CN108603181A - 新植酸酶及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及变体植酸酶及其用途。

Description

新植酸酶及其用途

发明背景

植酸盐是基于植物的饲料中找到的磷的主要但难消化的形式。它被认为是一种需要从基于谷物的食品和饲料中减少或除去的抗营养因子(ANF)。在酸性条件下，植酸盐与带正电荷的膳食蛋白相互作用，导致形成植酸盐-蛋白质聚集体和沉淀，这导致蛋白酶的可及性降低，并因此导致蛋白质消化效率低下。植酸盐还起强螯合剂作用，其在单胃生物体的小肠中结合食物和饲料中的不同重要金属离子，导致动物中许多重要矿物质如钙，锌等的营养缺乏。

植酸酶是一种催化植酸盐中O-P键的水解并释放无机可用磷的磷酸酶。植酸酶在农业和饲养领域中扮演着广泛的角色。反刍动物如牛和绵羊可以利用谷物中的植酸盐作为磷的来源，因为它们具有产生植酸酶的肠道中的细菌。非反刍动物如猪、家禽、鱼、狗、鸟等需要外源植物酶来释放无机磷。因此，向单胃动物的饲料添加无机磷(一种不可再生且昂贵的矿物质)是常见实践，这给饲料工业带来沉重的成本。因此，从各种来源产生的植酸酶已经成为这些物种饮食的最有效且有利可图的补充物之一以增强动物饲料的营养价值并减少导致环境污染的动物磷排泄。

饲料中的植酸酶可以受到饲料加工(造粒)期间的温度，受到动物胃肠道上部中的低pH或胃蛋白酶而失活。Selle和Ravindran展示理想饲料酶的特性，即；1)每单位蛋白质的高比活，2)饲料加工期间良好的热稳定性，3)动物肠道的典型pH范围内的高活性，4)对胃蛋白酶的抗性，和5)在环境温度下的良好稳定性。(SELLE,P.H.and RAVINDRAN,V.(2007)Microbial phytase in poultry nutrition.Animal Feed Science and Technology135:1–41)。

饲料的热处理可以包括单独的加热或者加热和压力两者的组合。家禽饲料生产中最常见的热处理形式是造粒。造粒过程首先涉及通过调节器(conditioner)的粉状饲料(mash feed)。在调节器中，将冷冻饲料暴露于在压力下添加的干蒸汽。此过程有助于改善团粒持久性，并且还增加碾磨机通量并降低能耗。在这些条件下，碾碎植物细胞，这有利于动物的消化过程。Nissinen发现低于85℃的湿度调节(conditioning)对于肉鸡性能是最佳的，而95℃的高调节温度导致较差的体重增加和饲料转化率(NISSINEN,V.(1994)Theeffects and interactions of enzymes and hydrothermal pre-treatments and theircontribution to feeding value.International Milling Flour and Feed,May:21–22.)。在65-85℃的造粒过程通常导致由于细胞壁基质的破裂(PICKFORD,J.R.(1992)Effects of processing on the stability of heat labile nutrients in animalfeeds,于:GARNSWORTHY,P.C.,HARESIGN,W.&COLE,D.J.A.(编)Recent Advances inAnimal Nutrition,pp.177–192(Butterworth-Heinemann,Oxford,U.K.)和谷物中存在的酶抑制剂的失活(SAUNDERS,R.M.(1975)α-Amylase inhibitors in wheat and othercereals.Cereal Foods World 20:282–285)而改善营养物的可用性。由于高压所致的对植酸酶活性的损伤效应似乎较小；它主要是源自使酶失活的高能量输入的高温。因此，开发热稳定性植酸酶为饲料工业中划算的工艺提供了有吸引力的解决方案。

植物酶在人类食品中的新应用与动物饲料中的应用同样重要，因为难消化的植酸盐螯合必需的矿物质并导致约20亿至30亿人缺乏这些营养物。植酸酶在人类健康和医药中的应用代表了其他新的令人兴奋的领域。另外，植酸酶在包括食品加工和生物燃料生产在内的工业应用中具有较大的潜力。已经提示了热稳定性植酸酶与木聚糖酶一起是纸浆和造纸工业中的有效添加剂。

发明概述

因而，本发明提供了变体植酸酶以及其使用方法。在一方面，本发明提供了包含变体植酸酶的组合物，所述变体植酸酶与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1,30,36,39,55,60,65,69,73,74,79,85,101,109,111,116,118,120,137,138,139,141,146,157,159,176,180,183,184,185,186,189,233,245,255,276,282,288,291,295,297,311,315,341,354,363,369,370,380,383,385和402。

在另一个方面，本发明提供了包含变体植酸酶的组合物，所述变体植酸酶与SEQID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1,30,36,39,55,60,65,69,73,74,79,85,101,109,111,116,118,120,137,138,139,141,146,157,159,176,180,183,184,185,186,189,233,245,255,276,282,288,291,295,297,311,315,341,354,363,369,370,380,383,385和402，且其中所述变体植酸酶与SEQ ID NO:1至少95％相同。在另外的方面，变体植酸酶与SEQ ID NO:1是至少96％,97％,98％或99％相同的，但不是SEQ ID NO:1。

在又一方面，本发明提供了包含变体植酸酶的组合物，所述变体植酸酶与SEQ IDNO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：1,30,36,39,55,60,65,69,73,74,79,85,101,109,111,116,118,120,137,138,139,141,146,157,159,176,180,183,184,185,186,189,233,245,255,276,282,288,291,295,297,311,315,341,354,363,369,370,380,383,385和402，其中所述变体植酸酶在选自下组的条件下与SEQ ID NO:1相比具有好至少1.1倍的活性：于58℃的热稳定性、于66℃的热稳定性、于pH4.5的pH稳定性和于pH 5.5的pH稳定性。

在另外的方面，本发明提供了具有一个或多个选自下组的氨基酸取代的变体植酸酶：Q1S,Q1V,Q1N,Q30K,A36K,T39D,I55V,H60S,H60Q,R65H,D69N,A73D,A73E,K74D,K74P,K74L,Q79L,Q79R,Q79A,Q79G,Q79F,I85V,A101L,A109D,A109E,A109G,A109F,A109P,T111S,T111D,T111Q,A116Y,A116P,A116R,A116S,T118R,T118S,S120R,N137S,N137P,A138V,A138H,A138D,A138P,N139P,N139A,N139H,T141E,T141G,T141A,T141R,S146R,G157Q,G157N,G157L,G157R,G157A,R159Y,N176K,N180T,N180E,K183R,Q184S,D185N,D185L,E186V,E186A,S189T,G233A,Y255D,T245E,M276V,H282N,H282P,A288E,A288R,A288V,V291I,T295I,V297L,G311S,E315G,E315S,L341Y,L341V,F354Y,K363A,K363L,N369P,T370P,A380R,A380T,A380P,E383S,R385S,R385V,R385T,E402R,E402T,E402D,E402P和E402N。

在又一方面，本发明提供了变体植酸酶，所述变体植酸酶在所述位置的1处、在所述位置的2处、在所述位置的3处、在所述位置的4处、在所述位置的5处、在所述位置的6处、在所述位置的7处、在所述位置的8处、在所述位置的9处、在所述位置的10处、在所述位置的1处、在所述位置的1处、在所述位置的1处、在所述位置的1处、在所述位置的11处、在所述位置的12处、在所述位置的13处、在所述位置的14处、在所述位置的15处、在所述位置的16处、在所述位置的17处、在所述位置的18处、在所述位置的19处或在所述位置的20处具有氨基酸取代。

在另外的方面，本发明提供了变体植酸酶，其包含氨基酸取代I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P和至少一个选自下组的另外的氨基酸取代：Q1S,Q1V,Q1N,Q30K,A36K,T39D,H60S,H60Q,R65H,D69N,A73D,A73E,K74D,K74P,K74L,Q79L,Q79R,Q79A,Q79G,Q79F,I85V,A101L,A109D,A109D,A109E,A109G,A109F,A109P,T111S,T111D,T111Q,A116Y,A116P,A116R,A116S,T118R,T118S,S120R,N137S,N137P,A138V,A138H,A138D,A138P,N139P,N139A,N139H,T141E,T141G,T141A,T141R,S146R,N176K,N180T,N180E,K183R,Q184S,D185N,D185L,E186V,E186A,S189T,G233A,T245E,M276V,H282N,H282P,A288E,A288R,A288V,V291I,T295I,V297L,G311S,E315G,E315S,L341Y,L341V,K363A,K363L,N369P,T370P,E383S,R385S,R385V,R385T,E402R,E402T,E402D,E402P和E402N。

在又一方面，本发明提供了变体植酸酶，所述变体植酸酶包含氨基酸取代H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P和至少一个选自下组的另外的氨基酸取代：Q1S,Q1V,Q1N,Q30K,A36K,T39D,I55V,R65H,A73D,A73E,Q79L,Q79R,Q79A,Q79G,Q79F,I85V,A101L,A109D,A109D,A109E,A109G,A109F,A109P,T111S,T111D,T111Q,A116Y,A116P,A116R,A116S,T118R,T118S,A138V,A138H,A138D,A138P,N139P,N139A,N139H,T141E,T141G,T141A,T141R,S146R,G157Q,G157N,G157L,G157R,G157A,R159Y,N176K,N180T,N180E,K183R,Q184S,D185N,D185L,E186V,E186A,S189T,G233A,Y255D,T245E,M276V,H282N,H282P,A288E,A288R,A288V,V291I,T295I,V297L,G311S,E315G,E315S,L341Y,L341V,F354Y,K363A,K363L,N369P,T370P,A380R,A380T,A380P,E383S,R385S,R385V,R385T,E402R,E402T,E402D,E402P和E402N。

在另外的方面，本发明提供了变体植酸酶，其包含氨基酸取代I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P和至少一个选自下组的另外的氨基酸取代：Q1S,Q1V,Q1N,Q30K,A36K,T39D,R65H,A73D,A73E,Q79L,Q79R,Q79A,Q79G,Q79F,I85V,A101L,A109D,A109D,A109E,A109G,A109F,A109P,T111S,T111D,T111Q,A116Y,A116P,A116R,A116S,T118R,T118S,A138V,A138H,A138D,A138P,N139P,N139A,N139H,T141E,T141G,T141A,T141R,S146R,N176K,N180T,N180E,K183R,Q184S,D185N,D185L,E186V,E186A,S189T,G233A,T245E,M276V,H282N,H282P,A288E,A288R,A288V,V291I,T295I,V297L,G311S,E315G,E315S,L341Y,L341V,K363A,K363L,N369P,T370P,E383S,R385S,R385V,R385T,E402R,E402T,E402D,E402P和E402N。

在另外的方面，本发明提供了变体植酸酶，其包含氨基酸取代N139A/N176K/D185N/E402D和至少一个选自下组的另外的氨基酸取代：Q1S,Q1V,Q1N,Q30K,A36K,T39D,I55V,H60S,H60Q,R65H,D69N,A73D,A73E,K74D,K74P,K74L,Q79L,Q79R,Q79A,Q79G,Q79F,I85V,A101L,A109D,A109D,A109E,A109G,A109F,A109P,T111S,T111D,T111Q,A116Y,A116P,A116R,A116S,T118R,T118S,S120R,N137S,N137P,A138V,A138H,A138D,A138P,T141E,T141G,T141A,T141R,S146R,G157Q,G157N,G157L,G157R,G157A,R159Y,N180T,N180E,K183R,Q184S,E186V,E186A,S189T,G233A,Y255D,T245E,M276V,H282N,H282P,A288E,A288R,A288V,V291I,T295I,V297L,G311S,E315G,E315S,L341Y,L341V,F354Y,K363A,K363L,N369P,T370P,A380R,A380T,A380P,E383S,R385S,R385V和R385T。

