CN110724676A - 一种植酸酶突变体及其载体与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明通过对植酸酶ExAppA和植酸酶CxAPPA通过大片段组合方式，对植酸酶结构带来较大变化，获得了比两个亲本热稳定性显著性提高的组合体。然后通过突变的方法获得了一种新型的耐高温植酸酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或4所述，该突变体在耐温性及pH适应性方面表现出良好的特性，具有较好的应用前景。耐温性能大大提升，在90℃‑95℃处理热稳定性高。

Description

一种植酸酶突变体及其载体与应用
技术领域
本发明于生物酶领域，更具体地，涉及一种植酸酶突变体及其载体与应用。
背景技术
植酸(Phytate，Phytic acid，IP6)又称肌醇六磷酸脂，含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，是饲料中磷的重要贮存形式。植酸盐在几乎所有的植酸饲料中作为储存磷的来源出现。磷是动物体内必须的矿物元素，由于单胃动物体内缺乏分解植酸酶，植酸不能直接被单胃动物利用吸收。植酸酶(Phytase)能够催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)。饲料中添加植酸酶，不仅可以提高动物对饲料中植酸磷的利用率，减少磷对环境的污染，还可以降低植酸磷的抗营养作用。研究发现将微生物植酸酶粗酶液加到猪饲料中可以使磷的吸收效率提高40-60％，而排泄物中磷可以降低35-45％，类似的结果也相继在多项研究中得到证实。而向单胃动物添加无机磷会给饲料工业带来沉重的成本，并且无机磷是一种不可再生且昂贵的矿物质。因此植酸酶在饲料业和饲养领域以及农业生态环境扮演着非常重要的角色。另外植酸酶在食品加工和生物燃料生产中也具有较大的潜力。
植酸酶的化学本质是蛋白质，温度影响其水解植酸盐的效果。畜禽的胃和肠道是植酸酶的作用场所，这就要求添加在畜禽饲粮中的植酸酶最适酶促反应温度在37℃左右，而饲料生产中的调质和制粒过程，要求其温度为80～85℃，有时温度高达90～95℃。因此，植酸酶产品的热稳定性与植酸酶本身的热稳定性密切相关。但市场上热稳定性好的植酸酶的最适酶促反应温度偏高，具有最适酶促反应温度的植酸酶则热稳定性较差，所以目前热稳定性强的植酸酶在饲料酶制剂行业中具有非常大的吸引力。
来源于大肠杆菌的植酸酶EcAppA,属于组氨酸酸性磷酸酶家族，是迄今所知的分解植酸能力最强的植酸酶之一，其pH范围与目前商业生产的曲霉属植酸酶相比，更适合在动物的胃肠道内发挥作用，且有着更好的抗蛋白酶降解能力。但是其稳定性差，在颗粒饲料生产过程中有一个短暂的80-95℃的造粒过程，通过制粒高温过程过其活性将损失70％以上，限制了饲料制粒中的应用。
尽管从自然界中获取了大量植酸酶基因，但是很少有植酸酶能够适应饲料工业的应用的所有需求。天然来源的植酸酶通常在热稳定性、pH耐受范围和比活力等方面有一定的局限性，通过遗传分子改造将植酸酶基因优化改良证明是一种获得性质优良酶分子的有效方法。
对酶分子进行抗逆性分子改造以提高其稳定性和催化活性，是当今研究的热点也是难点。一是定向进化分子改造。定向进化是通过模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方法，在体外改造基因，定向选择有价值的非天然蛋白分子获得某性能优化的突变体。定向进化主要包括建立突变文库、选择合适的表达体系以及建立快速、有效的高通量筛选方法3个关键步骤。在建立突变体文库方面，为了得到分子多样性最广泛采用的方法有随机突变的易错PCR和DNA 改组技术。定向进化的最大优点是不需事先了解蛋白分子的空间结构和机制就可以获得满足需要的突变体。Zhu等利用易错PCR技术筛选得到植酸酶EcAppA的突变体I408L,85℃处理5min后仍残留51.3％的活性，成功提高了EcAppA的热稳定性[1]。二是通过理论性的设计。随着可利用的蛋白质三维结构及序列增加，还有计算机计算软件技术的发展，蛋白质中与底物结合、稳定结构的氨基酸被识别出来，以此理论基础建立起来的突变库能构建有效筛选出优化的酶分子特性。Garrett等利用点饱和突变(GSSM)高通量筛选法得到能够提高该植酸酶热稳定性的14个单点突变位点，最后筛选到一个含有8个突变位点的酶，具有比野生型植酸酶EcAppA更好的耐热性[2]。中国专利201310125275.3利用突变技术对基因的关键位点进行定点突变，获取突变基因EcAppa-M2,该突变体耐热性能好，85℃保温10分钟，残余酶活可到60％。
WO190333,WO2008017066A2,WO2008036916A2,WO20117406A1,WO2017155803等专利通过对大肠杆菌植酸酶EcAppA单点定点突变得到提高热稳定性的位点，再通过组合突变获得耐热性提高的植酸酶突变体。
来自大肠杆菌的植酸酶(EcAppA)为目前所知活性最高的植酸酶之一，但是EcAppA的耐热性较差，需要增强热稳定性以避免在饲料制程中经高温处理而失去酶活。而Citrobacter.braakii植酸酶具有高活性以及高耐热性，其氨基酸序列与大肠杆菌EcAppA有高度相似性，具有60％左右相似度。Tzu-HuiWu等通过将大肠杆菌EcAppA与两个Citrobacter植酸酶进行序列分析，比对出活性区附近Citrobacter植酸酶4个氨基酸，然后将大肠杆菌AppA上相对的位点进行突变改造，进而提高大肠杆菌AppA的热稳定性。
