CN105624131A - 植酸酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种植酸酶突变体。本发明提供的植酸酶突变体APPA-M经75℃处理5min后残留酶活高于95％，其耐热性显著高于野生型APPA。80℃处理10min后，本发明提供的突变体PHY1、PHY4、PHY5、PHY6和PHY7的残留酶活比APPA-M分别提高了33.85％、53.11％、75.86％、74.33％和71.94％；85℃处理5min后，本发明提供的突变体PHY1、PHY4、PHY5、PHY6和PHY7的残留酶活比APPA-M分别提高了14.89％、28.45％、44.94％、42.73％和40.55％，其耐热性显著高于APPA-M。

Description

植酸酶突变体
本申请要求于2014年11月21日提交中国专利局、申请号为201410677220.8、发明名称为“植酸酶突变体”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种植酸酶突变体、其制备方法及应用、编码该植酸酶突变体的DNA分子、载体、宿主细胞。
背景技术
植酸酶是一种能水解植酸的磷酸酶类。它能将植酸磷(六磷酸肌醇)降解为肌醇和无机磷酸。此酶分为两类:3-植酸酶(EC.3.1.3.8)和6-植酸酶(EC.3.1.2.6)。植酸酶广泛存在于植物、动物和微生物中,如玉米、小麦等高等植物,枯草芽孢杆菌、假单孢杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌等原核微生物及酵母、根霉、曲霉等真核微生物中。
在谷物、豆类和油料等作物籽实中，磷的基本贮存形式是植酸磷，其含量高达1％～3％，它占植物中总磷的60％～80％。但是以植酸磷形式存在的磷却因单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶而难以被利用，其利用率仅在0％～40％，从而造成了许多问题：首先是造成磷源浪费，一方面饲料中的磷源不能得到有效利用，另一方面为了满足动物对磷的需求，又必须在饲料中添加无机磷,提高了饲料成本；其次是形成高磷粪便污染环境。饲料中85％左右的植酸磷会被动物直接排出体外，粪便中大量的植酸磷使水和土壤受到严重污染。另外，植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物胃肠道的消化吸收过程中会与多种金属离子如Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，降低了动物对这些营养物质的有效利用。
植酸酶可作为一种单胃动物的饲料添加剂，它的饲喂效果已在世界范围内得到了确证。它可使植物性饲料中磷的利用率提60％，粪便中磷排泄量减少40％，同时还可降低植酸的抗营养作用。因此在饲料中添加植酸酶对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。
现工业化生产的植酸酶主要有来源于黑曲霉的真菌植酸酶和来源于大肠杆菌的细菌植酸酶两种。其中来源于大肠杆菌的植酸酶APPA具有高比活性及良好的消化道稳定性等特点。目前主要通过在粉末饲料直接添加或颗粒饲料后喷涂的方法应用在饲料行业。
因为目前在颗粒饲料生产过程中有一个短暂的80-90℃的高温阶段。细菌植酸酶APPA热稳定性较差，其水溶液在70℃下保温5分钟剩余酶活性低于30％，直接添加到动物饲料中进行制粒后存留酶活一般低于20％，使APPA植酸酶在颗粒饲料的应用受到限制。采用饲料制粒后植酸酶液体喷涂到饲料上的方法不仅增加设备投入，而且对酶制剂的稳定性、饲料中分布均一性都无法很好的保证。因此，提高植酸酶热稳定性是目前饲料用植酸酶具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种植酸酶突变体，获得突变体蛋白，提高其耐热性，从而有利于植酸酶在饲料领域的广泛应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种植酸酶突变体，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)与植酸酶的氨基酸序列具有至少70％同源性的序列；
(Ⅱ)具有所述植酸酶的至少一个免疫表位，且所述植酸酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。
在本发明的一些实施例中，植酸酶突变体的氨基酸序列与植酸酶的氨基酸序列具有至少75％同源性的序列。
在本发明的另一些实施例中，植酸酶突变体的氨基酸序列与植酸酶的氨基酸序列具有至少80％同源性的序列。
在本发明的另一些实施例中，植酸酶突变体的氨基酸序列与植酸酶的氨基酸序列具有至少85％同源性的序列。
在本发明的另一些实施例中，植酸酶突变体的氨基酸序列与植酸酶的氨基酸序列具有至少90％同源性的序列。
在本发明的另一些实施例中，植酸酶突变体的氨基酸序列与植酸酶的氨基酸序列具有至少95％同源性的序列。