在另外的方面，本发明提供了变体植酸酶，其包含氨基酸取代I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/N139A/N176K/D185N/E402D和至少一个选自下组的另外的氨基酸取代：Q1S,Q1V,Q1N,Q30K,A36K,T39D,R65H,A73D,A73E,Q79L,Q79R,Q79A,Q79G,Q79F,I85V,A101L,A109D,A109D,A109E,A109G,A109F,A109P,T111S,T111D,T111Q,A116Y,A116P,A116R,A116S,T118R,T118S,A138V,A138H,A138D,A138P,T141E,T141G,T141A,T141R,S146R,N180T,N180E,K183R,Q184S,E186V,E186A,S189T,G233A,T245E,M276V,H282N,H282P,A288E,A288R,A288V,V291I,T295I,V297L,G311S,E315G,E315S,L341Y,L341V,K363A,K363L,N369P,T370P,E383S,R385S,R385V和R385T。

在又一方面，本发明提供了具有选自图5、6、7和8所示的氨基酸取代组的氨基酸取代组的变体植酸酶。

在另外的方面，本发明提供了变体植物酶的组合物，其进一步包含动物饲料。

在又一方面，本发明提供了编码本发明变体植物酶的核酸。

在另外的方面，本发明提供了包含编码本发明变体植酸酶的核酸的表达载体。

在又一方面，本发明提供了包含本发明的表达载体或核酸的宿主细胞。

在另外的方面，本发明提供了生成变体植酸酶的方法，包括在产生变体植酸酶的条件下培养本发明的宿主细胞，并回收酶。

在一些方面，本发明涉及具有改善的热性质，如热稳定性(thermostability)、加热稳定性(heat-stability)、蒸汽稳定性、温度概况(profile)和/或造粒稳定性的植酸酶变体，在许多实施方案中具有特定用途的热稳定性变体酶。

在另外的方面，本发明涉及具有改善的造粒稳定性和/或改善的酸稳定性的植酸酶变体。

因此，本发明的方法涉及具有改善的pH概况的植物酶变体。

因此，本发明的方法涉及在非反刍动物胃中发现的具有改善的蛋白酶稳定性，特别是胃蛋白酶稳定性的植酸酶变体。

因此，本发明的方法涉及在动物饲料中具有改善的性能(如改善的植酸盐释放和/或降解)的植酸酶变体。

本发明进一步涉及包含编码由该方法产生的植酸酶变体的核苷酸序列的多核苷酸、包含与指导多肽在表达宿主中产生的一个或多个控制序列可操作连接的多核苷酸的核酸构建体、包含此类核酸构建体的重组表达载体、以及包含核酸构建体和/或表达载体的重组宿主细胞。

在另外的方面，本发明涉及生产如提供的植酸酶变体的方法，其包括(a)培养宿主细胞以产生包含植酸酶的上清液；并且(b)回收植酸酶。

在又一方面，本发明涉及通过将本发明的植酸酶变体添加到饲料中来改善动物饲料的营养价值的方法、通过给动物喂食有效量的饲料来降低动物粪肥中的植酸盐水平的方法、处理植物蛋白的方法(包括将植物酶变体添加至少一种植物蛋白的步骤)、以及本发明组合物的植酸酶变体的用途。

本发明还提供了生产发酵产物如乙醇、啤酒、葡萄酒的方法，其包括在存在植酸酶变体的情况下发酵碳水化合物材料，生产乙醇的方法，包括在存在植酸酶变体的情况下发酵碳水化合物材料并产生乙醇。

附图简述

图1描绘了成熟EcPhytase G1P的核酸和氨基酸序列以及内源信号序列的氨基酸和核酸序列。在亲本大肠杆菌(E.coli)菌株中，使用内源信号序列生产G1P植酸酶，所述内源信号序列在表达期间被切除以形成成熟的G1P酶，如图9中描绘。应当注意的是，对于变体植酸酶，可以在一些生物体中使用信号序列，描绘的信号序列或对于植酸酶外源的信号序列(例如来自不同蛋白质或生物体的信号肽，或合成的(非天然存在的)序列)产生植酸酶。也就是说，根据生产宿主生物体，可以使用内源(对于植物酶天然的)信号，或者例如可以将对于生产宿主天然的信号序列重组且可操作地与成熟序列组合。在一些生产生物体实施方案中，在不使用信号序列的情况下生产植酸酶。因此，例如，为了在大肠杆菌中生产，将编码信号序列的DNA与编码成熟蛋白质的DNA连接。

图2描绘了EcPhytase G2P的核酸和氨基酸序列。与G1P相比，G2P序列具有以下变体：I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P。蛋白质和DNA序列用于成熟的酶。

图3描绘了EcPhytase G3P的核酸和氨基酸序列。在G2P的I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P外，G3P变体还具有H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P，使得G3P相对于G1P具有变体I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P。

图4描绘了EcPhytase G4P的核酸序列和氨基酸序列。在G3P的I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P(包括另外的G2P和G3P变体)外，G4P还变体N139A/N176K/D185N/E402D(形成I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/N139A/G157Q/R159Y/N176K/D185N/Y255D/F354Y/A380P/E402D的G4P总体组)。

图5A、5B、5C和5D描绘了显示一些第一代变体植酸酶及其pH和热稳定性的表。如图1所示，CL0000004是G1P亲本，其氨基酸序列是SEQ ID NO:1。大多数变体是单一氨基酸变体，如“AA突变”列中所见，其显示与G1P相比的氨基酸取代(例如在141位处对于CL00000605的从T至E)。如实施例5和6中所示，测定表的值。

图6描绘了显示另外的第一代变体植酸酶及其pH和热稳定性的表。如图1所示，CL0000004是G1P亲本，其氨基酸序列是SEQ ID NO:1。CL00000430是如图2所示的G2P序列。如实施例5和6所示测定表的值。

图7A、7B和7C描绘了显示第二代变体植酸酶及其pH和热稳定性的表。如图2所示，CL00000430是G2P亲本，其氨基酸序列是SEQ ID NO:5。应当注意的是，该表中列出的氨基酸突变是相对于G2P而非G1P。也就是说，在图中的氨基酸突变之外，图7中列出的所有变体植酸酶还含有变体I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P，它们是G2P的变体。因此，在H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P外，G3P变体(CL00005023)还具有I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P，使得G3P相对于G1P具有变体I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P。如实施例5和6中所示测定表的值。

图8描绘了显示第三代变体植酸酶及其pH和热稳定性的表。CL00005023是G3P，并且表中列出的另外的突变是相对于G3P变体而非G1P或G2P。也就是说，在图中的氨基酸突变之外，图8中列出的所有变体植酸酶相对于G1P还包含变体I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P。因此，G4P总体变体组为I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/N139A/G157Q/R159Y/N176K/D185N/Y255D/F354Y/A380P/E402D。如实施例5和6中所示测定表的值。

图9显示了G1P(野生型)、G2P、G3P和G4P变体植酸酶的比对。含有前22个氨基酸的信号序列是有双下划线的。催化域为粗体且有下划线的，催化残基为大斜体字体，而底物结合残基为大粗体字体。注意，图9的数目包括信号肽，其不是本文概述的变体位置的编号；也就是说，本文中的变体位置将谷氨酰胺(Q)残基计为成熟蛋白质的1位。因此，催化域是图中的氨基酸29-374，但成熟蛋白质中的氨基酸7-352。类似地，图中的H39和D326催化残基是成熟编号中的H17和D304，而底物结合残基是R16、R92和R267。

图10A和B显示选定序列(包括G1P、G2P和G3P)的热攻击(challenge)。如实施例7所讨论，热攻击是在指定温度下5分钟的攻击。

图11描绘了显示本发明的一些实施方案中的一些优选变体的变体表。如本文所述，这些可以以任何组合并且与本文所概述的变体组组合。

图12显示了选定序列(包括G1P、G2P、G3P和G4P)的热攻击。如实施例7中讨论，热攻击是在指定温度下的5分钟攻击。％残留活性计算为[(任何温度下变体的活性)/(在63.0℃下的变体活性)]x100％]。

发明详述

I.导言

植酸酶分解植酸盐(在为盐形式时肌醇六磷酸盐(IP6)或植酸)，其是植物中磷酸盐的主要储存。单胃动物如猪、家禽和鱼(以及人类)不能消化植酸盐，导致粪肥中的磷排泄，这在农业地区引起环境问题。此外，植酸盐可以导致蛋白质聚集，从而降低蛋白质的可用性，以及螯合矿物质和微量元素，进一步降低动物的可用营养物。

几十年前引入对动物饲料添加植酸酶，并且其可以将磷排泄降低多达50％，同时还允许动物更好地获取可用的营养物。然而，在许多食品，包括由植物来源制成的动物饲料以及人类食物(谷类等)两者的加工中使用的条件诸如较高温度和不同pH下，许多野生型植酸酶不是非常稳定的，导致植酸盐转化效率低和/或添加更多酶的成本高昂。类似地，植酸酶诸如在生物燃料的生产中的其他用途也可以包括更高的温度和/或不同的pH。因此，本发明的目的是提供具有改善性质的变体植酸酶，包括如本文概述的热稳定性和其他生物化学性质，其导致改善的结果，诸如由磷排泄降低所致的较小的环境应激、更好的饲料至动物重量的转化和更好的营养物获得。

II.定义

本文的“修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入、和/或缺失或对与蛋白质化学连接的部分的改变。例如，修饰可以是与蛋白质连接的改变的碳水化合物或PEG结构。本文中的“氨基酸修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另有说明，氨基酸修饰总是针对由DNA编码的氨基酸，例如在DNA和RNA中具有密码子的20个氨基酸。

本文中的“氨基酸取代”或“取代”是指用不同氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸。特别地，在一些实施方案中，取代针对不天然存在于特定位置处，不是天然存在于生物体内或任何生物体中的氨基酸。例如，取代I55V是指变体多肽，在此种情况下为下述植酸酶，其中55位的异亮氨酸用缬氨酸替换。为清楚起见，已经工程化改造以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)交换为CGA(仍编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管创建了编码相同蛋白质的新基因，但若蛋白质在其开始的特定位置处具有相同的氨基酸，则它不是氨基酸取代。

如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”是指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸序列。例如，-233E或233E表示在233位后且234位前插入谷氨酸。此外，-233ADE或A233ADE表示在233位后且234位前插入AlaAspGlu。

如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”是指在亲本多肽序列中的特定位置处除去氨基酸序列。例如，E233-或E233#、E233()或E233del1表示233位谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#表示233位开始的序列GluAspAla的缺失。

如本文所用，“亲本多肽”是指随后经修饰以产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽，或天然存在的多肽的变体或工程化形式。亲本多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物、或编码它的氨基酸序列。在本情况下，一些实施方案利用G1P、G2P或G3P作为亲本多肽，前者是优选的。

