CN109312320A - 2g16葡糖淀粉酶组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的葡糖淀粉酶。

Description

2G16葡糖淀粉酶组合物和方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求35U.S.C.§120下的优先权作为2016年8月5日提交的美国专利申请15/230,292的部分继续申请，其通过引用明确完整并入本文。
序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用完整并入本文。2016年12月5日创建的所述ASCII拷贝命名为5004_ST25.txt，并且大小为1,374千字节。
发明领域
本发明涉及变体葡糖淀粉酶、编码变体葡糖淀粉酶的多核苷酸、生成变体葡糖淀粉酶的方法、以及使用该变体葡糖淀粉酶的方法。还描述了本发明的葡糖淀粉酶用于改变淀粉转化以产生发酵产物如乙醇和糖浆如葡萄糖以及动物原料的用途。本发明还涉及包含本发明的一种或多种变体葡糖淀粉酶的组合物。
发明背景
葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)是一种催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原末端释放D-葡萄糖的酶。葡糖淀粉酶由几种丝状真菌和酵母产生，曲霉属(Aspergillus)的那些通常对商业目的最重要。
商业上使用葡糖淀粉酶将已经由α-淀粉酶部分水解的含淀粉的材料转化为葡萄糖。然后，可以使用发酵生物体将葡萄糖直接或间接转化为发酵产物。商业发酵产物的实例包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-D-葡萄糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)和更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素、B12、β-胡萝卜素)；激素和其他难以合成产生的化合物。发酵方法也常用于可饮用的酒精(例如啤酒和葡萄酒)、乳制品(例如，在生产酸奶和奶酪中)业中。
最终产物也可以是糖浆。例如，最终产物可以是葡萄糖，但也可以例如通过葡萄糖异构酶转化为果糖或几乎同等地由葡萄糖和果糖组成的混合物。此种混合物或进一步富含果糖的混合物是全世界商业化的最常用的高果糖玉米糖浆(HFCS)。
最终产物也可以是饲喂农业动物的商业原料。此外，葡糖淀粉酶在食品、纺织和制药业中具有重要应用。例如，在食品业中，葡糖淀粉酶用于改善面包皮的颜色并产生低卡路里啤酒。当与其他酶的混合物一起使用时，葡糖淀粉酶的另一个关键应用是作为消化助剂。
然而，本领域仍需要具有增加的活性、热活性、热稳定性和pH稳定性的变体葡糖淀粉酶。本发明满足了此种需要，并提供了与亲本葡糖淀粉酶相比具有改善性质的变体葡糖淀粉酶。
本发明的一个目的是提供具有葡糖淀粉酶活性的变体葡糖淀粉酶和编码变体葡糖淀粉酶的多核苷酸以及在各种方法中使用变体葡糖淀粉酶的方法。
发明概述
因此，本发明提供了分离的野生型葡糖淀粉酶以及变体葡糖淀粉酶和其使用方法。
在一方面，本发明提供了核酸构建体，其包含与外源构建体序列，例如外源启动子和/或选择基因可操作地连接的编码SEQ ID NO:1的核酸。
在另一方面，包含编码SEQ ID NO:1的核酸的核酸构建体是染色体外表达载体，并且可以包含复制起点和/或选择基因。
在又一方面，核酸构建体是整合表达载体。
在另外的方面，本发明提供了宿主细胞，其包含编码SEQ ID NO:1的核酸，其中所述宿主细胞不是Thielaviopsis punctuala细胞。宿主细胞还可以包含与编码SEQ ID NO:1的核酸可操作地连接的外源启动子和选择基因。
在又一方面，本发明提供了生成宿主细胞的方法，包括用核酸构建体转化细胞，使得宿主细胞表达SEQ ID NO:1。核酸构建体可以是染色体外表达载体，从而产生葡糖淀粉酶，其可以任选地从细胞培养基中回收。
在另外的方面，本发明提供了从淀粉底物的碳水化合物糖化的方法，包括使底物与SEQ ID NO:1的葡糖淀粉酶接触，其中降解淀粉。
在另外的方面，本发明提供了包含变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:1相比的至少一个氨基酸取代，其中氨基酸取代在选自下组的位置编号处：14,23,30,31,35,36,39,44,49,50,51,53,69,83,98,111,117,118,119,121,147,157,179,186,197,250,262,284,286,287,288,300,309,311,317,347,362,385,388,400,413,415,419,423,434,457,463,516,526,530,533,534,535,540,545,547,553,555,564,572,576,577,581,583,585和588。在此方面的一些实施方案中，变体酶与SEQ ID NO:1,SEQID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:207,SEQ ID NO:307和SEQ ID NO:361中的一种或多种是至少95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的。在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:1不是100％相同的。
在另外的方面，本发明提供了包含变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶包含与SEQ ID NO:1相比的至少一个氨基酸取代，其中氨基酸取代在选自下组的位置编号处：14,23,30,31,35,36,39,44,49,50,51,53,69,83,98,111,117,118,119,121,147,157,179,186,197,250,262,284,286,287,288,300,309,311,317,347,362,385,388,400,413,415,419,423,434,457,463,516,526,530,533,534,535,540,545,547,553,555,564,572,576,577,581,583,585和588，其中变体葡糖淀粉酶在选自下组的条件下与SEQ ID NO:1相比具有好至少1.1倍的活性：于40℃的活性和热活性、于57℃的热稳定性、于59℃的热稳定性、于62℃的热稳定性、于67℃的热稳定性和于72℃的热稳定性。在此方面的一些实施方案中，变体酶与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:207,SEQ ID NO:307和SEQ ID NO:361中的一种或多种是至少95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的。在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:1不是100％相同的。
在又一方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶，所述变体葡糖淀粉酶包含与SEQ IDNO:1相比的至少一个氨基酸取代，其中氨基酸取代选自下组：S14Q,K23N,K23R,K23Y,S30D,S30N,S30P,T31E,T31K,T31N,T31Q,A35L,S36R,S39A,L44I,T49K,T49R,S50E,S50I,S50N,S50Y,N51D,D53N,I69L,I69M,E83K,T98S,A111G,A117P,A117V,D118N,L119M,Q121A,Q121P,Y147W,C157W,Y179F,P186Y,Y197H,S250D,S250E,S250K,A262S,Q284H,I286A,T287N,T288H,A300L,A300Q,T309D,T309E,T309Q,L311V,A317K,L347K,T362A,S385L,S385Q,T388I,T388K,T388Y,T400K,N413S,A415D,A415F,A415N,A415S,A415T,A415W,A415Y,Q419P,Q423M,Q423P,S434T,G457N,G457P,T463F,F516L,L526F,S530E,S530G,T533K,A534L,S535E,S535G,S535K,S535T,T540A,T540S,V545L,Q547A,Q547H,F553Y,F555Y,I564F,K572E,V576I,V576L,G577R,T581I,T581K,V583F,V585P和S588Q，其中所述变体葡糖淀粉酶在选自下组的条件下与SEQ ID NO:1相比具有好至少1.1倍的活性：于40℃的活性和热活性、于57℃的热稳定性、于59℃的热稳定性、于62℃的热稳定性、于67℃的热稳定性和于72℃的热稳定性。在此方面的一些实施方案中，变体酶与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQID NO:5,SEQ ID NO:207,SEQ ID NO:307和SEQ ID NO:361中的一种或多种是至少95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的。在一些实施方案中，the变体葡糖淀粉酶与SEQ IDNO:1不是100％相同的。
在另外的方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:1的亲本葡糖淀粉酶是至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％但小于100％同一性。
在另外的方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:3的亲本葡糖淀粉酶是至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一性。
在另外的方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:5的亲本葡糖淀粉酶是至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一性。
在另外的方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:207的亲本葡糖淀粉酶是至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一性。
在另外的方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:307的亲本葡糖淀粉酶是至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一性。
在另外的方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:361的亲本葡糖淀粉酶是至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一性。
在又一方面，组合物包含变体葡糖淀粉酶，其在所述位置的1处、在所述位置的2处、在所述位置的3处、在所述位置的4处、在所述位置的5处、在所述位置的6处、在所述位置的7处、在所述位置的8处、在所述位置的9处、在所述位置的10处、在所述位置的1处、在所述位置的1处、在所述位置的1处、在所述位置的1处、在所述位置的11处、在所述位置的12处、在所述位置的13处、在所述位置的14处、在所述位置的15处、在所述位置的16处、在所述位置的17处、在所述位置的18处、在所述位置的19处或在所述位置的20处具有氨基酸取代。
在又一方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代A111G。另外，酶组合物可以与SEQ ID NO:3是至少95％,98％,99％或100％相同的。在一些方面，变体葡糖淀粉酶具有SEQ ID NO:3。
在又一些方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶包含A111G和至少一个选自下组的氨基酸取代：S14Q,K23N,K23R,K23Y,S30D,S30N,S30P,T31E,T31K,T31N,T31Q,A35L,S36R,S39A,L44I,T49K,T49R,S50E,S50I,S50N,S50Y,N51D,D53N,I69L,I69M,E83K,T98S,A117P,A117V,D118N,L119M,Q121A,Q121P,Y147W,C157W,Y179F,P186Y,Y197H,S250D,S250E,S250K,A262S,Q284H,I286A,T287N,T288H,A300L,A300Q,T309D,T309E,T309Q,L311V,A317K,L347K,T362A,S385L,S385Q,T388I,T388K,T388Y,T400K,N413S,A415D,A415F,A415N,A415S,A415T,A415W,A415Y,Q419P,Q423M,Q423P,S434T,G457N,G457P,T463F,F516L,L526F,S530E,S530G,T533K,A534L,S535E,S535G,S535K,S535T,T540A,T540S,V545L,Q547A,Q547H,F553Y,F555Y,I564F,K572E,V576I,V576L,G577R,T581I,T581K,V583F,V585P和S588Q。
在另外的方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶氨基酸取代S30P/A111G。另外，组合物可以与SEQ ID NO:5是至少95％,98％,99％或100％相同的。在一些方面，变体葡糖淀粉酶具有SEQ ID NO:5。
在又一些方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶包含S30P/A111G和至少一个选自下组的氨基酸取代：S14Q,K23N,K23R,K23Y,T31E,T31K,T31N,T31Q,A35L,S36R,S39A,L44I,T49K,T49R,S50E,S50I,S50N,S50Y,N51D,D53N,I69L,I69M,E83K,T98S,A117P,A117V,D118N,L119M,Q121A,Q121P,Y147W,C157W,Y179F,P186Y,Y197H,S250D,S250E,S250K,A262S,Q284H,I286A,T287N,T288H,A300L,A300Q,T309D,T309E,T309Q,L311V,A317K,L347K,T362A,S385L,S385Q,T388I,T388K,T388Y,T400K,N413S,A415D,A415F,A415N,A415S,A415T,A415W,A415Y,Q419P,Q423M,Q423P,S434T,G457N,G457P,T463F,F516L,L526F,S530E,S530G,T533K,A534L,S535E,S535G,S535K,S535T,T540A,T540S,V545L,Q547A,Q547H,F553Y,F555Y,I564F,K572E,V576I,V576L,G577R,T581I,T581K,V583F,V585P和S588Q。
在另外的方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代K23R/S30P/S39A/T49K/A111G/L119M/Q423P。另外，组合物可以与SEQ ID NO:207是至少95％,98％,99％或100％相同的。在一些方面，变体葡糖淀粉酶具有SEQ ID NO:207。
在又一些方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶包含K23R/S30P/S39A/T49K/A111G/L119M/Q423P和至少一个选自下组的氨基酸取代：S14Q,T31E,T31K,T31N,T31Q,A35L,S36R,L44I,S50E,S50I,S50N,S50Y,N51D,D53N,I69L,I69M,E83K,T98S,A117P,A117V,D118N,Q121A,Q121P,Y147W,C157W,Y179F,P186Y,Y197H,S250D,S250E,S250K,A262S,Q284H,I286A,T287N,T288H,A300L,A300Q,T309D,T309E,T309Q,L311V,A317K,L347K,T362A,S385L,S385Q,T388I,T388K,T388Y,T400K,N413S,A415D,A415F,A415N,A415S,A415T,A415W,A415Y,Q419P,S434T,G457N,G457P,T463F,F516L,L526F,S530E,S530G,T533K,A534L,S535E,S535G,S535K,S535T,T540A,T540S,V545L,Q547A,Q547H,F553Y,F555Y,I564F,K572E,V576I,V576L,G577R,T581I,T581K,V583F,V585P和S588Q。
在另外的方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P。另外，组合物可以与SEQ ID NO:307是至少95％,98％,99％或100％相同的。在一些方面，变体葡糖淀粉酶具有SEQ ID NO:307。
在又一些方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶包含K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P和至少一个选自下组的氨基酸取代：S14Q,T31E,T31K,T31N,T31Q,A35L,S36R,S50E,S50I,S50N,S50Y,D53N,I69L,I69M,E83K,T98S,D118N,Q121A,Q121P,Y147W,C157W,Y179F,P186Y,Y197H,S250D,S250E,S250K,A262S,Q284H,I286A,T287N,T288H,A300L,A300Q,T309D,T309E,T309Q,L311V,A317K,L347K,T362A,S385L,S385Q,T388I,T388K,T388Y,T400K,A415D,A415F,A415N,A415S,A415T,A415W,A415Y,Q419P,S434T,G457N,G457P,T463F,F516L,L526F,S530E,S530G,T533K,A534L,S535E,S535G,S535K,S535T,T540A,T540S,V545L,Q547A,Q547H,F553Y,F555Y,I564F,K572E,V576I,V576L,G577R,T581I,T581K,V583F,V585P和S588Q。
在另外的方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/Q121P/T309D/A415Y/N413S/Q423P。另外，组合物可以与SEQ ID NO:361是至少95％,98％,99％或100％相同的。在一些方面，变体葡糖淀粉酶具有SEQ ID NO:361。
在又一些方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶包含K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/Q121P/T309D/A415Y/N413S/Q423P和至少一个选自下组的氨基酸取代：S14Q,T31E,T31K,T31N,T31Q,A35L,S36R,S50E,S50I,S50N,S50Y,D53N,I69L,I69M,E83K,T98S,D118N,Y147W,C157W,Y179F,P186Y,Y197H,S250D,S250E,S250K,A262S,Q284H,I286A,T287N,T288H,A300L,A300Q,L311V,A317K,L347K,T362A,S385L,S385Q,T388I,T388K,T388Y,T400K,Q419P,S434T,G457N,G457P,T463F,F516L,L526F,S530E,S530G,T533K,A534L,S535E,S535G,S535K,S535T,T540A,T540S,V545L,Q547A,Q547H,F553Y,F555Y,I564F,K572E,V576I,V576L,G577R,T581I,T581K,V583F,V585P和S588Q。
