CN105164253A - 葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及葡糖淀粉酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

葡糖淀粉酶变体和编码它们的多核苷酸

对序列表的引用

本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及葡糖淀粉酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、以及使用这些变体的方法。还描述了本发明的葡糖淀粉酶用于淀粉转化以产生发酵产物，例如乙醇、和糖浆(例如葡萄糖)的用途。本发明还涉及一种包含本发明的葡糖淀粉酶的组合物。

相关技术说明

葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)是催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的一种酶。葡糖淀粉酶由若干丝状真菌和酵母产生，其中来自曲霉菌属(Aspergillus)的那些在商业上最为重要。

在商业上，葡糖淀粉酶用于将已经由α-淀粉酶部分水解的含淀粉材料转化成葡萄糖。然后可以使用一种发酵有机体将葡萄糖直接或间接地转化成发酵产物。商业发酵产物的实例包括醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸类(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸、葡糖酸盐、乳酸、丁二酸、2,5-二酮-D-葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H₂和CO₂)；以及更复杂的化合物，包括例如抗生素(例如，盘尼西林和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素)；激素以及难以合成生产的其他化合物。发酵过程通常还用于可食用酒精(例如，啤酒和酒)工业、乳制品(例如，在酸乳和奶酪的生产中)工业中。

最终产物还可以是糖浆。例如，最终产物可以是葡萄糖，但是还可以被葡萄糖异构酶转化成果糖或由几乎均等的葡萄糖与果糖组成的一种混合物。这种混合物或进一步富含果糖的一种混合物是全世界商业化的最常用的高果糖玉米糖浆(HFCS)。

本发明的一个目的是提供具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸，并且这些多肽和多核苷酸在发酵产物的生产过程中提供高产量，这些生产过程例如乙醇生产过程，包括从未凝胶化的生淀粉(或未蒸煮的淀粉)的一步乙醇发酵过程。

WO2011/068803披露了分离自粘褶菌属真菌的葡糖淀粉酶。具体地，分离自篱边粘褶菌和密粘褶菌。

本发明提供了与其亲本相比具有改进的特性的葡糖淀粉酶变体。

发明概述

本发明涉及葡糖淀粉酶变体，包括在对应于SEQIDNO:3的多肽的位置95、59、119、121、18、426、和316的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。

本发明还进一步涉及包括本发明的变体葡糖淀粉酶的组合物。

在另一个方面，本发明涉及该变体葡糖淀粉酶用于生产糖浆或发酵产物的用途。

仍在另一个方面，本发明涉及一种由含淀粉材料生产发酵产物的方法，包括以下步骤：

(a)在一种α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；

(b)使液化的材料糖化；以及

(c)使用一种发酵有机体进行发酵；

其中使用本发明的至少一种变体葡糖淀粉酶进行步骤(a)和/或步骤(b)。

在另一个方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物的方法，包括以下步骤：

(a)在低于含淀粉的材料的初始凝胶化温度的温度下使所述含淀粉的材料糖化；以及

(b)使用一种发酵有机体进行发酵，

其中使用本发明的至少一种变体葡糖淀粉酶进行步骤(a)。

定义

葡糖淀粉酶：术语葡糖淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)被定义为催化D-葡萄糖从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放的一种酶。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序测定葡糖淀粉酶活性。葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下(37℃，pH4.3，底物：23.2mM麦芽糖，缓冲液：0.1M醋酸盐，反应时间：5分钟)每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量。

本发明的多肽具有SEQIDNO:2的成熟多肽的至少20％、优选至少40％、优选至少45％、更优选至少50％、更优选至少55％、更优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％以及甚至最优选至少100％的葡糖淀粉酶活性。

在另一实施例中，本发明的多肽具有SEQIDNO:3的多肽的至少20％、优选至少40％、优选至少45％、更优选至少50％、更优选至少55％、更优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％以及甚至最优选至少100％的葡糖淀粉酶活性。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

cDNA：术语“cDNA”是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指明变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生(native)的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。

片段：术语“片段”意指在一种成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如若干个)氨基酸的一种多肽。其中该片段具有葡糖淀粉酶活性。在一个方面，一个片段包含至少454个氨基酸残基(例如，SEQIDNO:2的氨基酸18至471或SEQIDNO:3的氨基酸1至454)，包括催化结构域并且具有根据本发明所述的一个或多个取代。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

改进的特性：术语“改进的特性”意指与变体相关的与亲本相比得到改进的特征。此类改进的特性包括但不限于比活性、葡萄糖耐受性、和热稳定性。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然发生的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其本质相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多拷贝；使用比编码该物质的基因本质相关的启动子强的启动子)。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。

低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在50℃下洗涤三次，每次15分钟。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸18至576。SEQIDNO:2的氨基酸1至17是信号肽。本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。成熟多肽在此被披露为SEQIDNO:3。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有葡糖淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQIDNO:1的核苷酸52至1728(或至1731，包括终止密码子)。SEQIDNO:1的核苷酸1至51编码信号肽。

中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。

中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。

亲本或亲本葡糖淀粉酶：术语“亲本”或“亲本葡糖淀粉酶”意指进行变化以产生本发明的酶变体的葡糖淀粉酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位拓展罚分0.5，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的脱氧核糖核酸核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数)

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有葡糖淀粉酶活性的片段。在一个方面，一个子序列至少编码根据本发明所述的变体的催化结构域。例如，包含至少1362个核苷酸(例如，SEQIDNO:1的核苷酸52至1413)。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有葡糖淀粉酶活性的一个多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。本发明的变体具有披露为SEQIDNO:3的SEQIDNO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少45％、更优选至少50％、更优选至少55％、更优选至少60％、更优选至少65％、更优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、甚至更优选至少90％、最优选至少95％以及甚至最优选至少100％的葡糖淀粉酶活性。

非常高严格条件：术语“非常高严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。

非常低严格条件：术语“非常低严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。

野生型葡糖淀粉酶：术语“野生型”葡糖淀粉酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的一种葡糖淀粉酶。

变体命名惯例

出于本发明的目的，在SEQIDNO:3中披露的成熟多肽用于确定另一种葡糖淀粉酶中相对应的氨基酸残基。将另一种葡糖淀粉酶的氨基酸序列与SEQIDNO:3中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定与SEQIDNO:3中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。

可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种葡糖淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴别，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(NucleicAcidsResearch)32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物学方法(MethodsinMolecularBiology)537:39-64；加藤和都，2010，生物信息学26:1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的EMBOSSEMMA。

当其他酶与SEQIDNO:2的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(谱(profile))来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究(NucleicAcidsRes.)25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学(Bioinformatics)19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定此类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或组合延伸(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程(ProteinEngineering)11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学(Bioinformatics)16:566-567)。

在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。

缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、^*。因此，在位置195处的甘氨酸缺失表示为“Gly195*”或者“G195*”。多重缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195^*+Ser411^*”或“G195^*+S411^*”。

插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、初始氨基酸、插入氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或者“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为“Glyl95GlyLysAla”或“G195GKA”。

在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：

亲本：	变体：
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

多种改变。包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。

不同改变。可以在一个位置上引入不同的改变时，这些不同的改变由一个逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

发明详细说明

本发明涉及葡糖淀粉酶变体，这些变体包括在与SEQIDNO:3的多肽的位置59、95、119、121、18、426、和316相对应的一个或多个(例如，数个)位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性。具体地，与披露为SEQIDNO:3的葡糖淀粉酶相比，这些变体具有改进的特性。特别地，这一改进的特性是改进的热稳定性、增加的葡萄糖耐受性和/或增加的比活性。根据本发明所述的变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

SEQIDNO:2的成熟多肽对应于SEQIDNO:3。因此在此引用的位置编号对应于SEQIDNO:3的位置编号。

变体

本发明提供了多种葡糖淀粉酶变体，这些葡糖淀粉酶变体在与位置59、95、119、121、18、426、和316相对应的一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变，具体地是取代。

在一个实施例中，分离这些变体。

在一个实施例中，该变体与亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

在另一个实施例中，该变体与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％、但是小于100％的序列一致性。在一个实施例中，SEQIDNO:2的成熟多肽是SEQIDNO:3。

因此在一个实施例中，本发明涉及葡糖淀粉酶变体，该变体包括在对应于SEQIDNO:3的多肽的位置95、59、119、121、18、426、和316的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

