CN102002487A - 一种优化改良的耐高温植酸酶phyth及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种优化改良的耐高温植酸酶PHYTH及其基因和应用。其氨基酸序列中的第66位用I替代L，第91位用E替代D，第102位用T替代S，第154位用L替代V，第160位用S替代A，第180位用K替代H，第230位用S替代T，第258位用L替代T，第302位用S替代T，第337位用C替代E，第339位用Q替代N，第400位用C替代T。本发明为了解决现有技术的不足，利用基因工程手段对大肠杆菌植酸酶APPA的进行改良，以解决大肠杆菌植酸酶APPA热稳定性差，不能适用于工业生产的要求，经过优化改良的植酸酶PHYTH其热稳定性得到很大的提高，可在饲料工业中显示出巨大的应用潜力。

Description

一种优化改良的耐高温植酸酶PHYTH及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种优化改良的耐高温植酸酶PHYTH及其基因和应用。

背景技术

植酸(Phytate，Phytic acid，IP6)又称肌醇六磷酸脂，结构复杂。植酸分子含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，植酸是饲料中磷的重要贮存形式。磷是动物机体必需矿物元素，单胃动物体内缺乏分解植酸的植酸酶(Phytase，催化植酸及植酸盐水解的酶)，造成饲料中磷的利用率仅有1/3或更低，为了补充有效磷的不足，必须在饲料中添加无机磷酸盐，常用的为磷酸氢钙和骨粉。这样不仅大大增加了饲料的成本，而且大量的植酸磷不能被利用而直接排出体外，造成磷源的浪费及严重的环境问题。单胃动物饲料中通过添加植酸酶，可以提高饲料中植酸磷的利用率，减少磷的排出对环境的污染。

植酸酶(EC3.1.3.8)即肌醇六磷酸水解酶，是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称。当饲料中存在足量的植酸时，添加适量植酸酶可以替代部分补加的无机磷酸盐。同时也避免植酸磷与动物体内的多种金属离子以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，而导致动物对这些营养元素无法有效利用。

随着生物技术的发展，特别是DNA重组技术的应用，使各种微生物来源的植酸酶基因的大规模表达成为可能。目前来源于Escherichia coli，Aspergillus niger、Aspergillus fumigatus、Selenomonas ruminantium等微生物的植酸酶已经在巴斯德毕赤酵母中得到表达。但是，颗粒饲料生产中需要经历一个短暂的高温阶段，一般在85-95℃。植酸酶本身就是一种蛋白质，在高温条件下会变性失活。现在大多数商品植酸酶都不能耐高温，高温制粒过程造成酶活的急剧下降，无法满足实际应用要求。如何使植酸酶既能短暂耐高温又能在动物体中具有高酶活是目前饲料用植酸酶制剂急需解决的一个问题。

来源于大肠杆菌植酸酶APPA具有高比活性的优点，并且已经被克隆并测序(The complete Nucleotide sequence of the Escherichia coli gene appA reveals significant homology between pH2.5 Acid phosphatase and glucose-1-phosphatase.Journal of Bacteriology，Sept.1990，p.5497-5500)该基因全长1299bp，编码432个氨基酸。N端的22个氨基酸为信号肽。APPA的最适温度为60℃，但其热稳定性较差，在60℃下保温10分钟其剩余酶活性别仅为50％，在80℃下保温10分钟其剩余酶活性在15％以下，因此，在动物饲料制粒过程中酶活性损失过大，剩余不到20％的活性，使得其在具体的应用中受到限制，因此如何利用基因工程的手段来提高其热稳定性，是解决其应用的关键点。

发明内容

本发明的目的是通过对大肠杆菌植酸酶APPA的改造，使改造后的植酸酶在温度的耐受性方面更加优良，最终达到工业化生产的要求。

本发明的目的是提供一种优化改良的耐高温植酸酶PHYTH及其基因。

本发明的再一目的是提供一种优化改良大肠杆菌Escherichia coli的植酸酶APPA耐热性的方法。

本发明的再一目的是提供包含上述的植酸酶基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述的植酸酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种表达植酸酶PHYTH的方法。