在另外的方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶，其与SEQ ID NO:1相比具有选自下组的氨基酸取代：A111G/Q547A,A111G,A111G/Y179F,I69M/A111G/Q547H,I69L/A111G,A111G/Q419P,A111G/F555Y,I69L/A111G/Q547A,A111G/L311V,A111G/I286A/T288H/L311V/F516L/Q547A,Q547A,A111G/F516L/F555Y,A111G/A262S/Q547A,A111G/Y179F/A262S,A111G/Y147W,A117V/I564V,T98S/A117V/I564V,A117V,A117V/Q284H/T287N/I564V,I564V,T98S/A117V,V545L,A117V/F553Y,A117V/S434T,A117V/Y197H/V545L,T98S/A117V/F553Y,S30N/A111G,T49R/A111G,L44I/A111G,A111G/A117P,S30P/A111G,K23N/A111G,T31N/A111G,T31E/A111G,D53N/A111G,N51D/A111G,S39A/A111G,K23R/A111G,A35L/A111G,T31Q/A111G,T31K/A111G,S50I/A111G,S50Y/A111G,T49K/A111G,K23Y/A111G,S50E/A111G,S36R/A111G,S30D/A111G,A111G/S530E,A111G/T540S,A111G/S535E,A111G/S530G,A111G/T533K,A111G/A534L,A111G/S535T,A111G/Q423P,A111G/Q423M,A111G/Q121A,A111G/S535G,A111G/T540A,A111G/L119M,A111G/Q121P,A111G/S535K,A111G/V585P,A111G/V583F,A111G/G577R,A111G/T581K,A111G/V576I,A111G/K572E,A111G/V576L,A111G/S588Q,A111G/T581I,S30P/A111G/N413S,S30P/A111G/N413D,S30P/A111G/T362A,S30P/A111G/G457P,S30P/A111G/T463F,S30P/A111G/A317K,S30P/A111G/T388K,S30P/A111G/T388I,S30P/A111G/T388Y,S30P/A111G/G457N,S30P/A111G/P186Y,S30P/A111G/K23R/S39A/N51D,S30P/A111G/K23R/S39A/S50E/L119M/Q121P,S30P/A111G/K23R/T49K/S50E,S30P/A111G/K23R/S50E/N51D/A117V/L119M,S30P/A111G/L119M/Q121A,S30P/A111G/S39A/S50I/N51D/Q423P,S30P/A111G/Q423P,S30P/A111G/K23R/Q423P,S30P/A111G/A117P,S30P/A111G/S39A/A117V,S30P/A111G/S39A/T49R/L119M,S30P/A111G/T49K/Q423P,S30P/A111G/N51D/L119M,S30P/A111G/A117V/L119M/Q121P/Q423P,S30P/A111G/T49R/A117P/L119M,S30P/A111G/L119M,S30P/A111G/S39A/T49R/S50I/N51D,S30P/A111G/A117V,S30P/A111G/S39A,S30P/A111G/K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P,S30P/A111G/K23R/T49R,S30P/A111G/K23R/N51D/L119M/Q121P,S30P/A111G/L44I/A117V/L119M,S30P/A111G/T31K/L119M/Q423P,S30P/A111G/L44I,S30P/A111G/A415N,S30P/A111G/T400K,S30P/A111G/A415D,S30P/A111G/A415Y,S30P/A111G/L347K,S30P/A111G/A415T,S30P/A111G/A415W,S30P/A111G/A415F,S30P/A111G/T309Q,S30P/A111G/S385L,S30P/A111G/S385Q,S30P/A111G/S250E,S30P/A111G/T309E,S30P/A111G/T309D,S30P/A111G/S14Q,S30P/A111G/S250D,S30P/A111G/S250K,S30P/A111G/A300Q,S30P/A111G/A300L,K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/T31E/N51D/Q121P,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/N413D,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/N51D,K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/L44I/A117V,K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/Q121P/N413S,K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/N413D,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/N51D/N413S,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/A117V/N413S,K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/T31E/L44I/N51D/A117V,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/N51D/N413D,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/L44I/N51D/N413D,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/S50N/N51D/C157W,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/N51D,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/L44I/N51D,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/L44I/A117V,K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/L44I/N51D/A117V/Q121A,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/L44I/A117V,K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/L44I/N51D/A117V,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/L44I/N51D/A117V/N413S,K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/A117V/Q121A/N413D,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/L44I/A117V/Q121P,K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/N51D,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/L44I/Q121P/N413S,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/L44I/Q121P,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/L44I/N413S,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/L44I/N51D/A117V/N413S,K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/N51D/A117V/N413S,K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/N51D/N413S,K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/L44I,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T31E/Q121A/S413D,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/Q121P/S413D/A415N,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/A415W,K23R/S30P/S39A/T49K/A111G/L119M/Q423P/A415F,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T309D/A415S,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T309E,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T309E/A415W,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/A415D,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/E83K/D118N/,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/R49K,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T31E/A415F,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/A415Y,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T31E/T309E/A415W,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T31E/R49K/Q121A/A415W,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T31E/A415Y,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/R49K/T309E/A415D,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T31E/R49K/T309D/A415F/L526F,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T31E/T309D,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/Q121P/T309E/A415F,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/S413D/A415N,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T31E/Q121P/A415Y,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/Q121A/A415Y,K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T309D/A415W和K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/Q121P/T309D/A415Y。
在另外的方面，本发明提供了酶活性变体葡糖淀粉酶，其具有序列：
SPVSKRATLDEFI-X14-TERPLALE-X23-LLCNIG-X30-X31-GCR-X35-X36-GA-X39-SGVV-X44-ASPS-X49-X50-X51-P-X53-YYYTWTRDAALVFKE-X69-VDSVETNTTLLLP-X83-IENYVTAQAYLQTV-X98-NPSGSLSDGAGL-X111-EPKFN-X117-X118-X119-T-X121-FTGAWGRPQRDGPALRATAMIAYYN-X147-LLNNNATTD-X157-GLWQIIQNDLNYVAQYWNQTG-X179-DLWEEV-X186-GSSFFTVAAQ-X197-RALVEGSTLAAKLGKSHSAYDTVAPQILCYLQSFWSSSKGYIVANTQTASWV-X250-RSGLDANTPLT-X262-IHLFDPELGCDDSTFQPCSPK-X284-L-X286-X287-X288-KKLVDSFRSIY-X300-INSGKSAG-X309-A-X311-AVGRY-X317-EDVYYNGNPWYLCTLAVAEQLYDAVYTWK-X347-EGSITVTSVSLPFF-X362-DLLPSLTTGTYASGSTTFESII-X385-AV-X388-TYADGFVSIVQ-X400-YTPSDGALSEQY-X413-K-X415-NGQ-X419-LSA-X423-DLTWSYAAFL-X434-ATERRDSVVPAGWAGASSVSVP-X457-ACAAT-X463-VVGTYAAASNCGTPGSGSGGNGGSSGNALVTFNELATTYYGENIKLVGSTAA-X516-GSWSPSAGI-X526-LSA-X530-SY-X533-X534-X535-NPLW-X540-TTVS-X545-P-X547-GSTVE-X553-K-X555-IRVGSDGS-X564-TWESGNN-X572-VLT-X576-X577-SSA-X581-S-X583-T-X585-SA-X588-WNGAYSVSSS，其中X14选自下组：S和Q；X23选自下组：K,N,R和Y；X30选自下组：S,D,N和P；X31选自下组：T,E,K,N和Q；X35选自下组：A和L；X36选自下组：S和R；X39选自下组：S和A；X44选自下组：L和I；X49选自下组：T,K和R；X50选自下组：S,E,I,N和Y；X51选自下组：N和D；X53选自下组：D和N；X69选自下组：I,L和M；X83选自下组：E和K；X98选自下组：T和S；X111选自下组：A和G；X117选自下组：A,P和V；X118选自下组：D和N；X119选自下组：L和M；X121选自下组：Q,A和P；X147选自下组：Y和W；X157选自下组：C和W；X179选自下组：Y和F；X186选自下组：P和Y；X197选自下组：Y和H；X250选自下组：S,D,E和K；X262选自下组：A和S；X284选自下组：Q和H；X286选自下组：I和A；X287选自下组：T和N；X288选自下组：T和H；X300选自下组：A,L和Q；X309选自下组：T,D,E和Q；X311选自下组：L和V；X317选自下组：A和K；X347选自下组：L和K；X362选自下组：T和A；X385选自下组：S,L和Q；X388选自下组：T,I,K和Y；X400选自下组：T和K；X413选自下组：N和S；X415选自下组：A,D,F,N,S,T,W和Y；X419选自下组：Q和P；X423选自下组：Q,M和P；X434选自下组：S和T；X457选自下组：G,N和P；X463选自下组：T和F；X516选自下组：F和L；X526选自下组：L和F；X530选自下组：S,E和G；X533选自下组：T和K；X534选自下组：A和L；X535选自下组：S,E,G,K和T；X540选自下组：T,A和S；X545选自下组：V和L；X547选自下组：Q,A和H；X553选自下组：F和Y；X555选自下组：F和Y；X564选自下组：I和F；X572选自下组：K和E；X576选自下组：V,I和L；X577选自下组：G和R；X581选自下组：T,I和K；X583选自下组：V和F；X585选自下组：V和P；X588选自下组：S和Q；且其中变体不是SEQ ID NO:1。
在另外的方面，变体葡糖淀粉酶包含选自SEQ ID NO:1至361的奇数编辑序列的氨基酸序列。
在另外的方面，本发明提供了变体葡糖淀粉酶的组合物，其进一步包含动物饲料。
在又一方面，本发明提供了编码本发明的变体葡糖淀粉酶的核酸。
在另外的方面，本发明提供了表达载体，其包含编码本发明的变体葡糖淀粉酶的核酸。
在又一方面，本发明提供了包含本发明的表达载体或核酸的宿主细胞。
在另外的方面，本发明提供了生成变体葡糖淀粉酶的方法，包括在产生变体葡糖淀粉酶的条件下培养本发明的宿主细胞，并回收酶。
在一些方面，本发明涉及具有改善的热性质，如热稳定性、加热稳定性、蒸汽稳定性、温度概况和/或造粒稳定性的葡糖淀粉酶变体，热稳定变体酶在许多实施方案中特别有用。
在另外的方面，本发明涉及具有改善的造粒稳定性和/或改善的酸稳定性的葡糖淀粉酶变体。
在另外的方面，本发明提供淀粉加工方法，包括在淀粉降解的条件下使淀粉底物与本发明的新变体葡糖淀粉酶接触。
附图简述
图1提供了关于各种葡糖淀粉酶活性对淀粉底物的活性的数据。对于该测定法，在40℃在650rpm搅拌的情况下将150μL的1％玉米淀粉相对于马铃薯淀粉(终浓度0.75％淀粉)、25μL裂解物加25μL pH5.5缓冲液一起温育18小时。将20μL温育的样品加入180μLGOPOD(葡萄糖氧化酶/过氧化物酶)，并在50℃在150RPM搅拌的情况下温育30分钟。在510nm处读取吸光度以确定释放的葡萄糖。
图2提供了关于G16G1P,G2P,G3P,G4P,G5P和G6P的热梯度的数据。对于该测定法，将50μl来自裂解物板的酶加入到96孔Biorad PCR板，并在50-90℃在热循环仪中攻击10分钟。温育10分钟后，将20μl经攻击的裂解物加入到96深孔淀粉反应板，其含有0.1M乙酸钠，pH4.5中的150μl 2％玉米淀粉(最终淀粉浓度1.5％)。使用0.1M乙酸钠缓冲液，pH4.5将最终体积调节至200μl。将板在40℃，800rpm温育22小时。在22小时时，将板以4000rpm离心5分钟，并将20μl反应上清液取出到96孔浅微量滴定板中，并且将180μl D-葡萄糖测定试剂(来自Megazyme的GOPOD测定试剂盒，目录号K-GLUC)添加到每孔。然后将板在50℃温育30分钟。温育后，在510nm处读板以监测由于淀粉分解而释放的葡萄糖。
图3提供了各种第二代变体葡糖淀粉酶的热稳定性改善数据。如实施例1中所述测定该表的值。相对于G1P野生型序列SEQ ID NO:1显示变体。显示了G2P并且它具有单一氨基酸取代A111G。
图4A和4B提供了各种第三代变体葡糖淀粉酶的热稳定性改善数据。如实施例1中所述测定该表的值。相对于G2P序列SEQ ID NO:3显示变体；即，图4中的所有变体也具有G2P修饰A111G。鉴定出G3P并且它具有另外的S30P变体，因此G3P是S30P/A111G的双重变体。
图5A和5B提供了各种第四代变体葡糖淀粉酶的热稳定性改善数据。如实施例1中所述测定该表的值。相对于G3P序列SEQ ID NO:5显示变体；即，图5中的所有变体也具有G3P修饰S30P/A111G。鉴定出G4P并且它具有另外五种变体，因此G4P是包含7种氨基酸取代K23R/S30P/S39A/T49K/A111G/L119M/Q423P的变体。
图6A和6B提供了各种第五代变体葡糖淀粉酶的热稳定性改善数据。如实施例1中所述测定该表的值。相对于G4P序列SEQ ID NO:207显示变体；即，图6中的所有变体也具有G4P修饰，包括K23R/S30P/S39A/A111G/L119M/Q423P。然而，应当注意的是，G4P内包含的49位赖氨酸是G5P中的精氨酸；因此，图6中的一些变体列为“(T/K)49R”，意味着G4P突变为精氨酸，尽管野生型残基是苏氨酸。鉴定出G5P并且具有另外五种变体，因此G5P是包含11种氨基酸取代K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P的变体。