目前常规对植酸酶改造，常用技术在于对单点突变或者多点组合突变方式。在定点突变实验过程中，对一个氨基酸被另一个氨基酸取代对整个结构影响有限，对氨基酸的稳定性影响有限。
发明内容
本发明第一个方面的目的在于提供一种植酸酶突变体。
本发明第二个方面的目的在于提供一种编码上述植酸酶突变体的核苷酸序列。
本发明第三个方面的目的在于提供一种载体，所述载体包括上述核苷酸序列。
本发明第四个方面的目的在于提供一种细胞，所述细胞包括上述载体。
本发明第五个方面的目的在于提供一种制备有植酸酶酶活性的多肽的方法。
本发明第六个方面的目的在于提供上述植酸酶突变体在将植酸分解成肌醇和无机磷酸方面的应用。
本发明第七个方面的目的在于提供一种饲料添加剂。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种植酸酶突变体，所述植酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
本发明的第二个方面，提供一种编码本发明第一个方面所述植酸酶突变体的核苷酸序列。
本发明的第三个方面，提供一种载体，所述载体可表达本发明第一个方面所述的植酸酶突变体或含有本发明第二个方面所述的核苷酸序列。
本发明的第四个方面，提供一种细胞，所述细胞包含本发明第三个方面所述的载体。
根据本发明第四个方面所述的细胞，所述细胞选自细菌、真菌或哺乳动物细胞。
根据本发明第四个方面所述的细胞，所述细胞为毕赤酵母、黑曲霉或里氏木霉。
本发明的第五个方面，提供一种制备具有植酸酶酶活性的多肽的方法，包括以下步骤：
利用含有本发明第二个方面所述核苷酸序列的重组表达载体，
将重组表达载体转化宿主细胞，获得重组的宿主细胞；
对重组的宿主细胞进行诱导表达、分泌具有植酸酶酶活性的多肽。
本发明的第六个方面，提供本发明第一个方面所述植酸酶突变体在将植酸分解成肌醇和无机磷酸方面的应用。
本发明的第七个方面，提供一种饲料添加剂，所述饲料添加剂中含有本发明第一个方面所述植酸酶突变体或本发明第五个方面所述方法制备得到的具有植酸酶酶活性的多肽。
根据本发明第七个方面所述的饲料添加剂，所述饲料添加剂中植酸酶突变体或具有植酸酶酶活性的多肽的含量与饲料的比例为100g/t。
术语解释：
亲本多肽：是指随后经改造以产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是指天然存在的多肽，或者天然存在的多肽的变体。
交错延伸PCR：在一个PCR反应体系中有多个序列作为模板，进行多次“变性-简短退火-催化延伸”过程。由于模板的同源性，延伸片段在每次退火中以不同序列为模板不断延伸直到形成全长子链。
表达载体：表达载体可以是任何类型的表达载体，特别是质粒，能够表达本发明的变体的核苷酸序列。
宿主细胞：任何用于对应用包含本发明的多肽用于表达的细胞类型。所述宿主细胞可为单细胞微生物，例如原核生物，或非单细胞微生物，例如真核生物。
本发明的有益效果是：
1.在单点突变实验过程中，对一个氨基酸被另一个氨基酸取代对整个结构影响有限。本申请人在研究过程中通过重组基因方法将合成的植酸酶ExAPPA和植酸酶CxAPPA组合在一起，形成多个组合体。获得了比两个亲本热稳定性显著性提高的多个组合体。然后重组多肽的方式获得了一种新型的耐高温植酸酶突变体，该突变体在耐温性及pH适应性效果方面表现出良好的特性，在单胃动物胃肠道中能发挥最佳的酶解效果，具有较好的应用前景。本发明的一个目的是提供具有足够热稳定性的植酸酶，增加植酸酶在工业上应用的产业价值。
2.目前可获得的植酸酶不具备足够的热稳定性来用于动物饲料颗粒的生产中而其酶活没有显著的损失。本发明提供的植酸酶突变体具备足够的热稳定性，以使其能够被用于饲料制粒的生产而不需要其他材料包被等额外的保护措施且具有尽可能降低酶活损失，尤其在85℃，90℃制粒条件下相比野生植酸酶酶活损失率小，说明本发明的植酸酶具有能力抵抗在饲料工业造粒机中进行制粒时所遇到的高温湿热环境。
3.本发明提供的植酸酶具有3以上pH单位的宽pH范围，在该pH范围内，保留率至少70％。pH稳定范围较广，在pH2.0～10.0范围内酶活稳定。
附图说明
图1ExAPPA植酸酶和CxAPPA植酸酶的氨基酸序列比对结果。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
植酸酶的活性测定
按照中华人民共和国国家标准《GB/T 18634-2002》进行。植酸酶活性定义是指样品在植酸钠浓度为5.0mmol/L、温度37℃、pH值5.5的条件下，每min从植酸钠中释放l pmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
U＝FxC/(Vx30)
式中：U-试样中植酸酶的活性，U/mL；C-根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U；F-试样溶液反应前的总稀释倍数；V-试样体积，mL；30-反应时间，min。
标准曲线的制定如下表1：
表1植酸酶的活性测定标准曲线
磷浓度(mmol/L) 0 1.5625 3.125 6.25 12.5 25
OD值 0 0.054 0.109 0.212 0.437 0.942
实施例1植酸酶突变体的获取及表达载体构建
合成两条亲本植酸酶序列，分别是ExAPPA植酸酶序列和CxAPPA植酸酶序列。两条基因由Synbio Technologies(http://www.synbio-tech.com.cn/)合成。