如本文所用，“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”是指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本蛋白质不同的蛋白质。蛋白质变体可以指蛋白质本身、包含蛋白质的组合物、或编码它的氨基酸序列。优选地，与亲本蛋白质相比，蛋白质变体具有至少一个氨基酸修饰，例如，与亲本相比约1至约70个氨基酸修饰，且优选约1至约5个氨基酸修饰。如下所述，在一些实施方案中，亲本多肽是野生型序列，例如本文称为“G1P”的野生型大肠杆菌植物酶。如下文进一步讨论的，本文的蛋白质变体序列优选与亲本蛋白质序列拥有至少约80％的同一性，最优选至少约90％的同一性，更优选至少约95-98-99％的同一性。变体蛋白质可以指变体蛋白质本身、包含蛋白质变体的组合物、或编码它的DNA序列。因此，本文的“变体植酸酶”是指与亲本植物酶相比在氨基酸序列中具有至少一个氨基酸修饰的新植酸酶。如本文所讨论，在一些情况下，亲本植酸酶是第二代或更高代的变体；也就是说，如图6所示，与野生型G1P亲本相比，G2P植酸酶具有6个氨基酸取代。然而，如图7所示，与G2P亲本相比，G3P具有5个氨基酸取代，但与G1P相比总共有11个氨基酸取代。除非另有说明或从上下文中显而易见，通常将本发明的变体植酸酶与野生型G1P序列进行比较。另外，除非另有说明，本发明的变体植物酶具有酶活性，即，使用实施例5中所述的植酸酶测定法，使用没有温度处理的测定法，存在可检测的植物酶活性。

如本文所用，“蛋白质”在本文中是指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。肽基基团通常包含天然存在的氨基酸和肽键。另外，多肽可以包括一个或多个侧链或末端的合成衍生物化学、糖基化、PEG化、循环排列(circular permutation)、环化、与其他分子的接头、与蛋白质或蛋白质域的融合、以及肽标签或标记物的添加。

如本文所用，“残基”是指蛋白质中的位置及其相关的氨基酸身份。例如，组氨酸82(也称为His82或H82)是G1P亲本酶中82位的残基。

如本文所用，“非天然存在的修饰”是指在亲本(例如G1P)酶中未发现的氨基酸修饰。

如本文所用，“氨基酸”和“氨基酸身份”是指由DNA和RNA编码的20种天然存在的氨基酸之一。

如本文所用，“位置”是指蛋白质序列中的位置。通常，位置编号(其在下文中更充分地讨论)相对于成熟植酸酶序列(例如，排除信号肽)的第一个氨基酸。

“植酸酶”在本文中是指具有植酸酶活性的蛋白质。本文中的“植酸酶活性”是指该酶催化植酸盐(肌醇六磷酸盐)水解成(1)肌醇和/或(2)其单、二、三、四和/或五磷酸盐和(3)无机磷酸盐。在下文和实施例5中概述的测定法中具有可检测活性的酶在本文中认为是植酸酶。

就两个序列而言，本文中的“同一性”是指考虑到比对，相同的氨基酸处于相同的位置。计算本发明的氨基酸序列(“发明序列”)与权利要求中提及的亲本氨基酸序列(例如，对于G1P，SEQ ID NO:1)之间的同一性程度为两个序列的比对中的完全匹配的数目除以“发明序列”的长度，或SEQ ID NO:1的长度，以最短者为准。结果以百分比同一性表示，如下计算。

出于本发明的目的，使用SEQ ID NO:1中公开的成熟多肽测定本发明的另一种植酸酶中的相应氨基酸残基。将另一种植酸酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中公开的成熟多肽进行比对，并根据比对，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)测定对应于SEQ ID NO:1中公开的成熟多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号，如EMBOSS包的Needle程序(EMBOSS:The European Molecular BiologyOpen Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选版本5.0.0或以后的版本中执行。使用的参数是缺口开放罚分10、缺口延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。

可以通过使用几种计算机程序使用其相应的默认参数比对多个多肽序列来测定另一种植酸酶中相应的氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数期望值(log-expectation)的多重序列比较；版本3.5或以后的版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research 32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或以后的版本；Katoh andKuma,2002,Nucleic Acids Research 30:3059-3066；Katoh et al.,2005,Nucleic AcidsResearch 33:51 1-518；Katoh and Toh,2007,Bioinformatics 23:372-374；Katoh etal.,2009,Methods in Molecular Biology 537:39-64；Katoh and Toh,2010,Bioinformatics 26:1899-1900)、采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或以后的版本；Thompson et al.,1994,Nucleic Acids Research 22:4673-4680)、和采用Clustal Omega的EMBL-EBI(Sievers and Higgins,2014,Methods Mol Biol.2014；1079:105–16)。

当另一种酶与SEQ ID NO:1的多肽趋异，使得传统的基于序列的比较未能检测到它们的关系(Lindahl and Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)时，可以使用其他成对序列比较算法。可以使用利用多肽家族(概况)的概率呈现内搜索数据库的搜索程序来获得基于序列的搜索的更大灵敏度。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程生成概况，并且能够检测远程同源物(Atschul et al.,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。若多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个呈现，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序诸如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.287:797-815；McGuffinand Jones,2003,Bioinformatics 19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对概况和溶剂化电位)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，可以使用Gough et al.,2000,J.Mol.Biol.313:903-919的方法来将未知结构的序列与SCOP数据库中存在的超家族模型比对。这些比对可以继而用于生成多肽的同源性模型，并且可以使用为此目的而开发的多种工具来评估此类模型的准确性。

对于已知结构的蛋白质，几种工具和资源可用于检索和生成结构比对。例如，已经在结构上比对SCOP蛋白质超家族，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm and Sander,1998,Proteins33:88-96)或组合扩展(Shindyalovand Bourne,1998,Protein Engineering 11:739-747)来比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实现可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如Holm and Park,2000,Bioinformatics 16:566-567)。

在描述本发明的变体时，下面描述的命名法为了便于参考而改编。采用标准公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

对于氨基酸取代，本文中使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，用脯氨酸取代441位谷氨酰胺命名为“Gln441Pro”或“Q441P”。多个突变由正斜线标记(“/”)分隔，例如分别表示在位置91、133和169处的替换的“I91L/A133G/Y169W”。

在本文中的植酸酶的背景中，“分离的”是指多肽不含其他蛋白质。在一个具体的实施方案中，本发明的植酸酶是分离的。如本文所用，术语“分离的”是指至少20％纯、优选至少40％纯、更优选至少60％纯、甚至更优选至少80％纯、最优选至少90％纯，甚至最优选至少95-98％纯的多肽，如通过SDS-PAGE所测定的。特别地，优选的是多肽为“基本上纯的形式”，即多肽制品基本上不含与其天然结合的其他多肽材料。这可以通过例如通过公知的重组方法或经典的纯化方法制备多肽来完成。

本文中的“重组酶”是指通过重组技术产生酶，并且编码本发明变体酶的核酸与至少一个外源(例如对于亲本植酸酶不是天然的)序列可操作连接，所述外源序列包括但不限于例如启动子、终止子、信号序列等，如下面更全面概述的。

术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因中分离或以下述方式修饰以含有核酸区段，其在其它情况中不会存在于自然界中或者是合成的，并且包含一个或多个控制序列。

术语“可操作连接”是指将控制序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得控制序列指导编码序列的表达的构造。

III.本发明的植酸酶

因此，本发明提供了具有改善的活性的变体植酸酶，其可用于多种应用，包括动物和人类营养和饲料产品以及生物燃料如生物乙醇的生产。

通常，本发明的变体植酸酶与野生型亲本植物酶、“EcPhytaseG1P”或“G1P”(例如“第1代亲本”)、本文中SEQ ID NO:1相比具有经修饰的、改善的生物化学性质，如图1所示。可以在本文中改善的变体植物酶的生物化学性质包括但不限于pH活性、pH稳定性、热稳定性、比活、配制剂稳定性(包括液体、固体和团粒)、在动物和/或动物饲料中的性能和蛋白酶稳定性。

本发明的变体植酸酶与G1P相比具有一种或多种改善的性质。本文中“改善的”是指至少一种生物化学性质的期望变化。“改善的功能”在期望性质(例如pH稳定性，热稳定性)的增加或不期望性质(例如蛋白酶敏感性)的降低的情况下可以以特定活性的百分比增加或减少，或以“倍数”变化测量。也就是说，变体植酸酶与G1P相比可以具有10％的热稳定性增加或10％的蛋白酶敏感性降低。或者，变体植酸酶可以具有pH稳定性的2倍增加或蛋白酶敏感性的3倍降低。通常，使用百分比变化来描述小于100％的生物化学活性的变化，并且使用倍数变化来描述大于100％的生物化学活性的变化(与亲本酶相比，在许多情况下为G1P)。在本发明中，可以实现至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％和99％的生物化学活性的百分比变化(通常增加)。在本发明中，与起始酶或亲本酶相比测量“倍数增加”(或降低)。例如，如图所示，G2P与G1P相比具有11.64倍的温度耐受性增加：这通过[(变体的活性)/(亲本的活性)]来计算。在许多实施方案中，改善至少一点五(1.5倍)、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更高。

一般地，在使用植物酶活性测定法在相对于G1P酶攻击变体植酸酶的条件下与G1P酶相比测量改善。

A.植酸酶测定法

如实施例5所示并且如下运行基本植酸酶测定：在温度，pH等的适当的条件下攻击后，将样品添加到含有2mM植酸钠(C₆H₆Na₁₂O₂₄P₆,FW:923.81)底物的0.1M乙酸钠溶液，pH4.5和pH 5.5中。将反应物于24℃，150rpm温育30分钟。用5％w/v三氯乙酸的溶液体积的一半淬灭反应。添加样品量的新鲜着色剂，其通过混合4体积的5.5％硫酸中的2.5％钼酸铵溶液和1体积的2.7％硫酸亚铁溶液来制备。将样品摇动30秒，然后以4000rpm离心2分钟。用等体积的水稀释一定体积的上清液，并在700nm读取吸光度。在某些情况下，有用的是使用“植酸酶单位”或PU，其定义为每分钟释放1μmol无机磷酸盐所需要的植酸酶量。酶可以是纯化的样品、发酵样品或粗样品。

本发明的变体植物酶可以具有许多生物化学性质中的一种或多种的改善，所述生物化学包括但不限于pH活性、pH稳定性、热稳定性、比活、配制剂稳定性(包括液体、固体和团粒)、在动物和/或动物饲料中的表现和/或蛋白酶稳定性。

B.热稳定性

在许多实施方案中，本发明的变体植酸酶具有增加的热稳定性，特别是在用于生产动物饲料的条件下，例如在造粒过程期间经常使用高温达一段时间，该时间段在传统上使野生型植酸酶失活。在此背景中的“热稳定性”意指变体酶在相同的热攻击条件下比亲本植物酶(例如G1P)更稳定，即变体的活性在相同条件下高于G1P的活性(通常使用如本文概述并如实施例6中所示的植酸酶测定法)。

在一个实施方案中，当暴露于40℃、45℃、50℃、55℃、58℃、60℃、65℃、66℃、70℃、75℃、80℃和/或85℃的温度达一段时间，通常范围为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10分钟或更长(取决于使用变体植酸酶的最终条件)时，变体植酸酶比亲本植酸酶更稳定，一些实施方案利用5分钟至10分钟、5分钟至15分钟、5分钟至60分钟、10分钟至60分钟的热攻击时间，都可用于本发明。在一些实施方案中，使用85℃和5分钟的攻击。

因此，在一些实施方案中，变体植物酶与亲本植物酶，特别是G1P相比具有增加的热稳定性，在50℃至少5分钟、在55℃至少5-10分钟、在58℃至少5-10分钟、在60℃至少5-10分钟、在66℃至少5-10分钟、以及在一些实施方案中在70℃至少5-10分钟。

另外，pH也可以是热稳定性的考虑。因此，在一些实施方案中，变体植物酶与亲本植酸酶相比具有增加的热稳定性，在58℃，pH 5.5至少5分钟、在58℃，pH 4.5至少5分钟、66℃，pH4.5至少5分钟或66℃，pH 5.5至少5分钟。