图7提供了各种第六代变体葡糖淀粉酶的热稳定性改善数据。如实施例1中所述测定该表的值。相对于G5P序列SEQ ID NO:307显示变体；即，图7中的所有变体也具有G5P修饰，包括K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P。鉴定出G6P并且具有另外三种变体，因此G6P是包含14种氨基酸取代K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/Q121P/T309D/N413S/A415Y/Q423P的变体。
图8A和8B提供了SEQ ID NO:1(G1P),SEQ ID NO:3(G2P),SEQ ID NO:5(G3P),SEQID NO:207(G4P),SEQ ID NO:307(G5P)和SEQ ID NO:361(G6P)的葡糖淀粉酶域的示意图。含有前22个氨基酸的信号序列是双下划线的。催化域加粗并加下划线，催化残基为大斜体字体，底物结合残基为大粗体字体。注意，图6的数目包括信号肽，其不是本文概述的变体位置的编号；即，本文中的变体位置将丙氨酸(A)残基计数为成熟蛋白质的第1位。因此，催化域是图中的氨基酸42-457，但是成熟蛋白中的氨基酸20至435。类似地，图中的D202和E205催化残基在成熟编号中是D180和E183，并且底物结合残基是图中的W148，但是成熟蛋白中的W126。
图9描绘了显示本发明的一些实施方案中的一些优选变体的变体表。如本文所述，这些可以以任何组合并且与如本文概述的变体组组合。
图10A、10B、10C和10D描绘了G1P,G2P,G3P,G4P,G5P和G6P的氨基酸和核酸序列以及编码区上游的Thielaviopsis punctuala中的内源1900+碱基对序列，其含有启动子。如本领域技术人员所理解的，启动子的确切长度是未知的，启动子通常位于基因的转录位点附近，并且可以是大约100至1000个碱基对的任何长度。因此，出于本文概述的目的，启动子包括图中所示序列的至少100个上游碱基对。
发明详述
I.引言
淀粉是在许多重要食物植物来源中发现的主要碳水化合物储备聚合物，包括玉米、小麦、马铃薯、稻、木薯、燕麦等。淀粉用作生产葡萄糖的底物，所述葡萄糖继而用于生成许多产物，包括液体燃料(本文有时称为“生物燃料”)、蛋白质、糖和化学品，并广泛用于食品业中。淀粉向葡萄糖的常规转化需要液化(将固体淀粉底物转化为更可用的醪液)和糖化(将醪液分解成单糖)的两步过程。葡糖淀粉酶用于糖化反应以释放葡萄糖作为最终的终产物，其继而可用于生产食品、饮料和生物燃料。葡糖淀粉酶通常具有两个域，即用于实际转化的催化域和淀粉结合域，其允许可溶性酶至不溶性淀粉底物的相转移。
然而，许多利用葡糖淀粉酶的工业方法在通常苛刻的条件下进行，例如高温；因此，本文期望并提供热稳定性葡糖淀粉酶。令人惊讶地，发现来自Thielaviopsispunctuala KKA29558的葡糖淀粉酶具有相当大的热稳定性。
II.定义
在本文的核酸序列的上下文中，“外源的”是指外源元件在自然界中通常不与第二元件关联，因此是人工或合成的构建体。例如，编码本发明的Thielaviopsis punctualaG1P酶的野生型基因通常与其内源启动子相关联(包含在SEQ ID NO:363中，图10中所示)。因此，在许多实施方案中，本发明提供了核酸构建体，其包含与外源构建体序列如外源启动子连接的葡糖淀粉酶的编码序列。为清楚起见，通常提及“外源”是指葡糖淀粉酶而不是宿主细胞。例如，如果宿主细胞是黑曲霉(A.niger)细胞，则与葡糖淀粉酶基因可操作地连接的启动子可以对于黑曲霉是内源的，但是对葡糖淀粉酶是外源的(例如，来自黑曲霉α-淀粉酶的启动子可以连接到本发明的葡糖淀粉酶)。类似地，编码G1P酶的基因对于非T.punctuala的任何宿主细胞是外源的。因此，在一些实施方案中，本发明提供了编码与外源构建体核酸序列可操作地连接的葡糖淀粉酶(无论是野生型还是变体)两者的核酸构建体。本文的“外源构建体序列”是指通常不与编码葡糖淀粉酶的核酸关联的构建体序列(无论是氨基酸还是核酸序列，尽管如通过使用该术语的上下文将理解，通常是指核酸序列)。
可以包括在染色体外或整合表达载体中的合适构建体序列包括但不限于选择标志物、纯化标签、复制起点和调节序列，包括但不限于启动子(诱导性和组成型)、增强子、核糖体结合位点、起始密码子、终止密码子，Shine-Dalgarno序列等。
本文中的“选择标志物”或“可选择标志物”或“选择蛋白”是指导入宿主细胞中的蛋白质，其赋予在宿主细胞生长期间适于人工选择的性状，使得仅那些含有选择标志物的细胞生长。因此，选择标志物是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等的基因。下文概述选择标志物的实例。因此，“选择基因”是编码选择蛋白质的核酸。
本文中的“染色体外表达载体”(通常也称为“质粒”)是指携带感兴趣基因的自我复制表达载体(通常是质粒)，其保留在细胞内并且不整合到宿主细胞的基因组中。
本文中“整合表达载体”是指设计为插入宿主细胞基因组中的载体，有时称为“附加体”。
本文的“修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入、和/或缺失或对与蛋白质化学连接的部分的改变。例如，修饰可以是与蛋白质连接的改变的碳水化合物或PEG结构。本文中的“氨基酸修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另有说明，氨基酸修饰总是针对由DNA编码的氨基酸，例如在DNA和RNA中具有密码子的20个氨基酸。
本文中的“氨基酸取代”或“取代”是指用不同氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸。特别地，在一些实施方案中，取代针对不天然存在于特定位置处，不是天然存在于生物体内或任何生物体中的氨基酸。例如，取代E75D是指变体多肽，在此种情况下为下述葡糖淀粉酶，其中75位的谷氨酸用天冬氨酸替换。多个突变以正斜杠标记(“/”)分开，例如“A114G/I190V/S204A”，分别代表114、190和204位处的取代(在一些情况下，可以使用“+”)。为清楚起见，已经工程化改造以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将CGG(编码精氨酸)交换为CGA(仍编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管创建了编码相同蛋白质的新基因，但若蛋白质在其开始的特定位置处具有相同的氨基酸，则它不是氨基酸取代。
如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”是指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸序列。例如，-233E或233E表示在233位后且234位前插入谷氨酸。此外，-233ADE或A233ADE表示在233位后且234位前插入AlaAspGlu。
如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”是指在亲本多肽序列中的特定位置处除去氨基酸序列。例如，E233-或E233#、E233()或E233del1表示233位谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#表示233位开始的序列GluAspAla的缺失。
如本文所用，“亲本多肽”是指随后经修饰以产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽，或天然存在的多肽的变体或工程化形式。亲本多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物、或编码它的氨基酸序列。在本情况下，一些实施方案利用G1P、G2P、G3P、G4P、G5P或G6P作为亲本多肽，前者是优选的。
如本文所用，“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”是指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本蛋白质不同的蛋白质。蛋白质变体可以指蛋白质本身、包含蛋白质的组合物、或编码它的氨基酸序列。优选地，与亲本蛋白质相比，蛋白质变体具有至少一个氨基酸修饰，例如，与亲本相比约1至约70个氨基酸修饰，且优选约1至约5个氨基酸修饰。如下所述，在一些实施方案中，亲本多肽是本文称为“G1P”的野生型序列。如下文进一步讨论的，本文的蛋白质变体序列优选与亲本蛋白质序列拥有至少约80％的同一性，最优选至少约90％的同一性，更优选至少约95-98-99％的同一性。变体蛋白质可以指变体蛋白质本身、包含蛋白质变体的组合物、或编码它的DNA序列。因此，本文的“变体葡糖淀粉酶”是指与亲本植物酶相比在氨基酸序列中具有至少一个氨基酸修饰的新葡糖淀粉酶。如本文所讨论，在一些情况下，亲本葡糖淀粉酶是第二代或更高代的变体；也就是说，如图3所示，与野生型G1P亲本相比，G2P葡糖淀粉酶具有1个氨基酸取代。然而，如图4所示，与G2P亲本相比，G3P具有1个氨基酸取代，但与G1P相比总共有2个氨基酸取代。除非另有说明或从上下文中显而易见，通常将本发明的变体葡糖淀粉酶与野生型G1P序列进行比较。另外，除非另有说明，本发明的变体植物酶具有酶活性，即，使用实施例1和下文中所述的葡糖淀粉酶测定法，使用没有温度处理的测定法，存在可检测的植物酶活性。
如本文所用，“蛋白质”在本文中是指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。肽基基团通常包含天然存在的氨基酸和肽键。另外，多肽可以包括一个或多个侧链或末端的合成衍生物化学、糖基化、PEG化、循环排列(circular permutation)、环化、与其他分子的接头、与蛋白质或蛋白质域的融合、以及肽标签或标记物的添加。
如本文所用，“残基”是指蛋白质中的位置及其相关的氨基酸身份。例如，谷氨酸75(也称为Glu75或E75)是G1P亲本酶中75位的残基。
如本文所用，“非天然存在的修饰”是指在亲本(例如G1P)酶中未发现的氨基酸修饰。
如本文所用，“氨基酸”和“氨基酸身份”是指由DNA和RNA编码的20种天然存在的氨基酸之一。
如本文所用，“位置”是指蛋白质序列中的位置。通常，位置编号(其在下文中更充分地讨论)相对于成熟葡糖淀粉酶序列(例如，排除信号肽)的第一个氨基酸。
术语“葡糖淀粉酶”(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)定义为催化从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原末端释放D-葡萄糖的酶。出于本发明的目的，葡糖淀粉酶活性根据本文实施例中描述的程序测定，例如淀粉测定法以测定实施例1中的葡糖淀粉酶活性。
术语“编码序列”是指直接规定变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框决定，所述可读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
术语“控制序列”意指表达编码本发明变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列可以对于编码变体的多核苷酸是天然的(即，来自相同的基因)或外来的(即，来自不同的基因)或彼此天然的或外来的。此类控制序列包括但不限于前导物、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。控制序列至少包括启动子和转录和翻译终止信号。为了引入特定的限制性位点，可以给控制序列提供接头，从而促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区的连接。
术语“表达”包括参与产生本文所述的变体葡糖淀粉酶的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“表达载体”是指线性或环状DNA分子，其包含编码变体的多核苷酸并且与提供其表达的控制序列可操作地连接。
术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在一个或多个(例如几个)氨基酸的多肽。“葡糖淀粉酶片段”在本文中是指维持葡糖淀粉酶活性的本文所述的氨基酸序列的部分。如图5所示，本发明的亲本葡糖淀粉酶(G1P)包含淀粉结合域和催化域。在一些应用中，特别是对于淀粉加工，这两个域都是期望的。在其他应用中，仅催化域是期望的。在一方面，片段含有SEQ ID NO:1的至少250、至少300、至少350、或至少400个氨基酸残基(例如，氨基酸42至457(编号包括信号肽)；参见图8中序列的下划线部分)，包含催化域并具有一个或多个根据本发明的取代。在一些实施方案中，片段为至少380，至少390，至少400，至少410或至少420个氨基酸残基。在一些实施方案中，片段为至少405，至少406，至少407，至少408，至少409，至少410，至少411，至少412，至少413，至少414，或至少415氨基酸残基。
术语“宿主细胞”是指对用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等易感，并且允许表达酶的任何细胞类型。术语“宿主细胞”包括由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。在许多实施方案中，宿主细胞不是Thielaviopsis punctuala细胞；即，本发明的葡糖淀粉酶(包括SEQ ID NO:1的野生型序列和本文所述的变体酶两者)不在内源宿主中产生。
术语“改善的性质”是指与亲本葡糖淀粉酶相比改善的与本文所述的变体葡糖淀粉酶相关的特征。此类改善的性质包括但不限于比活性、降低的葡萄糖抑制、降低的异麦芽糖形成活性、增加的对麦芽糖糊精DE11-14的活性、增加的热稳定性(例如在较高温度下增加的稳定性)和增加的pH稳定性(例如，在较高pH下增加稳定性)。当将变体葡糖淀粉酶应用于糖化，然后在液化醪液上发酵时，进一步改善的性质是增加的EtOH产率。
术语“分离的”是指在自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)至少部分从与其在自然界中关联的一种或多种或所有天然存在组分取出的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的物质人为修改的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加物质量来修饰的任何物质(例如，编码物质的基因的多个拷贝；使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子等)。具体参考具有SEQ ID NO:1的分离的葡糖淀粉酶，分离的葡糖淀粉酶通常是：a)从与其通常相关的其他蛋白质纯化出来，例如当它在T.punctuala中产生时，但是除去至少一些其他分泌性蛋白质或除去宿主细胞；b)当酶处于自然界中未找到的浓度时，或c)当酶在非T.punctuala的宿主细胞中产生时。
术语“成熟多肽”是指翻译和任何翻译后修饰，如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等后的最终形式的多肽。
短语“成熟多肽编码序列”是指编码具有葡糖淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因中分离或以下述方式修饰以含有核酸区段，其在其它情况中不会存在于自然界中或者是合成的，并且包含一个或多个控制序列。
术语“可操作连接”是指将构建体序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得控制序列指导、允许或促进编码序列的表达的构造。
术语“亲本”或“亲本葡糖淀粉酶”是指进行改变以产生本发明的变体葡糖淀粉酶的葡糖淀粉酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。本发明的示例性亲本多肽是SEQ ID NO:1。
通过参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。出于本发明的目的，使用Needleman-Wunsch algorithm(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)测定两个氨基酸序列之间的序列同一性，如EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,TrendsGenet.16:276-277)的Needle程序中所实施，优选5.0.0版或以后。使用的参数是缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性，并如下计算：
(相同残基x 100)/(比对长度-比对中的缺口总数)
术语“亚序列”是指在成熟多肽编码序列的5’和/或3’末端不存在一个或多个(例如几个)核苷酸的多核苷酸；其中亚序列编码具有葡糖淀粉酶活性的片段。在一方面，亚序列至少编码根据本发明的变体的催化域。(例如，编码图8中所示的下划线部分的核苷酸)。
术语“变体”是指具有葡糖淀粉酶活性并且在一个或多个(例如几个)位置处包含改变，即取代、插入和/或缺失的多肽。取代是指将占据位置的氨基酸替换为不同氨基酸；缺失是指除去占据位置的氨基酸；并且插入是指在占据位置的氨基酸附近和紧随其后加入氨基酸。
术语“野生型”葡糖淀粉酶是指由天然存在的微生物，如自然界中找到的细菌、酵母或丝状真菌表达的葡糖淀粉酶。通常，本文最感兴趣的野生型葡糖淀粉酶是G1P，SEQ IDNO:1。
III.本发明的葡糖淀粉酶
本发明提供了热稳定性和/或热活性葡糖淀粉酶，其用于多种应用，包括饲料补充剂和淀粉加工。本发明提供了使用Thielaviopsis punctuala葡糖淀粉酶SEQ ID NO:1以及其变体的组合物和方法，如下文更全面描述的。
IV.本发明的变体葡糖淀粉酶
因此，本发明提供了具有改善的活性的变体葡糖淀粉酶，其可用于多种应用，包括糖化反应、动物和人类营养和饲料产品以及生物燃料如生物乙醇的生产。
通常，与野生型亲本G16葡糖淀粉酶或“G1P”(例如“第1代亲本”)，本文中SEQ IDNO:1(如图10所示)相比，本发明的变体葡糖淀粉酶具有修饰的、改善的生物化学性质。本文中可以改善的变体葡糖淀粉酶的生物化学性质包括但不限于pH活性、pH稳定性、热稳定性、比活性、活性和热活性、配制剂稳定性(包括液体、固体和团粒)、动物和/或动物饲料中的性能和蛋白酶稳定性。
与G1P相比，本发明的变体葡糖淀粉酶具有一种或多种改善的性质。本文中“改善的”是指至少一种生物化学性质的期望变化。“改善的功能”在期望性质(例如pH稳定性，热稳定性)的增加或不期望性质(例如蛋白酶敏感性)的降低的情况下可以以特定活性的百分比增加或减少，或以“倍数”变化测量。也就是说，变体葡糖淀粉酶与G1P相比可以具有10％的热稳定性增加或10％的蛋白酶敏感性降低。或者，变体葡糖淀粉酶可以具有pH稳定性的2倍增加或蛋白酶敏感性的3倍降低。通常，使用百分比变化来描述小于100％的生物化学活性的变化，并且使用倍数变化来描述大于100％的生物化学活性的变化(与亲本酶相比，在许多情况下为G1P)。在本发明中，可以实现至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％和99％的生物化学活性的百分比变化(通常增加)。在本发明中，与起始酶或亲本酶相比测量“倍数增加”(或降低)。例如，如图所示，G2P与G1P相比具有1.70倍的热稳定性改善的增加：这通过[(变体的活性)/(亲本的活性)]来计算。在许多实施方案中，改善至少一点一(1.1倍)、一点五(1.5倍)、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更高。
本发明的变体葡糖淀粉酶可以具有许多生物化学性质中的一种或多种的改善，包括但不限于pH活性、pH稳定性、热稳定性、比活性、活性和热活性、配制剂稳定性(包括液体、固体和团粒)、动物和/或动物饲料中的性能和/或蛋白酶稳定性。通常，与G1P酶相比使用葡糖淀粉酶活性测定法(如下所改善)在相对于G1P酶攻击变体葡糖淀粉酶的条件下测量改善。
A.淀粉测定法以测定葡糖淀粉酶活性和热活性
在一些实施方案中，使用淀粉测定法测定葡糖淀粉酶活性，如实施例部分中描述的活性。具体地，将150μl在0.1M乙酸钠，pH4.5中的1％玉米淀粉(最终淀粉浓度为0.75％)加入96深孔板中。将来自裂解物板的15μl-25μl酶加入到淀粉反应板(参见例如实施例1)。任选地，使用0.1M乙酸钠缓冲液pH 4.5将最终体积调节至200μl。将板在40℃，800rpm温育24-72小时。在24和72小时时，将板以4000rpm离心5分钟，并将20μl反应上清液取出到96孔浅微量滴定板中，并且将180μl D-葡萄糖测定试剂(来自Megazyme的GOPOD测定试剂盒，目录号K-GLUC)加入每孔。然后，将板在50℃温育30分钟。温育后，在510nm处读取平板以监测由于淀粉分解而释放的葡萄糖。在相同条件下将葡糖淀粉酶变体的活性与亲本葡糖淀粉酶进行比较以确定活性改善。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶是SEQ ID NO:1的多肽。