本发明的再一目的是提供上述植酸酶PHYTH的应用。

大肠杆菌植酸酶APPA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MKAILIPFLS LLIPLTPQSA FAQSEPELKL ESVVIVSRHG VRAPTKATQL

MQDVTPDAWP    60

TWPVKLGWLT PRGGELIAYL GHYQRQRLVA DGLLAKKGCP QSGQVAIIAD

VDERTRKTGE    120

AFAAGLAPDC AITVHTQADT SSPDPLFNPL KTGVCQLDNA NVTDAILSRA

GGSIADFTGH    180

RQTAFRELER VLNFPQSNLC LKREKQDESC SLTQALPSEL KVSADNVSLT

GAVSLASMLT    240

EIFLLQQAQG MPEPGWGRIT DSHQWNTLLS LHNAQFYLLQ RTPEVARSRA

TPLLDLIKTA    300

LTPHPPQKQA YGVTLPTSVL FIAGHDTNLA NLGGALELNW TLPGQPDNTP

PGGELVFERW    360

RRLSDNSQWI QVSLVFQTLQ QMRDKTPLSL NTPPGEVKLT LAGCEERNAQ

GMCSLAGFTQ    420

IVNEARIPACSL  432

本发明优选采用定点饱和基因突变和易错PCR随机突变及突变重组的方法对SEQ ID NO.1所示的大肠杆菌来源的植酸酶APPA进行改造，并经过高通量突变筛选的方法筛选得到耐高温植酸酶PHYTH，本发明的植酸酶PHYTH和原有大肠杆菌植酸酶APPA相比，去除前22个氨基酸的信号肽序列后，有12个氨基酸的差异，突变位点由+45L，+70D，+81S，+133V，+139A，+159H，+209T，+238T，+281T，+316E，+318N，+379T突变成+45I，+70E，+81T，+133L，+139S，+159K，+209S，+238L，+281S，+316C，+318Q，+379C，突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

MQSEPELKLE SVVIVSRHGV RAPTKATQLM QDVTPDAWPT WPVKIGWLTP

RGGELIAYLG      60

HYQRQRLVAE GLLAKKGCPQ TGQVAIIADV DERTRKTGEA FAAGLAPDCA

ITVHTQADTS     120

SPDPLFNPLK TGLCQLDNSN VTDAILSRAG GSIADFTGKR QTAFRELERV

LNFPQSNLCL     180

KREKQDESCS LTQALPSELK VSADNVSLSG AVSLASMLTE IFLLQQAQGM

PEPGWGRLTD     240

SHQWNTLLSL HNAQFYLLQR TPEVARSRAT PLLDLIKTAL SPHPPQKQAY

GVTLPTSVLF     300

IAGHDTNLAN LGGALCLQWT LPGQPDNTPP GGELVFERWR RLSDNSQWIQ

VSLVFQTLQQ     360

MRDKTPLSLN TPPGEVKLCL AGCEERNAQG MCSLAGFTQI VNEARIPACS L 411

或者包括大肠杆菌植酸酶APPA的信号肽序列，在APPA氨基酸序列中的第66位用I替代L，第91位用E替代D，第102位用T替代S，第154位用L替代V，第160位用S替代A，第180位用K替代H，第230位用S替代T，第258位用L替代T，第302位用S替代T，第337位用C替代E，第339位用Q替代N，第400位用C替代T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：

