CN107164344A - 一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107164344A
CN107164344A CN201710509025.8A CN201710509025A CN107164344A CN 107164344 A CN107164344 A CN 107164344A CN 201710509025 A CN201710509025 A CN 201710509025A CN 107164344 A CN107164344 A CN 107164344A
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
ala
thr
pro
gln
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710509025.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107164344B (zh
Inventor
肖志壮
崔巍
薛海曌
方安然
张稳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Red Cherry Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Qingdao Red Cherry Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Red Cherry Biotechnology Co Ltd filed Critical Qingdao Red Cherry Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201710509025.8A priority Critical patent/CN107164344B/zh
Publication of CN107164344A publication Critical patent/CN107164344A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107164344B publication Critical patent/CN107164344B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/30—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for swines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/70—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds
    • A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用，本发明具体是在大肠杆菌来源的植酸酶GHPH‑1的基础上通过大量突变和筛选获得的植酸酶突变体GHPH‑C以及GHPH‑C1、GHPH‑C2、GHPH‑C3、GHPH‑C4、GHPH‑C5、GHPH‑C6、GHPH‑C7；相比于未突变的植酸酶，本发明得到的植酸酶突变体的耐热性得到显著提高，适应的pH范围也更广泛，有利于其在饲料领域的开发和应用。

Description

一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用。
背景技术
植物性饲料中含有大量的植酸磷，但这些植酸磷不能被单胃畜禽动物有效地利用，造成了无机磷的浪费，同时未被利用的磷源通过粪便排泄到环境中，导致了环境污染。此外，植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物胃肠道中会与多种金属离子如钙、镁、锌、铁等以及蛋白质鳌合形成不溶性复合物，降低了动物对这些营养物质的有效利用。
植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸盐的一类酶的总称，它可以催化肌醇六磷酸(盐或醋)脱掉磷酸基团，从而分解动物饲料中的天然有机磷。在饲料中添加植酸酶可以代替部分磷酸氢钙，同时降低动物粪便中的磷，减少了集约化畜牧场排除粪便中磷对环境的污染。
目前，市场中的植酸酶多数有比较好的活性，但是很多耐热性能一般。通常饲料生产中，酶制剂与饲料混匀后在80℃左右的高温造粒，在此过程中酶易变性失活，解决这一问题的一种方法是利用包被剂和载体来提高酶的耐热性，但这无疑会增加酶制剂的生产成本，而且采用包被处理酶制剂会严重影响其生物利用率；另一种经济有效的方法就是通过改良酶的基因提高其耐热性。从酶的基因和结构入手，筛选得到耐热型植酸酶对降低目前饲用植酸酶的生产成本，提高其利用效率具有重要的意义。
发明内容
本发明的发明目的是提供了一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用，本发明通过人工基因突变和大量筛选的方法，对大肠杆菌来源的植酸酶GHPH-1（氨基酸序列SEQID NO：2，编码的核苷酸序列SEQ ID NO：1）进行改良，优选地，首先在GHPH-1的第63位点进行定点饱和突变，筛选得到热稳定性提高的突变体GHPH-C，继续以GHPH-C为模板用易错PCR的方法对该基因进行二轮随机突变，经过大批量筛选，得到热稳定性进一步提高的突变体GHPH-C1、GHPH-C2、GHPH-C3、GHPH-C4、GHPH-C5、GHPH-C6和GHPH-C7。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了耐热型单位点植酸酶突变体GHPH-C，所述的植酸酶突变体GHPH-C的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述突变体GHPH-C由氨基酸序列为SEQ ID NO：2的植酸酶的第63位氨基酸由Arg变为Cys获得。
本发明提供了耐热型双位点植酸酶突变体，所述双位点植酸酶突变体包括：氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的GHPH-C1、氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的GHPH-C2、氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的GHPH-C3和氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的GHPH-C4。
本发明提供了耐热型三位点植酸酶突变体，所述三位点植酸酶突变体包括氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的GHPH-C5和氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的GHPH-C6。