B.热稳定性
在许多实施方案中，本发明的变体葡糖淀粉酶具有增加的热稳定性，特别是在淀粉加工如糖化中使用的条件下，如下面更全面地概述的。热稳定性也是动物和人类饲料生产中的考虑因素，所述饲料例如在造粒过程期间经常使用高温达一段时间，该时间段传统上使野生型葡糖淀粉酶失活。在此上下文中的“热稳定性”意指变体酶在相同的热攻击条件下比亲本葡糖淀粉酶(例如G1P)更稳定，即，在相同条件下变体的活性高于G1P的活性(通常使用如本文概述和如实施例1中所示的葡糖淀粉酶测定法)。
合适的热稳定性测定法如下。将来自裂解物板的50μl酶加入到96孔Biorad PCR板中，并在57℃(对于G1)、59℃(对于G2)、62℃(对于G3)、67℃(对于G4)和72℃(对于G5)在热循环仪中攻击10分钟。温育10分钟后，将20μl经攻击的裂解物加入96深孔淀粉反应板，该板含有150μl在0.1M乙酸钠,pH4.5中的2％玉米淀粉(最终淀粉浓度为1.5％)。使用0.1M乙酸钠缓冲液，pH4.5将最终体积调节至200μl。将板在40℃，800rpm温育21-48小时。在21-48小时，将板以4000rpm离心5分钟，并将20μl反应上清液取出到96孔浅的微量滴定板，并且将180μl D-葡萄糖测定试剂(来自Megazyme的GOPOD测定试剂盒，目录号K-GLUC)加入每孔。然后将板在50℃温育30分钟。温育后，在510nm处读取平板以监测由于淀粉分解而释放的葡萄糖。在相同条件下将葡糖淀粉酶变体的活性与亲本进行比较以确定热稳定性改善。
在另外的实施方案中，当酶用于碳水化合物加工如糖化时，酶在淀粉底物存在下通常更稳定。因此，在这些实施方案中，反应通常以天测量，变体葡糖淀粉酶在60℃在底物存在下在24小时、48小时和72小时时显示出显著的稳定性，如下文概述。
总之，与SEQ ID NO:1相比，本发明的变体葡糖淀粉酶可以在40℃,45℃,50℃,55℃,58℃,60℃,65℃,66℃,70℃,75℃,80℃和/或85℃表现出增加的热稳定性达一段时间，范围通常为约10分钟至72小时，24、45、48和72小时在本发明中特别有用。
因此，如图中所示，本发明的许多变体葡糖淀粉酶表现出增加的热稳定性。
C.pH稳定性
在许多实施方案中，与亲本葡糖淀粉酶相比，本发明的变体葡糖淀粉酶具有改变的pH活性或稳定性。在此背景下，“增加的pH稳定性”意味着变体酶在相同的pH攻击条件下比亲本葡糖淀粉酶(例如G1P)更稳定，即，在相同条件下变体的活性高于G1P的活性(通常使用如本文概述并如实施例1所示的葡糖淀粉酶测定法)。例如，淀粉加工可以在多种pH下进行，这取决于粗底物和反应条件
D.比活性测定法
在一些实施方案中，与亲本葡糖淀粉酶，特别是G1P相比，本发明的变体葡糖淀粉酶具有增加的比活性。本文的“比活性”是指每酶量的活性，通常通过将样品的酶活性(有时以“葡糖淀粉酶单位”测量)除以葡糖淀粉酶的量来确定，通常如本领域已知的那样测定。
E.蛋白酶易感性
在一些实施方案中，本发明的变体葡糖淀粉酶在相同条件下比亲本酶更不易于蛋白酶降解。在一些情况下，由宿主生物体产生的蛋白酶在生产宿主生物体内生产变体葡糖淀粉酶期间的蛋白酶降解可以是一项问题，因此导致活性酶的产率较低。类似地，根据变体酶的用途，例如在淀粉加工中，可能存在粗底物中存在的其他蛋白酶或组合使用的其他酶，其可以在淀粉加工过程中降解葡糖淀粉酶。
这通常如本领域已知的那样确定，例如通过允许蛋白水解降解，然后对所得片段进行N端测序以确定切割位点。在一些情况下，根据变体和宿主生产生物体，可以没有显著的蛋白水解降解。
根据需要，如本领域技术人员所理解的，可以进行的特定突变将取决于宿主生物体产生的内源性蛋白酶，并且通常也发生在表面暴露的环结构或转角中，因此它们对蛋白酶可接近。例如，在黑曲霉真菌生产生物体中葡糖淀粉酶生产可以导致蛋白水解降解；参见Wyss et al.,Appl.And Environ.Microbiol.Feb.1999:359-366，其通过引用完整并入本文。
V.特定的变体葡糖淀粉酶
本发明提供了变体葡糖淀粉酶，其与亲本葡糖淀粉酶相比包含与以下位置对应的一个或多个(例如几个)位置处的氨基酸取代：位置14,23,30,31,35,36,39,44,49,50,51,53,69,83,98,111,117,118,119,121,147,157,179,186,197,250,262,284,286,287,288,300,309,311,317,347,362,385,388,400,413,415,419,423,434,457,463,516,526,530,533,534,535,540,545,547,553,555,564,572,576,577,581,583,585和588。在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶是SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，变体与SEQ ID NO:1的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但是小于100％序列同一性。为了清楚，本发明的变体葡糖淀粉酶不具有SEQ IDNO:1。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含选自下组的一个或多个(例如几个)取代：S14Q,K23N,K23R,K23Y,S30D,S30N,S30P,T31E,T31K,T31N,T31Q,A35L,S36R,S39A,L44I,T49K,T49R,S50E,S50I,S50N,S50Y,N51D,D53N,I69L,I69M,E83K,T98S,A111G,A117P,A117V,D118N,L119M,Q121A,Q121P,Y147W,C157W,Y179F,P186Y,Y197H,S250D,S250E,S250K,A262S,Q284H,I286A,T287N,T288H,A300L,A300Q,T309D,T309E,T309Q,L311V,A317K,L347K,T362A,S385L,S385Q,T388I,T388K,T388Y,T400K,N413S,A415D,A415F,A415N,A415S,A415T,A415W,A415Y,Q419P,Q423M,Q423P,S434T,G457N,G457P,T463F,F516L,L526F,S530E,S530G,T533K,A534L,S535E,S535G,S535K,S535T,T540A,T540S,V545L,Q547A,Q547H,F553Y,F555Y,I564F,K572E,V576I,V576L,G577R,T581I,T581K,V583F,V585P和S588Q。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含选自图10的一种或多种变体。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶是分离的变体葡糖淀粉酶。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列表现出至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1表现出至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含选自下组的位置处的至少一个取代：14,23,30,31,35,36,39,44,49,50,51,53,69,83,98,111,117,118,119,121,147,157,179,186,197,250,262,284,286,287,288,300,309,311,317,347,362,385,388,400,413,415,419,423,434,457,463,516,526,530,533,534,535,540,545,547,553,555,564,572,576,577,581,583,585和588。在一些情况下，变体酶可以包含这些位置处的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20个氨基酸取代，1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2或单一取代在本发明中特别有用。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含选自下组的位置处的至少一个取代：S14Q,K23N,K23R,K23Y,S30D,S30N,S30P.T31E,T31K,T31N,T31Q,A35L,S36R,S39A,L44I,T49K,T49R,S50E,S50I,S50N,S50Y,N51D,D53N,I69L,I69M,E83K,T98S,A111G,A117P,A117V,D118N,L119M,Q121A,Q121P,Y147W,C157W,Y179F,P186Y,Y197H,S250D,S250E,S250K,A262S,Q284H,I286A,T287N,T288H,A300L,A300Q,T309D,T309E,T309Q,L311V,A317K,L347K,T362A,S385L,S385Q,T388I,T388K,T388Y,T400K,N413S,A415D,A415F,A415N,A415S,A415T,A415W,A415Y,Q419P,Q423M,Q423P,S434T,G457N,G457P,T463F,F516L,L526F,S530E,S530G,T533K,A534L,S535E,S535G,S535K,S535T,T540A,T540S,V545L,Q547A,Q547H,F553Y,F555Y,I564F,K572E,V576I,V576L,G577R,T581I,T581K,V583F,V585P和S588Q。在一些情况下，变体酶可以包含这些位置处的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20个氨基酸取代，1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2或单一取代在本发明中特别有用。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含14位的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即谷氨酰胺、赖氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S14Q。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含23位的赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：S23N、S23R和S23Y。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含30位的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：S30D、S30N和S30P。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含31位的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：T31E、T31K、T31N和T31Q。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含35位的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A35L。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含36位的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S36R。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含39位的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S39A。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含44位的亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是L44I。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含49位的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：T49K和T49R。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含50位的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：S50E、S50I、S50N和S50Y。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含51位的天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N51D。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含53位的天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是D53N。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含69位的异亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：I69L和I69M。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含83位的谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是E83K。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含98位的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T98S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含111位的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A111G。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含117位的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：A117P和A117V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含118位的天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是D118N。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含119位的亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是L119M。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含121位的谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：Q121A和Q121P。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含147位的酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Y147W。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含157位的半胱氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是C157W。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含179位的酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Y179F。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含186位的脯氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是P186Y。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含197位的酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Y197H。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含250位的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：S250D、S250E和S250K。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含262位的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A262S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含284位的谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q284H。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含286位的异亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是I286A。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含287位的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T287N。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含288位的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T288H。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含300位的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：A300L和A300Q。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含309位的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：T309D、T309E和T309Q。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含311位的亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是L311V。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含317位的亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A317K。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含347位的亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是L347K。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含362位的亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T362A。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含385位的亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S385L和S385Q。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含388位的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：T388I、T388K和T388Y。