MKAILIPFLS LLIPLTPQSA FAQSEPELKL ESVVIVSRHG VRAPTKATQL

MQDVTPDAWP      60

TWPVKIGWLT PRGGELIAYL GHYQRQRLVA EGLLAKKGCP QTGQVAIIAD

VDERTRKTGE     120

AFAAGLAPDC AITVHTQADT SSPDPLFNPL KTGLCQLDNS NVTDAILSRA

GGSIADFTGK     180

RQTAFRELER VLNFPQSNLC LKREKQDESC SLTQALPSEL KVSADNVSLS

GAVSLASMLT     240

EIFLLQQAQG MPEPGWGRLT DSHQWNTLLS LHNAQFYLLQ RTPEVARSRA

TPLLDLIKTA     300

LSPHPPQKQA YGVTLPTSVL FIAGHDTNLA NLGGALCLQW TLPGQPDNTP

PGGELVFERW     360

RRLSDNSQWI QVSLVFQTLQ QMRDKTPLSL NTPPGEVKLC LAGCEERNAQ

GMCSLAGFTQ     420

IVNEARIPAC SL  432

该植酸酶PHYTH在温度的耐受性方面更加优良，在75℃水溶液中保温5分钟，剩余酶活在90％以上，而未改良的APPA植酸酶在75℃水溶液中保温5分钟，剩余酶活不足原来的10％；将该优化改良的植酸酶PHYTH添加到饲料中，经90℃高温制粒处理，其酶活仍保留90％以上，而未改良的APPA植酸酶经90℃高温制粒处理，酶活保留不足原来的20％，说明本发明的经过改良的植酸酶PHYTH达到了工业化生产的耐高温要求。

本发明还提供了上述优化改良的耐高温植酸酶PHYTH的基因序列，其碱基序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示：