因此，如图5、6、7和8中所示，本发明的许多变体植物酶表现出增加的热稳定性。

C.pH稳定性

在许多实施方案中，本发明的变体植酸酶在较低pH下具有增加的pH稳定性，以解决非反刍动物的胃和胃肠道的较低pH。也就是说，许多植物酶具有对于动物中期望有活性的降低的pH环境而言亚最佳的pH概况。在此背景中“增加的pH稳定性”意指变体酶在相同pH攻击条件下比亲本植酸酶(例如G1P)更稳定，也就是说，在相同条件下，变体的活性高于G1P的活性(通常使用如本文概述并且如实施例6中所示的植酸酶测定法)。

因此，在一些实施方案中，变体植酸酶与亲本植酸酶(特别是G1P)相比具有增加的pH稳定性，在pH4.5附近至少5分钟和在pH5.5附近至少5分钟。

D.比活测定法

在一些实施方案中，本发明的变体植物酶与亲本植酸酶，特别是G1P相比具有增加的比活。本文中的“比活”指每酶量的活性，通常通过将样品的酶活性(有时以“植酸酶单位”测量，如本文中讨论)除以植酸酶的量来测定，通常如如本领域所知测定。

E.蛋白酶易感性

在一些实施方案中，本发明的变体植酸酶在相同条件下比亲本酶对蛋白酶降解的易感性小。在某些情况下，由宿主生物体中产生的蛋白酶在生产宿主生物中变体植酸酶的生产期间的蛋白酶降解可以是问题，因此导致活性酶的较低产率。这通常如本领域已知的那样测定，例如通过允许蛋白水解降解，然后对所得片段进行N端测序以测定切割位点进行。在一些情况下，取决于变体和宿主生产生物，可以没有显著的蛋白水解降解。

根据需要，如本领域技术人员将理解，可以进行的特定突变将取决于宿主生物体产生的内源蛋白酶，并且还通常发生在表面暴露的环结构或转角中，因此其可接近蛋白酶。例如，在黑曲霉(A.niger)真菌生产生物体中生产植酸酶可以导致蛋白水解降解；见Wysset al.,Appl.And Environ.Microbiol.Feb.1999:359-366，其通过引用完整并入。

IV.植酸酶

因此，本发明提供了与野生型G1P序列相比具有一种或多种改善特性的变体植酸酶，其中植酸酶不是G1P(SEQ ID NO:1)。

在一些实施方案中，本发明的变体植酸酶与GFP具有至少87％的同一性，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的同一性(但小于100％的同一性)的酶也可用于本发明。因此，一些实施方案提供了与G1P(SEQ ID NO:1)具有90％至99％同一性的变体植酸酶，其他实施方案提供95％至99％的同一性，条件是植物酶不是G1P(SEQID NO:1)。

在一些实施方案中，本发明的变体植酸酶与G2P具有至少87％的同一性，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的同一性的酶也可用于本发明，条件是植酸酶不是G1P(SEQ ID NO:1)。

在一些实施方案中，本发明的变体植酸酶具有氨基酸取代I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P，并且与SEQ ID NO:5至少95％、96％、97％、98％或99％相同。

在一些实施方案中，本发明的变体植酸酶与G3P具有至少87％的同一性，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的同一性的酶也可用于本发明，条件是植酸酶不是G1P(SEQ ID NO:1)。

在一些实施方案中，本发明的变体植酸酶具有氨基酸取代I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P并且与SEQ ID NO:7至少95％、96％、97％、98％或99％相同。

在一些实施方案中，本发明的变体植酸酶具有氨基酸取代H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P并且与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:7至少95％、96％、97％、98％或99％相同。

在一些实施方案中，本发明的变体植酸酶与G4P具有至少87％的同一性，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的同一性的酶也可用于本发明，条件是植酸酶不是G1P(SEQ ID NO:1)。

在一些实施方案中，本发明的变体植酸酶具有氨基酸取代N139A/N176K/D185N/E402D并且与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:9至少95％、96％、97％、98％或99％相同。

在一些实施方案中，本发明的变体植酸酶具有氨基酸取代I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/N139A/G157Q/R159Y/N176K/D185N/Y255D/F354Y/A380P/E402D并且与SEQ IDNO:9至少95％、96％、97％、98％或99％相同。

V.特定变体植酸酶

因此，本发明提供了许多具有改善的活性，特别是热稳定性和/或pH稳定性，并且特别是在如本文概述的特定pH和温度下的热稳定性的特定变体植酸酶。

在一些实施方案中，变体植酸酶在选自下组的位置(相对于G1P)处具有一个或多个氨基酸取代：1、30、36、39、55、60、65、69、73、74、79、85、101、109、111、116、118、120、137、138、139、141、146、157、159、176、180、183、184、185、186、189、233、245、255、276、282、288、291、295、297、311、315、341、354、363、369、370、380、383、385和402。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有选自下组的一个或多个氨基酸取代：Q1S、Q1V、Q1N、Q30K、A36K、T39D、I55V、H60S、H60Q、R65H、D69N、A73D、A73E、K74D、K74P、K74L、Q79L、Q79R、Q79A、Q79G、Q79F、I85V、A101L、A109D、A109D、A109E、A109G、A109F、A109P、T111S、T111D、T111Q、A116Y、A116P、A116R、A116S、T118R、T118S、S120R、N137S、N137P、A138V、A138H、A138D、A138P、N139P、N139A、N139H、T141E、T141G、T141A、T141R、S146R、G157Q、G157N、G157L、G157R、G157A、R159Y、N176K、N180T、N180E、K183R、Q184S、D185N、D185L、E186V、E186A、S189T、G233A、Y255D、T245E、Y255D、M276V、H282N、H282P、A288E、A288R、A288V、V291I、T295I、V297L、G311S、E315G、E315S、L341Y、L341V、F354Y、K363A、K363L、N369P、T370P、A380R、A380T、A380P、E383S、R385S、R385V、R385T、E402R、E402T、E402D、E402P和E402N。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的1位处的谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自Q1S、Q1V和Q1N。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的30位处的谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q30K。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的36位处的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A36K。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的39位处的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T39D。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的55位处的异亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是I55V。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的位置60处的组氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自H60Q和H60S。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的65位处的天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是R65H。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的69位处的天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是D69N。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的73位处的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自A73D和A73E。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的74位处的赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自K74D、K74L和K74P。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的79位处的谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自Q79L、Q79A、Q79G、Q79R和Q79F。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的85位处的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是I85V。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的101位处的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A101L。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的109位处的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自A109D、A109E、A109F、A109P、A109G。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的111位处的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自T111S、T111D和T111Q。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的116位处的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自A116Y、A116P、A116R和A116S。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的118位处的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自T118S和T118R。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的120位处的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自S120R。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的137位处的天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自N137P和N137S。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的138位处的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自A138V、A138H、A138P和A138D。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的139位处的天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自N139P、N139A和N139H。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的141位处的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自E(T141E)、G(T141G)、A(T141A)、R(T141R)。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的146位处的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自R(S146R)。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的157位处的甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自G157Q、G157N、G157L、G157R、G157A。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的159位处的精氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、天冬酰胺、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是R159Y。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的176位处的天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N176K。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的位置180处的天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自N180T和N180E。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的183位处的赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是K183R。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的184位处的谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q184S。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的185位处的天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自D185L和D185N。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的186位处的谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自E186V和E186A。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的189位处的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S189T。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的233位处的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G233A。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的245位处的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T245E。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的255位处的酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和甲硫氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能形成二硫键)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Y255D。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的276位处的甲硫氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是M276V。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的位置282处的甲硫氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自H282N和H282P。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的288位处的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自A288E、A288R和A288V。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的291位处的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是V291I。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的295位处的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T295I。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的297位处的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自V297L。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的位311处的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G311S。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的315位处的谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自E315G和E315S。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的341位处的亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自L341Y和L341V。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的354位处的苯丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是F354Y。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的363位处的赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自K363A和K363L。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的369位处的天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N369P。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的370位处的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T370P。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的380位处的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自A380R、A380T和A380P。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的383位处的谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，并且一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是E383S。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的385位处的精氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自R385V、R385T和R385S。

在一些实施方案中，变体植酸酶具有SEQ ID NO:1的402位处的谷氨酸的氨基酸替换。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸取代，即丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫键形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自E402D、E402P、E402N、E402R和E402T。

在一些实施方案中，变体植酸酶包含G2P变体I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P和选自下组的另外的氨基酸取代：Q1S,Q1V,Q1N,Q30K,A36K,T39D,H60S,H60Q,R65H,D69N,A73D,A73E,K74D,K74P,K74L,Q79L,Q79R,Q79A,Q79G,Q79F,I85V,A101L,A109D,A109D,A109E,A109G,A109F,A109P,T111S,T111D,T111Q,A116Y,A116P,A116R,A116S,T118R,T118S,S120R,N137S,N137P,A138V,A138H,A138D,A138P,N139P,N139A,N139H,T141E,T141G,T141A,T141R,S146R,N176K,N180T,N180E,K183R,Q184S,D185N,D185L,E186V,E186A,S189T,G233A,T245E,M276V,H282N,H282P,A288E,A288R,A288V,V291I,T295I,V297L,G311S,E315G,E315S,L341Y,L341V,K363A,K363L,N369P,T370P,E383S,R385S,R385V,R385T,E402R,E402T,E402D,E402P和E402N。

在一些实施方案中，变体植酸酶包含G3P变体H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P和至少一个上文概述的另外的单一氨基酸变体，包括但不限于Q1S,Q1V,Q1N,Q30K,A36K,T39D,I55V,R65H,A73D,A73E,Q79L,Q79R,Q79A,Q79G,Q79F,I85V,A101L,A109D,A109D,A109E,A109G,A109F,A109P,T111S,T111D,T111Q,A116Y,A116P,A116R,A116S,T118R,T118S,A138V,A138H,A138D,A138P,N139P,N139A,N139H,T141E,T141G,T141A,T141R,S146R,G157Q,G157N,G157L,G157R,G157A,R159Y,N176K,N180T,N180E,K183R,Q184S,D185N,D185L,E186V,E186A,S189T,G233A,Y255D,T245E,M276V,H282N,H282P,A288E,A288R,A288V,V291I,T295I,V297L,G311S,E315G,E315S,L341Y,L341V,F354Y,K363A,K363L,N369P,T370P,A380R,A380T,A380P,E383S,R385S,R385V,R385T,E402R,E402T,E402D,E402P和E402N。

在一些实施方案中，变体植酸酶包含G2P和G3P变体I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P和至少一个上文概述的另外的单一氨基酸变体，包括但不限于Q1S,Q1V,Q1N,Q30K,A36K,T39D,R65H,A73D,A73E,Q79L,Q79R,Q79A,Q79G,Q79F,I85V,A101L,A109D,A109D,A109E,A109G,A109F,A109P,T111S,T111D,T111Q,A116Y,A116P,A116R,A116S,T118R,T118S,A138V,A138H,A138D,A138P,N139P,N139A,N139H,T141E,T141G,T141A,T141R,S146R,N176K,N180T,N180E,K183R,Q184S,D185N,D185L,E186V,E186A,S189T,G233A,T245E,M276V,H282N,H282P,A288E,A288R,A288V,V291I,T295I,V297L,G311S,E315G,E315S,L341Y,L341V,K363A,K363L,N369P,T370P,E383S,R385S,R385V,R385T,E402R,E402T,E402D,E402P和E402N。