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含400位的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T400K。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含413位的天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N413S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含415位的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：A415D、A415F、A415N、A415S、A415T、A415W和A415Y。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含419位的谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q419P。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含423位的谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：Q423M和Q423P。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含434位的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S434T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含457位的甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：G457N和G457P。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含463位的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T463F。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含516位的苯丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是F516L。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含526位的亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是L526F。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含530位的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：S530E和S530G。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含533位的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T533K。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含534位的丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A534L。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含535位的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：S535E、S535G、S535K和S535T。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含540位的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：T540A和T540S。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含545位的缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是V545L。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含547位的谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：Q547A和Q547H。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含553位的苯丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是F553Y。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含555位的苯丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是F555Y。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含564位的异亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是I564F。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含572位的赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是K572E。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含576位的缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：V576I和V576L。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含577位的甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G577R。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含581位的苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自下组：T581I和T581K。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含583位的缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是V583F。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含585位的缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是V585P。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含588位的丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何另一种取代，即赖氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸和酪氨酸，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S588Q。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶包含G2P变体A111G。
在一些实施方案中，本发明的变体酶包含氨基酸取代A111G并且与SEQ ID NO:3是至少95％,96％,97％,98％或99％相同的。在一些实施方案中，变体酶是SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中，本发明的变体酶包含氨基酸取代S30P/A111G并且与SEQ IDNO:5是至少95％,96％,97％,98％或99％相同的。在一些实施方案中，变体酶是SEQ ID NO:5。
在一些实施方案中，本发明的变体酶包含氨基酸取代K23R/S30P/S39A/T49K/A111G/L119M/Q423P并且与SEQ ID NO:207是至少95％,96％,97％,98％或99％相同的。在一些实施方案中，变体酶是SEQ ID NO:207。
在一些实施方案中，本发明的变体酶包含氨基酸取代K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P并且与SEQ ID NO:307是至少95％,96％,97％,98％或99％相同的。在一些实施方案中，变体酶是SEQ ID NO:307。
在一些实施方案中，本发明的变体酶包含氨基酸取代K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/Q121P/T309D/A415Y/N413S/Q423P并且与SEQ ID NO:361是至少95％,96％,97％,98％或99％相同的。在一些实施方案中，变体酶是SEQ ID NO:361。
合适的氨基酸取代组的具体实施方案是与SEQ ID NO:1相比在图3中找到的实施方案。
合适的氨基酸取代组的进一步的具体实施方案是在G2P，SEQ ID NO:3的背景中进行的图4中找到的那些实施方案。
合适的氨基酸取代组的进一步的具体实施方案是在G3P,SEQ ID NO:5的背景中进行的图5中找到的那些实施方案。
合适的氨基酸取代组的进一步的具体实施方案是在G4P,SEQ ID NO:207的背景中进行的图6中找到的那些实施方案。
合适的氨基酸取代组的进一步的具体实施方案是在G5P,SEQ ID NO:307的背景中进行的图7中找到的那些实施方案。
除了本文所述的特定取代之外可以存在的氨基酸变化可以是次要性质的，即保守的氨基酸取代或不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的插入；小的缺失，通常为1至10大约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；直至约20至约25个残基的小的接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一个功能，例如多组氨酸束、抗原表位或结合域促进纯化。
保守取代的实例包括碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬氨酸)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组内。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且例如由H.Neurath and R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York描述。常见取代是Ala/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,LeuAal,Ala/Glu,和Asp/Gly。
A.亲本葡糖淀粉酶
亲本葡糖淀粉酶可以是(a)多肽，其与SEQ ID NO:1的多肽具有至少85％序列同一性；(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在中等-高严格性条件下与(i)SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列或(ii)(i)的全长互补物杂交；或(c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸与SEQ ID NO:2的成熟多肽编码序列具有至少70％序列同一性。对于杂交方法和条件，参见例如Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor,New York。
在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:1的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同源性并且具有葡糖淀粉酶活性。在一方面，亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽相差直至10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ IDNO:2的成熟多肽编码序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
在一些实施方案中，亲本葡糖淀粉酶是Thielaviopsis punctuala葡糖淀粉酶，例如SEQ ID NO:1的葡糖淀粉酶。
在一个实施方案中，变体葡糖淀粉酶在暴露于40℃,45℃,50℃,52℃,55℃,56℃,58℃,60℃,65℃,66℃,70℃,75℃,80℃和/或85℃的温度达一段时间，通常范围为约1,2,3,4,5,6,7,8,9或10分钟或更长时比亲本变体葡糖淀粉酶更稳定，这取决于变体葡糖淀粉酶使用的最终条件，一些实施方案利用热攻击，5分钟至10分钟、5分钟至15分钟、5分钟至60分钟、10分钟至60分钟的时间均可用于本发明。在一些实施方案中，使用85℃和5分钟的攻击。
因而，在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与亲本变体葡糖淀粉酶，特别是G1P相比具有增加的热稳定性，于50℃至少5分钟，于52℃至少5-10分钟，于55℃至少5-10分钟，于58℃至少5-10分钟，于56℃至少5-10分钟，于60℃至少5-10分钟，于66℃至少5-10分钟和在一些实施方案中于70℃至少5-10分钟。
另外，pH可以也是热稳定性的考虑因素。因而，在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与亲本葡糖淀粉酶相比具有增加的热稳定性，于52℃于pH 4.5至少5分钟，于56℃于pH4.5至少5分钟。因而，在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶与亲本葡糖淀粉酶相比具有增加的热稳定性，于52℃于pH 4.5至少10分钟，或于56℃于pH 4.5至少10分钟。
因而，如图3-7中所示，本发明的许多变体葡糖淀粉酶表现出增加的热稳定性。
B.核酸组合物
本发明还提供了组合物，其包含本发明变体葡糖淀粉酶编码核酸。此类变体葡糖淀粉酶多肽编码核酸可以编码本申请中所述的任何变体葡糖淀粉酶，包括上述“C.变体葡糖淀粉酶”部分下的。在一些实施方案中，组合物包含选自下组的核酸：SEQ ID NO:2至362中的偶数编号的序列。
在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:2的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:4的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:6的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:208的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:308的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:362的核酸。
在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶编码核酸包含SEQ ID NO 2至362中任一项的经密码子优化的形式或变体。
“经密码子优化的”在此上下文中就特定宿主生物体及其通常优选的氨基酸密码子而言完成；也就是说，宿主生产生物体，例如曲霉物种与酵母生产生物体相比可以使用曲霉优选的密码子产生更高的翻译和/或分泌。
在一些实施方案中，组合物富含本发明的此类变体葡糖淀粉酶编码核酸。术语“富含”指示从组合物获得的葡糖淀粉酶活性已经增加，例如富集因子是至少1。在一些实施方案中，配制组合物以提供期望的特征，如低色、低臭和可接受的储存稳定性。
1.变体的制备
一般可以使用公知的技术通过编码蛋白质序列的构建基因制备变体，所述公知技术包括亲本基因的定点诱变和合成基因构建。
i.调节序列
本发明还涉及包含编码本发明变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个控制序列可操作地连接，所述控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
控制序列可以包括启动子，即为了表达多核苷酸而被宿主细胞识别的多核苷酸。启动子含有介导变体表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变体启动子、截短的启动子和杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从以下获得的启动子：曲霉物种基因，如本领域中已知的，包括构巢曲霉、黑曲霉和米曲霉及根毛霉物种基因，诸如米赫根毛霉，木霉物种基因，包括里氏木霉，镰孢菌物种基因，包括腐皮镰孢菌。包含启动子的酵母控制序列也是从酿酒酵母公知的。
来自这些物种的合适的启动子序列(以及其他控制序列)包括如本领域已知的来自淀粉酶(特别是α-淀粉酶)、葡糖淀粉酶、蛋白酶、磷酸酶、内切葡聚糖酶、纤维素酶等的启动子。另外，对于密码子优化，可能期望使用对宿主生产菌株内源的启动子(和其他控制序列)，其与编码变体葡糖淀粉酶的核酸可操作地连接。在许多实施方案中，可操作地连接至编码序列的启动子不是SEQ ID NO:147中发现的天然Thielaviopsis punctuala启动子序列。
控制序列也可以是转录终止子，其被宿主细胞识别以终止转录。终止子序列与编码变体的多核苷酸的3’端可操作连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞的终止子(和其它控制序列诸如启动子)获自构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因。
在一些实施方案中，用于酵母宿主细胞的终止子从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得。
控制序列也可以是增加基因表达的启动子下游且基因编码序列上游的mRNA稳定区。
合适的mRNA稳定区的实例从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)crylllA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue et al.,1995,Journal ofBacteriology 177:3465-3471)获得。
控制序列也可以是前导物，即对于由宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区。前导物序列与编码变体的多核苷酸的5’端可操作连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导物。
在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞的前导物是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的。
在一些实施方案中，从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得酵母宿主细胞的合适前导物。
控制序列也可以是多腺苷酸化序列，即与变体编码序列的3’端可操作连接的序列，并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷残基添加到转录的mRNA的信号。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，用于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列从构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得。