本发明提供了耐热型五位点植酸酶突变体GHPH-C7，其具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
本发明提供了分别产生所述的植酸酶突变体的编码基因。
本发明提供了含有所述的植酸酶突变体的编码基因的重组菌株。
所述重组菌株为毕赤酵母GS115。
本发明提供了所述的植酸酶突变体在用于制备水产类养殖饲料中的应用。
本发明提供了所述的植酸酶突变体在用于制备畜禽类养殖饲料中的应用，所述畜禽类包括猪、肉鸡、蛋鸡和鸭。
进一步的：所述植酸酶突变体用于饲料中时以液体酶制剂或固体酶制剂形式混匀在饲料中使用，其使用量为每克饲料中包含1~10U植酸酶。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明基于SEQ ID NO：1的植酸酶GHPH-1，所述植酸酶突变体首先在第63位的氨基酸有改变，置换方式为R63C；其次可能在第10位、第29位、第138位、第172位、第207位、第243位、第287位、第297位、第307位和第397位中一个或多个位置的氨基酸有改变，相应的置换方式为：S10N、M29F、A138L、F172W、L207E、W243P、Q287S、V297M、L307P、G311K和T397E。
本发明以植酸酶GHPH-1为基础，提供了包含R63C的单点突变体GHPH-C，包含R63C/S10N的双位点突变体GHPH-C1、包含R63C/F172W的双位点突变体GHPH-C2、包含R63C/L207E的双位点突变体GHPH-C3、包含R63C/Q287S的双位点突变体GHPH-C4；包含R63C/A138L/V297M的三位点突变体GHPH-C5、包含R63C/F172W/G311K的三位点突变体GHPH-C6；以及包含R63C/M29F/A138L/W243P/L307P的五位点突变体GHPH-C7。
本发明根据所取代的位置和氨基酸，与原始植酸酶GHPH-1相比，改造后的突变体GHPH-C以及 GHPH-C1、GHPH-C2、GHPH-C3、GHPH-C4、GHPH-C5、GHPH-C6、GHPH-C7在80℃处理3分钟时的热稳定性是原来的1.9~3.3倍；同时得到的植酸酶突变体GHPH-C6适应的pH范围更广泛，在pH3~4的酸性环境中其相对酶活较未突变的GHPH-1约提高了35%~60%，而GHPH-C2和GHPH-C6抵抗蛋白酶的降解能力有所提高，约为未突变的2倍。通过本发明技术方案得到的植酸酶可以有利于植酸酶在饲料中的广泛应用。
附图说明
图1 表明本发明所述植酸酶突变体的热稳定性；
图2是本发明所述植酸酶突变体GHPH-C6温度曲线；
图3 表明本发明所述植酸酶突变体对胃蛋白酶的耐受性。
具体实施方式
为了便于理解本发明，以下将结合较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行,或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
1.菌株和载体
毕赤酵母GS115，质粒pPIC9K，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌OrigamiB，大肠杆菌BL21，质粒pET 21a(+)购自Invitrogen公司。
2．试剂与培养基
质粒提取试剂盒，片段纯化回收试剂盒，限制性内切酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；GeneMorph II随机突变PCR试剂盒购自Stratagene公司；氨苄青霉素，IPTG等购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
LB培养基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl；
MD培养基：1.34%YNB，0.4mg/L生物素，2%葡萄糖；
YPD培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；
BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100mmol/L 磷酸钾缓冲液（pH6.0），1.34%YNB，0.4mg/L生物素，1%甘油；
BMMY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100mmol/L 磷酸钾缓冲液（pH6.0），1.34%YNB，0.4mg/L生物素，1%甲醇；
BSM培养基：26.7mL 85%的磷酸，0.93g 二水硫酸钙，14.9g 二水硫酸镁， 4.13g氢氧化钾，18.2g硫酸钾，40g甘油，4.0mlL PMT1。
以上培养基为固体时加入2%的琼脂粉。
3．实验方法
菌株培养条件：大肠杆菌37℃培养，酵母30℃培养。液体培养时摇床转速为200rpm。
毕赤酵母GS115转化方法：
将活化的毕赤酵母GS115接种到含有20mL YPD液体培养基中，30℃摇瓶培养至OD600为1.2～1.5后低温离心收集菌体，依次用20mL冰冷无菌水和5mL浓度为1mol/L的冰冷山梨醇溶液清洗菌体，最后用1mL山梨醇溶液重悬菌体制得酵母感受态悬液。将100μL酵母感受态与10μL线性化载体混匀后转移到预冷的电转杯中电击转化，电转化的条件为1.5kV，6msec。电击后加入1mL山梨醇溶液，转移至1.5mL离心管中30℃温育1h。5000rpm离心5min，收集菌体涂布于MD筛选平板上倒置培养，直至长出阳性单克隆。
植酸酶活性检测根据中华人民共和国国家标准《GB/T18634一2009》进行；植酸酶活性定义是指样品在温度37℃、pH值5.5的条件下，每分钟从5.0mmol/L植酸钠中释放1 μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
实施例1：植酸酶基因的合成
参考GHPH-1的氨基酸序列（氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示），人工合成该基因（核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示），根据基因5’端设计EcoRⅠ的引物，根据3’端设计NotⅠ的引物
引物序列如下：
F-GHPH- EcoRⅠ：5’-AGAATTCCAATCCGAACCAGAATTAAA-3’（SEQ ID No:11）；
R-GHPH-NotⅠ：5’-AGCGGCCGCTCAAAGAGAACAGGCAGGAAT-3’ （SEQ ID No:12）。
以合成基因GHPH-1为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增得到的片段切胶回收，用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，连接到pET-21a(+)载体上，转化大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素抗性LB平板筛选阳性克隆，测序验证得到pET - GHPH。