SEQ ID NO.4：

atgcaaagcg aacccgaatt aaaattagag tcagtcgtga tcgtgtcaag acacggcgtt       60

cgtgctccaa ctaaagcaac tcagcttatg caagacgtaa ctcctgatgc gtggcccaca       120

tggccagtca aaatagggtg gttgactccg agaggtggtg aattgattgc ttacttagga       180

cattatcagc ggcaaagatt agtggctgag gggctactag cgaaaaaggg atgtccacaa       240

actggtcaag tggctattat cgcggatgtt gatgaaagga ctagaaaaac cggtgaggct       300

ttcgctgccg gattagcacc cgattgtgca atcacagttc atacgcaagc tgacacttct       360

tcacccgatc cactttttaa tcctctaaaa acaggtttgt gtcaattgga taactccaat       420

gtgaccgacg ctatattatc aagagcagga ggctctatcg ccgattttac tggtaaaagg       480

caaacggctt tcagggaatt agagagagtg ttgaattttc cccagtccaa tttgtgccta       540

aaaagagaga aacaagatga atcctgttcg ttgacacaag ccttgccgtc tgagctcaaa       600

gtctcagcgg acaacgtgag tctgtcaggt gcagtatcat tagcttcaat gttgacggaa       660

attttcctgt tgcaacaggc tcagggaatg ccagaacctg ggtggggtag attaactgac       720

agtcaccagt ggaatacctt attgtcgttg cacaatgctc agttctatct tctgcagagg       780

acacctgagg ttgctcgaag tagagcaacc cctcttttgg atctaattaa aaccgccttg       840

agcccccacc cacctcaaaa acaagcatac ggtgtcacat tacctacatc ggttcttttt       900

attgccgggc atgatactaa cttagccaat ttagggggcg ctctatgctt gcagtggaca      960

ctacctggtc aaccggataa tactccgcca ggcggagaat tagtgttcga acggtggaga      1020

cggttgtcgg ataattctca atggatccaa gtatcattgg ttttccagac tttgcagcaa      1080

atgagggata agacccccct atcgctgaac actcccccag gtgaagttaa gctctgcttg      1140

gcaggctgcg aagaaagaaa tgcccaggga atgtgctcct tagccggctt cactcagatt      1200

gtaaatgaag ccaggattcc tgcctgttcc ctg                                   1233

SEQ ID NO.5：

包含信号序列的突变后核苷酸序列

atgaaagcgatcttaatcccatttttatctcttctgattccgttaaccccgcaatctgcattcgct

caaagcg    aacccgaatt aaaattagag tcagtcgtga tcgtgtcaag acacggcgtt       60

cgtgctccaa ctaaagcaac tcagcttatg caagacgtaa ctcctgatgc gtggcccaca       120

tggccagtca aaatagggtg gttgactccg agaggtggtg aattgattgc ttacttagga       180

cattatcagc ggcaaagatt agtggctgag gggctactag cgaaaaaggg atgtccacaa       240

actggtcaag tggctattat cgcggatgtt gatgaaagga ctagaaaaac cggtgaggct       300

ttcgctgccg gattagcacc cgattgtgca atcacagttc atacgcaagc tgacacttct       360

tcacccgatc cactttttaa tcctctaaaa acaggtttgt gtcaattgga taactccaat       420

gtgaccgacg ctatattatc aagagcagga ggctctatcg ccgattttac tggtaaaagg       480

caaacggctt tcagggaatt agagagagtg ttgaattttc cccagtccaa tttgtgccta       540

aaaagagaga aacaagatga atcctgttcg ttgacacaag ccttgccgtc tgagctcaaa       600

gtctcagcgg acaacgtgag tctgtcaggt gcagtatcat tagcttcaat gttgacggaa       660

attttcctgt tgcaacaggc tcagggaatg ccagaacctg ggtggggtag attaactgac       720

agtcaccagt ggaatacctt attgtcgttg cacaatgctc agttctatct tctgcagagg       780

acacctgagg ttgctcgaag tagagcaacc cctcttttgg atctaattaa aaccgccttg       840

agcccccacc cacctcaaaa acaagcatac ggtgtcacat tacctacatc ggttcttttt       900

attgccgggc atgatactaa cttagccaat ttagggggcg ctctatgctt gcagtggaca       960

ctacctggtc aaccggataa tactccgcca ggcggagaat tagtgttcga acggtggaga       1020

cggttgtcgg ataattctca atggatccaa gtatcattgg ttttccagac tttgcagcaa       1080

atgagggata agacccccct atcgctgaac actcccccag gtgaagttaa gctctgcttg       1140

gcaggctgcg aagaaagaaa tgcccaggga atgtgctcct tagccggctt cactcagatt       1200

gtaaatgaag ccaggattcc tgcctgttcc ctg

本发明还提供了一种优化改良大肠杆菌Escherichia coli的植酸酶APPA耐热性的方法，具体地，是通过定点饱和基因突变和易错PCR随机突变及突变重组的方法改变SEQ ID NO.1所示的来源于大肠杆菌Escherichia coli的植酸酶APPA的多个氨基酸，包括其氨基酸序列中的第66位用I替代L，第91位用E替代D，第102位用T替代S，第154位用L替代V，第160位用S替代A，第180位用K替代H，第230位用S替代T，第258位用L替代T，第302位用S替代T，第337位用C替代E，第339位用Q替代N，第400位用C替代T。

本发明还提供了包含上述优化改良的植酸酶基因PHYTH的重组载体，将本发明的优化改良的植酸酶基因PHYTH插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的植酸酶基因PHYTH插入到质粒pPICzalphaA上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPICzαA-PHYTH。

本发明还提供了包含上述植酸酶基因PHYTH的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母菌株X33。

本发明还提供了表达上述植酸酶PHYTH的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)重组菌株进行发酵，诱导重组植酸酶的表达；

3)发酵结束后，回收并纯化所表达的植酸酶PHYTH。

具体地，将重组酵母表达质粒pPICzαA-PHYTH，转化到酵母宿主菌株X33中，用高浓度的抗生素平板筛选高拷贝的转化子，将筛选到的转化子，在7L的发酵罐中进行发酵，发酵过程中，每隔24h取发酵液测定OD₆₀₀以及菌体湿重，取上清液进行植酸酶活性检测。发酵结束最终平均发酵酶活达到14300U/mL，实现的植酸酶PHYTH的高效表达。

本发明还提供了上述植酸酶PHYTH在饲料添加剂中的应用。

本发明为了解决现有技术的不足，利用基因工程手段对大肠杆菌植酸酶APPA的进行改良，以解决大肠杆菌植酸酶APPA热稳定性差，不能适用于工业生产的要求，经过优化改良的植酸酶PHYTH其热稳定性得到很大的提高，在75℃水溶液中保温5分钟，剩余酶活在90％以上，能够满足工业生产中高温制粒的要求。并且通过高通量筛选，获得高表达量的菌株，进一步满足工业化生产降低成本的要求，因此，本发明的优化改良的植酸酶可在饲料工业中显示出巨大的应用潜力。

附图说明

图1为pPICzαA-PHYTH酵母菌株在7升发酵罐中的发酵情况。

图2为植酸酶APPA和PHYTH在不同pH值环境下的相对酶活曲线图。

图3为植酸酶APPA和PHYTH经不同温度处理后的相对酶活曲线图。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验材料和试剂：