控制序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的N端连接并指导表达的变体葡糖淀粉酶进入细胞的分泌途径的信号肽。在许多情况中，信号序列是图5中描述的信号序列，内源G1P信号序列。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、高温毛壳霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶、和米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。Romanos等,1992，见上文描述了其它有用的信号肽编码序列。
在存在信号肽和前肽序列两者的情况下，前肽序列位于变体的N端附近，并且信号肽序列位于前肽序列的N端附近。
还可以期望添加相对于宿主细胞生长调节变体表达的调节序列。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操作基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用子囊菌纲(Ascomycota)诸如曲霉菌属(Aspergillus)的Gpd(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)，黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸将与调节序列可操作连接。
2.表达载体
本发明还涉及重组表达载体，其包含编码本发明变体的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，其可以包括一个或多个方便的限制性位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。或者，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的合适载体中来表达多核苷酸。在创建表达载体时，编码序列位于载体中，使得编码序列与适合于表达的控制序列可操作连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可以方便地进行重组DNA程序并且可以导致多核苷酸的表达。载体的选择通常取决于载体与待导入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含任何用于确保自我复制的手段。或者，载体可以是当被引入宿主细胞时整合到基因组中并且与已经整合有它的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单载体或质粒或一起含有待引入宿主细胞基因组中的总DNA的两种或更多种载体或质粒，或转座子。涵盖用于本发明方法的载体包括整合载体和非整合载体两者。
在一些实施方案中，载体含有一个或多个允许容易选择经转化的、经转染的、经转导的或类似细胞的选择性标志物。在许多实施方案中，选择基因编码对抗生素的抗性，诸如氨苄青霉素、氨苄青霉素、氯霉素、潮霉素、四环素或卡那霉素等。
用于酵母宿主细胞的合适标志物包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择标志物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)以及其等同物。对于在曲霉细胞中使用优选的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
在一些实施方案中，载体含有允许载体整合到宿主细胞基因组中或载体在细胞中不依赖于基因组的方式自主复制的元件。
为了整合到宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或载体的任何其他元件以通过同源或非同源重组整合到基因组中。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组在染色体中的精确位置处整合到宿主细胞基因组中。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、和800至10,000个碱基对，其与相应的靶序列具有高度的序列同一性以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码多核苷酸。另一方面，可以通过非同源重组将载体整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是任何介导在细胞中发挥功能的自主复制的质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”是指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANSI(Gems et al.,1991,Gene 98:61-67；Cullen et al.,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将超过一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生，包括在载体中使用编码变体葡糖淀粉酶的多个基因，将多个载体转化到细胞中，或者将载体对基因组中的多次整合。可以通过如下获得多核苷酸的拷贝数的增加：将至少一个额外的序列拷贝整合到宿主细胞基因组中或与多核苷酸一起纳入可扩增选择标志物基因，其中含有扩增拷贝的选择标志物基因和因此多核苷酸的额外拷贝的细胞可以通过在合适的选择剂存在下培养细胞来选择。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员公知的(参见例如Sambrook等，1989，同上)。
C.特定构建体
为了在酵母中表达，我们使用酿酒酵母INSCV1菌株(ThermoFisher Scientific,USA:目录号V8251-20)和pYES2/CT载体(ThermoFisher Scientific,USA:目录号V8251-20)。两者都是商品化的并且也在下文实施例1中讨论。
1.密码子优化
密码子优化可以与本发明的任何变体葡糖淀粉酶一起使用，以优化使用的宿主细胞中的表达。此类方法在本领域中是公知的，并且记载于例如WO 2007/142954。在异源表达系统中，优化步骤可以改善宿主产生期望变体葡糖淀粉酶的能力。蛋白质表达受许多因子控制，包括影响转录、mRNA加工和稳定性以及翻译起始的因子。多核苷酸优化步骤可以包括改善宿主产生外源蛋白质的能力的步骤以及协助研究人员有效设计表达构建体的步骤。优化策略可以包括例如翻译起始区域的修饰、mRNA结构元件的改变、以及使用不同的密码子偏倚。
在一些实施方案中，通过干扰二级结构发生减少的异源蛋白质表达。二级结构可以隔离RBS序列或起始密码子并且与蛋白质表达的降低相关。茎环结构也可以参与转录暂停和减弱。优化的多核苷酸序列可以含有核苷酸序列的RBS和基因编码区中的最小的二级结构以允许改善的转录和翻译。
在一些实施方案中，限制性位点可以实现异源蛋白质表达。通过修饰可以干扰转录单元随后亚克隆到宿主表达载体中的限制性位点，可以优化多核苷酸序列。
在一些实施方案中，经优化的核酸序列可以以下述水平表达本发明的变体葡糖淀粉酶，所述水平是尚未优化的核酸序列表达的水平的至少110％,150％,200％,500％,1,000％,5,000％或甚至10,000％。
D.宿主细胞和生产菌株
如本领域技术人员将理解的，存在用于重组生产本发明的变体葡糖淀粉酶的极其多种生产宿主生物体，包括但不限于细菌细胞和包括酵母的真菌细胞。
本发明还涉及包含编码本发明的变体葡糖淀粉酶的多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸与指导本发明变体的产生的一个或多个控制序列可操作连接。将包含多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞中，使得构建体或载体作为染色体整合体或作为自身复制的染色体外载体维持，如前所述。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码变体的基因及宿主生产生物体产生高蛋白质滴度的表达和/或分泌蛋白的能力。在一些实施方案中，宿主细胞展现变体葡糖淀粉酶的瞬时表达。在一些实施方案中，宿主细胞是稳定转染的宿主或稳定(即永久)表达变体葡糖淀粉酶的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是生产宿主细胞。
宿主细胞可以是用于重组生产变体的任何细胞，例如原核生物或真核生物。此类宿主细胞包括但不限于细菌、真菌和酵母细胞。宿主细胞也可以是真核生物，诸如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。完成用本发明的变体葡糖淀粉酶的编码区的表达载体转化和/或转染宿主，如本领域中公知(参见Sambrook,同上)。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用，“真菌”包括子囊菌纲(Ascomycota)，担子菌纲(Basidiomycota)，壶菌亚门(Chytridiomycota)和接合菌亚纲(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂真菌(mitosporic fungi)(如Hawksworth et al.,于Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK所定义)。在许多情况下，宿主细胞包括曲霉物种，包括构巢曲霉、黑曲霉和米曲霉，以及根毛霉物种诸如米赫根毛霉(R.miehei)、木霉物种，包括里氏木霉(T.reesei)和镰孢菌物种基因，包括腐皮镰孢菌(F.venenatum)。
丝状真菌宿主细胞可以是丝状真菌宿主细胞可以是支顶孢属(Acremonium)、曲霉菌属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、金小孢子属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、云芝(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻温病菌(Magnaporthe)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新丽鞭毛菌(Neocallimastix)、脉孢菌(Neurospora))、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、毛平革菌属(Phanerochaete)、脉射菌属(Phlebia)、单鞭毛菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂折菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、Thielavia、梭孢壳属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
在一些实施方案中，真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文中使用，“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)、和属于半知真菌(Fungi Imperfecti)(芽生菌目(Blastomycetes))的酵母。酵母宿主细胞是念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞诸如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
E.蛋白质组合物
本发明还提供了包含本发明的变体葡糖淀粉酶的组合物。在一些实施方案中，组合物包含载体和/或赋形剂。在一些实施方案中，组合物富含本发明的此类变体葡糖淀粉酶。术语“富含”表示组合物的葡糖淀粉酶活性已经增加，例如富集因子至少为1。在一些实施方案中，配制组合物以提供期望的特征，例如低色、低臭和可接受的储存稳定。
在一些实施方案中，组合物包含本发明的变体葡糖淀粉酶作为主要酶组分，例如单组分组合物。
在一些实施方案中，根据最终用途，组合物可以包含一种或多种另外的酶，包括但不限于氨肽酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、异淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、葡糖淀粉酶、多酚氧化酶、支链淀粉酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、和/或木聚糖酶。
在一些实施方案中，组合物包含α-淀粉酶和根据本发明的变体葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，组合物包含异淀粉酶和变体葡糖淀粉酶。在另一个实施方案中，组合物包含α-淀粉酶、异淀粉酶和根据本发明的变体葡糖淀粉酶。
在一些实施方案中，组合物包含与支链淀粉酶(pullulanase)组合的本发明的变体葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，组合物包含与支链淀粉酶和异淀粉酶组合的本发明的变体葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，组合物包含与支链淀粉酶和α-淀粉酶组合的本发明的变体葡糖淀粉酶。
在一些实施方案中，组合物包含本发明的变体葡糖淀粉酶，进一步包含酸性、中性和/或碱性蛋白酶。在另一个实施方案中，组合物包含根据本发明的变体葡糖淀粉酶和酶混合物，其包含α-淀粉酶、蛋白酶、肽酶、脂肪酶、纤维素酶、胰酶等。
F.变体葡糖淀粉酶的配制剂
在一些实施方案中，可以根据本领域已知的方法制备组合物，并且可以是液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以是颗粒或微粒的形式。可以根据本领域已知的方法稳定变体。
在一些实施方案中，本发明的酶组合物(即多肽组合物)可以为任何适合于使用的形式，诸如例如，除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或没有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物或宿主细胞作为酶的来源。
在一些实施方案中，酶组合物可以是干粉或颗粒、无尘颗粒、液体、稳定液体或稳定的受保护的酶。例如，液体酶组合物可以根据已建立的方法通过添加稳定剂诸如糖、糖醇或其他多元醇和/或乳酸或另一种有机酸来稳定。
在一些实施方案中，本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其他条件可以基于本领域已知的方法确定。
上述组合物适用于液化、糖化和/或发酵过程，并且在一些实施方案中适用于淀粉转化。在一些实施方案中，组合物可用于生产食物产品，包括糖浆，以及发酵产物如乙醇。在一些实施方案中，组合物可用于制药业，诸如在消化助剂中。
另外，如下文概述，本发明的新葡糖淀粉酶可以与其它酶组合，包括但不限于α-淀粉酶、支链淀粉酶、纤维素酶(木聚糖酶、木质酶等)，如下文更完全描述。
G.生产方法
本发明还涉及生产变体葡糖淀粉酶的方法，其包括：(a)在适合于表达变体葡糖淀粉酶多肽的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)任选地回收变体葡糖淀粉酶多肽。
使用本领域已知的方法在适于产生变体植物酶多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或在合适的培养基中和在允许变体表达和/或分离的条件下进行的实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞。使用本领域已知的程序在含有碳源和氮源和无机盐的合适的营养培养基中发生培养。合适的培养基可从商业供应商获得，或者可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。若将变体葡糖淀粉酶分泌到营养培养基中，则可以直接从培养基中回收变体葡糖淀粉酶。若不分泌变体，则可以从细胞裂解物中回收它。
使用本领域已知的方法在适于产生变体葡糖淀粉酶多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或在合适的培养基中和在允许变体表达和/或分离的条件下进行的实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞。使用本领域已知的程序在含有碳源和氮源和无机盐的合适的营养培养基中发生培养。合适的培养基可从商业供应商获得，或者可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。若将变体葡糖淀粉酶多肽分泌到营养培养基中，则可以直接从培养基中回收变体葡糖淀粉酶多肽。若不分泌变体，则可以从细胞裂解物中回收它。
可以使用本领域已知的对变体特异的方法来检测变体葡糖淀粉酶。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定法来测定变体葡糖淀粉酶多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法回收变体葡糖淀粉酶多肽。例如，可以通过包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀的常规程序从营养培养基中回收变体葡糖淀粉酶多肽。
可以通过本领域已知的多种程序纯化变体，所述程序包括但不限于层析(例如离子交换、亲和力、疏水性、层析聚焦和大小排阻)、电泳程序(例如制备性等电聚焦)、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如Protein Purification，Janson和Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)以获得基本上纯的变体。
在备选的方面，不回收变体，而是使用表达变体的本发明的宿主细胞作为变体的来源。
H.使用变体葡糖淀粉酶的方法
葡糖淀粉酶经常用于食品和发酵业中，用于淀粉糖化为葡萄糖。
糖化过程可以单独使用葡糖淀粉酶。或者，糖化过程可以是许多酶的协同作用，包括葡糖淀粉酶与淀粉酶(特别是α-淀粉酶)和另外的脱支酶如支链淀粉酶或异淀粉酶的组合。葡萄糖异构酶可以进一步用于将葡萄糖转化为果糖，所述果糖由于其更高的甜度和更容易的代谢性而是传统上优选的。例如，葡糖淀粉酶可用于面团中以改善面包皮的颜色并产生低卡路里的啤酒。当与其他酶的混合物一起使用时，葡糖淀粉酶的另一个关键应用是作为消化助剂。
在一些实施方案中，葡糖淀粉酶用于动物饲料原料或动物原料的生产中，包括下面详细描述的组分和用途。
如本文所讨论的，在动物饲料中使用葡糖淀粉酶具有许多益处，包括节省饲料成本，例如减少膳食无机磷酸盐、能量和氨基酸，包括快速且有效分解膳食葡萄糖和增加的从葡萄糖的营养物利用度，以及非反刍动物受试者的体重增加等生产益处。在一些实施方案中，将本发明的变体葡糖淀粉酶配制并加入到饲料中或可以作为饲料的组分制备。在前一种情况下，葡糖淀粉酶的原料添加可以通过在载体饲料如小麦粉上配制变体葡糖淀粉酶来完成。在一些实施方案中，将动物饲料或补充剂饲喂家畜，包括但不限于牛、猪、羊、鸟、猫、鱼、狗、马、宠物、家禽等。在一些实施方案中，本发明的变体葡糖淀粉酶可以供给人类(参见例如http://www.globalhealingcenter.com/natural-health/glucoamylase/)以及其它可供人类食用(consumption)的商品化产品，例如
在一些实施方案中，本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其他条件可以基于本领域已知的方法确定。
上述组合物适用于液化、糖化和/或发酵过程，以及在一些实施方案中用于淀粉转化。在一些实施方案中，该组合物可用于生产食品，包括糖浆，以及发酵产品，例如乙醇。在一些实施方案中，该组合物可用于制药业，如消化助剂。
在一个实施方案中，将变体葡糖淀粉酶加入动物原料中并造粒，如本领域已知，使得形成饲料，其中含有葡糖淀粉酶。在其他实施方案中，变体葡糖淀粉酶可以喷雾或以液体形式补料到动物饲料。
I.使用变体葡糖淀粉酶的方法
1.工业应用
本发明的变体葡糖淀粉酶拥有有价值的性质，其允许多种工业应用。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶可以用于原料生产、啤酒生产、乙醇生产、生物燃料生产和淀粉转化过程。
通常，葡糖淀粉酶的主要商业应用是催化淀粉糖化，产生可用于食品和发酵过程的葡萄糖。一般来说，这是两步法，第一步使用干燥的固体淀粉浆体(30-35％，任选研磨)，其在60-90℃下进行热处理，用α-淀粉酶在95-105℃下(通常为pH 6.5)进行液化来凝胶化。α-淀粉酶是内切作用酶，产生短链糊精。然后通过葡糖淀粉酶将这些糊精糖化以释放葡萄糖，该步骤通常在60℃进行2-4天。导致需要热稳定的葡糖淀粉酶正是最后一步。
在一些实施方案中，本发明提供了通过使用变体葡糖淀粉酶制备的生物燃料，所述变体葡糖淀粉酶产生葡萄糖，然后将其进行发酵步骤以产生乙醇(通常使用酵母)。
