CN107653235A - 植酸酶突变体f89s和f89s/e226h及其基因和应用 - Google Patents

植酸酶突变体f89s和f89s/e226h及其基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程与酶工程领域，具体涉及植酸酶YkAPPA突变体F89S和F89S/E226H及其基因和应用。胃蛋白酶抗性和耐热性提高的植酸酶及其编码基因和应用。通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的植酸酶的第89位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，或第89位的苯丙氨酸突变为丝氨酸、第226位的谷氨酸突变为组氨酸获得所述突变体。相比于野生型，本发明的植酸酶突变体的胃蛋白酶抗性和耐酸性明显提高，在动物生产中具有很大应用潜力。

Description

植酸酶突变体F89S和F89S/E226H及其基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程与酶工程领域，具体涉及植酸酶突变体F89S和F89S/E226H及其基因和应用。胃蛋白酶抗性和耐热性提高的植酸酶及其编码基因和应用。
背景技术
利用植酸酶的催化作用高效利用植酸对可持续发展和生态效益具有重要意义。肠道胃蛋白酶和制粒高温常会降低植酸酶活性，减少营养利用效率，造成经济和环境问题。具有胃蛋白酶抗性和耐热性的植酸酶是开发节约型饲料酶的重要目标。
获得胃蛋白酶抗性和耐热性的植酸酶有两种途径，一是直接从自然界获得具有高稳定性的植酸酶酶，二是通过改造提高植酸酶对蛋白酶和高温的耐受性。很多从自然界中获得的植酸酶对蛋白酶、酸或高温敏感，不能满足工业生产需求。通过定点突变干扰胃蛋白酶对底物的选择性，提高了植酸酶的胃蛋白抗性和耐热性。新型优质植酸酶的获得有利于节约生产成本，提高经济效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种胃蛋白酶抗性和耐热性提高的植酸酶突变体。
本发明另一目的是提供编码上述胃蛋白酶抗性和耐热性改良的植酸酶突变体的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述胃蛋白酶抗性和耐热性改良的植酸酶突变体基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述胃蛋白酶抗性和耐酸性改良的植酸酶突变体基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供上述胃蛋白酶抗性和耐酸性改良的植酸酶突变体基因的应用。
本发明对克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristensenii)来源植酸酶YkAPPA基因进行定点突变，该植酸酶YkAPPA的成熟蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，该成熟蛋白是由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的。
SEQ ID NO.1
MTIAKEYLRLSILTLVLSSFTLSAAPLAAQSTGYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPQWPVKAGYLTPRGAGLVTLMGGFYGDYFRSYGLLPAGCPADESIYVQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKIDPLFHTVEAGVCKLDPEKTHQAVEKRLGGPLNELSQRYAKPFALMGEVLNFSASPYCNSLQQKGKTCDFATFAANEIEVNKEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQNSQAMPDVAWNRLSGEENWISLLSLHNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMEQLRNADKLDLKNNPARIVPIAIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.
