突变体，其特征在于，所述的植酸酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:7 。

2.编码权利要求1所述的植酸酶突变体的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列为SEQ ID NO:8。

3.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求2所述的基因。

4.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述的重组宿主细胞为转化/转染权利要求3所述的重组质粒的宿主细胞。

5.如权利要求4所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichiapastoris)。

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