实施例2：植酸酶定点突变体筛选
确定大肠杆菌植酸酶GHPH-1的第63位的Arg为待突变位点，针对性的设计饱和突变引物。
GHPH-63F：5’-GGGACATTACTGGNNNCAACGTCTTGTTGCT-3’ （SEQ ID No:13）；
GHPH-63R：5’-CAACAAGACGTTGNNNCCAGTAATGTCCCAA-3’ （SEQ ID No:14）。
其中N代表A、T、C、G四种碱基。
以重组载体pET- GHPH为模板，加入突变位点的引物，用高保真酶进行PCR扩增，产物经DpnⅠ酶切处理后电击转化OrigamiB大肠杆菌感受态细胞，在含Amp的LB平板上筛选阳性克隆。将单克隆接种到96孔深孔板。每个平板接入2个原始克隆为对照。每孔装入300uLLB液体培养基（含有100μg/mL氨苄青霉素），37℃200rpm震荡培养4小时后，转移50uL菌液到新的96孔平板保种，在平板剩余菌液中添加200 uL含有IPTG的LB-Amp培养基，使IPTG终浓度为1mM，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，37℃ 200rpm摇床培养10h诱导表达植酸酶。
将诱导完成的菌液在80℃水浴3min破碎后，检测植酸酶的剩余活性。将剩余酶活高于对照的突变体基因进行测序。
最终筛选到以GHPH-1为出发模板的耐热性提高的突变体R63C（第63位氨基酸由Arg突变为Cys），命名为GHPH-C（氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示）。
实施例3：植酸酶随机突变体筛选
用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（Stratagene）将上述筛选到的GHPH-C进行随机突变，同时用高保真酶扩增GHPH-1的基因序列构建对照，使用的引物序列如下：
F-GHPH-EcoRⅠ：5’-AGAATTCCAATCCGAACCAGAATTAAA-3’；
R-GHPH-NotⅠ：5’-AGCGGCCGCTCAAAGAGAACAGGCAGGAAT-3’。
将切胶回收后的上述PCR产物和pET 21a(+)载体用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，纯化后的片段和pET 21a(+)连接构建表达载体pET-PHYm，转化至大肠杆菌BL21中，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选阳性转化子。得到GHPH-1及随机突变体的大肠杆菌表达菌株。
将单克隆接种到96孔深孔板。每个平板接入2个原始克隆为对照。每孔装入300uLLB液体培养基（含有100μg/mL氨苄青霉素），37℃200rpm震荡培养4h后，转移50uL菌液到新的96孔平板保种，在平板剩余菌液中添加200 uL含有IPTG的LB-Amp培养基，使IPTG终浓度为1mM，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，37℃ 200rpm摇床培养10h诱导表达植酸酶。
将诱导完成的菌液在80℃水浴3min破碎后，检测植酸酶的剩余活性。将剩余酶活高于对照的突变体基因进行测序。
结果获得以下突变体：
GHPH-C第10位的突变体R63C/S10N（命名为GHPH-C1），氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。
GHPH-C第172位的突变体R63C/F172W（命名为GHPH-C2），氨基酸序列如SEQ ID No：5所示。
GHPH-C第207位的突变体R63C/ L207E（命名为GHPH-C3），氨基酸序列如SEQ IDNo：6所示。
GHPH-C第287位的突变体R63C/Q287S（命名为GHPH-C4），氨基酸序列如SEQ ID No：7所示。
GHPH-C第138位和第297位同时突变的突变体R63C/A138L/V297M（命名为GHPH-C5），氨基酸序列如SEQ ID No：8所示。
GHPH-C第172位和第311位同时突变的突变体R63C/ F172W / G311K（命名为GHPH-C6），氨基酸序列如SEQ ID No：9所示。
GHPH-C第29位，第138位，第243位，第307位同时突变的突变体R63C/M29F/A138L/W243P/L307P（命名为GHPH-C7），热稳定性较随机突变前有明显提高，氨基酸序列如SEQ IDNo：10所示。
实施例4：耐热型植酸酶在毕赤酵母中的表达验证
人工合成上述筛选到的植酸酶突变体基因，并构建到pPIC9K质粒上，得到各突变体在毕赤酵母中的表达载体pPIC-PHYm；将各突变体的表达载体用SalⅠ酶切线性化后电转入毕赤酵母GS115中，MD平板筛选得到各突变体表达菌株的转化子并转接到YPD平板中活化。挑取活化后的转化子接于BMGY培养基中，30℃振荡培养18h后，离心获得菌体。将适量菌体转入BMMY培养基中，使菌体浓度达到OD600=1，继续振荡培养，每24h添加培养体积1%的甲醇。诱导表达96h后，将培养液离心获得上清，测定发酵液上清中植酸酶活力和热稳定性，结果显示突变后得到的植酸酶GHPH-C、GHPH-C1、GHPH-C2、GHPH-C3、GHPH-C4、GHPH-C5、GHPH-C6、GHPH-C7在80℃处理3min后耐热性较GHPH-1分别提高了0.95倍、1.53倍、2.01倍、1.98倍、1.87倍、1.61倍、2.26倍和2.10倍。
以上结果表明将GHPH-C第10位的Ser突变为Asn得到的突变体；或将其第172位的Phe突变为Trp得到的突变体；或将其第207位的Leu突变为Glu得到的突变体；或将其第287位的Gln突变为Ser得到的突变体；或将其第138位的Ala突变为Leu，同时第297位的Val突变为Met得到的突变体；或将其第172位的Phe突变为Trp，同时第311位的Gly突变为Lys得到的突变体；或将其第29位的Met突变为Phe，同时第138位的Ala突变为Leu，第243位的Trp突变为Pro，第307位的Leu突变为Pro得到的突变体，其耐热性有进一步提高。
实施例5：植酸酶突变体在10L发酵罐中制备
将保种于甘油管中的毕赤酵母划线于YPD平板上，30℃倒置培养3天长出单菌落，挑取长势良好的单菌落继续在YPD平板上划线培养，如此活化三代得到的毕赤酵母单菌落接种于20mLBMGY培养基中，30℃、200rpm培养24h。以2%的接种量接种到300mLBMGY培养基中，30℃、200rpm培养至OD600为5，用作种子液接种发酵罐。
发酵生产工艺：BSM培养基，pH4.8、温度30℃、搅拌速率500 rpm、通风量1.5(v/v)，溶氧控制在20%以上