在另一个方面，变体包括在与位置59、95、119、121、18、426、和316相对应的一个或多个位置处的取代。在另一方面，变体包含在与位置59、95、119、121、18、426、以及316中的任何一个相对应的两个位置处的取代。在另一方面，变体包含在与位置59、95、119、121、18、426、以及316中的任何一个相对应的三个位置处的取代。在另一方面，变体包含在与位置59、95、119、121、18、426、以及316中的任何一个相对应的四个位置处的取代。在另一方面，变体包含在与位置59、95、119、121、18、426、以及316中的任何一个相对应的五个位置处的取代。在另一方面，变体包含在与位置59、95、119、121、18、426、以及316中的任何一个相对应的六个位置处的取代。在另一方面，变体包含在与位置59、95、119、121、18、426、以及316相对应的每个位置处的取代。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置18的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，在对应于位置18的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、或Tyr取代，优选被Phe取代。在另一个方面，该变体改变包括SEQIDNO:3的多肽的取代V18F或由该取代组成。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，在对应于位置59的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、或Tyr取代，优选被Ala、Cys、Gly或Ile取代。在另一个方面，该变体改变包括SEQIDNO:3的多肽的取代V59A、V59C、V59G、或V59I或者由这些取代组成。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置95的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Pro取代。在另一个方面，该变体改变包括SEQIDNO:3的多肽的取代S95P或由该取代组成。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置119的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，在对应于位置119的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Trp取代。在另一个方面，该变体改变包括SEQIDNO:3的多肽的取代T119W或由该取代组成。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置121的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，在对应于位置121的位置的氨基酸被Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或者Val取代，优选被Pro取代。在另一个方面，该变体改变包括SEQIDNO:3的多肽的取代A121P或由该取代组成。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置316的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，在对应于位置316的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Trp取代。在另一个方面，该变体改变包括SEQIDNO:3的多肽的取代S316W或由该取代组成。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置426的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，在对应于位置426的位置的氨基酸被Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或者Val取代，优选被Gly取代。在另一个方面，该变体改变包括SEQIDNO:3的多肽的取代A426G或由该取代组成。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置18和59的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置18和95的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置18和119的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置18和121的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置18和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置18和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59和95的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59和119的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59和121的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95和119的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95和121的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置119和121的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置119和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置119和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置121和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置121和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置316和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、95、和119的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、95、和121的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、95、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、119、和121的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、119、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、119、和121的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、119、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置119、121、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、95、和18的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、95、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、119、和18的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、119、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、121、和18的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、121、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、121、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、18、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、18、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、426、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、119、和18的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、119、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、121、和18的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、121、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、121、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、18、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、18、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、426、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置119、121、和18的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置119、121、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置119、18、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置119、18、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置119、426、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置121、18、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置121、18、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置121、426、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置18、426、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、95、119、和121的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、95、119、和18的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、95、119、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、95、119、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、95、121、和18的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、95、121、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、95、121、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、95、18、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、95、18、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、95、426、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、119、121、和18的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、119、121、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、119、121、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、119、18、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、119、18、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、119、426、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、121、18、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、121、18、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、121、426、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置59、18、426、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、119、121、和18的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、119、121、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、119、121、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、119、18、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、119、18、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、119、426、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、121、18、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、121、18、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、121、426、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置95、18、426、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置119、121、18、和426的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置119、121、18、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置119、121、426、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置119、18、426、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体改变包括在对应于位置121、18、426、和316的位置处的取代或由其组成，例如以上所述的那些。

在另一个方面，该变体包括以下列出的特定取代或SEQIDNO:3的多肽的特定取代的组合或者由这些取代组成：

V18F；或

V59A；或

V59C；或

V59G；或

V59I；或

S95P；或

T119W；或

A121P；或

A426G；或

S316W；或

S95P+A121P；或

V59A+S95P；或

S95P+T119W；或

V59A+S95P+A121P；或

S95P+T119W+A121P；或

V59C+A426G；或

V59G+A426G；或

V18F+V59I；或

V59C+S95P+T119W+A426G；或

V59C+S95P+T119W+A121P+A426G；或

V59C+S95P+A121P+A426G；或

V18F+V59I+S95P+A121P；或

V18F+V59I+S95P+T119W+A121P；或

S95P+A121P+S316W；并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

在另一个实施例中，该变体包括以下列出的特定取代或SEQIDNO:3的多肽的特定取代的组合或者由这些取代组成：

V59A；或

S95P；或

T119W；或

A121P；或

S95P+A121P；或

V59A+S95P；或

S95P+T119W；或

V59A+S95P+A121P；或

S95P+T119W+A121P；并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

与SEQIDNO:3的葡糖淀粉酶相比，这些特定的取代和取代的组合已经在此示出增加变体葡糖淀粉酶的热稳定性。

在另一个实施例中，该变体包括以下列出的特定取代或SEQIDNO:3的多肽的特定取代的组合或者由这些取代组成：

V59C+S95P+T119W+A426G；或

V59C+S95P+T119W+A121P+A426G；或

V59C+S95P+A121P+A426G；或

V18F+V59I+S95P+A121P；或

V18F+V59I+S95P+T119W+A121P；并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

这些特定的取代和取代的组合已经在此示出增加根据本发明的变体葡糖淀粉酶的热稳定性连同降低其葡萄糖抑制。

在另一个实施例中，该变体包括以下列出的特定取代或SEQIDNO:3的多肽的特定取代的组合或者由这些取代组成：

S95P+A121P+S316W；并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

取代的这种特定组合已经在此示出增加根据本发明的变体葡糖淀粉酶的热稳定性连同增加其比活性。

在一个实施例中，通过引入选自下组的一个或多个取代，提供了根据本发明的葡糖淀粉酶变体的改进的热稳定性，该组由以下各项组成：59A、95P、119W、和121P，并且具体地，葡糖淀粉酶变体包括取代95P+121P、更具体地S95P+A121P，并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

在另一个实施例中，通过引入选自下组的取代的组合中的一个或多个，提供了根据本发明的葡糖淀粉酶变体的降低的葡萄糖抑制，该组由以下各项组成：59C+426G、59G+426G、和18F+59I，更具体地，V59C+A426G、或V59G+A426G、或V18F+V59I，并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

在另一个实施例中，通过引入316W取代、具体地S316W，提供了根据本发明的葡糖淀粉酶变体的增加的比活性，并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

在一个具体实施例中，可以通过去除淀粉结合结构域(SBD)，由此导致该变体的G2形式，来改进变体葡糖淀粉酶的比活性。在一个更具体的实施例中，在G2形式中，去除SEQIDNO:3的氨基酸455-559。如实例中所示，这是针对包括S95P+A121P+S316W或S95P+A121P的变体的G2形式所观察到的。

因此，在具体的实施例中，通过去除SBD，具体地是SEQIDNO:3的455-559，更具体地是包括S95P+A121P+S316W或S95P+A121P的变体中的SBD，提供了根据本发明的葡糖淀粉酶变体的增加的比活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

变体可以进一步包括在一个或多个(例如若干个)其他位置处的一个或多个另外的取代。

应当指出，对于所有的披露的特定变体，这样的另一个变化可以被引入而不显著地影响这些葡糖淀粉酶变体的特性。在一方面，除了在此讨论的特定取代，在本发明的变体中的取代数目是1-20个，例如1-10个和1-5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代。

因此，与SEQIDNO:3的亲本多肽相比，变体多肽的％一致性可以是至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的与SEQIDNO:3的多肽的序列一致性。

在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少85％、但是小于100％的序列一致性。

在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少90％、但是小于100％的序列一致性。

在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少91％、但是小于100％的序列一致性。

在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少92％、但是小于100％的序列一致性。

在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少93％、但是小于100％的序列一致性。

在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少94％、但是小于100％的序列一致性。

在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少95％、但是小于100％的序列一致性。

在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少96％、但是小于100％的序列一致性。

在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少97％、但是小于100％的序列一致性。

在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少98％、但是小于100％的序列一致性。

在一个具体实施例中，以上变体具有葡糖淀粉酶活性，并且该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少99％、但是小于100％的序列一致性。

除了在此描述的特定取代，可以存在的这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(H.Neurath)和R.L.希尔(R.L.Hill)，1979，在蛋白质(TheProteins)，学术出版社，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu以及Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质:改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基上引入单一丙氨酸突变，并且测试所得的突变型分子的葡糖淀粉酶活性以鉴别对分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(deVos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴定必需氨基酸。

在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的比活性。使用AGU测定法确定比活性。

在一个实施例中，与亲本相比，该变体具有改进的葡萄糖耐受性(或降低的葡萄糖抑制)。葡萄糖抑制被确定为相对于如SEQIDNO:3披露的亲本酶，具有和不具有30％葡萄糖的葡糖淀粉酶活性的比率。对于细节，参见包括在此的材料和方法部分。

在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的热稳定性。热稳定性被测量为，使用龟甲万(Kikkoman)测定试剂盒，在32℃的残余活性。对于细节，参见在此的材料和方法。

亲本葡糖淀粉酶

亲本葡糖淀粉酶可以是(a)一种与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少85％序列一致性的多肽；(b)由在中-高严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；或(c)由与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％序列一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽。

在一个方面，亲本与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有葡糖淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQIDNO:2的成熟多肽相差多达10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。

在另一方面，该亲本包括SEQIDNO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包括SEQIDNO:2的成熟多肽或由其组成。在另一方面，亲本包括SEQIDNO:3或者由其组成。

在另一实施例中，该亲本是SEQIDNO:2的成熟多肽的一个等位基因变体。

在另一方面，该亲本由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件下、或非常高严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，第二版，冷泉港(ColdSpringHarbor)，纽约)。

可以使用SEQIDNO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQIDNO:2的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或种的菌株的亲本进行编码的DNA。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以针对与上文所述的探针杂交并编码一个亲本的DNA来筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQIDNO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下项的标记的核酸探针杂交：(i)SEQIDNO:1；(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列；(iii)它们的全长互补体；或(iv)它们的子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一方面，核酸探针是SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列。在另一方面，核酸探针是SEQIDNO:1的核苷酸52至1728。在另一方面，核酸探针是编码以下项的多核苷酸：SEQIDNO:2的多肽；它的成熟多肽；或它的一个片段。在另一方面，核酸探针是SEQIDNO:1。

在另一个实施例中，该亲本是由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或者100％的序列一致性。

该多肽可以是一种杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。

亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。

融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure，Function，andGenetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(DrugDiscoveryWorld)4:35-48。

该亲本可以从任何属类的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面中，该亲本是胞外分泌的。

该亲本可以是一种真菌性葡糖淀粉酶。例如，该亲本可以是粘褶菌属或栓菌属葡糖淀粉酶。

在另一个方面，该亲本是密粘褶菌、篱边粘褶菌、或瓣环栓菌葡糖淀粉酶。

在另一方面，该亲本是密粘褶菌葡糖淀粉酶，例如SEQIDNO:2的葡糖淀粉酶或其成熟多肽。

将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfectandimperfectstates)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures，CBS)以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样本的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，见上文)。

变体的制备

可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。

定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。

通过使用涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究(NucleicAcidsRes.)18:7349-4966。

还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公开号2004/0171154；斯道瑞希(Storici)等人，2001，自然生物技术(NatureBiotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及凯利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学简讯(FungalGenet.Newslett.)43:15-16。

在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要体外合成一种设计的多核苷酸分子以编码一种所感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然(Nature)432:1050-1054)所描述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(NatureBiotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的一个过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包括编码本发明的一种变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的一种多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在一种适合的宿主细胞中的表达。