在本发明的一些实施例中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。
在本发明的另一些实施例中，所述取代为取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个氨基酸。
在本发明的一些实施例中，所述取代为取代12个、13个、15、16个或17个氨基酸。
在本发明的另一些实施例中，所述取代为第25位、第46位、第62位、第70位、第73位、第75位、第114位、第137位、第142位、第146位、第159位或第255位中的一个或多个氨基酸被取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代为第25位、第46位、第62位、第70位、第73位、第75位、第114位、第137位、第142位、第146位、第159位或第255位的氨基酸被取代。
在本发明的一些实施例中，所述植酸酶具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。
在本发明的另一些实施例中，所述取代为氨基酸序列为SEQIDNO:1的植酸酶的第25位氨基酸由Ala变为Phe，第46位氨基酸由Trp变为Glu，第62位氨基酸由Gln变为Trp，第70位氨基酸由Gly变为Glu，第73位氨基酸由Ala变为Pro，第75位氨基酸由Lys变为Cys，第114位氨基酸由Thr变为His，第137位氨基酸由Asn变为Val，第142位氨基酸由Asp变为Arg，第146位氨基酸由Ser变为Glu，第159位氨基酸由Arg变为Tyr，第255位氨基酸由Tyr变为Asp。
在本发明的另一些实施例中，所述取代为第46位、第62位、第70位、第73位、第75位、第114位、第137位、第142位、第146位、第159位或第255位的氨基酸被取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代为第46位、第62位、第70位、第73位、第75位、第137位、第142位、第146位、第159位或第255位的氨基酸被取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第380位的氨基酸被取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第80位、第176位或第187位中的一个或多个氨基酸被取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第161位的氨基酸被取代。
本发明还提供了编码上述的植酸酶突变体的DNA分子。
在本发明的另一些实施例中，植酸酶突变体具有如SEQIDNO:3或SEQIDNO:5或SEQIDNO:7或SEQIDNO:9或SEQIDNO:13或SEQIDNO:15所示的氨基酸序列。
在本发明的一些实施例中，编码上述的植酸酶突变体的DNA分子具有如SEQIDNO:4或SEQIDNO:6或SEQIDNO:8或SEQIDNO:10或SEQIDNO:14或SEQIDNO:16所示的核苷酸序列。
本发明还提拱了具有上述DNA分子的载体。
上述植酸酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:3，其一种编码基因的核酸序列为SEQIDNO:4。
本发明还包括携带有编码序列为SEQIDNO:4的植酸酶突变体基因的质粒。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第380位的氨基酸被取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括将氨基酸序列为SEQIDNO:3的植酸酶的第380位氨基酸由Ala变为Pro。
上述突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:5，其一种编码基因的核酸序列为SEQIDNO:6。
本发明还包括携带有编码序列为SEQIDNO:6的植酸酶突变体基因的质粒。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第80位、第176位或第187位中的一个或多个氨基酸被取代。
在本发明的另一些实施例中，氨基酸序列为SEQIDNO:5的植酸酶的第80位氨基酸由Ser变为Pro，第176位氨基酸由Asn变为Pro，第187位氨基酸由Ser变为Pro。
上述植酸酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:7，其一种编码基因的核酸序列为SEQIDNO:8。
本发明还包括携带有编码序列为SEQIDNO:8的植酸酶突变体基因的质粒。
在本发明的另一些实施例中，所述取代还包括第161位的氨基酸被取代。
在本发明的另一些实施例中，氨基酸序列为SEQIDNO:7的植酸酶的第第161位氨基酸由Thr变为Pro。
上述植酸酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:9，其一种编码基因的核酸序列为SEQIDNO:10。