变体葡糖淀粉酶可以用于淀粉工艺，特别是淀粉转化，尤其是淀粉的液化(参见例如美国专利No.3,912,590，EP 252730和EP 063909，WO 99/19467，和WO 96/28567，其均通过引用并入本文)。还考虑用于淀粉转化目的的组合物，其除了本发明的葡糖淀粉酶之外还可以包含α-淀粉酶、支链淀粉酶和/或蛋白酶。
此外，本发明的葡糖淀粉酶特别可用于自淀粉或全谷物生产甜味剂和乙醇(参见例如美国专利No.5,231,017，其通过引用并入本文)，如燃料、饮料和工业乙醇。
在一些实施方案中，本发明涉及根据本发明的葡糖淀粉酶用于从含淀粉的材料生产糖浆和/或发酵产物的用途。在一个实施方案中，淀粉材料可以是凝胶化的。在另一个实施方案中，淀粉材料是未凝胶化的。
2.淀粉加工
如本文所讨论的，本发明的新葡糖淀粉酶特别适用于淀粉加工。天然淀粉由微观颗粒组成，所述微观颗粒在室温下不溶于水。当加热含水淀粉浆体时，颗粒膨胀并最终破裂，将淀粉分子分散到溶液中。在高达约50℃至75℃的温度下，膨胀可以是可逆的。然而，随着温度升高，开始出现称为“凝胶化”的不可逆膨胀。在此种“凝胶化”过程期间，粘度显著增加。待加工的颗粒淀粉可以是高度精制的淀粉质量，优选至少90％，至少95％，至少97％或至少99.5％纯的，或者它可以是更粗的含淀粉的材料，包括(例如碾磨的)全谷物，包括非淀粉部分，如胚芽残留物和纤维。可以例如通过研磨减小原料，如全谷物，以便打开结构并允许进一步加工。在干磨中，将全谷粒研磨并使用。湿磨提供了胚芽(germ)和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并且通常应用于淀粉水解产物用于生产例如糖浆或其他饲料添加剂的位置处。干磨和湿磨两者都是淀粉加工领域中公知的，并且可以用于本发明的方法中。用于降低含淀粉的材料的粒度的方法是本领域技术人员公知的。
由于在典型的工业过程中固体水平为30-40％，淀粉必须稀释或“液化”，以便可以适当地加工它。粘度的此种降低主要通过目前商业实践中的酶促降解来实现。
液化可以在α-淀粉酶的存在下进行，并且在一些实施方案中，α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶。在一个实施方案中，在液化过程中也存在葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，在液化过程中还存在粘度降低酶，例如木聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。在一些实施方案中，还存在酸性蛋白酶。在一些实施方案中，还存在酸性蛋白酶以减少玉米浸泡时间。
在一些实施方案中，本发明的方法在将含淀粉的材料转化为糖/糊精之前还包括以下步骤：(i)降低含淀粉的材料的粒度；和(ii)形成包含含淀粉的材料和水的浆体。
3.啤酒制备
变体葡糖淀粉酶也可以用于啤酒制备过程和类似的发酵。
J.蒸馏
任选地，在发酵之后，可以通过例如蒸馏并任选地随后进行一个或多个工艺步骤提取醇(例如乙醇)。
1.酶
下文描述的酶和多肽将以“有效量”用于本发明的方法中，或者可以与本发明的变体葡糖淀粉酶组合使用。在一些实施方案中，变体葡糖淀粉酶可以与酶组合，所述酶包括但不限于α-淀粉酶、细菌α-淀粉酶、细菌杂合α-淀粉酶、真菌α-淀粉酶、真菌杂合α-淀粉酶、碳水化合物源产生酶(糖化酶)、葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、生麦淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶和蛋白酶。
a.α-淀粉酶
可以使用任何α-淀粉酶，如真菌、细菌或植物来源的α-淀粉酶。在一些实施方案中，α-淀粉酶是酸性α-淀粉酶，例如酸性真菌或酸性细菌α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”是指α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，其以有效量添加时在范围为3至7、3.5至6、或4-5的pH具有活性最佳值。
b.细菌α-淀粉酶
用于本发明的α-淀粉酶可以是细菌α-淀粉酶，例如源自芽孢杆菌(Bacillus)。在一个优选的实施方案中，芽孢杆菌α-淀粉酶源自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌株，但也可以源自其他芽孢杆菌。
c.细菌杂合α-淀粉酶
α-淀粉酶可以是杂合α-淀粉酶，例如，包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445个C端氨基酸残基和来自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的37个N端氨基酸残基的α-淀粉酶。
d.真菌α-淀粉酶
真菌α-淀粉酶包括但不限于源自曲霉菌株的α-淀粉酶，诸如川地曲霉(Aspergillus kawachii)，黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉α-淀粉酶。在一些实施方案中，α-淀粉酶源自川地曲霉(Kaneko et al.,1996,J.Ferment.Bioeng.81:292-298,“Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a geneencoding an acid-stable alpha-amylase from Aspergillus kawachii'；和进一步作为EMBL:#AB008370)。
真菌α-淀粉酶还可以是野生型酶，其包含淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域，或其变体。
2.真菌杂合α-淀粉酶
在一些实施方案中，真菌酸性α-淀粉酶是杂合α-淀粉酶。杂合α-淀粉酶可以包含α-淀粉酶催化域(CD)和碳水化合物结合域/模块(CBM)，如淀粉结合域(SBD)，和任选地接头。
3.商业α-淀粉酶产品
在一些实施方案中，包含α-淀粉酶的商业组合物包括MYCOLASETM(DSM),BANTM,TERMAMYLTMSC,FUNGAMYLTM,LIQUOZYMETMX,LIQUOZYMETMSC and SANTMSUPER,SANTMEXTRA L(Novozymes A/S)and CLARASETML-40,000,DEX-LOTM,SPEZYMETMFRED,SPEZYMETMAA,SPEZYMETMALPHA,SPEZYMETMDELTA AA,GC358,GC980,SPEZYMETMCL和SPEZYMETMRSL(DuPontIndustrial Biosciences)和称为SP288的来自黑曲霉的酸性真菌α-淀粉酶SP288(可购自Novozymes A/S,Denmark)。
4.碳水化合物源生成酶(糖化酶)
术语“碳水化合物源生成酶”包括葡糖淀粉酶(葡萄糖生成剂)、β-淀粉酶和生麦淀粉酶(都是麦芽糖生成剂)以及α-葡糖苷酶、异淀粉酶和支链淀粉酶。碳水化合物源生成酶能够产生碳水化合物，该碳水化合物可以被所讨论的发酵生物用作能量源，例如，当在本发明的方法中用于生产发酵产物时，如乙醇时。产生的碳水化合物可以直接或间接转化为期望的发酵产物，优选乙醇。可以使用碳水化合物源生成酶的混合物。在一些实施方案中，共混物包括含有至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，尤其是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶的混合物。
在常规的淀粉至乙醇方法(即包括液化步骤)中，可以如本领域已知的那样实施比率，特别是当糖化和发酵同时实施时。
5.β-淀粉酶
在一些实施方案中，β-淀粉酶可以包括在本发明的组合物中。β-淀粉酶(E.C3.2.1.2)是传统上给予外切作用生麦淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物中1,4-α-糖苷连接的水解。
已经从各种植物和微生物中分离β-淀粉酶(Fogarty and Kelly,1979,Progressin Industrial Microbiology 15:1 12-1 15)。这些β-淀粉酶的特征在于具有范围为40℃至65℃的温度最佳值和范围为4.5至7的pH最佳值。来自大麦的商品化β-淀粉酶是来自Novozymes A/S,Denmark的NOVOZYMTMWBA和来自DuPont Industrial Biosciences,USA的SPEZYMETMBBA 1500。
6.生麦淀粉酶
在一些实施方案中，生麦淀粉酶可以包括在本发明的组合物中和/或用于本发明的方法中。淀粉酶可以是生麦α-淀粉酶(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，EC 3.2.1.133)，其催化直链淀粉和支链淀粉水解成α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)菌株NCIB11837的生麦淀粉酶可购自Novozymes A/S.Maltogenic.
生麦淀粉酶可以以0.05-5mg总蛋白质/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加。
7.植酸酶
在一些实施方案中，葡糖淀粉酶可以包括在本发明的组合物中。任何葡糖淀粉酶可以用于本发明的方法中。植酸酶是通过特异性水解肌醇和磷之间的酯连接来降解植酸盐和/或植酸的酶。许多成分中的磷和离子可用性归功于植酸酶活性。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶能够从肌醇六磷酸(例如植酸)中释放至少一种无机磷酸盐。植酸酶可以根据其对开始水解的植酸盐分子上的磷酸酯基团的特定位置的偏好进行分组(例如3-植酸酶(EC3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26))。植酸酶的实例是肌肉-肌醇-六磷酸-3-磷酸水解酶。植酸酶还可以包括2016年6月30日提交的PCT申请号PCT/US2016/040555中的那些，其通过引用整体并入本文，并且特别是其中描述的植酸酶的序列。
在一些实施方案中，葡糖淀粉酶是商品化的植酸酶，此类商品化的植酸酶包括但不限于NATUPHOS(BASF),RONOZYME P(Novozymes A/S),PHYZYME(Danisco A/S,Verenium)和FINASE(AB Enzymes)。测定微生物植酸酶活性的方法和植酸酶单位的定义公开于Engelen et al.,1994,Journal of AOAC International 77:760-764。在一些实施方案中，植酸酶可以是野生型植酸酶、其活性变体或活性片段。
8.支链淀粉酶
在一些实施方案中，生麦淀粉酶可以包括在本发明的组合物中和/或用于本发明的方法中。支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41，支链淀粉6-葡聚糖-水解酶)是脱支酶，其特征在于它们水解例如胶淀粉和支链淀粉中的α-1,6-糖苷键的能力。
在一些实施方案中，支链淀粉酶是商品化的支链淀粉酶，例如商品化的支链淀粉酶包括但不限于PROMOZYME D,PROMOZYMETMD2(Novozymes A/S,Denmark),OPTIMAX L-1000,OPTIMAX L-300(DuPont Industrial Biosciences),和AMANO 8(Amano,Japan)。
9.蛋白酶
可以在糖化、发酵、同时糖化和发酵过程中添加蛋白酶。蛋白酶可以是任何蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶是微生物起源的酸性蛋白酶，例如真菌或细菌起源的酸性蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶是酸性真菌蛋白酶，但也可以使用其他蛋白酶。
合适的蛋白酶包括但不限于微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。
在一些实施方案中，蛋白酶是酸性蛋白酶，即特征在于在低于pH 7的酸性条件下水解蛋白质的能力的蛋白酶。
蛋白酶可以是中性或碱性蛋白酶，例如原值芽孢杆菌菌株的蛋白酶。在一些实施方案中，特定蛋白酶源自解淀粉芽孢杆菌并且具有可在Swissprot数据库，登录号No.P06832获得的序列。
在一些实施方案中，蛋白酶是源自曲霉属菌株，例如米曲霉的蛋白酶制剂。在另一个实施方案中，蛋白酶源自根毛霉菌株，例如米赫根毛霉。在一些实施方案中，蛋白酶是蛋白酶制剂，诸如源自曲霉属菌株(如米曲霉)的蛋白水解制剂和源自根毛霉菌株(例如米赫根毛霉)的蛋白酶的混合物。
在一些实施方案中，蛋白酶是商品化的蛋白酶，此类商品化蛋白酶包括但不限于ESPERASETM,FLAVOURZYMETM,NOVOZYMTMFM 2.0L,和iZymeBA(可购自Novozymes A/S,Denmark)和来自DuPont Industrial Biosciences,USA的SPEZYMETMFAN和GC106TM，以及来自DSM的
VI.实施例
实施例1：G16Tp葡糖淀粉酶变体制备
材料和方法
基因合成和克隆
G16Tc葡糖淀粉酶的cDNA序列以登录号KKA29558获自UniProt。该基因由GenScript合成(参见万维网genscript.com/)。将合成的基因克隆到pYES2/CT载体(ThermoFisher Scientific，USA：目录号V8251-20)中。
突变设计和构建
为了改善G16的热稳定性，基于G16的分析序列、结构和实验数据，分别在G1、G2、G3、G4和G5改善期间设计2、3、5、1和1个突变体集合。该设计包括每个突变体的一个到多个特定突变。随后使用Lightning试剂盒(Agilent Technologies，SantaClara，California)构建突变体集合，随后克隆到pYES2/CT载体(ThermoFisherScientific，USA：目录号V8251-20)中。
含HTP葡糖淀粉酶的湿细胞颗粒的制备
将含有来自单菌落的重组葡糖淀粉酶编码基因的酿酒酵母INSCV1菌株(ThermoFisher Scientific，USA：目录号V8251-20)接种到含有300μl含有2％葡萄糖且没有尿嘧啶补充的合成最小限定培养基(SC)的96孔板的各孔中。将培养物在30℃，250rpm和85％湿度下培养过夜。将获得OD600 0.4所需要的来自每孔的适当体积的过夜培养物加入到含有350μl诱导培养基(含有2％半乳糖的SC选择性培养基)的新96孔板的相应孔中。然后在30℃，250rpm和85％湿度下将板温育24小时。然后以4000rpm在4℃使用离心10分钟沉淀细胞。弃去上清液，并且将团粒在-80℃冷冻，然后裂解。
HTP葡糖淀粉酶板的裂解
如上所述，将150μL的Y-PER酵母蛋白提取试剂(ThermoFisher Scientific，USA：目录号78990)加入到每孔中的细胞糊。将细胞在室温在台式振荡器上振荡裂解1.5小时。然后将板在4000rpm和4℃下离心10分钟。将澄清的上清液用于进行生化测定以测定活性。
测定葡糖淀粉酶活性的淀粉测定法
a.将150μL的1％玉米淀粉对马铃薯淀粉(终浓度为0.75％淀粉)，25μL裂解物加25μLpH5.5缓冲液在40℃下以650rpm搅拌温育18小时。将20μL温育的样品加入180μL GOPOD(葡萄糖氧化酶/过氧化物酶)中，并在50℃下以150RPM搅拌温育30分钟。在510nm处读取吸光度以测定释放的葡萄糖。如图1所示，G16对淀粉的活性显著高于测试的任何其他葡糖淀粉酶。
测定改善的变体的热梯度的测定法
将来自裂解物板的50μl酶加入到96孔Biorad PCR板，并在50-90℃下在热循环仪中攻击10分钟。温育10分钟后，将20μl经攻击的裂解物加入到96深孔淀粉反应板，该板含有150μl在0.1M乙酸钠，pH4.5中的2％玉米淀粉(最终淀粉浓度为1.5％)。使用0.1M乙酸钠缓冲液pH4.5将最终体积调节至200μl。将板在40℃，800rpm温育22小时。在22小时时，将板以4000rpm离心5分钟，并将20μl反应上清液取出到96孔浅的微量滴定板，并且将180μl D-葡萄糖测定试剂(来自Megazyme的GOPOD测定试剂盒，目录号K-GLUC)添加到每孔中。然后将板在50℃下温育30分钟。温育后，在510nm处读板，以监测由于淀粉分解而释放的葡萄糖。如图2所示，G2P-G6P表明比G1P宽得多的热概况，G6P是最热稳定的(直至73℃是稳定的)。
测定变体的热稳定性改善的测定法
将来自裂解物板的50μl酶加入到96孔Biorad PCR板中，并在57℃(对于G1)、59℃(对于G2)、62℃(对于G3)、67℃(对于G4)和72℃(对于G5)在热循环仪中攻击10分钟。温育10分钟后，将20μl经攻击的裂解物加入96深孔淀粉反应板，该板含有150μl在0.1M乙酸钠,pH4.5中的2％玉米淀粉(最终淀粉浓度为1.5％)。使用0.1M乙酸钠缓冲液，pH4.5将最终体积调节至200μl。将板在40℃，800rpm温育21-48小时。在21-48小时时，将板以4000rpm离心5分钟，并将20μl反应上清液取出到96孔浅的微量滴定板，并且将180μl D-葡萄糖测定试剂(来自Megazyme的GOPOD测定试剂盒，目录号K-GLUC)加入每孔。然后将板在50℃温育30分钟。温育后，在510nm处读取平板以监测由于淀粉分解而释放的葡萄糖。在相同条件下将葡糖淀粉酶变体的活性与亲本进行比较以确定热稳定性改善(图3-7)。
提供以上提出的实施例以给本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明组合物、系统和方法的实施方案的完整公开和描述，而不是意图限制发明人视为其发明的事情的范围。对于本领域技术人员显而易见的用于实施本发明的上述模式的修改旨在落入所附权利要求书的范围内。本说明书中提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的技术人员的技术水平。本公开中引用的所有参考文献均以引用并入，其程度如同每篇参考文献已通过引用个别整体并入一样。
所有标题和部分名称仅用于清楚和参考目的，并不以任何方式视为限制。例如，本领域技术人员将理解根据本文所述的本发明的精神和范围，适当地组合来自不同标题和部分的各个方面的有用性。
本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文，并且出于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请明确地和单独地指出通过引用整体并入用于所有目的一样。
在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本申请进行许多修改和变化，这对本领域技术人员来说是显而易见的。本文描述的具体实施方案和实施例仅作为实例提供。

Claims (25)

1.包含变体葡糖淀粉酶的组合物，所述变体葡糖淀粉酶包含与SEQ IDNO:1相比的氨基酸取代，其中所述氨基酸取代在选自下组的位置编号处：111、30、14、23、31、35、36、39、44、49、50、51、53、69、83、98、117、118、119、121、147、157、179、186、197、250、262、284、286、287、288、300、309、311、317、347、362、385、388、400、413、415、419、423、434、457、463、516、526、530、533、534、535、540、545、547、553、555、564、572、576、577、581、583、585和588，且其中所述变体酶与SEQ ID NO:1至少95％相同。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述氨基酸取代选自下组：A111G,S14Q、K23N、K23R、K23Y、S30D、S30N、S30P、T31E、T31K、T31N、T31Q、A35L、S36R、S39A、L44I、T49K、T49R、S50E、S50I、S50N、S50Y、N51D、D53N、I69L、I69M、E83K、T98S、A117P、A117V、D118N、L119M、Q121A、Q121P、Y147W、C157W、Y179F、P186Y、Y197H、S250D、S250E、S250K、A262S、Q284H、I286A、T287N、T288H、A300L、A300Q、T309D、T309E、T309Q、L311V、A317K、L347K、T362A、S385L、S385Q、T388I、T388K、T388Y、T400K、N413S、A415D、A415F、A415N、A415S、A415T、A415W、A415Y、Q419P、Q423M、Q423P、S434T、G457N、G457P、T463F、F516L、L526F、S530E、S530G、T533K、A534L、S535E、S535G、S535K、S535T、T540A、T540S、V545L、Q547A、Q547H、F553Y、F555Y、I564F、K572E、V576I、V576L、G577R、T581I、T581K、V583F、V585P和S588Q。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶在选自下组的条件下与SEQID NO:1相比具有好至少1.1倍的活性：于40℃的活性和热活性、于57℃的热稳定性、于59℃的热稳定性、于62℃的热稳定性、于67℃的热稳定性和于72℃的热稳定性。