可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供一种变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是一个启动子，即由一个宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的一种多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(ScientificAmerican)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Usefulproteinsfromrecombinantbacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(FusariumvenenatumDaria)(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(FusariumvenenatumQuinn)(WO00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切右旋糖酐酶I、里氏木霉内切右旋糖酐酶II、里氏木霉内切右旋糖酐酶III、里氏木霉内切右旋糖酐酶IV、里氏木霉内切右旋糖酐酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。

用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马努斯等人，1992，见上文描述。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(JournalofBacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是一个前导序列，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的一个信号的一种序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.CellularBiol.)15:5983-5990中得以描述。

该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N-端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列5’-端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增加变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(MicrobiologicalReviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。见上文，罗马诺斯(Romanos)等人(1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。

该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调控系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调控序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包括编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(NucleicAcidsRes.)15:9163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO00/24883披露的方法完成。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的一种多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在重组产生一个变体中有用的任何细胞，例如一个原核细胞或一个真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌菌、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(NucleicAcidsRes.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(AinsworthandBisby’sDictionaryofTheFungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CABInternational)，大学出版社(UniversityPress)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。

该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(BiologyandActivitiesofYeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会系列号9(Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9)，1980)中所描述来定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474，以及科里蒂森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(AcademicPress,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适于表达该变体的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该变体。

使用本领域已知的方法在适合于产生该变体的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。

使用本领域已知的对这些变体特异的方法可以检测该变体。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定该变体的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如，蛋白质纯化(ProteinPurification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCHPublishers)，纽约，1989)。

在一个替代方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的一个来源。

组合物

本发明还涉及包括本发明的一种多肽的组合物。优选地，该组合物还包括一种运载体和/或一种赋形剂。更优选地，这些组合物富含这样一种多肽。术语“富含”指示该组合物的葡糖淀粉酶活性已经增加，例如，以至少1.1的一个富集因子。优选地，配制这些组合物以提供所希望的特性，例如浅颜色、低气味、以及可接受的储存稳定性。

组合物可以包括本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包括多种酶活性，如氨肽酶、α-淀粉酶、异淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、支链淀粉酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

在一个具体的实施例中，该组合物包括α淀粉酶和根据本发明的变体葡糖淀粉酶。在一个具体的实施例中，该组合物包括异淀粉酶和根据本发明的变体葡糖淀粉酶。在另一个具体的实施例中，该组合物包括α淀粉酶、异淀粉酶和根据本发明的变体葡糖淀粉酶。

在另一个方面，该组合物包括与支链淀粉酶组合的本发明的变体葡糖淀粉酶。在另一个方面，该组合物包括与支链淀粉酶、和异淀粉酶组合的本发明的变体葡糖淀粉酶。在另一个方面，该组合物包括与支链淀粉酶、和α-淀粉酶组合的本发明的变体葡糖淀粉酶。

在一个具体实施例中，该组合物进一步包括蛋白酶。

可以根据本领域已知的方法来制备多肽组合物，并且这些多肽组合物可以处于液体或干燥组合物的形式。例如，多肽组合物可处于颗粒或微粒的形式。包括在该组合物中的多肽可以根据本领域中已知的方法稳定化。

以下给出了本发明的多肽或多肽组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。

以上组合物适合在液化、糖化、和/或发酵过程中使用，优选在淀粉转化中使用，尤其是用于产生糖浆和发酵产物，例如乙醇。

以下给出了本发明的多肽组合物的优选用途的实例。本发明的多肽组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。

用途

本发明还针对本发明的一种多肽在一个液化过程、一个糖化过程、和/或一个发酵过程中的用途。可以在一个单个过程中，例如在一个液化过程、一个糖化过程、或一个发酵过程中使用该多肽。也可以在多个过程的一个组合中、例如在一个液化和糖化过程、在一个液化和发酵过程中、或在一个糖化和发酵过程中(优选是与淀粉转化有关)使用该多肽。

在本发明的一个优选方面，这一液化、糖化、和/或发酵过程包括依序或同时地进行的液化和糖化过程。

在常规的酶液化过程中，添加热稳定的α-淀粉酶并且将长链淀粉降解成支链且线性的更短单位(麦芽糊精)，但是没有添加葡糖淀粉酶。本发明的葡糖淀粉酶是高度热稳定的，所以在液化过程中添加该葡糖淀粉酶是有利的。当在液化过程中与一种α淀粉酶组合时，本发明的葡糖淀粉酶具有一种协同效应。在常规的糖化过程中，将在液化过程中产生的糊精进一步水解以产生能被发酵有机体代谢的低分子量的糖类DP1-3。水解典型地使用葡糖淀粉酶完成；可替代地，除了葡糖淀粉酶之外，还可以使用α-葡糖苷酶和/或酸性α-淀粉酶。

当将本发明的葡糖淀粉酶(可能结合α-淀粉酶)应用于液化和/或糖化过程、尤其是一个同时的液化和糖化过程中时，可以在更高的温度下进行该过程。在高温，但是低于胶凝温度，例如在从40℃至65℃、更具体地从50℃至62℃、更具体地从59℃至62℃的范围的温度下，对于原淀粉(颗粒淀粉)的糖化，本发明的变体葡糖淀粉酶是尤其有用的。

通过在更高的温度下进行这一液化和/或糖化过程，可以在更短的时段内进行该过程，或可替代地可以使用更低的酶剂量来进行该过程。此外，当在更高温度下进行液化和/或糖化过程时，微生物污染的风险减小。

含淀粉材料的转化

本发明提供了本发明的葡糖淀粉酶用于从淀粉中产生葡萄糖和类似物的用途。总体上，该方法包括单独亦或在一种α-淀粉酶存在下使用本发明的变体葡糖淀粉酶部分地水解前体淀粉的步骤。

本发明的变体葡糖淀粉酶还可以结合仅水解在包括至少四个葡糖残基的分子中的α-(1,6)-糖苷键的一种酶来使用。

在另一方面，本发明涉及本发明的一种葡糖淀粉酶在淀粉转化中的用途。此外，可以在包括一个连续的糖化过程的一个连续淀粉转化过程中使用本发明的葡糖淀粉酶。

糖浆、饮料和/或发酵产物的产生

本发明的葡糖淀粉酶的用途包括将淀粉转化成例如糖浆饮料和/或一种发酵产物(包括乙醇)。

本发明还提供了一种使用本发明的葡糖淀粉酶，由含淀粉材料生产糖浆(如葡萄糖等)的方法。在“含淀粉材料”部分中例证说明了适合的起始材料。总体上，该过程包括以下步骤：在本发明的葡糖淀粉酶单独或结合α-淀粉酶的存在下部分或完全水解含淀粉材料(液化和/或糖化)以从淀粉或相关寡糖和多糖分子的非还原端释放葡萄糖。

本发明的葡糖淀粉酶还可以按固定的形式使用。这适合且经常用于产生特种糖浆(例如麦芽糖糖浆)连同用在与果糖糖浆(例如，高果糖糖浆(HFS))的产生有关的寡糖的残液流中。

发酵产物

术语“发酵产物”意指通过包括使用一种发酵有机体的一个发酵过程的过程产生的产物。根据本发明考虑的发酵产物包括醇类(例如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、丙三醇(glycerol)、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇[丙二醇]、丁二醇、甘油(glycerin)、山梨醇、以及木糖醇)；有机酸类(例如，乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、反丁烯二酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、丁二酸、以及木糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸类(例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、以及苏氨酸)；一种烷烃(例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、以及十二烷)；一种环烷烃(例如，环戊烷、环己烷、环庚烷、以及环辛烷)；一种烯烃(例如，戊烯、己烯、庚烯、以及辛烯)；多种气体(例如，甲烷、氢气(H₂)、二氧化碳(CO₂)、以及一氧化碳(CO))；抗生素类(例如，盘尼西林和四环素)；酶类；维生素类(例如，核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素)以及激素类。在一个优选方面，发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即适于饮用的浓酒精(neutralspirits)；或者在可食用酒精工业(例如啤酒和白酒)、乳制品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业、以及烟草工业中使用的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包括爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(maltliquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒、或清淡啤酒。优选使用的发酵过程包括本领域熟知的醇发酵过程。优选的发酵过程是本领域熟知的厌氧发酵过程。

酿造

本发明的葡糖淀粉酶是高度热稳定的并且因此它们可以用于在高温下需要淀粉水解的工业中。例如，本发明的葡糖淀粉酶可以用于酿造工业中。按本领域普通技术人员可容易确定的有效量来添加本发明的葡糖淀粉酶。

液化、糖化和/或发酵产物的产生

在这个方面，本发明涉及一种用于由含淀粉的材料产生一种液化、糖化和/或发酵产物的过程，该过程包括以下步骤：用本发明的一种多肽处理含淀粉的材料。在以下“含淀粉材料”部分中列出了多种适合的含淀粉的起始材料。在以下“酶”部分中列出了多种所考虑的酶。优选地，本发明的过程包括用单独的或与一种α-淀粉酶一起的本发明的一种多肽来处理含淀粉的材料。本发明的液化和/或糖化产品是糊精或低分子量糖(例如，DP1-3)。在这一液化过程中，通过添加本发明的一种葡糖淀粉酶提高了淀粉到葡萄糖、糊精和/或低分子量糖的转化。发酵之后，这一发酵产物(例如乙醇)可以任选例如通过蒸馏来回收。优选在酵母(优选酵母属的一种菌株)存在下进行发酵。在以下“发酵有机体”部分中列出了多种适合的发酵有机体。