在一些实施方案中，变体植酸酶包含G4P变体N139A/N176K/D185N/E402D和至少一个上文概述的另外的单一氨基酸变体，包括但不限于Q1S,Q1V,Q1N,Q30K,A36K,T39D,I55V,H60S,H60Q,R65H,D69N,A73D,A73E,K74D,K74P,K74L,Q79L,Q79R,Q79A,Q79G,Q79F,I85V,A101L,A109D,A109D,A109E,A109G,A109F,A109P,T111S,T111D,T111Q,A116Y,A116P,A116R,A116S,T118R,T118S,S120R,N137S,N137P,A138V,A138H,A138D,A138P,T141E,T141G,T141A,T141R,S146R,G157Q,G157N,G157L,G157R,G157A,R159Y,N180T,N180E,K183R,Q184S,E186V,E186A,S189T,G233A,Y255D,T245E,M276V,H282N,H282P,A288E,A288R,A288V,V291I,T295I,V297L,G311S,E315G,E315S,L341Y,L341V,F354Y,K363A,K363L,N369P,T370P,A380R,A380T,A380P,E383S,R385S,R385V和R385T。

在一些实施方案中，变体植酸酶包含G4P变体I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/N139A/N176K/D185N/E402D和选自下组的另外的氨基酸取代：Q1S,Q1V,Q1N,Q30K,A36K,T39D,R65H,A73D,A73E,Q79L,Q79R,Q79A,Q79G,Q79F,I85V,A101L,A109D,A109D,A109E,A109G,A109F,A109P,T111S,T111D,T111Q,A116Y,A116P,A116R,A116S,T118R,T118S,A138V,A138H,A138D,A138P,T141E,T141G,T141A,T141R,S146R,N180T,N180E,K183R,Q184S,E186V,E186A,S189T,G233A,T245E,M276V,H282N,H282P,A288E,A288R,A288V,V291I,T295I,V297L,G311S,E315G,E315S,L341Y,L341V,K363A,K363L,N369P,T370P,E383S,R385S,R385V和R385T。

本发明的一些具体的实施方案是植酸酶变体，其与SEQ ID NO:1相比具有选自下组的氨基酸取代组：N139H/K183R,R159Y/Y255D/V291I/V297L/G311S,I55V/Y255D/G311S/F354Y,G233A/Y255D/V291I,I85V/G157Q/V291I/V297L/G311S/F354Y,A101L/Y255D,I55V/I85V/Y255D/V291I,I55V/F354Y,I55V/I85V/Y255D/V291I/F354Y,R159Y/Y255D/V291I,A101L/R159Y/S189T/T295I/F354Y,Q30K/I85V/Y255D/A380P,G157Q/R159Y,I55V/I85V/S189T/G233A/Y255D/F354Y/A380P,I55V/I85V/S189T/V297L/G311S,F354Y,I55V/I85V/A101L/G157Q/G233A/F354Y,I55V/G157Q/Y255D/V291I/V297L/F354Y,R159Y,I55V,Y255D,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P,I55V/R159Y/Y255D/V297L/A380P,I55V/I85V/G157Q/G233A/Y255D/V297L/F354Y,I55V/A101L/G157Q/Y255D/V297L,I55V/A101L/G157Q/Y255D/F354Y,I55V/V291I/V297L,和I55V/I85V/A101L/R159Y/S189T/Y255D/F354Y。在这些中，I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P在一些实施方案中是特别有用的。

在一些实施方案中，本发明的变体植酸酶包含选自下组的氨基酸取代组：T39D/K74D/Q157A,T39D/H60Q/K74D/N137P/T141A,K74D,T39D/D69N/N137P/T141E/Q157A,S120R/N137P/A138V,T39D/H60Q,K74D/T141A,K74P,N137P/A138V,H60Q/D69N,T39D/D69N/K74D,H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P,D69N/N137P/A138V/T141E,T39D/D69N/K74P/T111D/S120R/T141A,N137P/T141A,N137P/A138V/T141E,T39D/K74D,T39D/H60S/T111D/S120R,T39D/H60S/D69N/S120R/N137S/T141A,H60Q/N137P/A138V/T141A,Q157L,S120R/N137P,H60Q,S120R,S120R/N137S/A138V/Q157L,H60S/K74Y/S120R/A138V,T39D/D69N/S120R/T141A,H60S,T39D/S120R,T39D,H60S/K74D,T39D/T111D,T39D/H60S,T39D/K74D/T141E,K74D/T111D/T141E/Q157N,H60S/K74D/T111D/S120R/T141E/Q157N,T39D/K74D/S120R/T141E,T141E,K74D/S120R/Q157N,K74D/S120R,T111D/S120R/T141E,H60S/R65H,H60S/D69N/T111D/N137P,T39D/N137S/T141A,H60Q/D69N/N137P/A138V,T39D/D69N/K74D/N137P/A138V/T141E,K74D/T111D/T141A,N137S/A138V/T141E,H60Q/K74P/N137S/T141E,D69N/K74P,H60Q/K74P,T39D/T111D/S120R,T39D/H60Q/K74D/T111D/S120R,T39D/D69N,D69N/K74D,和T39D/H60Q/D69N/N137S/A138V。

在一些实施方案中，将G2P氨基酸变体组I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P添加到第二组(上述“G3P组”)以提供变体植酸酶，其具有选自下组的氨基酸取代：I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/K74D/Q157A,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60Q/K74D/N137P/T141A,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/N137P/T141E/Q157A,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/S120R/N137P/A138V,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60Q,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/T141A,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74P,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N137P/A138V,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/K74D,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/D69N/N137P/A138V/T141E,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/K74P/T111D/S120R/T141A,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N137P/T141A,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N137P/A138V/T141E,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/K74D,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60S/T111D/S120R,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60S/D69N/S120R/N137S/T141A,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/N137P/A138V/T141A,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/Q157L,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/S120R/N137P,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/S120R,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/S120R/N137S/A138V/Q157L,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/K74Y/S120R/A138V,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/S120R/T141A,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/S120R,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/K74D,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/T111D,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60S,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/K74D/T141E,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/T111D/T141E/Q157N,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/K74D/T111D/S120R/T141E/Q157N,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/K74D/S120R/T141E,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T141E,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/S120R/Q157N,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/S120R,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T111D/S120R/T141E,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/R65H,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/D69N/T111D/N137P,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/N137S/T141A,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/N137P/A138V,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/K74D/N137P/A138V/T141E,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/T111D/T141A,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N137S/A138V/T141E,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/K74P/N137S/T141E,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/D69N/K74P/,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/K74P,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/T111D/S120R,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60Q/K74D/T111D/S120R,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N,I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/D69N/K74D,和I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60Q/D69N/N137S/A138V。

本发明合适的变体植酸酶是在SEQ ID NO:12至171中列出的那些，以及在附图中描述的那些。

本发明的核酸

本发明另外提供了编码本发明的变体植酸酶的核酸。如本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，可以制备极大量的核酸，它们都编码本发明的变体植酸酶。因此，鉴定出特定的氨基酸序列后，本领域技术人员可以通过简单地以不改变蛋白质氨基酸序列的方式修饰一个或多个密码子的序列来制备任何数目的不同核酸。因此，提供氨基酸序列允许产生非常大量的编码蛋白质的不同核酸序列。

在一些实施方案中，特定变体植酸酶由特定核酸序列编码，如SEQ ID NOs 172-332中所列。

如本领域已知的，如本领域已知并且根据用于产生本发明的异二聚体抗体的宿主细胞，可以将编码本发明组分的核酸掺入表达载体中。通常，核酸与任何数目的调节元件(启动子、复制起点、选择标志物、核糖体结合位点、诱导物等)可操作连接。表达载体可以是染色体外或整合载体。

然后，将本发明的核酸和/或表达载体转化到本领域公知的任何数目的不同类型的宿主细胞中，包括哺乳动物、细菌、酵母、昆虫和/或真菌细胞，细菌和真菌可用于许多实施方案。

变体的制备

可以使用本领域已知的任何诱变程序制备编码本发明变体植物酶的核酸，例如定点诱变和合成基因构建是本领域公知的。

合成基因构建需要体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。可以利用多种技术进行基因合成，例如Tian et al.(2004,Nature 432:1050-1054)描述的基于多重微芯片的技术以及类似技术，其中合成寡核苷酸并且在光可编程的微流体芯片上组装。一种优选的技术是

i.调节序列

本发明还涉及包含编码本发明变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个控制序列可操作地连接，所述控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

可以以多种方式操作多核苷酸以提供变体的表达。根据表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是期望的或必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术在本领域中是公知的。

控制序列可以是启动子，即为了表达多核苷酸而被宿主细胞识别的多核苷酸。启动子含有介导变体表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变体启动子、截短的启动子和杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从以下获得的启动子：构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)植物酶(glaA)、米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、腐皮镰孢菌(Fusariumvenenatum)淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、腐皮镰孢菌Daria(WO 00/56900)、腐皮镰孢菌Quinn(WO 00/56900)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶的基因，以及NA2-tpi启动子(来自曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中未翻译的前导物已经由来自曲霉丙糖磷酸异构酶基因的非翻译前导物替换；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中未翻译的前导物已经由来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的非翻译前导物替换；和其突变体启动子、截短启动子和杂合启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因获得。Romanos et al.,1992,Yeast 8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用启动子。

控制序列也可以是转录终止子，其被宿主细胞识别以终止转录。终止子序列与编码变体的多核苷酸的3’端可操作连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。

在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞的终止子获自构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉植物酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因。

在一些实施方案中，用于酵母宿主细胞的终止子从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得。Romanos et al.,1992，见上文描述了用于酵母宿主细胞的其他有用终止子。

控制序列也可以是增加基因表达的启动子下游且基因编码序列上游的mRNA稳定区。

合适的mRNA稳定区的实例从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)crylllA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue et al.,1995,Journal ofBacteriology 177:3465-3471)获得。

控制序列也可以是前导物，即对于由宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区。前导物序列与编码变体的多核苷酸的5’端可操作连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导物。

在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞的前导物是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的。

在一些实施方案中，从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得酵母宿主细胞的合适前导物。

控制序列也可以是多腺苷酸化序列，即与变体编码序列的3’端可操作连接的序列，并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷残基添加到转录的mRNA的信号。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。

在一些实施方案中，用于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列从构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉植酸酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得。

Guo and Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990描述了酵母宿主细胞的有用的多聚腺苷酸化序列。

控制序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的N端连接并指导表达的变体葡糖淀粉酶进入细胞的分泌途径的信号肽。多核苷酸的编码序列的5’端可以固有地包含在翻译阅读框中与编码变体葡糖淀粉酶的编码序列片段天然连接的信号肽编码序列。或者，编码序列的5’端可以含有对于编码序列外源的信号肽编码序列。当编码序列天然不含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。或者，外源信号肽编码序列可以简单地替换天然信号肽编码序列以增强变体葡糖淀粉酶的分泌。然而，可以使用将表达的变体导入宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码序列。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉植酸酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、高温毛壳霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶、和米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的有用信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。图1中显示了特定的信号序列，SEQ ID NO:2。

在存在信号肽和前肽序列两者的情况下，前肽序列位于变体的N端附近，并且信号肽序列位于前肽序列的N端附近。

还可以期望添加相对于宿主细胞生长调节变体表达的调节序列。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操作基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉植物酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉植物酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸将与调节序列可操作连接。

1.表达载体

本发明还涉及重组表达载体，其包含编码本发明变体的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，其可以包括一个或多个方便的限制性位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。或者，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的合适载体中来表达多核苷酸。在创建表达载体时，编码序列位于载体中，使得编码序列与适合于表达的控制序列可操作连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可以方便地进行重组DNA程序并且可以导致多核苷酸的表达。载体的选择通常取决于载体与待导入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含任何用于确保自我复制的手段。或者，载体可以是当被引入宿主细胞时整合到基因组中并且与已经整合有它的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单载体或质粒或一起含有待引入宿主细胞基因组中的总DNA的两种或更多种载体或质粒，或转座子。涵盖用于本发明方法的载体包括整合载体和非整合载体两者。