序列如下：
ExAPPA氨基酸序列：
QSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTPDAWPTWPVKLGWLTPRGGELIAYLGHYQRQRLVADGLLAKKGCPQPGQVAIIADVDERTRKTGEAFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPVKMGVCAFNVQKTQEAILTRAEGNIERYTQRYDSAFRTLEQVLNFPQSKLCFNREKQNESCSLTQALPSELKVSADNVSITGAVSLASMLTEIFLLQEAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFDLLQRTPEVARSRATPLLDMIMAALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALGLNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVYQTLQQMRDKTPLSLNTPPGEVKLTLPGCEERNAQGMCSLAGFTQIVNEARIPACSL(SEQ ID NO.1)。
CxAPPA氨基酸序列：
EEQNGMKLERVVIVSRHGVRAPTKFTPIMKNVTPDQWPQWDVPLGWLTPRGCELVSELGQYQRLWFTSKGLLNNQTCPSPGQVAVIADTDQRTRKTGECFLAGLAPKCQIQVHYQKDEEKNDPLFNPLKTGVCQLDIANVTDAILRRAGGSIADFTQRYQTAFRELERVLNFPQSNLCFNREKQDESCSLTQALPSELKVSADNVSLTGAVSLASMLTEIFLLQEAQGMPQVAWGRITGEKEWRDLLSLHNAQFDLLQRTPEVARSRATPLLDMIDTALLTNGTTENRYGIKLPVSLLFIAGHDTNLANLSGALDLNWSLPGQPDNTPPGGELVFEKWKRTSDNTDWVQVSFVYQTLRDMRDIQPLSLEKPAGKVDLKLIACEEKNSQGMCSLKSFSRLIKEIRVPECAVTE(SEQ ID NO.2)。
ExAPPA与CxAPPA氨基酸比对序列见附图1，字母表示氨基酸残基的单字母代号。
以下序列用于比对：ExAPPA，与大肠杆菌植酸酶组氨酸磷酸酶的植酸酶家族(AppAfamily phytase/histidine-type acid phosphatase)比对相似度为91％；CxAPPA，与柠檬酸细菌组氨酸磷酸酶的植酸酶家族比对相似度为90.5％。比对中指定位置上的大写氨基酸残基属于共有残基的氨基酸序列。
交错延伸PCR扩增产生新的植酸酶突变体。
交错延伸PCR是在一个PCR反应体系中有多个序列作为模板，进行多次“变性-简短退火-催化延伸”过程。由于模板的同源性，延伸片段在每次退火中以不同序列为模板不断延伸直到形成全长子链。由于二个模板转换，大多数子链包含了两个亲本的序列信息而具有新的酶学特性。
将ExAPPA基因片段和CxAPPA基因片段通过NdeI和NotI限制性切割位点克隆入大肠杆菌表达载体pET22b中，得到pET22B-ExAPPA载体和pET22B-CxAPPA载体。以pET22B-ExAPPA载体和pET22B-CxAPPA载体模板混合物为模板。
正义引物5'-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG-3'(SEQ ID NO.5)(与基因上游连接处引物)。
反义引物5'-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGC-3'(SEQ ID NO.6)(与基因下游连接处引物)。
交错延伸PCR扩增程序扩增两个模板产物。
交错延伸PCR扩增程序：
Figure BDA0002241347930000061
将扩增得到的片段切胶回收，通过TAKARAIn-fusion Cloning Kit连接pET-22b(+)载体的NdeI和NotI位点，转化BL21大肠杆菌，LB-Amp平板培养获得pET-22b-EX-CXAPPA阳性菌落。挑取单克隆接种到96孔深孔板。每个96孔板分别挑取2个BL21-pET22B-ExAPPA和2个BL21-pET22B-CxAPPA为对照。每孔含500uL培养基LB-Amp。37℃摇床200rpm培养5小时，转移50uL菌液到新的96孔平板保种后，平板每孔剩余菌液添加含有IPTG的50uL LB-Amp培养基，并使每孔的IPTG终浓度为1mM，37℃摇床200rpm过夜诱导表达植酸酶。然后使用4000rpm离心5分钟沉淀细胞，去掉上清。加入200uL的细菌蛋白提取试剂(Thermo FisherScientific,B-PER)裂解2小时。4000rpm离心裂解液，离心5分钟，取上清测定酶活、热稳定性和酸性pH条件酶活。植酸酶活性检测根据中华人民共和国国家标准《GB/T 18634-2002》进行。
耐热突变体筛选：
将过夜培养诱导表达植酸酶的酶液在85℃水浴锅加热处理5分钟，检测培养液中存留植酸酶活性。根据植酸酶耐热检测结果，植酸酶耐温性高于对照克隆组挑选为正向突变。从保种板上挑选阳性克隆集中到96孔平板重复上述的培养、诱导表达、酶活测定筛选试验。确定耐温性提高的为阳性突变克隆，提取阳性克隆质粒DNA进行基因测序。