由含凝胶化淀粉的材料生产发酵产物的方法

在这一方面，本发明涉及一种由含淀粉材料生产发酵产物，尤其是乙醇的方法，该方法包括液化步骤及依序地或同时地进行的糖化和发酵步骤。

本发明涉及一种由含淀粉材料生产发酵产物的方法，包括以下步骤：

(a)使用一种α-淀粉酶，使含淀粉的材料液化；

(b)使用一种葡糖淀粉酶使步骤(a)中获得的液化材料糖化；并且

(c)使用一种发酵有机体来发酵糖化的材料。

优选，步骤(a)还包括使用本发明的葡糖淀粉酶变体。在一个实施例中，在步骤(b)中还存在/添加了本发明的葡糖淀粉酶变体。

发酵产物，如尤其是乙醇，可以可任选地在发酵之后，例如通过蒸馏来回收。在以下“含淀粉材料”部分中列出了多种适合的含淀粉的起始材料。在以下“酶”部分中列出了多种所考虑的酶。优选在一种α淀粉酶存在下进行液化。优选在酵母(优选酵母属的一种菌株)存在下进行发酵。在以下“发酵有机体”部分中列出了多种适合的发酵有机体。在多个优选实施例中，连续或同时进行步骤(b)和(c)(即，作为SSF过程)。

在一个具体实施例中，本发明的方法在步骤(a)之前进一步包括以下步骤：

x)优选地通过研磨来减小该含淀粉的材料的粒度；并且

y)形成一种包含该含淀粉材料和水的浆料。

该水性浆料可以包含从10wt％至40wt％、优选25wt％至35wt％的含淀粉材料。将该浆料加热至凝胶化温度以上，并且可添加α-淀粉酶、优选细菌和/或酸性真菌α淀粉酶以开始液化(稀薄化(thinning))。在一个实施例中，在本发明的步骤(a)中经受一种α-淀粉酶之前可以喷气蒸煮该浆料以进一步使该浆料凝胶化。

更确切地说，液化可作为一个三步热浆料过程进行。该浆料被加热到介于60℃到95℃，优选地80℃到85℃之间，并且添加α-淀粉酶以开始液化(稀释)。然后，该浆料可以在介于95℃到140℃，优选地105℃到125℃之间的温度下进行喷射烹饪1-15分钟，优选地3-10分钟，尤其是约5分钟。该浆料被冷却到60℃到95℃，并且再添加α-淀粉酶以结束水解(二次液化)。通常在pH4.5-pH6.5、特别是在pH5-pH6之间进行液化过程。经过研磨并且液化的完整细粒称为糊状物(mash)。

可使用本领域熟知的条件来进行步骤(b)中的糖化。例如，全部糖化过程可以持续从约24到约72小时，然而，通常仅在介于30℃到65℃之间的温度下，典型地约60℃下进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在一个同时糖化和发酵过程(SSF过程)中，在发酵期间进行完全糖化。糖化典型地在从30℃到65℃，典型地约60℃的温度下，并且在介于4与5之间的pH，通常在约pH4.5下进行。

在发酵产物(尤其是乙醇)生产中最广泛使用的过程是同时糖化和发酵(SSF)过程，其中没有糖化的保持阶段(holdingstage)，这意味着发酵有机体(例如酵母)和一种或多种酶可一起添加。SSF可以典型地在介于25℃与40℃之间，如介于29℃与35℃之间，如介于30℃与34℃之间，如约32℃的温度下进行。根据本发明，该温度可以在发酵期间上下调整。

根据本发明，发酵步骤(c)包括但不局限于用于产生以下各项的发酵过程：醇类(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸类(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮类(例如，丙酮)；氨基酸类(例如，谷氨酸)；多种气体(例如，H₂和CO₂)；抗生素(例如，盘尼西林和四环素)；酶类；维生素类(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；以及激素类。优选的发酵过程包括如本领域熟知的醇发酵过程。优选的发酵方法是厌氧发酵方法，如本领域中众所周知的。

由含未凝胶化淀粉的材料生产发酵产物的过程

在这个方面，本发明涉及用于由含淀粉材料产生发酵产物的过程，其中这一含淀粉材料没有进行凝胶化(即，未蒸煮的含淀粉材料)。根据本发明，可以在不对包含了该含淀粉材料的水性浆料进行液化的情况下，生产希望的发酵产物，如乙醇。在一个实施例中，本发明的一种过程包括在低于凝胶化温度下、在一种α淀粉酶存在下将(碾磨的)含淀粉材料(例如颗粒状淀粉)糖化以产生可以通过一种适合的发酵有机体发酵成所希望的发酵产物的多种糖。在另一实施例中，在糖化和发酵过程中使用了本发明的葡糖淀粉酶和一种α淀粉酶。在一方面，本发明涉及一种用于由含淀粉材料产生发酵产物的过程，该过程包括：

(a)用根据本发明的成熟葡糖淀粉酶变体使含淀粉的材料在低于所述含淀粉的材料的初始凝胶化温度的一个温度下进行糖化，

(b)使用一种发酵有机体进行发酵。

可以连续或同时进行本发明的方法的步骤(a)和(b)。在一个实施例中，在步骤(a)之前制备包括水和含淀粉材料的一种浆料。

在一个优选实施例中，步骤(a)包括添加一种α淀粉酶。

该发酵方法可以进行一段1到250小时，优选地从25到190小时，更优选地从30到180小时，更优选地从40到170小时，甚至更优选地从50到160小时，又更优选地从60到150小时，甚至又更优选地从70到140小时并且最优选地从80到130小时的时间。

术语“起始凝胶化温度”意指淀粉凝胶化开始时的最低温度。在水中加热的淀粉在50℃与75℃之间开始凝胶化；凝胶化的准确温度依赖于具体的淀粉，并能够由本领域的技术人员容易地确定。因此，初始凝胶化温度可根据植物种类、植物种类的具体品种、以及生长条件而变化。在本发明的背景下，一种给定的含淀粉材料的初始凝胶化温度是使用由高瑞斯坦(Gorinstein)&李(Lii)，1992，淀粉(Starch/)44(12):461-466所述的方法使得5％的淀粉颗粒的双折射丧失的温度。

在步骤(a)之前，可以制备具有含淀粉材料的10wt％-55wt％干燥固体、优选25wt％-40wt％干燥固体、更优选30wt％-35wt％干燥固体的一种含淀粉材料(例如颗粒状淀粉)的浆料。该浆料可以包含水和/或工艺用水，例如釜馏物(反流)、涤气器水、蒸发器冷凝物或馏出物、来自蒸馏的侧部汽提器水、或其他发酵产物工厂工艺用水。因为本发明的过程是在低于凝胶化温度下进行的并且因此没有显著的粘性增加发生，所以如果需要可以使用高水平的釜馏物。在一个实施例中，水性浆料包含从约1vol％至约70vol％釜馏物、优选15vol％至60vol％釜馏物、尤其是从约30vol％至50vol％釜馏物。

含淀粉的材料可优选地通过干式或湿式研磨来减少粒度至0.05至3.0mm，优选地0.1-0.5mm而制备。在经受本发明的一种方法之后，这一含淀粉材料的至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或优选至少99％的干燥固体可以被转化成一种可溶的淀粉水解物。

在低于初始凝胶化温度的温度下进行本发明的过程。优选地，步骤(a)进行的温度是介于30℃到75℃之间，优选地介于45℃到60℃之间。

在一个优选实施例中，作为一个连续或同时的糖化和发酵过程进行步骤(a)和步骤(b)。在这种优选的实施例中，该过程典型地在介于25℃与40℃之间，如介于29℃与35℃之间，如介于30℃与34℃之间，如约32℃的温度下进行。根据本发明，该温度可以在发酵期间上下调整。

在一个实施例中，进行同时糖化和发酵，这样使得糖水平(例如葡萄糖水平)保持在一个低水平下，例如低于6wt％、优选低于约3wt％、优选低于约2wt％、更优选低于约1wt％、甚至更优选低于约0.5wt％、或甚至更优选0.25wt％、例如低于约0.1wt％。通过简单地采用调整量的酶和发酵有机体就可以实现这样的低水平的糖。本领域的普通技术人员可以容易地确定使用多少量的酶和发酵有机体。还可以选择酶和发酵有机体的所采用的量以在发酵液中维持低麦芽糖浓度。例如，该麦芽糖水平可以保持低于约0.5wt.％或低于约0.2wt.％。

该过程可以是在pH3与pH7之间的范围内、优选从pH3.5至pH6、或更优选从pH4至pH5的pH下进行。

本发明的葡糖淀粉酶变体是热稳定的，所以可以在高于常规的预糖化和/或糖化温度下进行预糖化和/或糖化。在一个实施例中，本发明的一个方法包括在同时糖化和发酵(SSF)方法之前将含淀粉材料预糖化。在移入SSF之前，可以在高温(例如，50℃-85℃，优选是60℃-75℃)下进行预糖化。

含淀粉材料

根据本发明可以使用任何适合的含淀粉的起始材料，包括颗粒状淀粉。通常基于所希望的发酵产物来选择起始材料。适合在本发明的方法中使用的含淀粉的起始材料的实例包括块茎、根、茎、全谷粒、玉米、穗轴、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯粉、高粱、稻米、豌豆、豆类、或甜薯、或其混合物、或者谷类、含糖原料(例如糖蜜)、水果材料、甘蔗或甜菜、马铃薯、以及含纤维素的材料(例如木材或植物残渣)、或其混合物。考虑了糯与非糯类型的玉米与大麦两者。

发酵有机体

“发酵有机体”是指适合在发酵过程中使用并且能够产生所希望的发酵产物的任何有机体，包括细菌和真菌有机体。尤其适合的发酵有机体能够使糖(例如葡萄糖或麦芽糖)直接或间接发酵成、即转化成所希望的发酵产物。发酵有机体的实例包括真菌有机体，例如酵母。优选的酵母包括酵母属菌株，特别是酿酒酵母。可商购的酵母包括例如RedStar^TM/乐斯福(Lesaffre)乙醇红(可从美国红星/乐斯福(RedStar/Lesaffre)获得)、FALI(可从美国伯恩斯菲利普食品有限公司(BurnsPhilpFoodInc.)的分公司弗莱施曼酵母(Fleischmann’sYeast)公司获得)、SUPERSTART(可从阿尔泰克公司(Alltech)获得)、GERTSTRAND(可从瑞典的GertStrandAB公司获得)、以及FERMIOL(可从帝斯曼食品配料部(DSMSpecialties)获得)。