4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶包含取代A111G。
5.根据权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶包含取代S30P/A111G。
6.根据权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代K23R/S30P/S39A/T49K/A111G/L119M/Q423P。
7.根据权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P。
8.根据权利要求1-5或7中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶包含氨基酸取代K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/Q121P/T309D/A415Y/N413S/Q423P。
9.根据权利要求1-8中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶与SEQ ID NO:1的亲本葡糖淀粉酶表现出至少95％、97％、98％、或99％同一性。
10.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶具有SEQ ID NO:3。
11.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶具有SEQ ID NO:5。
12.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶具有SEQ ID NO:207。
13.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶具有SEQ ID NO:307。
14.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶具有SEQ ID NO:361。
15.根据权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶具有选自下组的氨基酸取代：A111G/Q547A、A111G、A111G/Y179F、I69M/A111G/Q547H、I69L/A111G、A111G/Q419P、A111G/F555Y、I69L/A111G/Q547A、A111G/L311V、A111G/I286A/T288H/L311V/F516L/Q547A、Q547A、A111G/F516L/F555Y、A111G/A262S/Q547A、A111G/Y179F/A262S、A111G/Y147W、A117V/I564V、T98S/A117V/I564V、A117V、A117V/Q284H/T287N/I564V、I564V、T98S/A117V、V545L、A117V/F553Y、A117V/S434T、A117V/Y197H/V545L、T98S/A117V/F553Y、S30N/A111G、T49R/A111G、L44I/A111G、A111G/A117P、S30P/A111G、K23N/A111G、T31N/A111G、T31E/A111G、D53N/A111G、N51D/A111G、S39A/A111G、K23R/A111G、A35L/A111G、T31Q/A111G、T31K/A111G、S50I/A111G、S50Y/A111G、T49K/A111G、K23Y/A111G、S50E/A111G、S36R/A111G、S30D/A111G、A111G/S530E、A111G/T540S、A111G/S535E、A111G/S530G、A111G/T533K、A111G/A534L、A111G/S535T、A111G/Q423P、A111G/Q423M、A111G/Q121A、A111G/S535G、A111G/T540A、A111G/L119M、A111G/Q121P、A111G/S535K、A111G/V585P、A111G/V583F、A111G/G577R、A111G/T581K、A111G/V576I、A111G/K572E、A111G/V576L、A111G/S588Q、A111G/T581I、S30P/A111G/N413S、S30P/A111G/N413D、S30P/A111G/T362A、S30P/A111G/G457P、S30P/A111G/T463F、S30P/A111G/A317K、S30P/A111G/T388K、S30P/A111G/T388I、S30P/A111G/T388Y、S30P/A111G/G457N、S30P/A111G/P186Y、S30P/A111G/K23R/S39A/N51D、S30P/A111G/K23R/S39A/S50E/L119M/Q121P、S30P/A111G/K23R/T49K/S50E、S30P/A111G/K23R/S50E/N51D/A117V/L119M、S30P/A111G/L119M/Q121A、S30P/A111G/S39A/S50I/N51D/Q423P、S30P/A111G/Q423P、S30P/A111G/K23R/Q423P、S30P/A111G/A117P、S30P/A111G/S39A/A117V、S30P/A111G/S39A/T49R/L119M、S30P/A111G/T49K/Q423P、S30P/A111G/N51D/L119M、S30P/A111G/A117V/L119M/Q121P/Q423P、S30P/A111G/T49R/A117P/L119M、S30P/A111G/L119M、S30P/A111G/S39A/T49R/S50I/N51D、S30P/A111G/A117V、S30P/A111G/S39A、S30P/A111G/K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P、S30P/A111G/K23R/T49R、S30P/A111G/K23R/N51D/L119M/Q121P、S30P/A111G/L44I/A117V/L119M、S30P/A111G/T31K/L119M/Q423P、S30P/A111G/L44I、S30P/A111G/A415N、S30P/A111G/T400K、S30P/A111G/A415D、S30P/A111G/A415Y、S30P/A111G/L347K、S30P/A111G/A415T、S30P/A111G/A415W、S30P/A111G/A415F、S30P/A111G/T309Q、S30P/A111G/S385L、S30P/A111G/S385Q、S30P/A111G/S250E、S30P/A111G/T309E、S30P/A111G/T309D、S30P/A111G/S14Q、S30P/A111G/S250D、S30P/A111G/S250K、S30P/A111G/A300Q、S30P/A111G/A300L,K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/T31E/N51D/Q121P、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/N413D、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/N51D、K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/L44I/A117V、K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/Q121P/N413S、K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/N413D、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/N51D/N413S、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/A117V/N413S、K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/T31E/L44I/N51D/A117V、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/N51D/N413D、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/L44I/N51D/N413D、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/S50N/N51D/C157W、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/N51D、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/L44I/N51D、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/L44I/A117V、K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/L44I/N51D/A117V/Q121A、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/L44I/A117V、K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/L44I/N51D/A117V、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/L44I/N51D/A117V/N413S、K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/A117V/Q121A/N413D、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/L44I/A117V/Q121P、K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/N51D、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/L44I/Q121P/N413S、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/L44I/Q121P、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/L44I/N413S、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/L44I/N51D/A117V/N413S、K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/N51D/A117V/N413S、K23R/S39A/T49K/L119M/Q423P/N51D/N413S、K23R/S39A/T49R/L119M/Q423P/T31E/L44I、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T31E/Q121A/S413D、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/Q121P/S413D/A415N、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/A415W、K23R/S30P/S39A/T49K/A111G/L119M/Q423P/A415F、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T309D/A415S、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T309E、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T309E/A415W、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/A415D、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/E83K/D118N/、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/R49K、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T31E/A415F、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/A415Y、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T31E/T309E/A415W、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T31E/R49K/Q121A/A415W、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T31E/A415Y、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/R49K/T309E/A415D、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T31E/R49K/T309D/A415F/L526F、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T31E/T309D、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/Q121P/T309E/A415F、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/S413D/A415N、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T31E/Q121P/A415Y、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/Q121A/A415Y、K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/T309D/A415W和K23R/S30P/S39A/L44I/T49R/N51D/A111G/A117V/L119M/N413S/Q423P/Q121P/T309D/A415Y。
16.根据权利要求17的组合物，其中所述变体葡糖淀粉酶包含选自下组的序列：SEQ IDNO:1至361的奇数编号。
17.核酸构建体，其包含编码根据权利要求1-16中任一项的变体葡糖淀粉酶的核酸。
18.表达载体，其包含权利要求17的核酸。
19.宿主细胞，其包含权利要求17的核酸。
20.宿主细胞，其包含权利要求19的表达载体。
21.权利要求19或20的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自下组：细菌细胞、真菌细胞、或酵母细胞。
22.生成变体葡糖淀粉酶的方法，其包括：a)在表达所述变体葡糖淀粉酶的条件下培养包含表达根据权利要求1-16的变体葡糖淀粉酶的核酸的宿主细胞；并且b)回收所述变体葡糖淀粉酶。
23.适合于动物食用(consumption)的配制剂，其中所述配制剂包含根据权利要求1-16的变体葡糖淀粉酶和一种或多种可食用的组分。
24.从淀粉底物的碳水化合物糖化的方法，其包括使所述底物与根据权利要求1-6中任一项的变体葡糖淀粉酶接触，其中降解所述淀粉。
25.酶活性变体葡糖淀粉酶，其具有以下序列：
SPVSKRATLDEFI-X14-TERPLALE-X23-LLCNIG-X30-X31-GCR-X35-X36-GA-X39-SGVV-X44-ASPS-X49-X50-X51-P-X53-YYYTWTRDAALVFKE-X69-VDSVETNTTLLLP-X83-IENYVTAQAYLQTV-X98-NPSGSLSDGAGL-X111-EPKFN-X117-X118-X119-T-X121-FTGAWGRPQRDGPALRATAMIAYYN-X147-LLNNNATTD-X157-GLWQIIQNDLNYVAQYWNQTG-X179-DLWEEV-X186-GSSFFTVAAQ-X197-RALVEGSTLAAKLGKSHSAYDTVAPQILCYLQSFWSSSKGYIVANTQTASWV-X250-RSGLDANTPLT-X262-IHLFDPELGCDDSTFQPCSPK-X284-L-X286-X287-X288-KKLVDSFRSIY-X300-INSGKSAG-X309-A-X311-AVGRY-X317-EDVYYNGNPWYLCTLAVAEQLYDAVYTWK-X347-EGSITVTSVSLPFF-X362-DLLPSLTTGTYASGSTTFESII-X385-AV-X388-TYADGFVSIVQ-X400-YTPSDGALSEQY-X413-K-X415-NGQ-X419-LSA-X423-DLTWSYAAFL-X434-ATERRDSVVPAGWAGASSVSVP-X457-ACAAT-X463-VVGTYAAASNCGTPGSGSGGNGGSSGNALVTFNELATTYYGENIKLVGSTAA-X516-GSWSPSAGI-X526-LSA-X530-SY-X533-X534-X535-NPLW-X540-TTVS-X545-P-X547-GSTVE-X553-K-X555-IRVGSDGS-X564-TWESGNN-X572-VLT-X576-X577-SSA-X581-S-X583-T-X585-SA-X588-WNGAYSVSSS，
其中X14选自下组：S和Q；
X23选自下组：K、N、R和Y；
X30选自下组：S、D、N和P；
X31选自下组：T、E、K、N和Q；
X35选自下组：A和L；
X36选自下组：S和R；
X39选自下组：S和A；
X44选自下组：L和I；
X49选自下组：T、K和R；
X50选自下组：S、E、I、N和Y；
X51选自下组：N和D；
X53选自下组：D和N；
X69选自下组：I、L和M；
X83选自下组：E和K；
X98选自下组：T和S；
X111选自下组：A和G；
X117选自下组：A、P和V；
X118选自下组：D和N；
X119选自下组：L和M；
X121选自下组：Q、A和P；
X147选自下组：Y和W；
X157选自下组：C和W；
X179选自下组：Y和F；
X186选自下组：P和Y；
X197选自下组：Y和H；
X250选自下组：S、D、E和K；
X262选自下组：A和S；
X284选自下组：Q和H；
X286选自下组：I和A；
X287选自下组：T和N；
X288选自下组：T和H；
X300选自下组：A、L和Q；
X309选自下组：T、D、E和Q；
X311选自下组：L和V；
X317选自下组：A和K；
X347选自下组：L和K；
X362选自下组：T和A；
X385选自下组：S、L和Q；
X388选自下组：T、I、K和Y；
X400选自下组：T和K；
X413选自下组：N和S；
X415选自下组：A、D、F、N、S、T、W和Y；
X419选自下组：Q和P；
X423选自下组：Q、M和P；
X434选自下组：S和T；
X457选自下组：G、N和P；
X463选自下组：T和F；
X516选自下组：F和L；
X526选自下组：L和F；
X530选自下组：S、E和G；
X533选自下组：T和K；
X534选自下组：A和L；
X535选自下组：S、E、G、K和T；
X540选自下组：T、A和S；
X545选自下组：V和L；
X547选自下组：Q、A和H；
X553选自下组：F和Y；
X555选自下组：F和Y；
X564选自下组：I和F；
X572选自下组：K和E；
X576选自下组：V、I和L；
X577选自下组：G和R；
X581选自下组：T、I和K；
X583选自下组：V和F；
X585选自下组：V和P；
X588选自下组：S和Q；并且
其中所述变体不是SEQ ID NO:1。
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