共筛选得到6个突变序列，分别命名为ExCxAPPA1，ExCxAPPA2，ExCxAPPA3，ExCxAPPA4，ExCxAPPA5，ExCxAPPA6。
其中，ExCxAPPA3氨基酸序列：
EEQNGMKLERVVIVSRHGVRAPTKFTPIMKNVTPDQWPQWDVPLGWLTPRGCELVSELGQYQRLWFTSKGLLNNQTCPSPGQVAVIADTDQRTRKTGECFLAGLAPKCQIQVHYQKDEEKNDPLFNPLKTGVCQLDIANVTDAILRRAGGSIADFTQRYQTAFRELERVLNFPQSKLCFNREKQNESCSLTQALPSELKVSADNVSITGAVSLASMLTEIFLLQEAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFDLLQRTPEVARSRATPLLDMIMAALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALGLNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVYQTLQQMRDKTPLSLNTPPGEVKLTLPGCEEKNSQGMCSLKSFSRLIKEIRVPECAVTE(SEQ ID NO.3)。
ExCxAPPA4氨基酸序列：
EEQNGMKLERVVIVSRHGVRAPTKFTPIMKNVTPDQWPQWDVPLGWLTPRGCELVSELGQYQRLWFTSKGLLNNQTCPSPGQVAVIADTDQRTRKTGECFLAGLAPKCQIQVHYQKDEEKNDPLFNPLKTGVCQLDIANVTDAILRRAGGSIADFTQRYQTAFRELERVLNFPQSNLCFNREKQDESCSLTQALPSELKVSADNVSLTGAVSLASMLTEIFLLQEAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFDLLQRTPEVARSRATPLLDMIMAALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALGLNWTLPGQPDNTPPGGELVFEKWKRTSDNTDWVQVSFVYQTLRDMRDIQPLSLEKPAGKVDLKLIACEEKNSQGMCSLKSFSRLIKEIRVPECAVTE(SEQ ID NO.4)。
根据植酸酶变体基因，5'端设计PCR引物含有EcoRI内切酶位点，3'端设计PCR引物含NotI内切酶位点。分别以植酸酶突变体ExCxAPPA1，ExCxAPPA2，ExCxAPPA3，ExCxAPPA4，ExCxAPPA5，ExCxAPPA6基因为模板，进行PCR扩增，将扩增得到的片段，用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切，纯化，连接到pPICZαA载体EcoRI和NotI位点，使植酸酶突变体ExCxAPPA1，ExCxAPPA2，ExCxAPPA3，ExCxAPPA4，ExCxAPPA5，ExCxAPPA6基因插入到上述表达载体的信号肽序列的下游。连接产物转化Top10大肠杆菌，LB-Zeo平板培养获得pPICZαA-ExCxAPPA阳性菌落，提取pPICZαA-ExCxAPPA阳性菌落质粒。分别经过PmeI内切酶线性化后，电击转化毕赤酵母X33感受态细胞，涂布含100ug/mL Zeocin的YPDZ固体培养平板，30℃培养2-3d。挑取YPDS平板上生长速度快及菌落较大的转化子，每个24孔深孔板含22个转化子，2个改造前的原始转化菌作为对照。每孔含2mL酵母培养基BMGY，待其生长至饱和状态，离心弃去BMGY培养基，换上酵母诱导培养基BMMY，诱导48小时后，取上清液进行植酸酶酶活性检测和耐热活性检测。
突变体酶活测定数据和酶学性质
同时测定亲本及6个突变体的酶活，结果如下表2：
表2植酸酶亲本及突变体酶活测定
酶种 酶活(U/mL)
ExAPPA 327U
CxAPPA 267U
ExCxAPPA1 346U
ExCxAPPA2 221U
ExCxAPPA3 263U
ExCxAPPA4 312U
ExCxAPPA5 139U
ExCxAPPA6 287U
实施例2植酸酶突变体的最适反应温度
将植酸酶突变的酶液在不同温度(60℃～90℃)热处理5min，测定残留植酸酶活力，以未处理的酶活力为对照，计算得到该温度下剩余的相对酶活。结果如下表3所示。
表3植酸酶突变体的不同温度下酶活保留率
酶种 60℃ 65℃ 70℃ 75℃ 80℃ 85℃ 90℃
ExAPPA 99.5 94.3 80.2 56.3 41.6 22.4 12.3
CxAPPA 99.4 97.6 85.5 64.8 52.5 34.6 24.6
ExCxAPPA1 99.2 99.5 94.6 76.5 67.6 45.6 34.5
ExCxAPPA2 87.2 80.3 73.3 69.5 73.4 73.6 67.5
ExCxAPPA3 99.5 99.5 92.6 91.5 82.3 62.6 45.5
ExCxAPPA4 100.4 93.8 97.5 90.7 89.6 73.8 64.5
ExCxAPPA5 102.8 102.4 104.1 100.6 98.1 86.4 76.3
ExCxAPPA6 98.5 93.7 91.1 78.9 68.5 54.2 38.9