酶

葡糖淀粉酶

该葡糖淀粉酶优选地是本发明的葡糖淀粉酶。然而，如上文所提到的，本发明的葡糖淀粉酶也可以与其他葡糖淀粉酶组合。

该葡糖淀粉酶的添加量可以为0.001到10AGU/gDS，优选地从0.01到5AGU/gDS，例如为约0.05、0.1、0.3、0.5、1或2AGU/gDS，尤其是0.05至0.5AGU/gDS或0.02-20AGU/gDS，优选地0.1-10AGU/gDS。

α-淀粉酶

根据本发明，α-淀粉酶可以是任何来源的。优选是真菌或细菌来源的α-淀粉酶。

在一个优选方面，该α-淀粉酶是一种酸性α-淀粉酶，例如真菌酸性α-淀粉酶或细菌酸性α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指以有效量添加，在3至7、优选从3.5至6或更优选从4-5的范围内的pH下具有最适活性的一种α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)。

细菌α-淀粉酶

根据本发明，一种细菌α-淀粉酶可优选来源于芽孢杆菌属。

在一个优选方面，芽孢杆菌α-淀粉酶是来源于地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，但还可以是来源于其他芽孢杆菌种类。所考虑的α-淀粉酶的具体实例包括示出在WO99/19467的SEQIDNO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(BLA)、示出在WO99/19467的SEQIDNO:5中的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(BAN)、以及示出在WO99/19467的SEQIDNO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSG)。在本发明的一个实施例中，该α-淀粉酶是与如WO99/19467中的SEQIDNO:1、2、3、4、或5所示的任何序列分别具有至少60％、优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少90％、例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的一致性程度的一种酶。

芽孢杆菌α-淀粉酶还可以是一种变体和/或杂合体，尤其是在任何以下各项中所述的一种变体和/或杂合体：WO96/23873、WO96/23874、WO97/41213、WO99/19467、WO00/60059、以及WO02/10355(所有文件都通过引用结合在此)。确切考虑的α-淀粉酶变体被披露在美国专利号6,093,562、美国专利号6,297,038或美国专利号6,187,576(通过引用结合在此)中，并且包括具有以下的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体：在位置179至182中具有一个或两个氨基酸的缺失、优选披露在WO1996/023873(参见，例如，第20页，第1至10行)(通过引用结合在此)中的一种双缺失(优选与WO99/19467披露的SEQIDNO:3中阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比对应于δ(181-182)的双缺失)、或者使用WO99/19467(该参考文献通过引用结合在此)的SEQIDNO:3进行编号的氨基酸179和180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，它与披露于WO99/19467中的SEQIDNO:3阐述的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比具有对应于δ(181-182)的一种双缺失并且进一步包括N193F取代(也被表示为I181*+G182*+N193F)。

α-淀粉酶还可以是一种麦芽糖α-淀粉酶。一种“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成处于α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB11837的一种麦芽糖α-淀粉酶是从丹麦诺维信公司(NovozymesA/S)可商购的。该麦芽糖α-淀粉酶被描述在美国专利号4,598,048、美国专利号4,604,355以及美国专利号6,162,628中，将其通过引用结合在此。

细菌杂合α-淀粉酶

确切考虑的一种杂合α-淀粉酶包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示出为WO99/19467中的SEQIDNO:4)的445个C-末端氨基酸残基和来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(示出为WO99/194676中的SEQIDNO:3)的37个N-末端氨基酸残基，它们具有一个或多个、尤其是全部的以下取代：

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用地衣芽孢杆菌编号)。还优选的是具有以下一个或多个突变(或其他芽孢杆菌α-淀粉酶主链中相应的突变)的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V及Q264S；和/或介于位置176与179之间的两个残基的缺失，优选地E178和G179的缺失(使用WO99/19467的SEQIDNO:5编号)。

真菌α-淀粉酶

真菌酸性α-淀粉酶包括来源于曲霉属的一种菌株的酸性α-淀粉酶，例如米曲霉、黑曲霉、或白曲霉(Aspergilluskawachii)α-淀粉酶。

优选的酸性真菌α-淀粉酶是一种真菌淀粉样(Fungamyl-like)的α-淀粉酶，该α-淀粉酶优选地来源于米曲霉菌株。在本披露中，术语“真菌淀粉样的α-淀粉酶”指示了与WO96/23874中的SEQIDNO:10中所显示的氨基酸序列的成熟部分展现出高一致性，即，超过70％，超过75％，超过80％，超过85％，超过90％，超过95％，超过96％，超过97％，超过98％，超过99％或甚至100％的一致性的一种α-淀粉酶。

另一种优选的酸性α-淀粉酶是来源于黑曲霉菌株。在一个优选方面，酸性真菌α-淀粉酶是来自在Swiss-prot/TeEMBL数据库中在主入藏号P56271下披露为“AMYA_ASPNG”并且在WO89/01969(实例3)中进行更详细描述的黑曲霉的一种α-淀粉酶。酸性黑曲霉酸性α-淀粉酶还在WO2004/080923(诺维信)中示出为SEQIDNO:1，将其通过引用结合在此。还考虑了与WO2004/080923中的SEQIDNO:1具有至少70％一致性、例如至少80％或甚至至少90％一致性、例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％一致性的所述酸性真菌淀粉酶的多种变体。

在一个优选方面，α-淀粉酶是来源于白曲霉并且是由金子(Kaneko)等人，发酵与生物工程杂志(J.Ferment.Bioeng.)81:292-298(1996)：“编码来自白曲霉的酸稳定的α-淀粉酶的一种基因的核苷酸序列的分子克隆和测定(Molecular-cloninganddeterminationofthenucleotide-sequenceofageneencodinganacid-stablealpha-amylasefromAspergilluskawachii)”所披露；并且进一步被披露为EMBL：#AB008370。

该真菌酸性α-淀粉酶还可以是包括碳水化合物结合模块(CBM)和α-淀粉酶催化结构域(即，非杂合体)的一种野生型酶或其变体。在一个实施例中，野生型酸性α-淀粉酶是来源于一种白曲霉菌株。

真菌杂合α-淀粉酶

在一个优选方面，该真菌酸性α-淀粉酶是一种杂合α-淀粉酶。真菌杂合α-淀粉酶的优选实例包括在WO2005/003311或美国专利公开号2005/0054071(诺维信)或美国专利申请号2006/0148054(诺维信)中披露的那些，将其通过引用结合在此。一种杂合α-淀粉酶可以包括α-淀粉酶催化结构域(CD)和碳水化合物结合域/模块(CBM)以及任选的接头。

所考虑的杂合α-淀粉酶的具体实例包括但不局限于在美国专利申请号2006/0148054中所披露的那些，包括具有催化结构域JA118和罗氏阿太菌(Atheliarolfsii)SBD的真菌α-淀粉酶变体(在美国申请号2006/0148054中的SEQIDNO:100)、具有罗氏阿太菌AMG接头和SBD的微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)α-淀粉酶(在美国申请号2006/0148054中的SEQIDNO:101)、以及具有罗氏阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的大型亚灰树花菌(Meripilusgiganteus)α-淀粉酶(在美国申请号2006/0148054中的SEQIDNO:102)；以及具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和CBM的微小根毛霉α-淀粉酶(在国际公开WO2007/144424中的SEQIDNO2)。

所考虑的杂合α-淀粉酶的其他具体实例包括但不局限于在美国专利公开号2005/0054071中披露的那些，包括在第15页的表3中披露的那些，例如具有白曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。

商用α-淀粉酶产物

包括α-淀粉酶的优选商用组合物包括：来自帝斯曼(吉斯特·布罗卡德斯有限公司(GistBrocades))的MYCOLASE，BAN^TM、TERMAMYL^TMSC、FUNGAMYL^TM、LIQUOZYME^TMSC、LIQUOZYME^TMSCDS、以及SAN^TMSUPER、SAN^TMEXTRAL(诺维信公司)、以及CLARASE^TML-40,000、DEX-LO^TM、SPEZYME^TMFRED、SPEZYME^TMAA、SPEZYME^TMEthyl、以及SPEZYME^TMDELTAAA(杰能科国际有限公司(GenencorInt.))。

通过以下编号的段落进一步说明本发明：

段落[1].一种葡糖淀粉酶变体，包括在对应于SEQIDNO:3的多肽的位置95、59、119、121、18、426、和316中的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

段落[2].如段落1所述的变体，该变体是选自下组的一种亲本葡糖淀粉酶的一种变体，该组由以下各项组成：

a)与SEQIDNO:3的多肽具有至少85％序列一致性的一种多肽；

b)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少85％一致性；以及

c)SEQIDNO:3的多肽的、具有葡糖淀粉酶活性的一个片段。

段落[3].如段落2所述的变体，其中该亲本葡糖淀粉酶与SEQIDNO:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

段落[4].如段落2-3中任一段落所述的变体，其中该亲本葡糖淀粉酶是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。

段落[5].如段落2-4中任一项所述的变体，其中该亲本葡糖淀粉酶包括SEQIDNO:3的多肽或由其组成。

段落[6].如段落2-5中任一项所述的变体，其中该亲本葡糖淀粉酶是SEQIDNO:3的多肽的一个片段，其中该片段具有葡糖淀粉酶活性。

段落[8].如段落1-7中任一项所述的变体，该变体与该亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列具有至少85％、至少90％、至少95％一致性，至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但是小于100％的序列一致性。

段落[9].如段落1-8中任一项所述的变体，该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少85％，例如至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。

段落[10].如段落1-9中任一项所述的变体，其中取代的数目是1-20个，例如1-10和1-5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个取代。