本发明还包括携带有编码序列为SEQIDNO:10的植酸酶突变体基因的质粒。
在本发明的另一些实施例中，氨基酸序列为SEQIDNO:9的植酸酶的第25位氨基酸由Phe变为Ala。所述植酸酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:13，其一种编码基因的核酸序列为SEQIDNO:14。
本发明还包括携带有编码序列为SEQIDNO:14的植酸酶突变体基因的质粒。
在本发明的另一些实施例中，氨基酸序列为SEQIDNO:13的植酸酶的第114位氨基酸由His变为Thr。所述植酸酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNO:15，其一种编码基因的核酸序列为SEQIDNO:16。
本发明还包括携带有编码序列为SEQIDNO:16的植酸酶突变体基因的质粒。
本发明还提供了上述植酸酶突变体的制备方法，包括：
步骤1：获取编码具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个的DNA分子：
(Ⅰ)与植酸酶的氨基酸序列具有至少70％同源性的序列；
(Ⅱ)具有植酸酶的至少一个免疫表位，且所述植酸酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
步骤2：将步骤1获得的所述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体，转化宿主细胞；
步骤3：诱导含重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。
在本发明的一些实施例中，制备方法中所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。
在本发明的另一些实施例中，制备方法中所述取代为取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个氨基酸。
在本发明的另一些实施例中，制备方法中所述取代为第25位、第46位、第62位、第70位、第73位、第75位、第114为、第137位、第142位、第146位、第159位或第255位中的一个或多个氨基酸被取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代为第25位、第46位、第62位、第70位、第73位、第75位、第114位、第137位、第142位、第146位、第159位或第255位的氨基酸被取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代为第46位、第62位、第70位、第73位、第75位、第114位、第137位、第142位、第146位、第159位或第255位的氨基酸被取代。
在本发明的另一些实施例中，所述取代为第46位、第62位、第70位、第73位、第75位、第137位、第142位、第146位、第159位或第255位的氨基酸被取代。
在本发明的另一些实施例中，制备方法中所述取代还包括第380位的氨基酸被取代。
在本发明的另一些实施例中，制备方法中所述取代还包括第80位、第176位或第187位中的一个或多个氨基酸被取代。
在本发明的另一些实施例中，制备方法中所述取代还包括第161位的氨基酸被取代。
在本发明的一些实施例中，所述步骤1具体为以编码SEQIDNO:3或SEQIDNO:5或SEQIDNO:7或SEQIDNO:9或SEQIDNO:13或SEQIDNO:15所示氨基酸序列的cDNA为模板，经引物扩增。
步骤2所述宿主细胞为毕赤酵母。
本发明还提供了上述植酸酶突变体在饲料中的应用。
本发明还提供了一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母。
将上述的质粒转入毕赤酵母中，重组表达的植酸酶突变体的耐热性得到显著提升。
本发明提供了一种植酸酶突变体，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)与植酸酶的氨基酸序列具有至少70％同源性的序列；
(Ⅱ)具有所述植酸酶的至少一个免疫表位，且所述植酸酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。
本发明提供的6个植酸酶突变体的耐热性都比突变前得到显著提升。野生型植酸酶APPA经75℃处理5min后残留酶活不足10％，而植酸酶突变体APPA-M经75℃处理5min后残留酶活高于95％，其耐热性显著高于野生型APPA。本发明以植酸酶突变体APPA-M为基础，还提供了A380P单点突变体PHY1，S80P、N176P、S187P和A380P四点突变体PHY4，S80P、T161P、N176P、S187P和A380P五点突变体PHY5，S80P、T161P、N176P、S187P、A380P和F25A六点突变体PHY6以及S80P、T161P、N176P、S187P、A380P，F25A和H114T七点突变体PHY7。80℃处理10min后，突变体PHY1、PHY4、PHY5、PHY6和PHY7的残留酶活比APPA-M分别提高了33.85％、53.11％、75.86％、74.33％和71.94％；85℃处理5min后，突变体PHY1、PHY4、PHY5、PHY6和PHY7的残留酶活比APPA-M分别提高了14.89％、28.45％、44.94％、42.73％和40.55％，其耐热性显著高于APPA-M，从而有利于植酸酶在饲料中的广泛应用。