1、菌株与载体

大肠杆菌菌株Top10、毕赤酵母X33、载体pPICzalphaA，Zeocin购自Invitrogen公司，载体pECO购自Gentarget公司。

2、酶与试剂盒

PCR酶，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、试剂盒购自上海生工公司。

3、培养基

大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LB-AMP为LB培养基加100ug/mL氨苄青霉素。LB-Zeo为LB培养基加25ug/mLZeocin。

酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDzeo(YPD+100mg/L zeocin)。

酵母诱导培养基BMGY(I％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。

重组酵母发酵培养基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％、消泡剂0.03％。高压后每升加4.35毫升PTM1。

PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％。

实施例1、大肠杆菌植酸酶基因APPA的合成及克隆

以已公布的大肠杆菌来源的植酸酶基因APPA序列作为参考，应用生物软件UPGENE，根据毕赤酵母最适密码子人工合成该基因。

根据基因5’端设计PCR引物含有EcoRI内切酶位点，3’端设计PCR引物含NotI内切酶位点，起引物序列如下：

5’端引物PHYTH-F1：gtaGAATTCatgcaaagcgaacccgaattaaaattag

3’端引物PHYTH-R1：attGCGGCCGCttacagggaacaggcaggaatcctg

以合成基因为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体pECO上，得到重组载体pECO-PHYTH。

实施例2、基因定点突变

对去除了信号肽的大肠杆菌植酸酶APPA进行蛋白结构自动建模分析(swissmodel)，分析其二级结构和三级结构。APPA共有410个氨基酸残基，其中共有20个a螺旋，其15-23个氨基酸残基为酸性植酸酶所共有的保守序列：RAGVRAPT。该蛋白共有两个结构域：N端的134个氨基酸残基与C端的152的氨基酸残基共同组成结构域1，其余中间124氨基酸残基组成结构域2，保守序列与活性中心均位于结构域1中。在不破坏其二级结构与活性中心的前提下，对活性中心附近以及二级结构连接处进行氨基酸定点突变。共预测了17个待突变位点，分别为：+7L，+45L，+70D，+77G，+112T，+133V，+150G，+159H，+210G，+238T，+2623E，+281T，+297S，+316E，+343S，+379T，+406I针对性的设计了17对饱和突变引物，目的基因突变位点统一为NNK，NNK左右各取15个碱基构成正向引物；反向引物与正向引物完全互补，其中，N代表A，T，C，G等四种碱基，K代表G，T等两种碱基。

PCR产物经DpnI酶切处理后转化BL21感受态细胞，在LB-Amp平板筛选阳性突变重组克隆。通过定点突变PCR得到10个相关氨基酸位点突变的阳性克隆，突变位点为+45L，+70D，+133V，+159H，+238T，+262E，+281T，+296S，+316E，+379T突变成+45I，+70E，+133L，+159K，+238L，+262I，+281S，+296N，+316C，+379C。对阳性突变位点进行随机重组得到最优组合，其含有8个突变位点，为+45L，+70D，+133V，+159H，+238T，+281T，+316E，+379T突变成+45I，+70E，+133L，+159K，+238L，+281S，+316C，+379C，该克隆命名为pECO-PHY-M8。

实施例3、基因易错PCR随机突变

以上述pECO-PHY-M8为模板，进行易错PCR随机突变扩增，具体地扩增方法是：

第一轮扩增：以载体启动子引物T7-F和T7-R为引物进行PCR扩增，反应体系如下：

反应程序如下：

回收第一轮PCR产物，去1uL稀释50-100倍用作第二轮PCR的模板；

第二，第三轮易错PCR以植酸酶特异性引物PHYTH-F1及PHYTH-R1替代引物T7-F和T7-R为反应引物，重复PCR反应。

取第二、三轮的产物用NotI和EcoRI进行双酶切，连接至pECO载体上的EcoRI和NotI位点之间。连接产物转化BL21，在LB氨苄琼脂糖平板培养筛选突变菌株。