发酵过程分为三个阶段：（1）菌体培养阶段：按8%比例接入种子液，30℃培养20~24h，使发酵液中甘油耗尽；（2）饥饿阶段：当碳源甘油耗尽后，暂不补加任何碳源，待溶氧上升至80%饥饿阶段结束；（3）诱导表达阶段：用氨水或磷酸调节pH至所需值，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20%以上，诱导时间为160~200h；待发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理得到粗酶液，用于酶学性质和应用测试。
实施例6：植酸酶突变体的其它酶学性质分析
按照常规方法对实施例5中得到粗酶液的pH曲线及胃蛋白酶耐受性进行测定。
对各突变体的pH曲线测定（pH3.0~8.0），GHPH-C、GHPH-C1、GHPH-C2、GHPH-C3、GHPH-C4、GHPH-C5和GHPH-C7与未突变的植酸酶GHPH-1比较，其反应pH曲线基本无差异，最适pH均为5.0；GHPH-C6的最适pH仍为5.0，但是在pH3~4条件下，其相对酶活明显高于GHPH-1（图2），说明改造后的GHPH-C6适应的pH范围更广泛，尤其是在酸性环境中，能更好的发挥作用。
用胃蛋白酶对植酸酶突变体进行处理（蛋白酶：植酸酶=1：200，pH3.0，37℃处理1h），结果如图3所示。与GHPH-1相比，GHPH-C、GHPH-C1、GHPH-C2、GHPH-C3、GHPH-C4、GHPH-C5、GHPH-C6、GHPH-C7对抵抗胃蛋白酶降解的能力基本无差异，但GHPH-C2和GHPH-C6抗胃蛋白的能力有所提高，剩余的相对酶活力由39.86%分别提高到68.55%和72.36%。
实施例7：植酸酶突变体在水产养殖中的应用
试验产品：20000U/ml的液体植酸酶GHPH-C6。
将液体植酸酶按照每千克饲料2000U植酸酶的比例喷涂到沉水鱼粮中，对水产养殖场中进行试验；其中对照1是普通沉水鱼粮喂养草鱼（添加10 kg/t磷酸二氢钙），对照2为沉水鱼粮（添加2kg/t磷酸二氢钙）喂养草鱼；试验组为沉水鱼粮（添加2kg/t磷酸二氢钙，同时添加2000U/kg的本实施例中制备的植酸酶GHPH-C6），试验结果如表1所示。
表1 植酸酶突变体GHPH-C6在草鱼养殖中使用效果
对照1 对照2 试验组
增重率（%） 298.34±12.43 236.54±8.92 310.67±10.63
肥满度 1.961±0.092 2.040±0.073 1.981±0.065
饲料系数 1.753±0.068 2.116±0.053 1.672±0.091
实施例8：植酸酶突变体在畜禽类养殖中的应用
试验材料：5000U/g植酸酶成品GHPH-C6
选取体重相近和产蛋性能相似的30周龄产蛋高峰期罗曼蛋鸡1200只，随机分为4个处理，每处理组5重复，每一重复60只鸡。试验共进行10周，在正式试验进行前预试一周，试验期间每天添料2次（7:00/14:00），每天光照时长16h，前5周温度为10°C，后5周温度为15°C，每天下午16:00捡蛋并称重。
对照组基础日粮（I组）参照中华人民共和国农业行业标准中褐壳蛋鸡（产蛋率＞85%）营养需要推荐值配制（有效磷0.36%），处理II组在基础日粮中降低有效磷至0.22%，处理III组及处理IV组分别在处理II组基础上添加100g和300g植酸酶。
每周以重复为单位观察记录鸡的产蛋枚数、破蛋数、蛋重、死亡情况等，计算日平均产蛋率、平均蛋重、破蛋率和死亡率，结果如表2。
表2植酸酶突变体GHPH-C6蛋鸡养殖中的使用效果
处理 产蛋率(%) 平均蛋重(g) 料蛋比 破蛋率(%) 死亡率(%)
I 96.6±0.62 60.4±0.22 2.24±0.05 1.6±0.19 2.27±0.12
II 95.7±0.48 60.0±0.27 2.26±0.04 2.4±0.17 3.05±0.27
III 96.5±0.49 60.4±0.19 2.25±0.04 2.0±0.13 3.01±0.19
IV 96.8±0.56 60.9±0.11 2.25±0.06 1.7±0.14 2.19±0.13
注：同列上标小写字母不同者表示差异显著（P<0.05）
与未添加植酸酶的II组相比，添加植酸酶的III和IV组，其产蛋率、平均蛋重、和平均增重都有所提高，而料蛋比、破蛋率和死亡率有所降低，这说明本发明的植酸酶突变体有利于GHPH-C6蛋鸡的生长和产蛋，且在实验范围内增加植酸酶GHPH-C6的添加量使蛋鸡的生长和产蛋状况有进一步改善。
改良后植酸酶突变体的热稳定性有显著提高，同时能改善草鱼的增重状况以及蛋鸡的生长产蛋状况，由此推测在饲料行业中会有很好的应用前景。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛红樱桃生物技术有限公司
<120> 一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用
<130>
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1233
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caatccgaac cagaattaaa gcttgaatcc gttgttattg tttctagaca tggtgttcgt 60
gcccctacta agtttaccca acttatgcaa gatgttactc cagatgcctg gccaacctgg 120
ccagttaagt taggagaatt gacccctaga ggtggtgaat tgattgccta cttgggacat 180
tactggcgtc aacgtcttgt tgctgatgaa cttttgccta agtgtggatg tcctcaatca 240
ggacaagttg ctattattgc cgatgttgat gaacgtaccc gtaagactgg agaagccttt 300
gctgccggtt tagcccctga ttgtgctatt accgttcatc atcaagccga tacctcatca 360
cctgatccac tcttcaaccc attaaagacc ggagtttgtc aattagatgt tgccaacgtt 420
actagagcca ttttggaaag agccggagga tctattgctg attttactgg tcattaccaa 480
accgcctttc gtgaattgga aagagttctt aactttccac aatctaactt gtgtcttaag 540
cgtgaaaagc aagatgaatc atgttccttg actcaagctc ttccatccga acttaaggtt 600
tccgccgata acgtttcctt gactggtgct gtttcattag cctctatgct taccgaaatt 660
tttcttttac aacaagctca aggtatgcca gaaccaggat ggggtcgtat taccgattca 720
catcagtgga acactctttt gtcacttcat aacgcccaat ttgatcttct tcaacgtacc 780