附图说明
图1为重组质粒pPIC9K-APPA图谱；
图2为PHY1，PHY4，PHY5，PHY6和PHY7耐热性比较图。
具体实施方式
本发明公开了一种植酸酶突变体、其制备方法及应用、编码该植酸酶突变体的DNA分子、载体、宿主细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。例如，本发明可选用如下实验材料和试剂：
菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、Amp、G418购自Invitrogen公司。
酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorphII随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
培养基配方：
大肠杆菌培养基(LB培养基)：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCL，pH7.0)；
LB-AMP培养基：LB培养基加100μg/mL氨苄青霉素；
酵母培养基(YPD培养基)：1％酵母提取物、2％蛋白胨2％葡萄糖；
酵母筛选培养基(MD培养基)：2％蛋白胨、2％琼脂糖；
BMGY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10-5生物素，1％甘油；
BMMY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10-5生物素，0.5％甲醇。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1植酸酶突变体
1.1野生型植酸酶APPA及突变体APPA-M基因的合成
为了提高大肠杆菌来源的植酸酶APPA(氨基酸序列为SEQIDNO:1，其编码核苷酸序列为SEQIDNO:2)的耐热性，对12个位点进行突变(A25F，W46E，Q62W，G70E，A73P，K75C，T114H，N137V，D142R，S146E，R159Y，Y255D)。
将包含上述12个突变位点的植酸酶突变体命名为APPA-M，其氨基酸序列为SEQIDNO:3，参照该序列合成一个编码核苷酸序列为SEQIDNO:4。所述序列由上海捷瑞生物生物工程有限公司依照毕赤酵母的密码偏爱性优化合成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上EcoRI和NotI两个酶切位点。
采用同样的方法合成野生型植酸酶APPA的编码核苷酸序列SEQIDNO:2。1.2野生型及突变体基因表达载体的构建
将1.1合成的2条序列分别进行EcoRI和NotI双酶切后与经同样酶切后的pPIC-9k载体16℃过夜连接并转化大肠杆菌DH5a，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，菌落PCR(反应体系：模板挑取的单克隆，rTaqDNA聚合酶0.5ul，10×Buffer2.0μL，dNTPs(2.5mM)2.0μL，5’AOX引物(10M)：0.5μL，3’AOX引物：0.5μL，ddH2O14.5μL，反应程序：95℃预变性5min，30cycles：94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，72℃10min)验证阳性克隆子，经测序验证后最后获得了正确的重组表达质粒，2个重组表达质粒分别命名为pPIC9K-APPA(质粒图谱见图1)和pPIC9K-APPA-M。
1.3毕赤酵母工程菌株的构建
1.3.1酵母感受态制备
将毕赤酵母GS115菌株进行YPD平板活化，30℃培养48h后接种活化的GS115单克隆于6mLYPD液体培养基中，30℃、220rpm，培养约12h后转接菌液于装有30mLYPD液体培养基的三角瓶中，30℃、220rpm培养约5h经紫外分光光度计检测其菌体密度，待其OD600值在1.1–1.3范围后，4℃9,000rpm离心2min分别收集4mL菌体至灭菌EP管中，轻轻弃上清，用灭菌的滤纸吸干残留的上清后用预冷的1mL灭菌水重悬菌体，4℃、9,000rpm离心2min，轻轻弃上清，重复用1mL灭菌水洗一遍后4℃、9,000rpm离心2min，轻轻弃上清，预冷的1mL山梨醇(1mol/L)重悬菌体；4℃、9,000rpm离心2min，轻轻弃上清，预冷的100-150μl山梨醇(1mol/L)轻柔重悬菌体。
1.3.2转化和筛选
