CN106011101B - 植酸酶突变体YkAPPA-L162V及其编码基因和应用 - Google Patents

植酸酶突变体YkAPPA-L162V及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及植酸酶突变体YkAPPA‑L162V及其编码基因和应用。通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的植酸酶的第162位的亮氨酸突变为缬氨酸获得所述植酸酶突变体YkAPPA‑L162V。相比于野生型，本发明的两个植酸酶YkAPPA突变体YkAPPA‑L162V的最适温度较55℃提高了5℃，耐酸性和蛋白酶抗性及在60℃下30min的热稳定性明显改良，在发展节约环保型饲料酶工业上具有潜在的应用价值。

Description

植酸酶突变体YkAPPA-L162V及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及植酸酶突变体YkAPPA-L162V及其编码基因和应用。
背景技术
豆类、谷类等作物种子中有80％以上的磷以植酸形式存在。植酸酶广泛分布在土壤、植物以及微生物分泌物中，对自然环境中磷代谢有着重要的作用。植酸酶，又叫肌醇六磷酸水解酶，能够水解植酸的磷酸单酯键释放无机磷。单胃动物饲料中添加植酸酶能够可有效地提高植酸磷的利用效率、降低动物养殖区的磷排放对环境的污染。
尽管从自然界中获得了大量植酸酶基因，但没有一个植酸酶可以同时满足工业应用的所有需求。目前科学家们通过蛋白质工程技术手段获得具有优良物理化学性质的植酸酶，以适应动物消化道内pH条件的变化、增加蛋白酶抗性、减少饲料制粒过程中的损失。对具有良好酸稳定性和高最适温度植酸酶的需求，促进了新酶资源的开发以及酶学性质改良研究。新型优质植酸酶的获得将大大扩展其实际应用空间，也正是目前急需解决的问题和热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种最适温度提高且耐酸性改良的植酸酶。
本发明另一目的是提供编码上述最适温度提高且耐酸性改良的植酸酶基因。
本发明的另一目的是提供包含上述最适温度提高且耐酸性改良的植酸酶基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述最适温度提高且耐酸性改良的植酸酶基因的重组菌株。
本发明的另一目的是提供上述最适温度提高且耐酸性改良的植酸酶基因的应用。
本发明对克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristensenii)来源植酸酶YkAPPA基因进行定点突变，该植酸酶YkAPPA的成熟蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，该成熟蛋白是由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的。
SEQ ID NO.1
MTIAKEYLRLSILTLVLSSFTLSAAPLAAQSTGYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPQWPVKAGYLTPRGAGLVTLMGGFYGDYFRSYGLLPAGCPADESIYVQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKIDPLFHTVEAGVCKLDPEKTHQAVEKRLGGPLNELSQRYAKPFALMGEVLNFSASPYCNSLQQKGKTCDFATFAANEIEVNKEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQNSQAMPDVAWNRLSGEENWISLLSLHNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMEQLRNADKLDLKNNPARIVPIAIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.
SEQ ID NO.2
Atgacaatagcaaaagaatatctgcggttatccatactcactttggtgctcagtagttttacgctaagtgctgcaccgcttgcagcacaatctaccggttacactttggagcgcgtggtgattttgagccgccacggtgttcgttccccgacgaaacaaacacagttaatgaatgatgttacaccggacaaatggccacaatggccagtaaaagcgggctatttaacgccgcgaggggcaggattagtcactttaatgggcgggttctatggtgattatttccgcagctatgggttgttaccggcggggtgcccggcagacgaatccatctatgtgcaagctgatgttgaccaacgtacccgcttaaccgggcaggcatttctggacggtatagccccggattgcggcctgaaagtacattatcaagctgatttgaaaaaaattgacccattgttccataccgtcgaggcgggggtatgtaaattggacccagagaaaactcatcaggctgttgaaaaacgcttgggtgggccattaaatgaactgagtcaacgctatgccaagccctttgccctgatgggcgaggtgctgaatttttcggcctcaccttattgcaactcactgcaacagaaaggaaaaacctgtgattttgcgacttttgcagcaaatgaaatcgaggtaaataaagaagggacaaaagtctcactgagtgggccattggcgctatcatcgacattaggtgaaattttcctattacaaaattcacaggccatgccagatgtcgcctggaaccgtctcagcggtgaagaaaattggatttcattattgtcactgcataatgcacagttcgatttgatggccaaaaccccttatatcgcccggcataaaggaactccgttgttgcaacaaattgatacggcattagtgttgcaacgtgatgctcaggggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcgggggacatgacaccaatattgccaatattgcgggtatgttaggggccaattggcaattaccgcagcaacctgataataccccgccaggcggagggctagtctttgagctatggcagaatccggataaccatcaacgctatgtggcggtgaaaatgttctatcaaacgatggagcagttgcgcaatgcagataagttagatttgaaaaacaacccggcaagaattgttcccattgctattgaagggtgtgaaaacgagggtgataacaaactttgtcagcttgaaacgttccaaaagaaagtcgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa
本发明采用定点突变的方法，获得了最适温度提高且耐酸性改良的突变体，命名为YkAPPA-L162V，即YkAPPA的第162位的亮氨酸突变为缬氨酸。
因此根据本发明的最适温度提高且耐酸性改良的植酸酶突变体YkAPPA-L162V，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示
SEQ ID NO.3
MTIAKEYLRLSILTLVLSSFTLSAAPLAAQSTGYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPQWPVKAGYLTPRGAGLVTLMGGFYGDYFRSYGLLPAGCPADESIYVQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKIDPLFHTVEAGVCKVDPEKTHQAVEKRLGGPLNELSQRYAKPFALMGEVLNFSASPYCNSLQQKGKTCDFATFAANEIEVNKEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQNSQAMPDVAWNRLSGEENWISLLSLHNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMEQLRNADKLDLKNNPARIVPIAIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.
本发明还提供了编码上述最适温度提高且耐酸性改良的植酸酶突变体YkAPPA-L162V的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.4
Atgacaatagcaaaagaatatctgcggttatccatactcactttggtgctcagtagttttacgctaagtgctgcaccgcttgcagcacaatctaccggttacactttggagcgcgtggtgattttgagccgccacggtgttcgttccccgacgaaacaaacacagttaatgaatgatgttacaccggacaaatggccacaatggccagtaaaagcgggctatttaacgccgcgaggggcaggattagtcactttaatgggcgggttctatggtgattatttccgcagctatgggttgttaccggcggggtgcccggcagacgaatccatctatgtgcaagctgatgttgaccaacgtacccgcttaaccgggcaggcatttctggacggtatagccccggattgcggcctgaaagtacattatcaagctgatttgaaaaaaattgacccattgttccataccgtcgaggcgggggtatgtaaagtggacccagagaaaactcatcaggctgttgaaaaacgcttgggtgggccattaaatgaactgagtcaacgctatgccaagccctttgccctgatgggcgaggtgctgaatttttcggcctcaccttattgcaactcactgcaacagaaaggaaaaacctgtgattttgcgacttttgcagcaaatgaaatcgaggtaaataaagaagggacaaaagtctcactgagtgggccattggcgctatcatcgacattaggtgaaattttcctattacaaaattcacaggccatgccagatgtcgcctggaaccgtctcagcggtgaagaaaattggatttcattattgtcactgcataatgcacagttcgatttgatggccaaaaccccttatatcgcccggcataaaggaactccgttgttgcaacaaattgatacggcattagtgttgcaacgtgatgctcaggggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcgggggacatgacaccaatattgccaatattgcgggtatgttaggggccaattggcaattaccgcagcaacctgataataccccgccaggcggagggctagtctttgagctatggcagaatccggataaccatcaacgctatgtggcggtgaaaatgttctatcaaacgatggagcagttgcgcaatgcagataagttagatttgaaaaacaacccggcaagaattgttcccattgctattgaagggtgtgaaaacgagggtgataacaaactttgtcagcttgaaacgttccaaaagaaagtcgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa
将上述编码最适温度提高且耐酸性改良的植酸酶突变体YkAPPA-L162V的cDNA分子以合适的取向和正确的读码框插入到所述载体的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。本发明优选的载体为pET-22b(+)，使改造的植酸酶基因插入到质粒pET-22b(+)上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到各突变体的重组原核表达质粒。本发明优选的宿主菌为BL21(DE3)。相比于野生型，本发明的两个植酸酶YkAPPA突变体YkAPPA-L162V的最适温度较55℃提高了5℃，耐酸性和蛋白酶抗性及在60℃下30min的热稳定性明显改良，在发展节约环保型饲料酶工业上具有潜在的应用价值。
附图说明
图1突变酶YkAPPA-L162V与野生酶YkAPPA的耐酸性比较；
图2突变酶YkAPPA-L162V与野生酶YkAPPA的蛋白酶抗性比较。
具体实施方式
实验材料
原核表达载体pET-22b(+)购自Novagen公司。大肠杆菌Trans1-t1和BL21(DE3)细胞购自天根，分别作为质粒扩增及原核表达宿主菌。DNA纯化试剂盒购自TaKaRa。Pfu DNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶购自天根。植酸钠和胃蛋白酶(p0685)购自Sigma。由上海英俊生物技术有限公司合成核苷酸引物。
实施例1：突变基因的获得