实施例4、高通量耐温性突变菌株筛选

从实施例3易错PCR平板上挑取突变单菌落，接种到96孔深孔培养平板(即母板)。每个平板挑选16个未突变的克隆为对照。每孔含500uL培养基LB-Amp。37℃摇床200rpm培养24小时后，转移50uL平台期生长菌液到新的96孔平板，平板每孔添加450uL LB-AMP培养基，含有终浓度为0.5mM IPTG(即子板)，37℃过夜摇床200rpm诱导表达植酸酶。含有过夜培养诱导表达植酸酶的菌液平板在75℃水浴锅加热处理5分钟后细胞裂解，检测培养液中存留植酸酶活性。植酸酶初步耐热活性检测根据中华人民共和国国家标准《GB/T 18634-2002》进行。

剩余酶活反应结果超过对照克隆组的克隆挑选为阳性克隆。从母板上挑选阳性克隆集中到96孔平板重复上述的培养，诱导表达，热处理筛选试验。确定耐温性能有所提高的阳性突变克隆，得到3个阳性克隆，取阳性克隆质粒DNA进行基因测序。

测序结果确定氨基酸阳性突变位点，克隆1的突变位点为+25A，+81S，+139A替换为+25H，+81T，+139S；克隆2的突变位点为+209T，+409S替换为+209S，+409C；克隆3的突变点为+139A，+318N替换为+139S，+318Q。结合定点突变和易错PCR获得了阳性克隆，为进一步提高植酸酶的耐温性，进行了突变位点的重组筛选。以pECO-PHY-M8为模板，选用上述6个位点的定点突变引物，定点突变引物设计如上所述，通过定点突变PCR进行随机组合扩增，PCR产物经DpnI酶切处理后转化BL21感受态细胞，在LB-Amp平板筛选阳性突变重组克隆。挑取突变重组克隆菌落到96孔培养板培养，进行诱导表达，按上述方法进行热处理筛选实验。

通过剩余植酸酶酶活性的测定，突变重组克隆经过98个平板的重复筛选，在约8000个重组菌落中筛选得到了最佳耐温性突变克隆，经测序得到其基因序列，新加入了4个突变点，突变位点为+81S，+139A，+209T，+318N替换为+81T，+139S，+139S+318Q，较之原始人工合成基因，突变体共加入了共12个突变位点(突变位点由+45L，+70D，+81S，+133V，+139A，+159H，+209T，+238T，+281T，+316E，+318N，+379T突变成+45I，+70E，+81T，+133L，+139S，+159K，+209S，+238L，+281S，+316C，+318Q，+379C)，该最佳耐温性突变的植酸酶基因命名为PHYTH。

实施例5、植酸酶PHYTH酵母表达载体的构建及工程菌株的筛选

培养高通量热处理筛选得到的耐热植酸酶PECO-PHYTH大肠杆菌细胞，提取质粒DNA。限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切后纯化含有PHYTH基因的DNA片段，连接到pPICzaA载体EcoRI和NotI位点，使植酸酶基因PHYTH插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，通过载体与毕赤酵母染色体基因组之间的同源重组事件使目的基因稳定整合到酵母染色体上。连接产物转化TOP10大肠杆菌，LB-ZEO琼脂糖平板培养获得pPICzaA-PHYTH阳性菌落。

提取pPICzaA-PHYTH阳性菌落质粒，电击转化酵母X33感受态细胞，涂布含100ug/mL Zeocin和含500ug/mL Zeocin的YPDS固体培养平板，30℃培养2-3d。挑取在高浓度Zeocin YPDS平板(500ug/mL)上生长速度及菌落大小与100ug/mL ZeocinYPDS平板上相同的转化子，有可能含高拷贝的外源基因，挑选这些转化子进行进一步的表达实验。

实施例6、植酸酶的活性测定

按照中华人民共和国国家标准《GB/T 18634-2002》进行。植酸酶活性定义是指样品在植酸钠浓度为5.0mmol/L、温度37℃、pH值5.5的条件下，每min从植酸钠中释放1pmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

U＝FxC/(Vx30)

式中：U-试样中植酸酶的活性，U/mL；C-根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U；F-试样溶液反应前的总稀释倍数；V-试样体积，mL；30-反应时间，min。