将表达质粒pPIC9K-APPA和pPIC9K-APPA-M用SalI进行线性化，线性化片段纯化回收后通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，将电击混合物均匀涂布于MD平板上，在无菌操作台中晾干；将MD平板倒置培养在30℃培养箱2–3日，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-APPA和GS115/pPIC9K-APPA-M，每个平板约300个克隆子，将其分别用无菌水洗下来后涂布在含不同浓度遗传霉素的YPD(0.5mg/mL-8mg/mL)平板上筛选多拷贝的转化子。
将毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-APPA的一个转化子命名为毕赤酵母APPA(PichiapastorisAPPA)，重组菌株GS115/pPIC9K-APPA-M的一个转化子命名为毕赤酵母APPA-M(PichiapastorisAPPA-M)，分别转接于BMGY培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入BMMY培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5％的甲醇，诱导表达4d；9000rpm离心10min去除菌体离心去除菌体，得到含植酸酶APPA和APPA-M的发酵上清液。
(1)植酸酶酶活单位的定义
在温度为37℃、pH为5.0的条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
(2)植酸酶酶活测定方法
取甲、乙两支25mL比色管，各加入1.8mL乙酸缓冲液(PH5.0)、0.2mL样品反应液，混匀，37℃预热5min。在甲管中加入4mL底物溶液，乙管中加入4mL终止液，混匀，37℃反应30min，反应结束后甲管中加入4mL终止液，乙管中加入4mL底物溶液，混匀。静置10min，分别在415nm波长处测定吸光值。每种样品作3个平行，取吸光值的平均值，通过标准曲线用回归直线方程计算植酸酶活性。
酶活X＝F×C/(m×30)
其中:X——酶活力单位，U/g(mL)；
F——试样溶液反应前的总稀释倍数；
C——根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U；
m——试样质量或体积，g/mL；
30——反应时间；
(3)酶活测定结果见表1。
表1酶活检测结果
按照上述方法测定毕赤酵母APPA和APPA-M发酵上清液的酶活分别为166U/mL和195U/mL。
1.4发酵验证
在10升发酵罐上分别进行毕赤酵母APPA和毕赤酵母APPA-M的发酵，发酵使用的培养基配方为：硫酸钙1.1g/L、磷酸二氢钾5.5g/L、磷酸二氢铵55g/L、硫酸镁16.4g/L、硫酸钾20.3g/L、氢氧化钾1.65g/L、消泡剂0.05％。
发酵生产工艺：pH值5.0、温度30℃、搅拌速率300rpm、通风量1.0-1.5(v/v)、溶氧控制在20％以上。
整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7％比例接入种子，30℃培养24-26h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％以上表明该阶段结束，为期约30-60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，培养时间在150-180h之间；发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。
采用1.3.2所述植酸酶酶活测定方法对上述粗酶液进行检测，酶活测定结果见表2。
表2酶活测定结果
重组表达野生型植酸酶的毕赤酵母APPA最终的发酵酶活为9800U/mL，而重组表达植酸酶突变体的毕赤酵母APPA-M最终的发酵酶活高达10257U/mL。
1.5酶学特性分析
1.5.1最适作用温度
分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃，pH5.5条件下测定上述毕赤酵母APPA和毕赤酵母APPA-M发酵所得粗酶液的酶活，以最高酶活力为100％，计算相对酶活。结果显示：野生型植酸酶APPA和突变体APPA-M的最适作用温度均为75℃。
1.5.2最适作用pH值
分别用pH2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液对上述毕赤酵母APPA和毕赤酵母APPA-M发酵所得粗酶液进行稀释，在37℃条件下测定酶活，以最高酶活力为100％，计算相对酶活，实验结果显示：野生型植酸酶APPA和突变体APPA-M的的最适作用pH值均为5.0。
1.5.3温度稳定性
用预热10min、pH5.0的0.25M乙酸钠缓冲液分别将上述毕赤酵母APPA和毕赤酵母APPA-M发酵所得粗酶液稀释10倍，混合均匀，75℃处理5min，结束时取样并冷却至室温，然后测定稀释后的酶活，以未处理样品的酶活为100％，计算残留酶活。