在一些实施方案中，载体含有一个或多个允许容易选择经转化的、经转染的、经转导的或类似细胞的选择性标志物。选择性标志物是下述基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等。

用于酵母宿主细胞的合适标志物包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标志物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)以及其等同物。对于在曲霉细胞中使用优选的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。

在一些实施方案中，载体含有允许载体整合到宿主细胞基因组中或载体在细胞中不依赖于基因组的方式自主复制的元件。

为了整合到宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或载体的任何其他元件以通过同源或非同源重组整合到基因组中。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组在染色体中的精确位置处整合到宿主细胞基因组中。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、和800至10,000个碱基对，其与相应的靶序列具有高度的序列同一性以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码多核苷酸。另一方面，可以通过非同源重组将载体整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是任何介导在细胞中发挥功能的自主复制的质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”是指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANSI(Gems et al.,1991,Gene 98:61-67；Cullen et al.,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可以将超过一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生。可以通过如下获得多核苷酸的拷贝数的增加：将至少一个额外的序列拷贝整合到宿主细胞基因组中或与多核苷酸一起纳入可扩增选择标志物基因，其中含有扩增拷贝的选择标志物基因和因此多核苷酸的额外拷贝的细胞可以通过在合适的选择剂存在下培养细胞来选择。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员公知的(参见例如Sambrook等，1989，同上)。

2.密码子优化

密码子优化可以与本发明的任何变体植酸酶多肽一起使用，以优化使用的宿主细胞中的表达。此类方法在本领域中是公知的，并且记载于例如WO2007/142954。在异源表达系统中，优化步骤可以改善宿主产生期望变体植物酶多肽的能力。蛋白质表达受许多因子控制，包括影响转录、mRNA加工和稳定性以及翻译起始的因子。多核苷酸优化步骤可以包括改善宿主产生外源蛋白质的能力的步骤以及协助研究人员有效设计表达构建体的步骤。优化策略可以包括例如翻译起始区域的修饰、mRNA结构元件的改变、以及使用不同的密码子偏倚。以下段落讨论可以导致异源蛋白质表达降低的潜在问题以及可以克服这些问题的技术。

在一些实施方案中，减少的异源蛋白质表达源自罕见的密码子诱导的翻译暂停。罕见的密码子诱导的翻译暂停包括在宿主生物中很少使用的感兴趣多核苷酸中密码子的存在由于它们在可用的tRNA库中的缺乏而可以对蛋白质翻译具有负面影响。改善宿主生物体中最佳翻译的一种方法包括进行密码子优化，其可以导致在合成多核苷酸序列中修饰罕见的宿主密码子。

在一些实施方案中，减少的异源蛋白质表达源自交替的翻译起始。交替的翻译起始可以包括合成的多核苷酸序列，其无意地含有能够作为核糖体结合位点(RBS)发挥功能的基序。这些位点可以导致从基因内部位点起始截短的蛋白质的翻译。一种降低产生截短蛋白质(其在纯化期间可以难以除去)的可能性的方法包括从优化的多核苷酸序列修饰推定的内部RBS序列。

在一些实施方案中，通过重复诱导的聚合酶滑动发生减少的异源蛋白质表达。重复诱导的聚合酶滑动涉及核苷酸序列重复，已经显示其引起DNA聚合酶的滑动或延宕(stuttering)，这可以导致移码突变。此类重复也可以引起RNA聚合酶的滑动。在具有高G+C含量偏好的生物体中，可以存在由更高程度的G或C核苷酸重复组成的重复。因此，一种降低诱导RNA聚合酶滑动的可能性的方法包括改变G或C核苷酸的延伸重复。

在一些实施方案中，通过干扰二级结构发生减少的异源蛋白质表达。二级结构可以隔离RBS序列或起始密码子并且与蛋白质表达的降低相关。茎环结构也可以参与转录暂停和减弱。优化的多核苷酸序列可以含有核苷酸序列的RBS和基因编码区中的最小的二级结构以允许改善的转录和翻译。

在一些实施方案中，限制性位点可以实现异源蛋白质表达。通过修饰可以干扰转录单元随后亚克隆到宿主表达载体中的限制性位点，可以优化多核苷酸序列。

优化DNA序列可以负面或正面影响基因表达或蛋白质。例如，用更常见的密码子修饰不太常见的密码子可以通过引入干扰信息翻译的二级结构来影响mRNA的半衰期或改变其结构。因此，在某些情况下，可以有必要改变优化的信息。

可以优化AUG或基因的一部分。在一些实施方案中，通过优化基本上整个基因来实现表达的期望调节。在其他实施方案中，将通过优化部分而不是整个基因来实现期望的调节。

可以调节任何编码序列的密码子选择以实现期望的性质，例如特定细胞类型中的高水平表达。此类优化的开始点可以是具有100％常见密码子的编码序列，或含有常见和非常见密码子的混合物的编码序列。

可以产生并测试两种或更多种在其密码子选择上不同的候选序列以确定它们是否拥有期望的性质。候选序列可以通过使用计算机来评估调控元件诸如沉默子或增强子的存在并且寻找编码序列的区域的存在来评估，所述编码序列的区域可以通过密码子选择的改变而转换成此类调控元件。另外的标准可以包括特定核苷酸，例如A、C、G或U的富集、特定氨基酸的密码子偏好、或特定mRNA二级或三级结构的存在或缺乏。可以基于许多此类标准来对候选序列进行调整。

构建有希望的候选序列，然后通过实验评估。多个候选物可以彼此独立评估，或者该过程可以是迭代的，其通过使用最有希望的候选物作为新的开始点，或者通过组合两个或更多个候选物的区域来产生新的杂合物来进行。可以包括进一步的修改和评估轮次。

修改候选序列的密码子选择可以导致正或负元件的创建或破坏。一般地，正元件是指任何下述元件，其改变或从候选序列的除去可以导致治疗性蛋白质表达的减少或其创建可以导致治疗性蛋白质表达的增加。例如，正元件可以包括增强子、启动子、下游启动子元件、正调节物(例如转录激活物)的DNA结合位点或负责赋予或修饰mRNA二级或三级结构的序列。负元件是任何下述元件，其改变或从候选序列的除去可以导致治疗性蛋白质表达增加或其创建会导致治疗性蛋白质表达的减少。负元件包括沉默子、负调节子(例如转录阻遏子)的DNA结合位点、转录暂停位点或负责赋予或修饰mRNA二级或三级结构的序列。一般地，负元件比正元件更频繁出现。因此，导致蛋白质表达增加的密码子选择的任何变化更可能源自负元件的破坏而非正元件的创建。另外，与创建正元件相比，候选序列的改变更有可能破坏负元件。在一些实施方案中，选择和修饰候选序列以增加治疗性蛋白质的产生。可以例如通过顺序改变密码子或通过随机改变候选序列中的密码子来修饰候选序列。然后通过测定所得治疗性蛋白的表达水平或通过评估另一个参数(例如与表达水平相关的参数)来评估经修饰的候选序列。选择与未改变的候选序列相比产生增加水平的治疗性蛋白质的候选序列。

在一些实施方案中，可以例如在不参考蛋白质或信息结构的情况下修饰一个或一组密码子并测试。或者，可以在信息水平特性上选择一个或多个密码子，例如预先确定的，例如高或低GC含量的区域中的位置、具有诸如增强子或沉默子的结构的区域中的位置、可以经修饰以引入诸如增强子或沉默子的结构的区域、在具有或预测具有二级或三级结构的区域中的位置，例如链内配对、链间配对、缺乏或预测缺乏二级或三级结构的区域中的位置，例如链内或链间配对。若产生期望的结果，则选择特定的经修饰的区域。

系统性产生候选序列的方法是有用的。例如，可以将合成核酸序列的各个位置处的一个或一组，例如连续的一段密码子用常见的密码子(或者若例如起始序列已经经优化，则用非常见密码子)修饰，并且评估所得的序列。可以通过优化(或去优化)序列中给定的密码子“窗”以产生第一候选物，然后将窗移动到序列中的新位置，以及优化(或去优化(de-optimizing))窗下的新位置中的密码子以提供第二候选物。候选物可以通过测定它们提供的表达水平或通过评估另一个参数(例如与表达水平相关的参数)来评估。可以通过检查或以计算方式来评估一些参数，例如其拥有或缺乏高或低GC含量；序列元件，如增强子或沉默子；二级或三级结构，例如链内或链间配对。

在一些实施方案中，优化的核酸序列可以以由尚未优化的核酸序列表达的水平的至少110％、150％、200％、500％、1,000％、5,000％或甚至10,000％的水平表达本发明的变体植酸酶多肽。

以变体植酸酶的氨基酸序列开始，可以设计候选DNA序列。在合成DNA序列的设计期间，可以将密码子选择的频率与宿主表达生物体的密码子选择比较，并且可以在合成序列中修饰稀有的宿主密码子。另外，可以修饰合成候选DNA序列以除去不期望的酶限制性位点并添加或改变任何期望的信号序列、接头或非翻译区。可以对合成的DNA序列分析可能干扰翻译过程的二级结构的存在，诸如G/C重复和茎环结构。在合成候选DNA序列之前，可以检查经优化的序列设计以验证序列正确编码期望的氨基酸序列。最后，可以使用DNA合成技术，如本领域已知的技术合成候选DNA序列。

在一些实施方案中，可以利用宿主生物体中的一般密码子选择(诸如本文所述的那些)来优化宿主生物体中异源多核苷酸序列的表达。可以评估在宿主表达系统中很少被认为是特定氨基酸优选的密码子的百分比和分布。可以使用5％和10％选择的数值作为确定稀有密码子的截留值。

VII.宿主细胞和生产菌株

如本领域技术人员将理解的，存在用于重组生产本发明的变体植酸酶的极其多种生产宿主生物体，包括但不限于细菌细胞和包括酵母的真菌细胞。此外，虽然G1P亲本植酸酶是未糖基化的，但通过在酵母和真菌中产生的糖基化不会不利影响植酸酶活性。

本发明还涉及包含编码本发明的变体葡糖淀粉酶的多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸与指导本发明变体的产生的一个或多个控制序列可操作连接。将包含多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞中，使得构建体或载体作为染色体整合体或作为自身复制的染色体外载体维持，如前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码变体的基因及其来源。在一些实施方案中，宿主细胞展现变体葡糖淀粉酶的瞬时表达。在一些实施方案中，宿主细胞是稳定转染的宿主或稳定(即永久)表达变体植酸酶的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是生产宿主细胞。

宿主细胞可以是用于重组生产变体的任何细胞，例如原核生物或真核生物。此类宿主细胞包括但不限于细菌、真菌和酵母细胞。宿主细胞也可以是真核生物，诸如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用，“真菌”包括子囊菌纲(Ascomycota)，担子菌纲(Basidiomycota)，壶菌亚门(Chytridiomycota)和接合菌亚纲(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂真菌(mitosporic fungi)(如Hawksworth et al.,于Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK所定义)。

真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文所用，“酵母”包括子囊孢子酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、担子孢子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知真菌(Fungi Imperfecti)(芽生菌目(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来发生变化，为了本发明的目的，酵母的定义应当如Biology and Activities of Yeast(Skinner,Passmore,and Davenport编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)所述定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，毕赤酵母属(Pichia)，酵母属(Saccharomyces)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔斯伯氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括亚门真菌亚门(Eumycota)和卵菌亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等，1995，同上所定义)。丝状真菌的特征通常在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，并且碳分解代谢是专门需氧的。相反，酵母诸如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽并且碳分解代谢可以是发酵性的。