以克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristeensenii)来源的植酸酶YkAPPA的基因序列(SEQ IDNO.2)进行改造，通过Overlap PCR的方式引入突变，并对其进行测序，获得突变基因。该方法以含有野生植酸酶基因YkAPPA的pEASY-T3-YkAPPA重组质粒为模板，通过两轮PCR反应引入突变。其中使用四条引物，包括扩增突变基因完整编码序列的分别带有EcoR I和Not I识别序列的上下游引物(YkAPPA Forward:5’-cgcgaattcgcaccgcttgcagcacaatctac-3’和YkAPPA Reverse:5’-gatgcggccgcttaaatatggcaggctggctcG-3’)及在特定位置引入突变的上下游引物(YkAPPA L162V Forward:5’-gtatgtaaagtggacccagagaaaactc-3’和YkAPPA L162V Reverse:5’-gagttttctctgggtccactttacatac-3’)。所需的突变基因连接到载体pEASY-T3载体上并经DNA测序证实。
实施例2：改造前后的植酸酶的原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化
野生植酸酶YkAPPA和突变体YkAPPA-L162V分别编码441个氨基酸和一个终止密码子，N端23个氨基酸为信号肽序列，成熟蛋白理论分子量为48.6kDa。野生型植酸酶及其突变体去除信号肽后的编码区序列插入到原核表达载体pET-22b(+)的EcoRI和NotI酶切位点之间，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，加入终浓度2mM的IPTG(异丙基-β-D-半乳糖苷)在24℃和220rpm的摇床中振荡培养5h诱导目的蛋白表达。粗酶液经镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱和二乙基氨基乙基(DEAE)柱进行层析纯化。野生酶和突变酶经10％SDS-PAGE电泳检测为一条约46kDa的特异性表达条带。
实施例3：突变植酸酶与野生酶的酶学性质比较
使用硫酸亚铁钼蓝法测定野生型和突变型酶的活性。将50μL适当浓度酶液加入到950μL 1.5mmol/L植酸钠底物(用pH 4.5和0.25M的NaAc-HAc缓冲液配制)中，在37℃水浴锅中反应30min，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应，最后加入2mL显色液(1％四水合钼酸铵，3.2％浓硫酸，7.32硫酸亚铁)进行显色。在700纳米下测定吸光度值衡量释放的无机磷酸盐的量。一个植酸酶活性单位定义为在测定条件下，每分钟释放1微摩尔的磷酸盐所需的酶量。所有反应重复三次。
(1)最适温度和热稳定性
突变酶与野生酶在不同温度(30-80℃)下处理30min，确定最适温度。热稳定性测定是在一定温度下将酶液分别处理0，2，5，10，20，30，60min后进行测定，结果如表1。突变酶的最适温度为60℃，较野生型提高了5℃。突变酶在60℃下处理30min较野生酶有更好的热稳定性，可保持30.5％酶活，而野生酶保持16.1％的酶活。因此，植酸酶YkAPPA的第162位的亮氨酸突变为缬氨酸提高了植酸酶的最适温度和热稳定性。
表1pH和温度对改造前后的植酸酶的酶活和稳定性的影响的比较
(2)最适pH和pH稳定性
改造前后的植酸酶在不同pH(1-12)和37℃下进行酶促反应30min，测定最适pH。酶液在pH 1-9和37℃下处理1h或pH1-4下37℃处理2h，研究酶的pH稳定性。所用的缓冲液为：0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液，pH1-3；0.1mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液，pH3-6；0.1mol/LTris-盐酸缓冲液，pH6-8；0.1mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH8-12。
改造前后的植酸酶的pH值特性比较如表1。突变酶的最适pH类似于野生型，为pH4.5。突变酶在pH 3.0-9.0下处理1h与野生型具有相似的稳定性；pH值为1下处理1h，突变酶可保持83.5％活性，而野生酶只能保持在30.5％活性。当pH1下处理时间延长至2h，突变酶可保持74.8％的酶活性，而野生酶仅保持58.4％的酶活性(图1)。因此突变酶比野生酶具有较高的酸稳定性。
(3)蛋白酶抗性
突变酶与野生酶分别用胃蛋白酶(0.25M甘氨酸盐酸，pH2)和胰蛋白酶(0.25MTris-HCl，pH7)在37℃下处理2h,蛋白酶和植酸酶的比例在1/1000到1/20范围之间。对蛋白酶处理后的样品用最适pH缓冲液稀释，在37℃和最适pH件下研究蛋白酶对植酸酶活性的影响。
突变酶与野生酶经不同浓度的胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后的蛋白酶抗性结果见图2。野生酶对胰蛋白酶具有高度抗性，在胰蛋白酶与植酸酶的比例从1/1000升至1/20时，野生酶的酶活基本不变。而野生酶对胃蛋白敏感，当用1/20高浓度的胃蛋白处理2h后，其酶活基本消失。突变酶与野生酶相比其胃蛋白酶抗性明显提高，在1/20高浓度胃蛋白处理下突变酶可保持33.3％的酶活。植酸酶YkAPPA的第162位的亮氨酸突变为缬氨酸后，没有改变其胰蛋白酶抗性。

Claims (7)

1.植酸酶突变体YkAPPA-L162V，其特征在于，通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的植酸酶的第162位的亮氨酸突变为缬氨酸获得所述植酸酶突变体YkAPPA-L162V。
2.植酸酶突变体基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的植酸酶突变体YkAPPA-L162V。
3.根据权利要求2所述的植酸酶突变体基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.包含权利要求2所述的植酸酶突变体基因的重组载体。
5.包含权利要求2所述的植酸酶突变体基因的重组菌株。
6.一种制备稳定性改良的植酸酶突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组的植酸酶表达；以及
3)回收并纯化所表达的植酸酶突变体YkAPPA-L162V。
7.权利要求1所述的植酸酶突变体YkAPPA-L162V用于水解植酸钠的应用。
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