由图结果可知，ExCxAPPA1，ExCxAPPA2，ExCxAPPA3，ExCxAPPA4，ExCxAPPA5，ExCxAPPA6在75℃，80℃反应5分钟酶活保留率皆高于亲本ExAPPA,CxAPPA的保留率。ExCxAPPA1，ExCxAPPA2，ExCxAPPA3，ExCxAPPA4，ExCxAPPA5，ExCxAPPA6在85℃，90℃反应5分钟酶活保留率皆高于亲本ExAPPA、CxAPPA的保留率，尤其ExCxAPPA3，ExCxAPPA4，相比亲本的耐热有显著性提升。
实施例3植酸酶突变体的不同pH环境下热稳定性
在不同pH(2.5～7.0)的缓冲液体系中分别测定植酸酶的酶活，在37℃条件下反应以pH值5.5的酶活为对照，测定不同pH值下的相对酶活。结果如下表4所示。
表4植酸酶突变体的不同pH环境下热稳定性
Figure BDA0002241347930000091
检测结果显示，筛选得到的6个植酸酶具有3以上pH单位的宽pH范围，在该pH范围内，保留率至少70％。其中ExCxAPPA3，ExCxAPPA4突变体尤其在85℃，90℃制粒条件下相比野生植酸酶酶活损失率小，说明ExCxAPPA3，ExCxAPPA4突变体能在单胃动物胃肠道中能发挥最佳的酶解效果。
实施例4制粒应用实验
将ExAPPA、CxAPPA、ExCxAPPA1，ExCxAPPA2，ExCxAPPA3，ExCxAPPA4，ExCxAPPA5，ExCxAPPA6分别制成1万酶活酶粉，各酶样均按照100g/t添加到肉鸡中大期饲料中，通过制粒机加工生产成颗粒饲料，加工条件是制粒温度85℃、湿度16～18％、蒸汽压力0.28MPa、调质时间30秒、环膜压缩比7:1。饲料配方见表5。每打包3袋饲料取一份样品(重量>500g),连续取6个样品进行测定。测定结果见下表6。
表5肉鸡中大期饲料配方及营养成分
Figure BDA0002241347930000101
表6不同批次制粒酶活保留率(％)比较
Figure BDA0002241347930000102
从实际制粒结果来看，ExCxAPPA1，ExCxAPPA2，ExCxAPPA3，ExCxAPPA4，ExCxAPPA5，ExCxAPPA6突变体在85℃生产制粒相比野生型酶种酶活保留率都有提升。尤其ExCxAPPA4，ExCxAPPA5突变体在85℃制粒条件下保留率提升到80％以上，大大提升了植酸酶在制粒后饲料中的植酸酶酶活。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东溢多利生物科技股份有限公司
<120> 一种植酸酶突变体及其载体与应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 410
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 1
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Gln Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys Lys Gly Cys Pro Gln Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Val
115 120 125
Lys Met Gly Val Cys Ala Phe Asn Val Gln Lys Thr Gln Glu Ala Ile
130 135 140
Leu Thr Arg Ala Glu Gly Asn Ile Glu Arg Tyr Thr Gln Arg Tyr Asp
145 150 155 160
Ser Ala Phe Arg Thr Leu Glu Gln Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Lys
165 170 175
Leu Cys Phe Asn Arg Glu Lys Gln Asn Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Ile Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Glu Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Met Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Gly Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Tyr Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Pro Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 2
<211> 412
<212> PRT
<213> 布氏柠檬酸杆菌
<400> 2
Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asn Val
20 25 30
Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Cys Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Leu
50 55 60
Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Cys Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val