丝状真菌宿主细胞可以是丝状真菌宿主细胞可以是支顶孢属(Acremonium)、曲霉菌属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、金小孢子属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、云芝(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻温病菌(Magnaporthe)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新丽鞭毛菌(Neocallimastix)、脉孢菌(Neurospora))、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、毛平革菌属(Phanerochaete)、脉射菌属(Phlebia)、单鞭毛菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂折菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、Thielavia、梭孢壳属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

真菌细胞可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。适用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的方法记载于EP 238023,Yeltonet al,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474和Christensen et al.,1988,BiolTechnology 6:1419-1422。适合于转化镰孢菌物种的方法由Malardier et al.,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由Becker and Guarente,于Abelson,J.N.and Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods inEnzymology,第194卷,第182-187页,Academic Press,Inc.,New York；Ito et al.,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen et al.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1920描述的程序转化酵母。VIII.组合物

本发明还提供了包含变体植酸酶的组合物。在一些实施方案中，组合物包含载体和/或赋形剂。在一些实施方案中，组合物富含本发明的此类变体植酸酶多肽。术语“富含”表示组合物的植酸酶活性已经增加，例如富集因子至少为1。在一些实施方案中，配制组合物以提供期望的特征，例如低色、低臭和可接受的储存稳定。

在一些实施方案中，组合物包含本发明的变体植酸酶多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。在一些实施方案中，组合物可以包含多种酶活性，例如氨肽酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、植酸酶、异淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、植酸酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、支链淀粉酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、和/或木聚糖酶。

IX.生产方法

本发明还涉及生产变体植酸酶多肽的方法，其包括：(a)在适于表达变体植酸酶多肽的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)任选回收变体植酸酶多肽。

使用本领域已知的方法在适于产生变体植物酶多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或在合适的培养基中和在允许变体表达和/或分离的条件下进行的实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞。使用本领域已知的程序在含有碳源和氮源和无机盐的合适的营养培养基中发生培养。合适的培养基可从商业供应商获得，或者可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。若将变体植酸酶多肽分泌到营养培养基中，则可以直接从培养基中回收变体植酸酶多肽。若不分泌变体，则可以从细胞裂解物中回收它。

可以使用本领域已知的对变体特异的方法来检测变体植酸酶多肽。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定法来测定变体植酸酶多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法回收变体植物酶多肽。例如，可以通过包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀的常规程序从营养培养基中回收变体植酸酶多肽。

可以通过本领域已知的多种程序纯化变体，所述程序包括但不限于层析(例如离子交换、亲和力、疏水性、层析聚焦和大小排阻)、电泳程序(例如制备性等电聚焦)、差异SDS-PAGE、或提取(参见例如Protein Purification，Janson和Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)以获得基本上纯的变体。

在备选的方面，不回收变体，而是使用表达变体的本发明的宿主细胞作为变体的来源。在一个具体的实施方案中，不回收本发明的植物酶变体，并且宿主细胞是酵母宿主细胞。具体地，酵母是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母、卡尔斯伯氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁维酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母细胞。在一些实施方案中，酵母是酿酒酵母。

X.植酸酶配制剂和用途

如本文所讨论的，植酸酶在动物饲料中的使用具有许多益处，包括饲料成本节省，诸如膳食无机磷酸盐、能量和氨基酸的减少，包括膳食植酸盐的快速且有效的分解以及从植酸盐的增加的营养物利用度、以及生产效益，如非反刍动物受试者的体重增加、来自植酸盐的营养物释放增加、以及减少磷排泄以改善非反刍动物的环境影响的显著益处。在一些实施方案中，将本发明的变体植酸酶配制并添加到饲料中或可以作为饲料的组分制备。在前一种情况下，植酸酶的原料添加可以通过在载体饲料如小麦粉上配制植酸酶来完成。

如本领域技术人员所理解的，本发明的变体植酸酶的配制剂取决于其最终用途和相关条件。本发明变体植酸酶的合适配制剂包括液体配制剂、干燥配制剂(包括喷雾干燥配制剂)、粉末配制剂、颗粒配制剂和造粒(pelleted)配制剂。

在一些实施方案中，本发明的酶组合物(即多肽组合物)可以为任何适合于使用的形式，诸如例如，除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或没有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物或宿主细胞作为酶的来源。

在一些实施方案中，酶组合物可以是干粉或颗粒、无尘颗粒、液体、稳定液体或稳定的受保护的酶。例如，液体酶组合物可以根据已建立的方法通过添加稳定剂诸如糖、糖醇或其他多元醇和/或乳酸或另一种有机酸来稳定。

在一些实施方案中，本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其他条件可以基于本领域已知的方法确定。

上述组合物适用于液化、糖化和/或发酵过程，并且在一些实施方案中适用于淀粉转化。在一些实施方案中，组合物可用于生产食物产品，包括糖浆，以及发酵产物如乙醇。在一些实施方案中，组合物可用于制药业，例如消化助剂。

在一个实施方案中，将植酸酶添加到动物饲料中并造粒，如本领域已知，使得饲料与植酸酶一起在其中形成。在其他实施方案中，植酸酶可以喷雾或以液体形式定量到动物饲料中。

实施例

XI.实施例1：基因合成和克隆

EcPhytase(G1P)的起始基因由GenScript(http://www.genscript.com/)合成。将合成的基因克隆到pET-20b(+)载体(Novagen EMD Millipore,USA：目录号69739)中。

XII.实施例2：突变体收集设计和构建

在第一代改善中，使用来自大肠杆菌菌株的天然植物酶基因(G1P，SEQ ID NO:1)作为亲本。为了改善第1代亲本的热稳定性和pH耐受性，基于EcPhytase的蛋白质序列和结构分析设计8个突变体集合。设计包括每个变体一个至多个特定的突变。使用Lightning试剂盒(Agilent Technologies，Santa Clara，California)构建突变体集合，随后将其克隆到pET-20b(+)载体(Novagen EMD Millipore，USA：目录号69739)中。

在第二代改善中，使用来自第一代的最佳变体作为亲本。为了进一步改善第二代亲本的热稳定性和pH耐受性，基于第一代中鉴定的有利突变设计两个突变体集合。设计包括每个变体的一个至多个特定的突变。随后使用Lightning试剂盒(Agilent Technologies，Santa Clara，California)构建突变体集合。

在第三代改善中，使用来自第二代的最佳变体作为亲本。为了进一步改善第3代亲本的热稳定性和pH耐受性，基于第一代和第二代中鉴定的有利突变设计1个突变体集合。设计包括每个变体的一个至多个特定的突变。随后使用Lightning试剂盒(Agilent Technologies，Santa Clara，California)构建突变体集合。

XIII.实施例3：制备含有HTP植酸酶的湿细胞团粒

将包含来自单菌落的重组植酸酶编码基因的BL21(DE3)pLysS大肠杆菌细胞(Thermo Fisher Scientific，USA:目录号C606003)接种到96孔的浅孔微量滴定板的各个孔中，所述孔含有180μl含有1％葡萄糖和100μg/mL氨苄青霉素的LB。将培养物在30℃，200rpm和85％湿度下培养过夜。将来自每孔的10μL的过夜培养物转移到含有390mLTerrific Broth(TB)和100μg/mL氨苄青霉素的96孔深孔板的相应孔中。在37℃，250rpm和85％湿度下将深孔板温育3.5-4小时(OD600 0.6-0.8)。然后通过IPTG将细胞培养物诱导至终浓度1mM，并在与最初使用相同的条件下温育过夜。然后在4℃使用4000rpm离心10分钟沉淀细胞。弃去上清液，并将团粒在-80℃冷冻，然后裂解。

XIV.实施例4：HTP植酸酶板的裂解

如上所述，将150μL的B-PER细菌蛋白提取试剂(Thermo Fisher Scientific，USA：目录号78248)添加到每个孔中的细胞糊。将细胞在室温下在台式振荡器上振荡的情况下裂解1.5小时。然后将板在4000rpm和4℃下离心10分钟。将澄清的上清液用于进行生物化学测定以测定活性、pH耐受性和热稳定性。

XV.实施例5：无温度处理的酶测定法

使用0.1M乙酸钠，pH 4.5和pH 5.5将来自实施例4的裂解物稀释400倍。在96孔浅孔微量滴定板中，将30μl稀释的裂解物添加到0.1M乙酸钠，pH 4.5和pH 5.5中制备的20μl植酸钠底物(C₆H₆Na₁₂O₂₄P₆,FW:923.81)。将反应在24℃，150rpm温育30分钟。用50μl 5％w/v三氯乙酸淬灭反应。向96孔浅孔微量滴定板的每个孔添加100μl着色试剂。该着色剂是通过混合四体积的5.5％硫酸中的2.5％钼酸铵溶液和1体积2.7％硫酸亚铁溶液新鲜制备的。摇动板30秒后，将它们以4000rpm离心2分钟。然后用100μl水稀释离心板的每个孔中的100μl上清液，并在700nm读取吸光度。在相同条件下将变体的酶活性与亲本比较以测定活性改善(图5和6)。

XVI.实施例6：具有温度处理的酶测定法

使用0.1M乙酸钠，pH4.5和pH5.5将来自实施例4的裂解物稀释90倍。将50μl稀释的裂解物转移至PCR板，并在热循环仪中在58℃或66℃(G1)、66℃(G2)和70.2℃(G3)下加热5分钟以鉴定改善的变体。在96孔浅孔微量滴定板中，将30μl处理的裂解物添加至0.1M乙酸钠，pH 5.5中制备的20μl植酸钠底物(C₆H₆Na₁₂O₂₄P₆,FW:923.81)。将反应在37℃，150rpm温育30分钟。用50μl5％w/v三氯乙酸淬灭反应。向96孔浅孔微量滴定板的每个孔加入100μl着色试剂。该着色剂是通过混合四体积的5.5％硫酸中的2.5％钼酸铵溶液和1体积2.7％硫酸亚铁溶液新鲜制备的。摇动板30秒后，将它们以4000rpm离心2分钟。然后用100μl水稀释来自离心板的每个孔中的100μl上清液，并在700nm读取吸光度。在pH/温度处理后，在相同条件下将变体的酶活性与亲本进行比较以测定pH耐受性和热稳定性的改善。最佳第1代变体G2P在pH4.5和pH5.5时分别比第1代亲本G1P显示12和20倍改善(图6)。最佳第2代变体G3P在pH5.5时比第2代亲本G2P显示2倍改善(图7)。最佳第3代G4P变体在pH5.5时比第3代亲本G3P显示4倍的改善(图8)。

XVII.实施例7：温度梯度测定法中的变体的验证

根据改善的pH耐受性和热稳定性选择来自每代的顶部变体。然后遵循实施例6中描述的方案，在pH 4.5和/或5.5下，将最佳变体在55℃-75℃或63℃-75℃范围内的温度梯度处理5分钟。图10分别显示了在pH4.5和5.5下G1P、G2P和G3P变体的热稳定性概况。在这两种pH下，G1P维持100％活性直到57℃。G2P维持100％活性直至64℃，而G3P直至68℃是稳定的。图12分别显示了在pH 5.5下G1P、G2P、G3P和G4P变体的热稳定性概况。

Claims (19)

1.包含变体植酸酶的组合物，所述变体植酸酶与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：255、159、354、1、30、36、39、55、60、65、69、73、74、79、85、101、109、111、116、118、120、137、138、139、141、146、157、176、180、183、184、185、186、189、233、245、276、282、288、291、295、297、311、315、341、363、369、370、380、383、385和402。