残余酶活(％)＝处理后酶液的酶活/未处理酶液的酶活×100％
结果显示：野生型植酸酶APPA经75℃处理5min后残余酶活不足10％，而植酸酶突变体APPA-M经75℃处理5min后残余酶活高于95％，从而说明植酸酶突变体APPA-M的耐热性显著高于野生型植酸酶。
实施例2植酸酶突变体
为了进一步提高植酸酶突变体APPA-M(氨基酸序列为SEQIDNO:3)的热稳定性，对合成的基因(序列为SEQIDNO:4)进行蛋白结构分析，该蛋白有两个结构域：N端的134个氨基酸残基与C端的152个氨基酸残基共同组成结构域1，剩余中间124氨基酸残基组成结构域2，保守序列和活性中心均位于结构域1中，在不破坏蛋白二级结构与活性中心的前提下，进一步对位点进行突变。
2.1设计PCR引物APPAM-F1、APPAM-R1：
APPAM-F1：GGCGAATTCCAGTCAGAACCAGAGTTGAAGTT(下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点)，如SEQIDNO：11所示；
APPAM-R1：ATAGCGGCCGCTTACAAGGAACAAGCAGGGAT(下划线为限制性内切酶NotI识别位点)，如SEQIDNO：12所示；
以APPA-M基因(SEQIDNO：4)为模板，以上述引物用GeneMorphII随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mMIPTG的LB+Amp培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有植酸酶的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出40ul裂解液至两块新的96孔板，其中一块板于80℃处理10min后，两块96孔板都加入80ul底物，于37℃反应30min后加入80ul终止液(钒酸铵：钼酸铵：硝酸＝1:1:2)测定生成的无机磷含量，不同的突变子高温处理后保持的活性不同。
实验结果表明，有些突变对APPA-M蛋白耐热性没有影响，有些突变甚至使其耐热性或酶活变得更差了，例如Q184E/Y289K/I405L三点突变体和去C端(CNZSMQTD)突变体在80℃处理5min后，残留酶活比APPA-M分别降低9％和17％，Q285Y/C178N两点突变体基本没有活性；另外还有些突变，虽然能提高蛋白对温度的耐受性，但突变后其酶学性质发生了显著的变化，例如K43E/N204W两点突变体的蛋白酶抗性较APPA-M降低了10-20％，这些均不符合要求。最终，得到既能显著提高APPA-M蛋白耐热性，又不会影响其酶活及原有酶学性质的突变位点及位点的组合：A380P单点突变，S80P、N176P、S187P和A380P四点突变，S80P、T161P、N176P、S187P和A380P五点突变，S80P、T161P、N176P、S187P、A380P和F25A六点突变以及S80P、T161P、N176P、S187P、A380P、F25A和H114T七点突变。
将上述含A380P单点突变的植酸酶突变体命名为PHY1，其氨基酸序列为SEQIDNO:5，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQIDNO:6。
将上述含S80P、N176P、S187P和A380P四点突变的植酸酶突变体命名为PHY4，其氨基酸序列为SEQIDNO:7，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQIDNO:8。
将上述含S80P、T161P、N176P、S187P和A380P五点突变的植酸酶突变体命名为PHY5，其氨基酸序列为SEQIDNO:9，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQIDNO:10。
将上述含S80P、T161P、N176P、S187P、A380P和F25A六点突变的植酸酶突变体命名为PHY6，其氨基酸序列为SEQIDNO:13，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQIDNO:14。
将上述含S80P、T161P、N176P、S187P、A380P、F25A和H114T七点突变的植酸酶突变体命名为PHY7，其氨基酸序列为SEQIDNO:15，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQIDNO:16。
2.2突变体基因的合成及扩增
由上海捷瑞生物工程有限公司依照毕赤酵母的密码偏爱性分别优化合成SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:14和SEQIDNO:16这五条突变体的基因序列，并且在合成序列5’和3’两端分别加上EcoRI和NotI两个酶切位点。
2.3突变体基因表达载体的构建