cctgaagttg ctcgatctcg tgctactcca cttctggatc ttattaagac cgctttgact 840
cctcatccac cacaaaagca agcctacggt gttactcttc ctacctccgt tttattcatt 900
gccggacatg atactaactt agctaacttg ggaggagctt tggaattaaa ctggaccctt 960
ccaggtcaac cagataacac tccaccaggt ggagaattgg tttttgaaag atggcgtcgt 1020
ctttcagata actcacagtg gattcaagtt tcattggttt ttcaaacctt gcaacaaatg 1080
cgtgataaga ctccattgtc cttaaacacc ccaccaggag aagttaagtt gaccttggcc 1140
ggttgtgaag aacgtaacgc ccaaggtatg tgttccttag ccgggtttac ccaaattgtt 1200
aacgaagctc gtattcctgc ctgttctctt tga 1233
<210> 2
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Arg Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Glu Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro Gln Ser
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His His Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Thr Arg Ala Ile
130 135 140
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Tyr Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 3
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Cys Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Glu Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro Gln Ser
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His His Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Thr Arg Ala Ile
130 135 140
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Tyr Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 4
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Asn Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Cys Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Glu Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro Gln Ser
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His His Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Thr Arg Ala Ile
130 135 140
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Tyr Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 5
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Cys Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Glu Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro Gln Ser
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His His Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Thr Arg Ala Ile
130 135 140
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Tyr Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Trp Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 6
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Cys Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Glu Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro Gln Ser
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His His Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Thr Arg Ala Ile
130 135 140
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Tyr Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Glu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 7
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Cys Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Glu Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro Gln Ser