2.包含变体植酸酶的组合物，所述变体植酸酶与SEQ ID NO:1相比包含至少一个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：255、159、354、1、30、36、39、55、60、65、69、73、74、79、85、101、109、111、116、118、120、137、138、139、141、146、157、176、180、183、184、185、186、189、233、245、276、282、288、291、295、297、311、315、341、363、369、370、380、383、385和402，其中所述变体植酸酶在选自下组的条件下与SEQ ID NO:1相比具有好至少1.1倍的活性：于58℃的热稳定性、于66℃的热稳定性、于pH 4.5的pH稳定性和于pH5.5的pH稳定性。

3.根据权利要求1或2的组合物，其中所述变体植酸酶与SEQ ID NO:1至少95％相同。

4.根据权利要求1、2和3中任一项的组合物，其中所述氨基酸取代选自下组：Y255D、R159Y、F354Y、Q1S、Q1V、Q1N、Q30K、A36K、T39D、I55V、H60S、H60Q、R65H、D69N、A73D、A73E、K74D、K74P、K74L、Q79L、Q79R、Q79A、Q79G、Q79F、I85V、A101L、A109D、A109D、A109E、A109G、A109F、A109P、T111S、T111D、T111Q、A116Y、A116P、A116R、A116S、T118R、T118S、S120R、N137S、N137P、A138V、A138H、A138D、A138P、N139P、N139A、N139H、T141E、T141G、T141A、T141R、S146R、G157Q、G157N、G157L、G157R、G157A、N176K、N180T、N180E、K183R、Q184S、D185N、D185L、E186V、E186A、S189T、G233A、Y255D、T245E、M276V、H282N、H282P、A288E、A288R、A288V、V291I、T295I、V297L、G311S、E315G、E315S、L341Y、L341V、K363A、K363L、N369P、T370P、A380R、A380T、A380P、E383S、R385S、R385V、R385T、E402R、E402T、E402D、E402P和E402N。

5.根据权利要求1、2、3或4的组合物，其中所述变体植酸酶在所述位置的1处、在所述位置的2处、在所述位置的3处、在所述位置的4处、在所述位置的5处、在所述位置的6处、在所述位置的7处、在所述位置的8处、在所述位置的9处、在所述位置的10处、在所述位置的1处、在所述位置的1处、在所述位置的1处、在所述位置的1处、在所述位置的11处、在所述位置的12处、在所述位置的13处、在所述位置的14处、在所述位置的15处、在所述位置的16处、在所述位置的17处、在所述位置的18处、在所述位置的19处或在所述位置的20处具有氨基酸取代。

6.根据权利要求1、2、3或4的组合物，其中所述变体植酸酶包含氨基酸取代I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P并且与SEQ ID NO:5至少95％相同。

7.根据权利要求1、2、3或4的组合物，其中所述变体植酸酶包含氨基酸取代I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380和至少一个选自下组的另外的氨基酸取代：Q1S、Q1V、Q1N、Q30K、A36K、T39D、H60S、H60Q、R65H、D69N、A73D、A73E、K74D、K74P、K74L、Q79L、Q79R、Q79A、Q79G、Q79F、I85V、A101L、A109D、A109D、A109E、A109G、A109F、A109P、T111S、T111D、T111Q、A116Y、A116P、A116R、A116S、T118R、T118S、S120R、N137S、N137P、A138V、A138H、A138D、A138P、N139P、N139A、N139H、T141E、T141G、T141A、T141R、S146R、N176K、N180T、N180E、K183R、Q184S、D185N、D185L、E186V、E186A、S189T、G233A、Y255D、T245E、M276V、H282N、H282P、A288E、A288R、A288V、V291I、T295I、V297L、G311S、E315G、E315S、L341Y、L341V、K363A、K363L、N369P、T370P、E383S、R385S、R385V、R385T、E402R、E402T、E402D、E402P和E402N。

8.根据权利要求1、2、3或4的组合物，其中所述变体植酸酶包含氨基酸取代H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P和至少一个选自下组的另外的氨基酸取代：Q1S、Q1V、Q1N、Q30K、A36K、T39D、I55V、R65H、A73D、A73E、Q79L、Q79R、Q79A、Q79G、Q79F、I85V、A101L、A109D、A109D、A109E、A109G、A109F、A109P、T111S、T111D、T111Q、A116Y、A116P、A116R、A116S、T118R、T118S、A138V、A138H、A138D、A138P、N139P、N139A、N139H、T141E、T141G、T141A、T141R、S146R、G157Q、G157N、G157L、G157R、G157A、R159Y、N176K、N180T、N180E、K183R、Q184S、D185N、D185L、E186V、E186A、S189T、G233A、Y255D、T245E、Y255D、M276V、H282N、H282P、A288E、A288R、A288V、V291I、T295I、V297L、G311S、E315G、E315S、L341Y、L341V、F354Y、K363A、K363L、N369P、T370P、A380R、A380T、A380P、E383S、R385S、R385V、R385T、E402R、E402T、E402D、E402P和E402N。

9.根据权利要求1、2、3或4的组合物，其中所述变体植酸酶包含氨基酸取代I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P和至少一个选自下组的另外的氨基酸取代：Q1S、Q1V、Q1N、Q30K、A36K、T39D、R65H、A73D、A73E、Q79L、Q79R、Q79A、Q79G、Q79F、I85V、A101L、A109D、A109D、A109E、A109G、A109F、A109P、T111S、T111D、T111Q、A116Y、A116P、A116R、A116S、T118R、T118S、A138V、A138H、A138D、A138P、N139P、N139A、N139H、T141E、T141G、T141A、T141R、S146R、N176K、N180T、N180E、K183R、Q184S、D185N、D185L、E186V、E186A、S189T、G233A、T245E、Y255D、M276V、H282N、H282P、A288E、A288R、A288V、V291I、T295I、V297L、G311S、E315G、E315S、L341Y、L341V、K363A、K363L、N369P、T370P、E383S、R385S、R385V、R385T、E402R、E402T、E402D、E402P和E402N。

10.根据权利要求1、2、3或4的组合物，其中所述变体植酸酶包含氨基酸取代I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P并且与SEQ ID NO:7至少95％相同。

11.根据权利要求1、2、3或4的组合物，其中所述变体植酸酶包含氨基酸取代N139A/N176K/D185N/E402D和至少一个选自下组的另外的氨基酸取代：Q1S、Q1V、Q1N、Q30K、A36K、T39D、I55V、H60S、H60Q、R65H、D69N、A73D、A73E、K74D、K74P、K74L、Q79L、Q79R、Q79A、Q79G、Q79F、I85V、A101L、A109D、A109D、A109E、A109G、A109F、A109P、T111S、T111D、T111Q、A116Y、A116P、A116R、A116S、T118R、T118S、S120R、N137S、N137P、A138V、A138H、A138D、A138P、T141E、T141G、T141A、T141R、S146R、G157Q、G157N、G157L、G157R、G157A、R159Y、N180T、N180E、K183R、Q184S、E186V、E186A、S189T、G233A、Y255D、T245E、M276V、H282N、H282P、A288E、A288R、A288V、V291I、T295I、V297L、G311S、E315G、E315S、L341Y、L341V、F354Y、K363A、K363L、N369P、T370P、A380R、A380T、A380P、E383S、R385S、R385V和R385T。

12.根据权利要求1、2、3或4的组合物，其中所述变体植酸酶包含氨基酸取代I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/N139A/N176K/D185N/E402D和至少一个选自下组的另外的氨基酸取代：Q1S、Q1V、Q1N、Q30K、A36K、T39D、R65H、A73D、A73E、Q79L、Q79R、Q79A、Q79G、Q79F、I85V、A101L、A109D、A109D、A109E、A109G、A109F、A109P、T111S、T111D、T111Q、A116Y、A116P、A116R、A116S、T118R、T118S、A138V、A138H、A138D、A138P、T141E、T141G、T141A、T141R、S146R、N180T、N180E、K183R、Q184S、E186V、E186A、S189T、G233A、T245E、M276V、H282N、H282P、A288E、A288R、A288V、V291I、T295I、V297L、G311S、E315G、E315S、L341Y、L341V、K363A、K363L、N369P、T370P、E383S、R385S、R385V和R385T。

13.根据权利要求1、2、3或4的组合物，其中所述变体植酸酶包含氨基酸取代I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/N139A/N176K/D185N/E402D并且与SEQ ID NO:9至少95％相同。

14.根据权利要求1、2、3或4的组合物，其中所述变体植酸酶具有选自下组的氨基酸取代组：N139H/K183R、R159Y/Y255D/V291I/V297L/G311S、I55V/Y255D/G311S/F354Y、G233A/Y255D/V291I、I85V/G157Q/V291I/V297L/G311S/F354Y、A101L/Y255D、I55V/I85V/Y255D/V291I、I55V/F354Y、I55V/I85V/Y255D/V291I/F354Y、R159Y/Y255D/V291I、A101L/R159Y/S189T/T295I/F354Y、Q30K/I85V/Y255D/A380P、G157Q/R159Y、I55V/I85V/S189T/G233A/Y255D/F354Y/A380P、I55V/I85V/S189T/V297L/G311S、I55V/I85V/A101L/G157Q/G233A/F354Y、I55V/G157Q/Y255D/V291I/V297L/F354Y、I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P、I55V/R159Y/Y255D/V297L/A380P、I55V/I85V/G157Q/G233A/Y255D/V297L/F354Y、I55V/A101L/G157Q/Y255D/V297L、I55V/A101L/G157Q/Y255D/F354Y、I55V/V291I/V297L、I55V/I85V/A101L/R159Y/S189T/Y255D/F354Y、I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/D69N/T111D/N137P、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/N137S/T141A、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/N137P/A138V、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/K74D/N137P/A138V/T141E、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/T111D/T141A、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N137S/A138V/T141E、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/K74P/N137S/T141E、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/D69N/K74P、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/K74P、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/T111D/S120R、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60Q/K74D/T111D/S120R、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/D69N/K74D、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60Q/D69N/N137S/A138V、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/K74D/Q157A、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60Q/K74D/N137P/T141A、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/N137P/T141E/Q157A、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/S120R/N137P/A138V、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60Q、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/T141A、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74P、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N137P/A138V、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/K74D、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/D69N/N137P/A138V/T141E、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/K74P/T111D/S120R/T141A、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N137P/T141A、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N137P/A138V/T141E、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/K74D、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60S/T111D/S120R、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60S/D69N/S120R/N137S/T141A、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q/N137P/A138V/T141A、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/Q157L、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/S120R/N137P、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60Q、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/S120R、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/S120R/N137S/A138V/Q157L、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/K74Y/S120R/A138V、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/D69N/S120R/T141A、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/S120R、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/K74D、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/T111D、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/H60S、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/K74D/T141E、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/T111D/T141E/Q157N、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/K74D/T111D/S120R/T141E/Q157N、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T39D/K74D/S120R/T141E、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T141E、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/S120R/Q157N、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/K74D/S120R、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/T111D/S120R/T141E、

I55V/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/H60S/R65H、

I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N139A/N176K/D185N/E402D、

I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N176K/D185N/H282N/R385T、

I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N176K/D185N/K363A/R385T/E402T、

I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N139H/N176K/D185N/H282N/A288R/E315G/R385T、

I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/N139A/N176K/A288R/E315G、和

I55V/H60Q/D69N/K74D/S120R/N137P/G157Q/R159Y/Y255D/F354Y/A380P/D185N/H282N/A288R/E315G。

15.根据前述权利要求中任一项的组合物，其还包含动物饲料。

16.编码权利要求1至13中任一项的植酸酶的核酸。

17.包含权利要求15的核酸的表达载体。

18.包含权利要求16的表达载体的宿主细胞。

19.生成植酸酶的方法，其包括在产生所述植酸酶的条件下培养权利要求17的宿主细胞，并且回收所述酶。