SEQ ID NO.2
Atgacaatagcaaaagaatatctgcggttatccatactcactttggtgctcagtagttttacgctaagtgctgcaccgcttgcagcacaatctaccggttacactttggagcgcgtggtgattttgagccgccacggtgttcgttccccgacgaaacaaacacagttaatgaatgatgttacaccggacaaatggccacaatggccagtaaaagcgggctatttaacgccgcgaggggcaggattagtcactttaatgggcgggttctatggtgattatttccgcagctatgggttgttaccggcggggtgcccggcagacgaatccatctatgtgcaagctgatgttgaccaacgtacccgcttaaccgggcaggcatttctggacggtatagccccggattgcggcctgaaagtacattatcaagctgatttgaaaaaaattgacccattgttccataccgtcgaggcgggggtatgtaaattggacccagagaaaactcatcaggctgttgaaaaacgcttgggtgggccattaaatgaactgagtcaacgctatgccaagccctttgccctgatgggcgaggtgctgaatttttcggcctcaccttattgcaactcactgcaacagaaaggaaaaacctgtgattttgcgacttttgcagcaaatgaaatcgaggtaaataaagaagggacaaaagtctcactgagtgggccattggcgctatcatcgacattaggtgaaattttcctattacaaaattcacaggccatgccagatgtcgcctggaaccgtctcagcggtgaagaaaattggatttcattattgtcactgcataatgcacagttcgatttgatggccaaaaccccttatatcgcccggcataaaggaactccgttgttgcaacaaattgatacggcattagtgttgcaacgtgatgctcaggggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcgggggacatgacaccaatattgccaatattgcgggtatgttaggggccaattggcaattaccgcagcaacctgataataccccgccaggcggagggctagtctttgagctatggcagaatccggataaccatcaacgctatgtggcggtgaaaatgttctatcaaacgatggagcagttgcgcaatgcagataagttagatttgaaaaacaacccggcaagaattgttcccattgctattgaagggtgtgaaaacgagggtgataacaaactttgtcagcttgaaacgttccaaaagaaagtcgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa
根据本发明的胃蛋白酶抗性和耐酸性提高的植酸酶YkAPPA的突变体，通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的植酸酶的第89位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，进一步，第226位的谷氨酸突变为组氨酸而得。
根据本发明的具体实施方式，采用定点突变的方法，获得了2个胃蛋白酶抗性和耐热性提高的的植酸酶YkAPPA的突变体，分别命名为F89S和F89S/E226H，即：F89S为第89位苯丙氨酸突变为丝氨酸；F89S/E226H为第89位苯丙氨酸突变为丝氨酸且第226位谷氨酸突变为组氨酸。
因此根据本发明的胃蛋白酶抗性和耐热性改良的植酸酶YkAPPA的突变体F89S，其中第89位苯丙氨基酸突变为丝氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示
SEQ ID NO.3
MTIAKEYLRLSILTLVLSSFTLSAAPLAAQSTGYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPQWPVKAGYLTPRGAGLVTLMGGSYGDYFRSYGLLPAGCPADESIYVQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKIDPLFHTVEAGVCKLDPEKTHQAVEKRLGGPLNELSQRYAKPFALMGEVLNFSASPYCNSLQQKGKTCDFATFAANEIEVNKEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQNSQAMPDVAWNRLSGEENWISLLSLHNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMEQLRNADKLDLKNNPARIVPIAIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.
根据本发明的胃蛋白酶抗性改良的植酸酶YkAPPA的突变体，其中第89位苯丙氨基酸突变为丝氨酸、且第226位亮氨酸突变为甘氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示
SEQ ID NO.4
MTIAKEYLRLSILTLVLSSFTLSAAPLAAQSTGYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPQWPVKAGYLTPRGAGLVTLMGGSYGDYFRSYGLLPAGCPADESIYVQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKIDPLFHTVEAGVCKLDPEKTHQAVEKRLGGPLNELSQRYAKPFALMGEVLNFSASPYCNSLQQKGKTCDFATFAANEIHVNKEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQNSQAMPDVAWNRLSGEENWISLLSLHNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMEQLRNADKLDLKNNPARIVPIAIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.