段落[11].如段落1-10中任一项所述的变体，该变体包含在与位置59相对应的位置处的取代。

段落[12].如段落11所述的变体，其中该取代是用Ala、Cys、Gly、或Ile取代。

段落[13].如段落1-12中任一项所述的变体，该变体包含在与位置95相对应的位置处的取代。

段落[14].如段落13所述的变体，其中该取代是用Pro取代。

段落[15].如段落1-14中任一项所述的变体，该变体包含在与位置119相对应的位置处的取代。

段落[16].如段落15所述的变体，其中该取代是用Trp取代。

段落[17].如段落1-16中任一项所述的变体，该变体包含在与位置121相对应的位置处的取代。

段落[18].如段落17所述的变体，其中该取代是用Pro取代。

段落[19].如段落1-18中任一项所述的变体，该变体包含在与位置18相对应的位置处的取代。

段落[20].如段落19所述的变体，其中该取代是用Phe取代。

段落[21].如段落1-20中任一项所述的变体，该变体包含在与位置426相对应的位置处的取代。

段落[22].如段落21所述的变体，其中该取代是用Gly取代。

段落[23].如段落1-22中任一项所述的变体，该变体包含在与位置316相对应的位置处的取代。

段落[24].如段落23所述的变体，其中该取代是用Trp取代。

段落[25].如段落1-24中任一项所述的变体，包括在与位置59、95、119、121、18、426、以及316中的任何所相对应的两个位置处的取代。

段落[26].如段落1至25中任一项所述的变体，包括在与位置59、95、119、121、18、426、以及316中的任何所相对应的三个位置处的取代。

段落[27].如段落1-26中任一项所述的变体，包括在与位置59、95、119、121、18、426、以及316中的任何所相对应的四个位置处的取代。

段落[28].如段落1-27中任一项所述的变体，包括在与位置59、95、119、121、18、426、以及316中的任何所相对应的五个位置处的取代。

段落[29].如段落1-28中任一项所述的变体，包括在与位置59、95、119、121、18、426、以及316中的任何所相对应的六个位置处的取代。

段落[30].如段落1-21中任一项所述的变体，包括在与位置59、95、119、121、18、426、以及316相对应的每个位置处的取代。

段落[31].如段落1-24中任一项所述的变体，包括选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：59A、95P、119W、和121P，并且具体地，是包括取代95P+121P，更具体地S95P+A121P的葡糖淀粉酶变体，并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

段落[32].如段落1-24中任一项所述的变体，包括选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：59C+426G、59G+426G、和18F+59I，更具体地，V59C+A426G、或V59G+A426G、或V18F+V59I，并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

段落[33].如段落1-24中任一项所述的变体，包括选自以下一个或多个取代：316W取代，具体地S316W，并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

段落[34].如以上段落中任一项所述的变体，其中该变体包含以下取代或取代的组合中的至少一个：

V59A；或

S95P；或

A121P；或

T119W；或

S95P+A121P；或

V59A+S95P；或

S95P+T119W；或

V59A+S95P+A121P；或

S95P+T119W+A121P，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

段落[35].如以上段落中任一项所述的变体，其中该变体包括以下取代的组合中的至少一个：

V59C+A426G；或

V59G+A426G；或

V18F+V59I；或

V59C+S95P+T119W+A426G；或

V59C+S95P+T119W+A121P+A426G；或

V59C+S95P+A121P+A426G；或

V18F+V59I+S95P+A121P；或

V18F+V59I+S95P+T119W+A121P，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

段落[36].如以上段落中任一项所述的变体，其中该变体包含以下取代或取代的组合中的至少一个：

S316W；或

S95P+A121P+S316W，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

段落[37].如段落1-36中任一项所述的变体，该变体相对于该亲本具有改进的特性，其中该改进的特性选自下组，该组由以下各项组成：比活性、热稳定性、和葡萄糖耐受性。

段落[38].如段落1-37所述的变体，该变体相对于该亲本具有改进的特性，其中该改进的特性是增加的热稳定性。

段落[39].如段落35所述的变体，该变体相对于该亲本具有改进的特性，其中该改进的特性是增加的热稳定性和增加的葡萄糖耐受性。

段落[40].如段落36所述的变体，该变体相对于该亲本具有改进的特性，其中该改进的特性是增加的热稳定性、和增加的比活性。

段落[41].一种组合物，该组合物包括如段落1-40中任一项所述的多肽。

段落[42].根据段落41所述的组合物，包括α-淀粉酶以及如段落1-40中任一项所述的多肽。

段落[43].根据段落41所述的组合物，包括异淀粉酶以及如段落1-40中任一项所述的多肽。

段落[44].根据段落41所述的组合物，包括α-淀粉酶、异淀粉酶、以及如段落1-40中任一项所述的多肽。

段落[45].根据段落41所述的组合物，包括支链淀粉酶以及如段落1-40中任一项所述的多肽。

段落[46].一种如段落1-40中任一段落所述的多肽用于生产糖浆和/或一种发酵产物的用途。

段落[47].根据段落46所述的用途，其中起始材料是凝胶化或未凝胶化的含淀粉材料。

段落[48].一种用于由含淀粉材料来生产发酵产物的过程，该过程包括以下步骤：

(a)在一种α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；

(b)使液化的材料糖化；以及

(c)使用一种发酵有机体进行发酵；

其中使用如段落1-40中任一项所述的至少一种变体葡糖淀粉酶进行步骤(a)和/或步骤(b)。

段落[49].一种用于由含淀粉材料来生产发酵产物的过程，该过程包括以下步骤：

(a)在低于含淀粉的材料的初始凝胶化温度的温度下使所述含淀粉的材料糖化；以及

(b)使用一种发酵有机体进行发酵，

其中使用如段落1-40中任一段落所述的至少一种变体葡糖淀粉酶进行步骤(a)。

段落[50].一种用于由含淀粉材料来生产糖浆产物的过程，该过程包括以下步骤：

在如段落1-40中任一项所述的变体葡糖淀粉酶存在下，在低于含淀粉的材料的初始凝胶化温度的温度下使所述含淀粉的材料糖化。

段落[51].一种用于由含淀粉材料来生产糖浆产物的过程，该过程包括以下步骤：

(a)在一种α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；

(b)在如段落1-40中任一项所述的变体葡糖淀粉酶存在下，使液化的材料糖化。

段落[52].根据段落51所述的过程，其中步骤b)进一步包括添加一种支链淀粉酶。

段落[53].根据段落51和52所述的过程，其中糖化温度是在从40℃至65℃、更具体地从50℃至62℃、更具体地从59℃至62℃的范围内。

段落[54].一种分离的多核苷酸，其编码如段落1-40中任一项所述的变体。

段落[55].一种包含如段落54所述的多核苷酸的核酸构建体。

段落[56].一种包含如段落54所述的多核苷酸的表达载体。

段落[57].一种包含如段落54所述的多核苷酸的宿主细胞。

段落[58].一种产生葡糖淀粉酶变体的方法，该方法包括：

在适合于表达该变体的条件下培养根据段落57所述的宿主细胞；并且回收该变体葡糖淀粉酶。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。

实例

材料与方法

葡糖淀粉酶活性

可以按AGU单位来测量葡糖淀粉酶活性。

葡糖淀粉酶活性(AGU)

葡糖淀粉酶单位(AGU)被定义为在标准条件下(37℃，pH4.3，底物：100mM麦芽糖，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间：6分钟，如以下葡糖淀粉酶孵育中所说明的)每分钟水解1微摩尔麦芽糖由此产生葡萄糖的酶的量。

葡糖淀粉酶孵育
		底物：	麦芽糖100mM
缓冲液：	乙酸盐0.1M
		pH：	4.30±0.05
孵育温度：	37℃±1
		反应时间：	6分钟
酶工作范围：	0.5AGU/mL至4.0AGU/mL

通过3个反应步骤描述分析原理：

步骤1是一个酶反应：

葡糖淀粉酶(AMG)EC3.2.1.3(外-α-1,4-葡聚糖-葡糖淀粉酶)水解麦芽糖以形成α-D-葡萄糖。孵育之后，用NaOH来停止该反应。

步骤2和步骤3引起一个终点反应。

在由己糖激酶催化的一个反应中，葡萄糖被ATP磷酸化。形成的葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化成6-磷酸葡萄糖酸。在这个相同的反应中，等摩尔量的NAD+被还原成NADH，导致在340nm处的吸光度增加。可以使用自动分析仪系统例如Konelab30分析仪(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))。

葡糖淀粉酶的比活性

通过使用Konelab仪器的以上AGU测定，确定比活性。

使用龟甲万(Kikkoman)试剂盒的葡糖淀粉酶活性

葡糖淀粉酶活性测定(龟甲万)

产品代码：60211

测定原理：

底物4-硝基苯基-β-麦芽糖苷(G2-β-pNP)由葡糖淀粉酶或α-葡糖苷酶降解成4-硝基苯基-β-葡糖苷(G1-β-pNP)。G1-β-pNP进一步由这一试剂盒中的β-葡糖苷酶降解成4-硝基苯酚(pNP)。反应是在室温下于约pH4下进行的。通过添加碳酸钠来停止该反应，并且同时，该溶液变为碱性pH以使pNP的吸光度最大。该葡萄糖形成活性是通过在400nm下对该pNP进行定量来测量。

1)测量的反应显示出样品中葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶的G2-β-pNP降解活性。这被认为是样品中的葡萄糖形成活性。

2)该测试可以用于未透析的米曲提取物。

3)这一检验不受样品中的α-淀粉酶影响。

试剂盒组分

试剂	主要组分	量
			底物溶液	G2-β-pNP	60ml
酶溶液	β-葡糖苷酶	60ml
			终止溶液	碳酸钠	120ml

1)以1:1混合该试剂盒的“底物溶液”和“酶溶液”。

2)吸取10μl纯化的具有约0.1AGUg/ml活性的葡糖淀粉酶变体样品(或作为空白的水)并转移至一个微量滴定板的孔中。(一式两份)

3)将60μl的该底物-酶混合物添加到该孔中。

4)在32℃温度孵育20分钟。

5)将120μl的终止溶液添加到该孔中。

6)读取OD400nm。#NetOD₄₀₀＝OD₄₀₀(样品)-OD₄₀₀(空白)

1.空白：通常，该空白的吸光度小于0.200。

2.特异性：该反应不受葡萄糖(多达100g/l)或α-淀粉酶(725U/ml)影响。

3.可重现性：当对相同样品分析10次时，吸光度的CV小于1％。

4.线性范围：最多1.6的净OD₄₀₀应当与该酶浓度成比例。

5.颜色的稳定性：该吸光度在25℃下2小时不改变。

热稳定性测定

使用龟甲万(Kikkoman)葡糖淀粉酶试剂盒，在63℃或67℃加热1小时后，确定选择的变体的热稳定性，为残余活性。

葡萄糖抑制测定

葡萄糖抑制被确定为在葡萄糖存在下和葡萄糖不存在下，葡糖淀粉酶(AMG)活性的比率。将龟甲万(Kikkoman)测定试剂盒用于AMG测定。将十微升的3倍稀释的样品添加到190微升的底物(在该试剂盒中的底物溶液:在该试剂盒中的酶溶液：40％葡萄糖或DW＝1:1:6)，并且在37℃，孵育该反应混合物。反应时间取决于底物，对于无葡萄糖的底物是30min，并且对于有葡萄糖的底物是2hr。然后80微升的反应混合物与160微升的3％Na₂CO₃进行混合以终止反应，并且测量A400。

按以下公式计算葡萄糖抑制值；

葡萄糖抑制＝(Vg/Vdw)/(WTg/WTdw)/2*0.5*100

Vg；变体的δA400，来自具有葡萄糖的底物

Vdw；变体的δA400，来自不具有葡萄糖的底物

WTg；Gt-AMG的δA400，来自具有葡萄糖的底物

Vdw；Gt-AMG的δA400，来自不具有葡萄糖的底物

DNA操纵

在大肠杆菌Dh5α细胞中构建并且扩增所有质粒。用于DNA操纵的限制性内切核酸酶可获得自新英格兰生物试验室公司(NewEnglandBiolabs,Inc.)并且根据说明书进行使用。将In-fusion(科隆达公司(Clontech))用于DNA的连接。用凯杰公司质粒试剂盒回收扩增的质粒。聚合酶链式反应(PCR)是用PrimestarMaxDNA聚合酶(宝生物公司)进行的。QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰公司)被用于纯化切除自琼脂糖凝胶的DNA片段。所有DNA操纵基本上遵循由制造商的说明书和分子克隆实验指南(Molecularcloning:alaboratorymanual)(第2版)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，描述于萨姆布鲁克(Sambrook)，弗里奇(FritschEF)，马尼亚蒂斯(ManiatisT)(1989)中。

实施例1：Gt-AMG葡糖淀粉酶基因的克隆

密粘褶菌菌株cDNA的制备。

cDNA是按照转录子高保真度cDNA合成试剂盒(TransciptorhighFidelitycDNAsynthesiskit)(Roche(罗氏公司))的以下说明合成的。

Gt-AMG葡糖淀粉酶基因的克隆

通过PCR使用以下所示的两种克隆引物pra102和引物pra103将葡糖淀粉酶基因重新从cDNA克隆到曲霉菌表达载体中，这两种克隆引物是基于已知的序列来设计的并且添加了标签以用于通过IN-FUSION^TM策略直接克隆。

引物par102:5’AGTCTTGATCGGATCCATGTACCGCTTCCTTGTCTGTGCT3’

引物pra103:5’CGCACCACGTGGTTTAAACTTAACGCCAAGTGTCATTCTC3’

在以下所述的条件下使用PTC-200DNA引擎(PTC-200DNAEngine)进行PCR。

使用1xTAE缓冲液，通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中从凝胶切下大约1.7bpPCR产物带，并且根据厂商的说明书，使用凯杰公司凝胶提取试剂盒进行纯化。使用5XHDIN-FUSION^TM试剂盒(科隆达公司公司)，根据该制造商的说明书，将对应于密粘褶菌葡糖淀粉酶基因的DNA克隆到用BamHI和PmeI线性化的曲霉菌表达载体。

使用2μl体积的连接混合物来转化大肠杆菌DH5α细胞(东洋公司(TOYOBO))。在42℃下热休克45秒并在冰中冷却之后，添加250μl的SOC培养基，并且将这些细胞在225rpm下在37℃下孵育90分钟，随后铺在每ml含250μg氨苄西林的LB琼脂板上，并在37℃下培养过夜。在每毫升补充有50μg氨苄西林的3mlLB培养基中接种所选择的菌落，并在225rpm下在37℃下孵育过夜。根据制造商的说明使用凯杰质粒微型试剂盒(凯杰公司)从所选择的菌落纯化质粒DNA。在异源表达之前通过桑格测序(Sangersequencing)来验证密粘褶菌葡糖淀粉酶基因序列。选择这些质粒之一用于进一步表达，并将其命名为pNori140。

如WO95/02043所述地制备黑曲霉宿主的原生质体。优选地，该黑曲霉宿主已经缺失了内源葡糖淀粉酶活性。使用如描述于WO2012/160093的基于FLP的定点整合系统，将密粘褶菌葡糖淀粉酶基因整合到黑曲霉宿主的基因组。将一百μl的原生质体悬浮液与2.5μg的pNori140质粒相混合，该质粒拥有具有WO2012/160093中描述的启动子、终止子、FLP基因和整合位点的密粘褶菌葡糖淀粉酶基因，并且添加250微升的60％PEG4000(艾普利公司(Applichem))(聚乙二醇，分子量4,000)、10mMCaCl₂、以及10mMTris-HCl(pH7.5)并轻轻混合。在37℃下孵育该混合物30分钟并且在补充有10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖(科夫(Cove)，1996，生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)133:51-56)(1M)板上将原生质体与6％的低熔琼脂糖(惠泰克生物分子应用公司(BiowhittakerMolecularApplications))相混合，并将其作为一个顶层添加在补充有10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖(1M)板上以用于转化子选择(每板4ml顶层琼脂)。在32℃孵育持续6天之后，将5个转化子的孢子分离到COVEII板上，并且使分离转化子经受瓶中培养。

培养。在30℃将分离转化子接种至COVENgly板，持续7天，并且将板培养物接种进100ml的MSS培养基，并且在旋转式摇床上，在500ml摇瓶中在30℃培养3天。将10ml的培养液接种到100ml的MU-1培养基中并在30℃下培养6天。将培养液离心并使用0.2μm的膜滤器过滤上清液。

α-环糊精亲和凝胶。使10克环氧基活化的琼脂糖6B(英国查尔方特圣吉尔斯(ChalfontSt.Giles)的通用电气医疗集团)粉末悬浮在蒸馏水中并在烧结玻璃过滤器上用蒸馏水进行洗涤。使凝胶悬浮于偶合溶液(100ml的12.5mg/mlα-环糊精，0.5MNaOH)并在室温下孵育一天，同时轻轻振荡。在烧结玻璃过滤器上使用蒸馏水洗涤该凝胶，并使其悬浮在pH10的100ml1M乙醇胺中，并在50℃下孵育4小时以进行封闭。随后使用pH8的50mMTris-HCl和可替代地pH4.0的50mMNaOAc洗涤该凝胶若干次。最后使用平衡缓冲液(50mMNaOAc，150mMNaCl，pH4.5)将该凝胶装填在35-40ml的柱中。

从培养液纯化葡糖淀粉酶。通过0.22μmPES过滤器过滤来自具有葡糖淀粉酶基因的黑曲霉转化子的发酵的培养液，并施加在之前在50mMNaOAc、150mMNaCl、pH4.5缓冲液中平衡的α-环糊精亲和凝胶柱上。使用平衡缓冲液将未结合的材料从该柱中洗出，并且使用3倍柱体积以上的含有10mMβ-环糊精的相同缓冲液洗脱葡糖淀粉酶。

检查洗脱液的葡糖淀粉酶活性以查看葡糖淀粉酶是否已结合至α-环糊精亲和凝胶。然后相对于pH5.0的20mMNaOAc透析纯化的葡糖淀粉酶样品。最后通过SDS-PAGE检查纯度并且仅发现一条单独的带。

实例2：密粘褶菌葡糖淀粉酶的定点变体的构建和表达

用实例1所述的质粒pNori140、使用以下所示的引物V59A-F和V59A-R(这些引物被设计成用于将成熟序列的位置59处的丙氨酸(A)取代为缬氨酸(V))以及以下所示的引物pra102和pra102(这两个引物基于已知的序列来设计标签添加了的标签以用于通过IN-FUSION^TM策略直接克隆)进行两个PCR反应。

引物par102:5’agtcttgatcggatccatgtaccgcttccttgtctgtgct3’

引物pra103:5’cgcaccacgtggtttaaacttaacgccaagtgtcattctc3’

在以下所述的条件下使用PTC-200DNA引擎(PTC-200DNAEngine)进行PCR。

根据制造商的说明通过凯杰凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。根据制造商的说明，使用IN-FUSION^TM(美国加利福尼亚州帕洛阿尔托的BD生物科学公司(BDBiosciences,PaloAlto,CA,USA))将所得的纯化的两个片段克隆到用BamHI和PmeI线性化的曲霉菌表达载体pNori140中。

使用连接混合物来转化大肠杆菌DH5α细胞(TOYOBO公司)。在每毫升补充有50μg氨苄西林的3mlLB培养基中接种所选择的菌落，并在225rpm下在37℃下孵育过夜。根据制造商的说明使用凯杰质粒微型试剂盒(凯杰公司)从所选择的菌落纯化质粒DNA。在异源表达之前验证密粘褶菌葡糖淀粉酶定点变体基因序列的序列，并选择这些质粒之一来用于进一步表达。

如WO95/02043中所述，制备缺失了内源葡糖淀粉酶活性的黑曲霉宿主细胞的原生质体。将一百μl的原生质体悬浮液与2.5μg的pNori140质粒相混合，该质粒包括具有位点特异性取代的密粘褶菌AMG变体，并且添加250微升的60％PEG4000(艾普利公司(Applichem))(聚乙二醇，分子量4,000)、10mMCaCl₂、以及10mMTris-HCl(pH7.5)并轻轻混合。在37℃下孵育该混合物30分钟并且在补充有10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖(科夫(Cove)，1996，生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)133:51-56)(1M)板上将原生质体与6％的低熔琼脂糖(惠泰克生物分子应用公司(BiowhittakerMolecularApplications))相混合，并将其作为一个顶层添加在补充有10mM乙酰胺和15mMCsCl的COVE蔗糖(1M)板上以用于转化子选择(每板4ml顶层琼脂)。在32℃孵育持续6天之后，将5个转化子的孢子分离到COVEII板上，并且使分离转化子经受瓶中培养。

使用下表中所示的正向和反向引物来构建其他变体。

5'-	acgcgtgactcgtcactcgctttcaagtct	-3'	V59A-F
				5'-	gagtgacgagtcacgcgt	-3'	V59A-R
5'-	agcaggtccctaatcccagc	-3'	S95P-F
				5'-	gattagggacctgctgaatg	-3'	S95P-R
5'-	accggtccgtggggtcgacc	-3'	A121P-F

5'-	accccacggaccggtgaatg	-3'	A121P-R
				5'-	tcactcgggttcaag	-3'	V59G-F
5'-	cttgaacccgagtga	-3'	V59G-R
				5'-	acgcgtgactcgtcactctgtttcaagtct	-3'	V59C-F
5'-	agacttgaaacagagtgacgagtcacgcgt	-3'	V59C-R
				5'-	acatggagctatggttctgcattgaccgcg	-3'	A426G-F
5'-	cgcggtcaatgcagaaccatagctccatgt	-3'	A426G-R
				5'-	acttggacgcgtgactcgtcactcattttcaagtctctcatt	-3'	V59I-F
5'-	tgacgagtcacgcgtccaag	-3'	V59I-R
				5'-	cgaaggccccatagcaaaggccggctttcttgccaacatt	-3'	V18F-F
5'-	ggcctttgctatggggccttcg	-3'	V18F-R
				5'-	taccagggcgggaacccatg	-3'	S316W-F
5'-	gttcccgccctggtaccagtcttccgggta	-3'	S316W-R
				5'-	gatgaaactgcattctggggtgcatgg	-3'	T119W-F
5'-	gaatgcagtttcatcgacat	-3'	T119W-R

培养。在30℃将分离的转化子接种至COVENgly板，持续7天，并且将板培养物接种进100ml的MSS培养基，并且在旋转式摇床上，在500ml摇瓶中在30℃培养3天。将10ml的培养液接种到100ml的MU-1培养基中并在30℃下培养6天。将培养液离心并使用0.2μm的膜滤器过滤上清液。

实例3：定点GtAMG变体的纯化

将变体的所选择的转化子培养在实例1所述MU-1中，并且培养物通过0.22μmPES过滤器过滤，并施加在之前于50mMNaOAc、150mMNaCl、pH4.5缓冲液中平衡的α-环糊精亲和凝胶柱上。使用平衡缓冲液将未结合的材料从该柱中洗出，并且使用3倍柱体积以上的含有10mMβ-环糊精的相同缓冲液洗脱葡糖淀粉酶。

检查洗脱液的葡糖淀粉酶活性以查看葡糖淀粉酶是否已结合至α-环糊精亲和凝胶。随后相对于pH5.0的20mMNaOAc透析纯化的葡糖淀粉酶样品。

实例4：具有改进的热稳定性的葡糖淀粉酶变体的表征

通过在63℃和67℃的热处理持续1小时后，使用来自龟甲万(Kikkoman)的葡糖淀粉酶测定试剂盒测量残余活性，来确定具有特定取代或取代的组合的葡糖淀粉酶变体的热稳定性。表中的值是相对于针对未经历热处理的对照样品所测量的活性。

在下表1中概述了结果。

表1.

对于所有测试的组合热稳定性都得以改进，这些组合来自单取代(JGA064、078、083、和122)、双取代(JGA098、099和123)、至三取代(JGA100和125)并且JGA100是最热稳定的。另一方面，具有V59A的JGA064、099、和100显示出更低葡萄糖抑制，提示位置V59也是对葡萄糖抑制而言重要的。

葡萄糖抑制(GI)被确定为在具有和不具有30％葡萄糖情况下的AMG活性的比率。这些值是相对于野生型。更高的值对应于更低抑制。

为了以精细调谐围绕V59的空间，基于结构分析，选择4个邻近氨基酸V18、V37、T422和A426。构建并且筛选具有V59和选择的氨基酸的四个双饱和文库。

实例5：具有改进的葡萄糖耐受性和改进的热稳定性的葡糖淀粉酶变体的表征

来自双饱和文库的(V59X-V18X、V59X-V37X、V59X-T422X、和V-59X-A426X)、JGA127、128、以及129被选择为用于改进葡萄糖抑制的最佳候选物。为了改进JGA127和129的稳定性，引入热稳定取代S95P、T119W、和A121P。表征结果概括在表2中。

表2.具有更低葡萄糖抑制的变体的表征

所有变体维持更低的比活性。

实例6：具有与良好的比活性相结合的改进的葡萄糖耐受性和改进的热稳定性的葡糖淀粉酶变体的表征

JGA149获得自取代S316X的单位点饱和文库，为更低葡萄糖抑制的变体同时维持亲本葡糖淀粉酶的比活性。为了改进它热稳定性，将取代S95P和A121P引入JGA149，并且将生成的变体JGA151进行表征。热稳定性和比活性增加(表4)。

构建JGA098和JGA151的G2形式(没有淀粉结合结构域)，并且分别命名为JJGA148和203。JGA148以及JGA203显示出增加的比活性，并且不具有其他特征的变化(表3)。

表3.

在此描述并且要求的本发明不限于在此披露的具体方面的范围，因为这些方面意图作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims (22)

1.一种葡糖淀粉酶变体，包含在对应于SEQIDNO:3的多肽的位置95、59、119、121、18、426、和316的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

2.如权利要求1所述的变体，其中取代的数目是1-20个，例如1-10和1-5，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个取代。

3.如权利要求1-2中任一项所述的变体，该变体包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：59A、95P、119W、和121P，并且特别是包含取代95P+121P的、更特别地S95P+A121P的葡糖淀粉酶变体，并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

4.如权利要求1-2中任一项所述的变体，该变体包含选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：59C+426G、59G+426G、和18F+59I，更特别地V59C+A426G、或V59G+A426G、或V18F+V59I，并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

5.如权利要求1-2中任一项所述的变体，该变体包含选自以下项的一个或多个取代：316W取代，特别地S316W，并且其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

6.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该变体包含以下取代或取代的组合中的至少一个：

V59A；

S95P；

A121P；

T119W；

S95P+A121P；

V59A+S95P；

S95P+T119W；

V59A+S95P+A121P；或

S95P+T119W+A121P，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

7.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该变体包含以下取代的组合中的至少一个：

V59C+A426G；

V59G+A426G；

V18F+V59I；

V59C+S95P+T119W+A426G；

V59C+S95P+T119W+A121P+A426G；

V59C+S95P+A121P+A426G；

V18F+V59I+S95P+A121P；或

V18F+V59I+S95P+T119W+A121P，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

8.如以上权利要求中任一项所述的变体，其中该变体包含以下取代或取代的组合中的至少一个：

S316W；或

S95P+A121P+S316W，其中该变体具有葡糖淀粉酶活性，并且其中该变体与SEQIDNO:3的多肽具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。

9.如权利要求1-8中任一项所述的变体，该变体相对于亲本具有改进的特性，其中该改进的特性选自下组，该组由以下各项组成：比活性、热稳定性、和葡萄糖耐受性。

10.如权利要求6所述的变体，该变体相对于亲本具有改进的特性，其中该改进的特性是增加的热稳定性。

11.如权利要求7所述的变体，该变体相对于亲本具有改进的特性，其中该改进的特性是增加的热稳定性和增加的葡萄糖耐受性。

12.如权利要求8所述的变体，该变体相对于亲本具有改进的特性，其中该改进的特性是增加的热稳定性、和增加的比活性。

13.一种包括如权利要求1-12中任一项所述的多肽的组合物。

14.根据权利要求13所述的组合物，包含α-淀粉酶和如权利要求1-12中任一项所述的多肽。

15.如权利要求1-14中任一项所述的多肽用于生产糖浆和/或发酵产物的用途。

16.一种用于由含淀粉材料来生产发酵产物的过程，该过程包括以下步骤：

(a)在一种α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；

(b)使液化的材料糖化；并且

(c)使用一种发酵有机体进行发酵；

其中使用如权利要求1-12中任一项所述的至少一种变体葡糖淀粉酶进行步骤(a)和/或步骤(b)。

17.一种用于由含淀粉材料来生产糖浆产物的过程，该过程包括以下步骤：

(a)在一种α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；

(b)在如权利要求1-12中任一项所述的变体葡糖淀粉酶的存在下，使液化的材料糖化。

18.一种编码如权利要求1-12中任一项所述的变体的分离的多核苷酸。

19.一种包含如权利要求18所述的多核苷酸的核酸构建体。

20.一种包含如权利要求18所述的多核苷酸的表达载体。

21.一种包含如权利要求18所述的多核苷酸的宿主细胞。

22.一种产生葡糖淀粉酶变体的方法，该方法包括：

在适于表达该变体的条件下培养如权利要求21所述的宿主细胞；并且回收该变体葡糖淀粉酶。