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His His Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Thr Arg Ala Ile
130 135 140
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Tyr Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Ser Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 8
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Cys Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Glu Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro Gln Ser
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His His Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Leu Asn Val Thr Arg Ala Ile
130 135 140
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Tyr Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Met Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 9
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Gln Leu Met Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Cys Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Glu Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro Gln Ser
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His His Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Ala Asn Val Thr Arg Ala Ile
130 135 140
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Tyr Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Trp Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Leu Ala Asn Leu Lys Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 10
<211> 410
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser Val Val Ile Val Ser Arg
1 5 10 15
His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr Gln Leu Phe Gln Asp Val
20 25 30
Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val Lys Leu Gly Glu Leu Thr
35 40 45
Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Gly His Tyr Trp Cys Gln
50 55 60
Arg Leu Val Ala Asp Glu Leu Leu Pro Lys Cys Gly Cys Pro Gln Ser
65 70 75 80
Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp Glu Arg Thr Arg Lys Thr
85 90 95
Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro Asp Cys Ala Ile Thr Val
100 105 110
His His Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp Pro Leu Phe Asn Pro Leu
115 120 125
Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Val Leu Asn Val Thr Arg Ala Ile
130 135 140
Leu Glu Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp Phe Thr Gly His Tyr Gln
145 150 155 160
Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu Asn Phe Pro Gln Ser Asn
165 170 175
Leu Cys Leu Lys Arg Glu Lys Gln Asp Glu Ser Cys Ser Leu Thr Gln
180 185 190
Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala Asp Asn Val Ser Leu Thr
195 200 205
Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr Glu Ile Phe Leu Leu Gln
210 215 220
Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp Gly Arg Ile Thr Asp Ser
225 230 235 240
His Gln Pro Asn Thr Leu Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu
245 250 255
Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala Thr Pro Leu Leu
260 265 270
Asp Leu Ile Lys Thr Ala Leu Thr Pro His Pro Pro Gln Lys Gln Ala
275 280 285
Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Met Leu Phe Ile Ala Gly His Asp
290 295 300