将2.1合成的5条基因序列分别进行EcoRI和NotI双酶切，然后与经同样酶切后的pPIC-9k载体16℃过夜连接，并转化大肠杆菌DH5a，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，菌落PCR(反应体系及程序同实施例1)验证阳性克隆子，经测序验证后最后获得了正确的重组表达质粒，5个重组表达质粒分别命名为pPIC9K-PHY1、pPIC9K-PHY4、pPIC9K-PHY5、pPIC9K-PHY6和pPIC9K-PHY7。
2.4毕赤酵母工程菌株的构建
分别将表达质粒pPIC9K-PHY1、pPIC9K-PHY4、pPIC9K-PHY5、pPIC9K-PHY6和pPIC9K–PHY7用SacI进行线性化，线性化片段纯化回收后通过电穿孔法分别转化毕赤酵母GS115，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-PHY1、GS115/pPIC9K-PHY4、GS115/pPIC9K-PHY5、GS115/pPIC9K-PHY6和GS115/pPIC9K-PHY7；然后在含不同浓度遗传霉素的YPD平板(0.5mg/mL-8mg/mL)上筛选多拷贝的转化子。
将毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-PHY1的一个转化子命名为毕赤酵母PHY1(PichiapastorisPHY1)，重组菌株GS115/pPIC9K-PHY4的一个转化子命名为毕赤酵母PHY4(PichiapastorisPHY4)，重组菌株GS115/pPIC9K-PHY5的一个转化子命名为毕赤酵母PHY5(PichiapastorisPHY5)，重组菌株GS115/pPIC9K-PHY6的一个转化子命名为毕赤酵母PHY6(PichiapastorisPHY6)，重组菌株GS115/pPIC9K-PHY7的一个转化子命名为毕赤酵母PHY7(PichiapastorisPHY7)。将毕赤酵母PHY1、PHY4、PHY5、PHY6和PHY7分别转接于BMGY培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入BMMY培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5％的甲醇，诱导表达4d；9000rpm离心10min去除菌体，即得到分别含植酸酶突变体PHY1、PHY4、PHY5、PHY6和PHY7的发酵上清液。
采用实施例1中1.3.2所述植酸酶酶活测定方法对毕赤酵母PHY1、PHY4、PHY5、PHY6和PHY7发酵上清液进行酶活测定，检测结果见表3。
表3酶活测定结果
毕赤酵母PHY1、PHY4、PHY5、PHY6和PHY7发酵上清液的酶活分别为211U/mL、201U/mL、255U/mL、229U/mL、236U/mL。
2.5发酵验证
在10升发酵罐上分别进行毕赤酵母PHY1、毕赤酵母PHY4、毕赤酵母PHY5、毕赤酵母PHY6和毕赤酵母PHY7的发酵，发酵使用的培养基配方为：硫酸钙1.1g/L、磷酸二氢钾5.5g/L、磷酸二氢铵55g/L、硫酸镁16.4g/L、硫酸钾20.3g/L、氢氧化钾1.65g/L、消泡剂0.05％。
发酵生产工艺：pH5.0、温度30℃、搅拌速率300rpm、通风量1.0-1.5(v/v)、溶氧控制在20％以上。
整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7％比例接入种子，30℃培养24-26h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％以上表明该阶段结束，为期约30-60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，培养时间在150-180h之间；发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。
采用实施例1中1.3.2所述植酸酶酶活测定方法对上述粗酶液进行检测，结果见表4。
表4酶活测定结果
重组表达植酸酶突变体PHY1的毕赤酵母PHY1最终的发酵酶活为10317U/mL，重组表达植酸酶突变体PHY4的毕赤酵母PHY4最终的发酵酶活为10401U/mL，重组表达植酸酶突变体PHY5的毕赤酵母PHY5最终的发酵酶活高达10813U/mL，重组表达植酸酶突变体PHY6的毕赤酵母PHY6最终的发酵酶活高达11033U/mL，重组表达植酸酶突变体PHY7的毕赤酵母PHY7最终的发酵酶活高达10115U/mL。
2.6酶学特性分析
2.6.1最适作用温度
分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃，pH5.5条件下测定上述毕赤酵母PHY1、PHY4、PHY5、PHY6和PHY7发酵所得粗酶液的酶活，以最高酶活力为100％，计算相对酶活。结果显示：与植酸酶突变体APPA-M相比，突变体PHY1、PHY4、PHY5、PHY6和PHY7的最适作用温度没有发生变化，均为75℃。
2.6.2最适作用pH值
分别用pH2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液对上述毕赤酵母PHY1、PHY4、PHY5、PHY6和PHY7发酵所得粗酶液进行稀释，在37℃条件下测定酶活，以最高酶活力为100％，计算相对酶活。结果显示：与植酸酶突变体APPA-M相比，突变体PHY1、PHY4、PHY5、PHY6和PHY7的最适作用pH均为5.0。
2.6.3耐热性分析
用预热10min、pH5.0的0.25M乙酸钠缓冲液分别将上述毕赤酵母PHY1、PHY4、PHY5、PHY6和PHY7发酵所得粗酶液稀释10倍，混合均匀；分别在85℃条件下处理5min，在80℃条件下处理10min，结束时取样并冷却至室温，然后分别测定稀释后的酶活，以未处理样品的酶活计100％，计算残留酶活。
结果如图2所示：80℃处理10min后，突变体PHY1、PHY4、PHY5、PHY6和PHY7的残留酶活比APPA-M分别提高33.85％、53.11％、75.86％、74.33％和71.94％；85℃处理5min后，突变体PHY1、PHY4、PHY5、PHY6和PHY7的残留酶活比APPA-M分别提高14.89％、28.45％、44.94％、42.73％和40.55％。
综上，本发明以植酸酶突变体APPA-M为基础，提供了包含A380P单点突变的植酸酶突变体PHY1，包含S80P、N176P、S187P和A380P四点突变的植酸酶突变体PHY4，包含S80P、T161P、N176P、S187P和A380P五点突变的植酸酶突变体PHY5，包含S80P、T161P、N176P、S187P、A380P和F25A六点突变的植酸酶突变体PHY6以及包含S80P、T161P、N176P、S187P、A380P、F25A和H114T七点突变的植酸酶突变体PHY7。与APPA-M相比，PHY1、PHY4、PHY5、PHY6和PHY7的最适作用温度和pH没有发生改变，但其耐热性得到显著提升，从而有利于植酸酶在饲料中的广泛应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.一种植酸酶突变体，其特征在于，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：
(Ⅰ)与植酸酶的氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少70％同源性的序列；
(Ⅱ)具有所述植酸酶的至少一个免疫表位，且所述植酸酶的氨基酸序列SEQIDNO:1经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
所述取代为取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的植酸酶突变体，其特征在于，所述取代为第25位、第46位、第62位、第70位、第73位、第75位、第114位、第137位、第142位、第146位、第159位或第255位中的一个或多个氨基酸被取代。
3.根据权利要求1或2所述的植酸酶突变体，其特征在于，所述取代为第25位、第46位、第62位、第70位、第73位、第75位、第114位、第137位、第142位、第146位、第159位或第255位的氨基酸被取代。
4.根据权利要求1或2所述的植酸酶突变体，其特征在于，所述取代为第46位、第62位、第70位、第73位、第75位、第114位、第137位、第142位、第146位、第159位或第255位的氨基酸被取代。
5.根据权利要求1或2所述的植酸酶突变体，其特征在于，所述取代为第46位、第62位、第70位、第73位、第75位、第137位、第142位、第146位、第159位或第255位的氨基酸被取代。
6.根据权利要求2至5任一项所述的植酸酶突变体，其特征在于，所述取代还包括第380位的氨基酸被取代。
7.根据权利要求2至6任一项所述的植酸酶突变体，其特征在于，所述取代还包括第80位、第176位或第187位中的一个或多个氨基酸被取代。
8.根据权利要求2至7任一项所述的植酸酶突变体，其特征在于，所述取代还包括第161位的氨基酸被取代。
9.根据权利要求1至8任一项所述的植酸酶突变体，其特征在于，其具有如SEQIDNO:3或SEQIDNO:5或SEQIDNO:7或SEQIDNO:9或SEQIDNO:13或SEQIDNO:15所示的氨基酸序列。
10.编码如权利要求1至9任一项所述的植酸酶突变体的DNA分子。
11.根据权利要求10所述的DNA分子，其特征在于，其具有如SEQIDNO:4或SEQIDNO:6或SEQIDNO:8或SEQIDNO:10或SEQIDNO:14或SEQIDNO:16所示的核苷酸序列。
12.具有如权利要求10或11所述DNA分子的载体。
13.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求12所述的载体。
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