本发明还提供了编码上述胃蛋白酶抗性和耐热性改良的植酸酶YkAPPA的突变体F89S和F89S/E226H的基因序列，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和6所示。
SEQ ID NO.5
Atgacaatagcaaaagaatatctgcggttatccatactcactttggtgctcagtagttttacgctaagtgctgcaccgcttgcagcacaatctaccggttacactttggagcgcgtggtgattttgagccgccacggtgttcgttccccgacgaaacaaacacagttaatgaatgatgttacaccggacaaatggccacaatggccagtaaaagcgggctatttaacgccgcgaggggcaggattagtcactttaatgggcgggagctatggtgattatttccgcagctatgggttgttaccggcggggtgcccggcagacgaatccatctatgtgcaagctgatgttgaccaacgtacccgcttaaccgggcaggcatttctggacggtatagccccggattgcggcctgaaagtacattatcaagctgatttgaaaaaaattgacccattgttccataccgtcgaggcgggggtatgtaaattggacccagagaaaactcatcaggctgttgaaaaacgcttgggtgggccattaaatgaactgagtcaacgctatgccaagccctttgccctgatgggcgaggtgctgaatttttcggcctcaccttattgcaactcactgcaacagaaaggaaaaacctgtgattttgcgacttttgcagcaaatgaaatcgaggtaaataaagaagggacaaaagtctcactgagtgggccattggcgctatcatcgacattaggtgaaattttcctattacaaaattcacaggccatgccagatgtcgcctggaaccgtctcagcggtgaagaaaattggatttcattattgtcactgcataatgcacagttcgatttgatggccaaaaccccttatatcgcccggcataaaggaactccgttgttgcaacaaattgatacggcattagtgttgcaacgtgatgctcaggggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcgggggacatgacaccaatattgccaatattgcgggtatgttaggggccaattggcaattaccgcagcaacctgataataccccgccaggcggagggctagtctttgagctatggcagaatccggataaccatcaacgctatgtggcggtgaaaatgttctatcaaacgatggagcagttgcgcaatgcagataagttagatttgaaaaacaacccggcaagaattgttcccattgctattgaagggtgtgaaaacgagggtgataacaaactttgtcagcttgaaacgttccaaaagaaagtcgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa
SEQ ID NO.6
Atgacaatagcaaaagaatatctgcggttatccatactcactttggtgctcagtagttttacgctaagtgctgcaccgcttgcagcacaatctaccggttacactttggagcgcgtggtgattttgagccgccacggtgttcgttccccgacgaaacaaacacagttaatgaatgatgttacaccggacaaatggccacaatggccagtaaaagcgggctatttaacgccgcgaggggcaggattagtcactttaatgggcgggagctatggtgattatttccgcagctatgggttgttaccggcggggtgcccggcagacgaatccatctatgtgcaagctgatgttgaccaacgtacccgcttaaccgggcaggcatttctggacggtatagccccggattgcggcctgaaagtacattatcaagctgatttgaaaaaaattgacccattgttccataccgtcgaggcgggggtatgtaaattggacccagagaaaactcatcaggctgttgaaaaacgcttgggtgggccattaaatgaactgagtcaacgctatgccaagccctttgccctgatgggcgaggtgctgaatttttcggcctcaccttattgcaactcactgcaacagaaaggaaaaacctgtgattttgcgacttttgcagcaaatgaaatccatgtaaataaagaagggacaaaagtctcactgagtgggccattggcgctatcatcgacattaggtgaaattttcctattacaaaattcacaggccatgccagatgtcgcctggaaccgtctcagcggtgaagaaaattggatttcattattgtcactgcataatgcacagttcgatttgatggccaaaaccccttatatcgcccggcataaaggaactccgttgttgcaacaaattgatacggcattagtgttgcaacgtgatgctcaggggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcgggggacatgacaccaatattgccaatattgcgggtatgttaggggccaattggcaattaccgcagcaacctgataataccccgccaggcggagggctagtctttgagctatggcagaatccggataaccatcaacgctatgtggcggtgaaaatgttctatcaaacgatggagcagttgcgcaatgcagataagttagatttgaaaaacaacccggcaagaattgttcccattgctattgaagggtgtgaaaacgagggtgataacaaactttgtcagcttgaaacgttccaaaagaaagtcgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa
将上述编码胃蛋白酶抗性和耐热性改良的植酸酶YkAPPA的突变体的cDNA分子以合适的取向和正确的读码框插入到所述载体的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。本发明优选的载体为pPIC9r，使改造的植酸酶基因插入到质粒pPIC9r上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到各突变体的重组细菌表达质粒。本发明优选的宿主菌为毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115。
相比于野生型，本发明的植酸酶YkAPPA的突变体F89S和F89S/E226H的胃蛋白酶抗性和耐酸性明显提高，在动物生产中具有很大应用潜力。
附图说明
图1为改造前、后的植酸酶对不同浓度胃蛋白酶处理2h的耐受性曲线图；
图2为改造前、后的植酸酶在60℃下处理不同时间后酶活曲线图；
图3为改造前、后的植酸酶在不同pH下的酶活曲线图；
图4为改造前、后的植酸酶对玉米粉中植酸钠的降解曲线图。
具体实施方式
实验材料
真核表达载体pPIC9r购自Novagen公司。大肠杆菌Trans1-T1和BL21(DE3)细胞购自天根，分别作为质粒扩增及原核表达宿主菌。DNA纯化试剂盒购自TaKaRa。Pfu DNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶购自天根。植酸钠和胃蛋白酶(p0685)购自Sigma。由上海英俊生物技术有限公司合成核苷酸引物。
实施例1：突变基因的获得
通过Overlap PCR的方式对克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristensenii)来源植酸酶YkAPPA的基因序列(SEQ IDNO.2)进行改造，并对其进行测序，获得突变基因。该方法以含有野生植酸酶基因YkAPPA的pEASY-T3-YkAPPA重组质粒为模板，通过两轮PCR反应引入突变，所需的突变基因连接到载体pEASY-T3载体上送公司经测序证实。
突变使用六条引物，包括Yk-F：5’-cgcgaattcgcaccgcttgcagcacaatctac-3’，Yk-R：5’-gatgcggccgcttaaatatggcaggctggctcga-3’，F89S-F：5’-taatgggcgggagctatggtgattatttc-3’F89S-R：5’-gaaataatcaccatagctcccgcccatta-3’，E226H-F：5’-agcaaatgaaatccatgtaaataaagaag-3’，和E226H-R：5’-cttctttatttacatggatttcatttgct-3’。引物中斜体代表限制性酶切位点EcoR I和Not I，下划线标记的核苷酸序列为突变位点。
实施例2：改造前后的植酸酶在毕赤酵母中的表达与纯化
植酸酶YkAPPA的突变体F89S和F89S/E226H的编码区序列插入到真核表达载体pPIC9r的EcoRI和NotI酶切位点之间，在毕赤酵母GS115细胞中受AOX1启动子的调控表达。诱导剂是甲醇。在0.5％甲醇诱导下于30℃和220rpm的摇床中培养3天进行大量表达。粗酶液经镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱和二乙基氨基乙基(DEAE)柱进行层析纯化。经10％SDS-PAGE电泳检测，突变酶F89S和F89S/E226H与野生酶的表面分子量一致，均为约52kDa。
实施例3：突变植酸酶的胃蛋白酶抗性
突变植酸酶的胃蛋白酶抗性通过比较突变植酸酶与野生植酸酶在不同浓度胃蛋白酶在37℃处理2h后剩余的植酸酶酶活进行确定。用胃蛋白酶与植酸酶的质量比为3、6、14、28、71和141U/mg的胃蛋白浓度处理突变植酸酶和野生植酸酶。
使用硫酸亚铁钼蓝法测定胃蛋白酶处理后剩余的植酸酶酶活。将50μL适当浓度酶液加入到950μL 1.5mmol/L植酸钠底物(用pH 4.5和0.25M的NaAc-HAc缓冲液配制)中，在37℃水浴锅中反应30min，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应，并用2mL显色液(1％四水合钼酸铵，3.2％浓硫酸，7.32硫酸亚铁)进行显色。根据700nm下吸光度值衡量释放的无机磷酸盐的量。一个植酸酶活性单位定义为在测定条件下每分钟释放1微摩尔的磷酸盐所需的酶量。结果(图1)显示，胃蛋白酶浓度从3U/mg升至141U/mg时，野生酶YkAPPA完全失去活性，突变植酸酶F89S和F89S/E226H分别保持21％和57％以上的酶活。当用28U/mg的胃蛋白酶处理时，野生植酸酶YkAPPA的水解半衰期为31min，突变植酸酶F89S和F89S/E226H较野生酶显示了更长的水解半衰期，分别为59min和161min(表1)。因此突变植酸酶F89S和F89S/E226H较野生酶具有更高的胃蛋白酶抗性。
表1改造前后的植酸酶在胃蛋白处理下的水解半衰期
实施例4：突变植酸酶的耐热性
改造前后的植酸酶在不同pH(1-12)和37℃下进行酶促反应30min，测定最适pH。酶液在pH 1-9和37℃下处理1h，研究酶的pH稳定性。所用的缓冲液为：0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液，pH1-3；0.1mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液，pH3-6；0.1mol/LTris-盐酸缓冲液，pH7-8；0.1mol/L Bis-Tris-盐酸缓冲液，pH6-7.3；0.1mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH8-12。突变酶F89S和F89S/E226H的最适pH类似于野生型，为pH 4.5-5.0(表1)。突变酶F89S/E226H较野生型YkAPPA和突变酶F89S具有更好的酸稳定性，在pH 1下处理1h，突变酶F89S/E226H保持94％的酶活，突变酶F89S和野生酶YkAPPA保持64-65％的酶活(图2)。
突变酶与野生酶在最适pH和不同温度(30-80℃)下处理30min，确定最适温度。热稳定性测定是60℃下将酶液分别处理不同时间后进行测定。突变植酸酶F89S和F89S/E226H的最适温度与突变酶一致，为55℃(表1))。突变酶F89S和F89S/E226H在60℃下处理30min较野生酶有更好的热稳定性，分别保持34％和54％的酶活，而野生酶仅保持16％的酶活(图3)。在60℃下，突变酶F89S和F89S/E226H的半衰期分别为20min和32min，较野生酶YkAPPA在60℃的热失活半衰期7min分别提高了2.9和4.6倍(表1)。因此，植酸酶YkAPPA的第89位苯丙氨酸突变为丝氨酸且第226位的谷氨酸突变为组氨酸提高了植酸酶的胃蛋白酶抗性和耐热性。
实施例5：突变植酸酶对玉米粉的降解能力
在pH 1.5-5.5和37℃下处理2h测定突变酶F89S和F89S/E226H及野生酶YkAPPA对玉米粉的降解能力。野生酶YkAPPA在pH 4.5下释放最大量的无机磷为1640mg，突变酶F89S和F89S/E226H分别在pH 4.5和pH 5下释放最大量的无机磷，达野生型的1.3-1.7倍。加入胃蛋白酶，减少了突变植酸酶F89S和F89S/E226H及野生酶YkAPPA降解玉米粉释放无机磷的量。用28U/mg胃蛋白酶处理2h后突变酶F89S和F89S/E226H水解玉米粉释放无机磷的最大量较野生酶YkAPPA提升了9.1-14.9倍。这显示了突变酶F89S和F89S/E226H较野生酶YkAPPA有更高的胃蛋白酶抗性。
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 植酸酶突变体F89S和F89S/E226H及其基因和应用
<160>6
<210> 1
<211> 441
<212> PRT
<213> 克氏耶尔森氏菌
<400> 1
MTIAKEYLRL SILTLVLSSF TLSAAPLAAQ STGYTLERVV ILSRHGVRSP TKQTQLMNDV 60
TPDKWPQWPV KAGYLTPRGA GLVTLMGGFY GDYFRSYGLL PAGCPADESI YVQADVDQRT 120
RLTGQAFLDG IAPDCGLKVH YQADLKKIDP LFHTVEAGVC KLDPEKTHQA VEKRLGGPLN 180
ELSQRYAKPF ALMGEVLNFS ASPYCNSLQQ KGKTCDFATF AANEIEVNKE GTKVSLSGPL 240
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<213> 克氏耶尔森氏菌
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acgctaagtg ctgcaccgct tgcagcacaa tctaccggtt acactttgga gcgcgtggtg 120
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aaattggacc cagagaaaac tcatcaggct gttgaaaaac gcttgggtgg gccattaaat 540
gaactgagtc aacgctatgc caagcccttt gccctgatgg gcgaggtgct gaatttttcg 600
gcctcacctt attgcaactc actgcaacag aaaggaaaaa cctgtgattt tgcgactttt 660
gcagcaaatg aaatcgaggt aaataaagaa gggacaaaag tctcactgag tgggccattg 720
gcgctatcat cgacattagg tgaaattttc ctattacaaa attcacaggc catgccagat 780
gtcgcctgga accgtctcag cggtgaagaa aattggattt cattattgtc actgcataat 840
gcacagttcg atttgatggc caaaacccct tatatcgccc ggcataaagg aactccgttg 900
ttgcaacaaa ttgatacggc attagtgttg caacgtgatg ctcaggggca aacactgccg 960
ctgtcaccgc aaaccaaatt gctgttcctc gggggacatg acaccaatat tgccaatatt 1020
gcgggtatgt taggggccaa ttggcaatta ccgcagcaac ctgataatac cccgccaggc 1080
ggagggctag tctttgagct atggcagaat ccggataacc atcaacgcta tgtggcggtg 1140
aaaatgttct atcaaacgat ggagcagttg cgcaatgcag ataagttaga tttgaaaaac 1200
aacccggcaa gaattgttcc cattgctatt gaagggtgtg aaaacgaggg tgataacaaa 1260
ctttgtcagc ttgaaacgtt ccaaaagaaa gtcgcccaag tgatcgagcc agcctgccat 1320
atttaa 1326
<210> 3
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
MTIAKEYLRL SILTLVLSSF TLSAAPLAAQ STGYTLERVV ILSRHGVRSP TKQTQLMNDV 60
TPDKWPQWPV KAGYLTPRGA GLVTLMGGSY GDYFRSYGLL PAGCPADESI YVQADVDQRT 120
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ELSQRYAKPF ALMGEVLNFS ASPYCNSLQQ KGKTCDFATF AANEIEVNKE GTKVSLSGPL 240
ALSSTLGEIF LLQNSQAMPD VAWNRLSGEE NWISLLSLHN AQFDLMAKTP YIARHKGTPL 300
LQQIDTALVL QRDAQGQTLP LSPQTKLLFL GGHDTNIANI AGMLGANWQL PQQPDNTPPG 360
GGLVFELWQN PDNHQRYVAV KMFYQTMEQL RNADKLDLKN NPARIVPIAI EGCENEGDNK 420
LCQLETFQKK VAQVIEPACH I 441
<210> 4
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
MTIAKEYLRL SILTLVLSSF TLSAAPLAAQ STGYTLERVV ILSRHGVRSP TKQTQLMNDV 60
TPDKWPQWPV KAGYLTPRGA GLVTLMGGSY GDYFRSYGLL PAGCPADESI YVQADVDQRT 120
RLTGQAFLDG IAPDCGLKVH YQADLKKIDP LFHTVEAGVC KLDPEKTHQA VEKRLGGPLN 180
ELSQRYAKPF ALMGEVLNFS ASPYCNSLQQ KGKTCDFATF AANEIHVNKE GTKVSLSGPL 240
ALSSTLGEIF LLQNSQAMPD VAWNRLSGEE NWISLLSLHN AQFDLMAKTP YIARHKGTPL 300
LQQIDTALVL QRDAQGQTLP LSPQTKLLFL GGHDTNIANI AGMLGANWQL PQQPDNTPPG 360
GGLVFELWQN PDNHQRYVAV KMFYQTMEQL RNADKLDLKN NPARIVPIAI EGCENEGDNK 420
LCQLETFQKK VAQVIEPACH I 441
<210> 5
<211> 1326
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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cgcttaaccg ggcaggcatt tctggacggt atagccccgg attgcggcct gaaagtacat 420
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atttaa 1326

Claims (8)

1.一种植酸酶突变体，其特征在于，通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的植酸酶的第89位的苯丙氨酸突变为丝氨酸获得所述突变体。
2.一种植酸酶突变体，其特征在于，通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的植酸酶的第89位的苯丙氨酸突变为丝氨酸、第226位的谷氨酸突变为组氨酸获得所述突变体。
3.一种植酸酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1或2所述的植酸酶突变体。
4.根据权利要求3所述的植酸酶突变体基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
5.包含权利要求3所述的植酸酶突变体基因的重组载体。
6.包含权利要求3所述的植酸酶突变基因的重组菌株。
7.一种制备权利要求1或2所述的植酸酶突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求5的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组的植酸酶突变体表达；以及
3)回收并纯化所表达的植酸酶突变体。
8.权利要求1或2所述的植酸酶的突变体的应用。
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