100 105 110
His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Asn Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Ile Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gln Arg Tyr Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Phe Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Glu Ala Gln Gly Met Pro Gln Val Ala Trp Gly Arg Ile Thr Gly Glu
225 230 235 240
Lys Glu Trp Arg Asp Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Met Ile Asp Thr Ala Leu Leu Thr Asn Gly Thr Thr Glu Asn Arg
275 280 285
Tyr Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Ala Leu Asp Leu Asn Trp Ser Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Lys Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe
340 345 350
Val Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Met Arg Asp Ile Gln Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Glu Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu Ile Ala Cys Glu Glu
370 375 380
Lys Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu Ile
385 390 395 400
Lys Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu
405 410
<210> 3
<211> 412
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asn Val
20 25 30
Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Cys Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Leu
50 55 60
Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Cys Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val
100 105 110
His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Asn Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Ile Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gln Arg Tyr Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Lys
165 170 175
Leu Cys Phe Asn Arg Glu Lys Gln Asn Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Ile Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Glu Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Met Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Gly Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Tyr Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Pro Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Lys Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu Ile
385 390 395 400
Lys Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu
405 410
<210> 4
<211> 412
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Glu Glu Gln Asn Gly Met Lys Leu Glu Arg Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Pro Ile Met Lys Asn Val
20 25 30
Thr Pro Asp Gln Trp Pro Gln Trp Asp Val Pro Leu Gly Trp Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Cys Glu Leu Val Ser Glu Leu Gly Gln Tyr Gln Arg Leu
50 55 60
Trp Phe Thr Ser Lys Gly Leu Leu Asn Asn Gln Thr Cys Pro Ser Pro
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp Gln Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Cys Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Lys Cys Gln Ile Gln Val
100 105 110
His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Lys Asn Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Ile Ala Asn Val Thr Asp Ala Ile
130 135 140
Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gln Arg Tyr Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Phe Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Glu Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Met Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Gly Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Lys Trp Lys Arg Thr Ser Asp Asn Thr Asp Trp Val Gln Val Ser Phe
340 345 350
Val Tyr Gln Thr Leu Arg Asp Met Arg Asp Ile Gln Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Glu Lys Pro Ala Gly Lys Val Asp Leu Lys Leu Ile Ala Cys Glu Glu
370 375 380
Lys Asn Ser Gln Gly Met Cys Ser Leu Lys Ser Phe Ser Arg Leu Ile
385 390 395 400
Lys Glu Ile Arg Val Pro Glu Cys Ala Val Thr Glu
405 410
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg 30
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tggtggtggt ggtgctcgag tgcggccgc 29

Claims (10)

1.一种植酸酶突变体，其特征在于，所述植酸酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。
2.一种编码权利要求1所述植酸酶突变体的核苷酸序列。
3.一种载体，其特征在于，所述载体可表达权利要1所述的植酸酶突变体或含有权利要求2所述的核苷酸序列。
4.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求3所述的载体。
5.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自细菌、真菌或哺乳动物细胞。
6.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述细胞为毕赤酵母、黑曲霉或里氏木霉。
7.一种制备具有植酸酶酶活性的多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用含有权利要求2所述核苷酸序列的重组表达载体，
将重组表达载体转化宿主细胞，获得重组的宿主细胞；
对重组的宿主细胞进行诱导表达、分泌具有植酸酶酶活性的多肽。
8.权利要求1所述植酸酶突变体在将植酸分解成肌醇和无机磷酸方面的应用。
9.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂中含有权利要求1所述植酸酶突变体或权利要求7所述方法制备得到的具有植酸酶酶活性的多肽。
10.根据权利要求9所述的饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂中植酸酶突变体或具有植酸酶酶活性的多肽的含量与饲料的比例为100g/t。
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