标准曲线的制定如表1：

磷浓度(mmol/L)	0	1.5625	3.125	6.25	12.5	25
							OD值	0	0.054	0.109	0.212	0.437	0.942

实施例7、7L发酵罐小试

从YPD-zeo平板上选取单克隆，接种于20mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养20hr。以1∶50的比例接种到300mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养至OD600＝5，用以接种发酵罐。

国产7L发酵罐，加入3L发酵基础培养基，121℃灭菌20min，调节温度至30℃，用氨水调节pH至4.6，加入PTM1(4.35mL/L)，接入种子菌(1∶10)。发酵过程中，温度控制在30℃，通气量维持在2vvm，转速控制在500-800rpm之间以维持溶氧20％以上。

发酵分为三个阶段：生长期，从加入种子菌，培养约16-24h，直到将发酵罐中甘油耗尽，表现为溶氧突然上升；之后进入甘油促生长期，补加50％甘油(含有PTM1，12mL/L)，补料速度为18mL/L·h，持续4-6h；最后进入诱导期，用氨水或磷酸调节pH至所需值，流加100％甲醇(含有PTM1，12mL/L)，流速从1mL/L·h经15hr线性升至4mL/L·h，持续120h。

发酵过程中，每隔24h取发酵液测定OD₆₀₀以及菌体湿重，取上清液进行植酸酶活性检测。发酵结束最终平均发酵酶活达到14300U/mL，发酵过程曲线如图1所示。

实施例8、对改良前大肠杆菌植酸酶APPA及改良后植酸酶PHYTH的性质分析

对改良前大肠杆菌植酸酶APPA和改良后植酸酶PHYTH分别进行最适pH的测定，测定方法按常规方法进行测定，结果如图2所示，从图2可见，改良前大肠杆菌植酸酶APPA和改良后植酸酶PHYTH的pH反应曲线没有改变，最适pH值均为5.0。

根据国家植酸酶检测方法稀释植酸酶发酵液，在60-82℃区域进行耐温性实验。改良前大肠杆菌植酸酶APPA和改良后植酸酶PHYTH在PCR仪上不同温度加热处理5min后迅速放入冰水降温。另设一个未加热对照组。按常规方法进行酶活测定，以未加热处理样品结果为100％，检测各温度热处理5分钟后剩余酶活，如图3所示。从图3可见，本发明的改良后植酸酶PHYTH在耐热性能上有了很大的提高，75℃处理5分钟，酶活仍保留90％以上，而突变前的植酸酶经75℃处理5分钟，酶活保留不足原来的10％。经过突变筛选，获得的植酸酶PHYTH耐温性提高了11℃以上，实现了真正的耐高温，完全可以满足颗粒饲料制粒耐温条件要求。

Claims (10)

1.一种优化改良的耐高温植酸酶PHYTH，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示。

2.根据权利要求1所述的植酸酶PHYTH，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。

3.一种优化改良的耐高温植酸酶基因PHYTH，其特征在于，编码权利要求1或2所述的植酸酶。

4.如权利要求3所述的植酸酶基因PHYTH，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

5.一种优化改良植酸酶APPA耐热性的方法，其特征在于，通过基因突变改变SEQ ID NO.1所示的来源于大肠杆菌Escherichia coli的植酸酶APPA的多个氨基酸，包括其氨基酸序列中的第66位用I替代L，第91位用E替代D，第102位用T替代S，第154位用L替代V，第160位用S替代A，第180位用K替代H，第230位用S替代T，第258位用L替代T，第302位用S替代T，第337位用C替代E，第339位用Q替代N，第400位用C替代T。

6.包含权利要求3或4所述的植酸酶基因的重组载体。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPICzαA-PHYTH。

8.包含权利要求3或4所述的植酸酶基因的重组菌株。

9.一种表达权利要求1或2所述优化改良的植酸酶PHYTH的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求7所述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)重组菌株进行发酵，诱导重组植酸酶的表达；以及

3)发酵结束后，回收并纯化所表达的植酸酶PHYTH。

10.权利要求1或2所述的植酸酶PHYTH在饲料添加剂中的应用。

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