Thr Asn Pro Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu Glu Leu Asn Trp Thr Leu
305 310 315 320
Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu Leu Val Phe Glu
325 330 335
Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln Trp Ile Gln Val Ser Leu
340 345 350
Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp Lys Thr Pro Leu Ser Leu
355 360 365
Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr Leu Ala Gly Cys Glu Glu
370 375 380
Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala Gly Phe Thr Gln Ile Val
385 390 395 400
Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ser Leu
405 410
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agaattccaa tccgaaccag aattaaa 27
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agcggccgct caaagagaac aggcaggaat 30
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 13
gggacattac tggnnncaac gtcttgttgc t 31
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(16)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 14
caacaagacg ttgnnnccag taatgtccca a 31

Claims (10)

1.耐热型单位点植酸酶突变体GHPH-C，其特征在于：所述的植酸酶突变体GHPH-C的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述突变体GHPH-C由氨基酸序列为SEQ ID NO：2的植酸酶的第63位氨基酸由Arg变为Cys获得。
2.耐热型双位点植酸酶突变体，其特征在于：所述双位点植酸酶突变体包括：氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的GHPH-C1、氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的GHPH-C2、氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示的GHPH-C3和氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的GHPH-C4。
3.耐热型三位点植酸酶突变体，其特征在于：所述三位点植酸酶突变体包括氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示的GHPH-C5和氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的GHPH-C6。
4.耐热型五位点植酸酶突变体GHPH-C7，其特征在于：其具有如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
5.分别产生权利要求1-4任一项所述的植酸酶突变体的编码基因。
6.含有权利要求1-4任一项所述的植酸酶突变体的编码基因的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的含有所述植酸酶编码基因的重组菌株，其特征在于所述重组菌株为毕赤酵母GS115。
8.权利要求1-4任一项所述的植酸酶突变体在用于制备水产类养殖饲料中的应用。
9.权利要求1-4任一项所述的植酸酶突变体在用于制备畜禽类养殖饲料中的应用，其特征在于：所述畜禽类包括猪、肉鸡、蛋鸡和鸭。
10.根据权利要求9所述的植酸酶突变体在用于制备畜禽类养殖饲料中的应用，其特征在于：所述植酸酶突变体用于饲料中时以液体酶制剂或固体酶制剂形式混匀在饲料中使用，其使用量为每克饲料中包含1~10U植酸酶。
CN201710509025.8A 2017-06-28 2017-06-28 一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用 Active CN107164344B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710509025.8A CN107164344B (zh) 2017-06-28 2017-06-28 一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710509025.8A CN107164344B (zh) 2017-06-28 2017-06-28 一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107164344A true CN107164344A (zh) 2017-09-15
CN107164344B CN107164344B (zh) 2020-03-17

Family

ID=59826932

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710509025.8A Active CN107164344B (zh) 2017-06-28 2017-06-28 一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107164344B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110484521A (zh) * 2018-05-14 2019-11-22 广东溢多利生物科技股份有限公司 高热稳定性的植酸酶突变体KsPHY9及其基因和应用
CN110484520A (zh) * 2018-05-14 2019-11-22 广东溢多利生物科技股份有限公司 比活提高的植酸酶appa突变体及其基因和应用
CN111593063A (zh) * 2017-09-30 2020-08-28 山东隆科特酶制剂有限公司 一种包含植酸酶突变体的重组载体或重组菌株的应用
CN113699134A (zh) * 2020-05-22 2021-11-26 青岛蔚蓝生物集团有限公司 植酸酶突变体
CN113717959A (zh) * 2020-05-22 2021-11-30 青岛蔚蓝生物集团有限公司 植酸酶突变体
CN113717958A (zh) * 2020-05-22 2021-11-30 青岛蔚蓝生物集团有限公司 比活力提高的植酸酶突变体
CN114807088A (zh) * 2022-06-28 2022-07-29 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种提高植酸酶热稳定性的方法及突变体APPAmut6和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1184156A (zh) * 1997-12-16 1998-06-10 中国农业科学院饲料研究所 植酸酶及其基因的克隆和表达
CN102943083A (zh) * 2012-11-27 2013-02-27 青岛根源生物技术集团有限公司 一种定点突变的耐高温植酸酶基因tp及其表达载体和应用
CN105624131A (zh) * 2014-11-21 2016-06-01 青岛蔚蓝生物集团有限公司 植酸酶突变体

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1184156A (zh) * 1997-12-16 1998-06-10 中国农业科学院饲料研究所 植酸酶及其基因的克隆和表达
CN102943083A (zh) * 2012-11-27 2013-02-27 青岛根源生物技术集团有限公司 一种定点突变的耐高温植酸酶基因tp及其表达载体和应用
CN105624131A (zh) * 2014-11-21 2016-06-01 青岛蔚蓝生物集团有限公司 植酸酶突变体

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
丁强等: "植酸酶发展现状和研究趋势", 《中国农业科技导报》 *
张耀华: "大肠杆菌植酸酶的定点突变及其热稳定性", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（基础科学辑）》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111593063A (zh) * 2017-09-30 2020-08-28 山东隆科特酶制剂有限公司 一种包含植酸酶突变体的重组载体或重组菌株的应用
CN111593063B (zh) * 2017-09-30 2021-11-19 山东隆科特酶制剂有限公司 一种包含植酸酶突变体的重组载体或重组菌株的应用
CN110484521A (zh) * 2018-05-14 2019-11-22 广东溢多利生物科技股份有限公司 高热稳定性的植酸酶突变体KsPHY9及其基因和应用
CN110484520A (zh) * 2018-05-14 2019-11-22 广东溢多利生物科技股份有限公司 比活提高的植酸酶appa突变体及其基因和应用
CN110484521B (zh) * 2018-05-14 2022-09-23 广东溢多利生物科技股份有限公司 高热稳定性的植酸酶突变体KsPHY9及其基因和应用
CN113699134A (zh) * 2020-05-22 2021-11-26 青岛蔚蓝生物集团有限公司 植酸酶突变体
CN113717959A (zh) * 2020-05-22 2021-11-30 青岛蔚蓝生物集团有限公司 植酸酶突变体
CN113717958A (zh) * 2020-05-22 2021-11-30 青岛蔚蓝生物集团有限公司 比活力提高的植酸酶突变体
CN114807088A (zh) * 2022-06-28 2022-07-29 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种提高植酸酶热稳定性的方法及突变体APPAmut6和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107164344B (zh) 2020-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107164344A (zh) 一类耐热型植酸酶突变体及其编码基因和应用
CN107760663A (zh) 油莎草pepc基因的克隆及表达载体的构建和应用
CN101426907B (zh) 一种植酸酶的克隆和表达
CN102002487B (zh) 一种优化改良的耐高温植酸酶phyth及其基因和应用
CN105969750B (zh) 一种植酸酶突变体及其应用
CN105219749B (zh) 优化改良的植酸酶突变体及其编码基因和应用
CN110577946B (zh) 酶活性和耐热性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用
CN107083374B (zh) 酶活性提高的β-甘露聚糖酶突变体及其编码基因和应用
CN102392002A (zh) 一种改进的大肠杆菌植酸酶htp6m及其基因和应用
CN109576244A (zh) 一种新型脂肪酶及其制备与应用
CN104911160B (zh) 一种中性植酸酶突变体及其应用
CN108048335B (zh) 蒙古口蘑新菌株草原白蘑2号及其选育方法
CN107287176A (zh) 一种耐高温中性植酸酶Physh-A及其基因和应用
CN109997970B (zh) 一类酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用
CN106119219A (zh) 酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体及其表达载体和应用
CN106011093A (zh) 一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体god-m01及其表达载体和应用
CN105981687A (zh) 一种高产抗病虎纹蛙养殖方法
CN100491533C (zh) 改良的高比活木聚糖酶及其基因、包括该基因的表达载体和重组酵母细胞以及表达方法
CN104322925A (zh) 一种黄粉虫饲料及制备方法
CN114774396B (zh) 角蛋白酶突变体及与胆汁酸的复配制剂和在添加剂的应用
CN103849607B (zh) 耐高温植酸酶及其用途
CN113025593B (zh) 一种亲本植酸酶变体
CN114921440A (zh) 一种木聚糖酶突变体及其应用
CN107488643A (zh) 一种兰花叶绿素降解代谢调控蛋白及其编码基因和应用
CN110484521B (zh) 高热稳定性的植酸酶突变体KsPHY9及其基因和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant