CN105219749B - 优化改良的植酸酶突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及优化改良的植酸酶突变体及其编码基因和应用。基于SEQ ID NO.2植酸酶的第10位，第70位，第142位，第159位和第255位中至少一个氨基酸被替换。本发明利用基因工程手段对大肠杆菌来源的植酸酶衍生体和毕赤酵母表达载体进行改良，以得到耐高温、高酶活植酸酶的毕赤酵母生产菌。本发明的经过改良的植酸酶在热稳定方面更优势。同时，该菌株生产植酸酶的产量也得到了大幅度的提高，其在180小时的发酵酶活达到25400U/mL，比改造前的植酸酶生产菌提高59.8％。因此，本发明的优化改良的植酸酶可在饲料工业中显示出巨大的应用潜力。

Description

优化改良的植酸酶突变体及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及优化改良的植酸酶突变体及其编码基因和应用。
背景技术
植酸(Phytate，Phytic acid，IP6)又称肌醇六磷酸脂，含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，是饲料中磷的重要贮存形式。植酸酶(Phytase)能够催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)。
单胃动物体和水产动物体内缺乏分解植酸的植酸酶，以植酸形式存在的磷很难被动物吸收利用而造成以下几种问题：第一，植酸在饲料中存在具有抗营养作用，植酸磷本身难于被猪禽和水产动物自身的消化道水解利用；植酸在动物胃肠道的消化过程中会与多种金属离子和蛋白质结合，形成不溶性的复合物，使一些消化酶的作用受到抑制，使得饲料中的矿物元素和其他营养物质的消化利用率大大降低。第二，为了满足动物对磷的需求，必须在饲料中添加无机磷酸盐。这样不仅大大增加了饲料生产的成本，而且大量不被动物利用的磷直接排出体外，造成磷源的浪费及严重的环境问题。因此，饲料中添加植酸酶，不仅可以提高动物对饲料中植酸磷的利用率，减少磷对环境的污染，还可以降低植酸磷的抗营养作用。
通过基因工程手段使植酸酶基因在重组菌株中高效表达是植酸酶得以大规模廉价生产的有效途径。目前植酸酶的生产主要依靠真菌、细菌的微生物发酵。毕赤酵母是近年来发展比较快的一个真核表达系统，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。毕赤酵母在表达产物的加工、外分秘、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势，而且还具有表达产量高、背景蛋白少、产物易于纯化、培养简单廉价、发酵密度高、发酵方法成熟等优点，是生产植酸酶较为理想的表达系统。
目前来源于Escherichia coli,Aspergillus niger,Aspergillusfumigatus,Selenomonas ruminantium等微生物的植酸酶已经在毕赤酵母中得到高效表达。来源于大肠杆菌的植酸酶APPA具有比活高的优点，是比较有应用潜力的植酸酶。野生的植酸酶APPA热稳定性差，目前市场上商品化的大肠杆菌植酸酶制剂大多数都是经过优化改良的，优化改良的植酸酶在热稳定上有了较大的提高，但是比活和生产效率的下降也令人堪忧，因此怎样让热稳定好的植酸酶在宿主菌中得到更高效的表达是企业提高产品质量降低成本的关注焦点。
发明内容
本发明的目的是通过对大肠杆菌来源的植酸酶衍生体PHd和表达载体进行改造，使改造后的植酸酶在温度的耐受性和/或表达量方面更加优良。
本发明的目的是提供优化改良的植酸酶突变体及其基因。
本发明的目的是提供优化改良的毕赤酵母表达载体。
本发明的再一目的是提供包含上述突变的植酸酶基因的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含上述突变的植酸酶基因的重组菌株。
本发明的再一目的是提供一种提高毕赤酵母表达植酸酶的方法。
本发明的再一目的是提供上述植酸酶的应用。
大肠杆菌植酸酶APPA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
MKAILIPFLS LLIPLTPQSA FAQSEPELKL ESVVIVSRHG VRAPTKATQL MQDVTPDAWP 60
TWPVKLGWLT PRGGELIAYL GHYQRQRLVA DGLLAKKGCP QSGQVAIIAD VDERTRKTGE 120
AFAAGLAPDC AITVHTQADT SSPDPLFNPL KTGVCQLDNA NVTDAILSRA GGSIADFTGH 180
RQTAFRELER VLNFPQSNLC LKREKQDESC SLTQALPSEL KVSADNVSLT GAVSLASMLT 240
EIFLLQQAQG MPEPGWGRIT DSHQWNTLLS LHNAQFYLLQ RTPEVARSRA TPLLDLIKTA300
LTPHPPQKQA YGVTLPTSVL FIAGHDTNLA NLGGALELNW TLPGQPDNTP PGGELVFERW 360
RRLSDNSQWI QVSLVFQTLQ QMRDKTPLSL NTPPGEVKLT LAGCEERNAQ GMCSLAGFTQ 420
IVNEARIPAC SL 432
大肠杆菌植酸酶衍生体PHd的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：
QSEPELKLES VVIVSRHGVR APTKFTQLMQ DVTPDAWPTW PVKLGELTPR GGELIAYLGH 60
YWRQRLVADG LLPKCGCPQS GQVAIIADVD ERTRKTGEAF AAGLAPDCAI TVHHQADTSS 120
PDPLFNPLKT GVCQLDVANV TDAILERAGG SIADFTGHRQ TAFRELERVL NFPQSNLCLK 180
REKQDESCSL TQALPSELKV SADNVSLTGA VSLASMLTEI FLLQQAQGMP EPGWGRITDS 240
HQWNTLLSLH NAQFYLLQRT PEVARSRATP LLDLIKTALT PHPPQKQAYG VTLPTSVLFI 300
AGHDTNLANL GGALELNWTL PGQPDNTPPG GELVFERWRR LSDNSQWIQV SLVFQTLQQM 360
RDKTPLSLNT PPGEVKLTLA GCEERNAQGM CSLAGFTQIVNEARIPACSL 410
优化合成的大肠杆菌植酸酶衍生体PHd的核酸序列，如SEQ ID NO.3所示：
cagagtgagcctgagttgaaactggaaTCCgttgtcatcgtctctagacatggtgttagagcaccaaccaagttcacccaacttatgcaagatgtcaccccagacgcttggccaacctgg 120
ccagtcaagctgggtgaattgacacctagaggtggtgagctcattgcttacttgggtcactactggagacagcgtcttgttgccgacGGAttgttgcctaagtgtggttgtccacaatct 240
ggtcaagtagctattattgctgacgtcgacgaaagaacccgtaagacaggtgaagccttcgccgccggtcttgctcctgactgtgccattaccgttcaccatcaagctgacacttcttct 360
ccagatccattgttcaaccctttgaagactggtgtttgccaattggacgttgctaacgttactGACgctatcttggaaagagctggaggatctattgctgacttcaccggtcacAGAcag 480
actgccttcagagagttggaaagagttcttaacttcccacaatccaacttgtgccttaagcgtgagaagcaagacgaatcctgttccttgactcaagcattaccatctgagttgaaggtc 600
tccgccgacaacgtctctttgaccggtgctgtcagcttggcttccatgttgactgaaatctttcttctgcaacaagctcaaggtatgcctgagccaggttggggtagaatcaccgactct 720
caccaatggaacaccttgttgtccttgcacaacgctcaattcTACttgctgcagagaactccagaggttgctagatccagagccaccccattgttggacttgatcaagactgctttgact 840
cctcacccacctcaaaagcaagcctacggtgttaccttgcccacttctgtcttgttcattgccggtcacgatactaacttggcaaatctcggcggtgctttggagttgaactggactctt 960
cctggtcaacctgataacactccaccaggtggtgagctcgttttcgaaagatggcgtagactatctgataactctcaatggattcaggtttcgttggtcttccaaactttgcagcagatg 1080
agagacaagactccactgtctttgaacacgcctccaggagaagtcaaattgaccttggctggatgtgaagagagaaatgctcagggtatgtgttccttggctggtttcactcaaatcgtt 1200
aacgaagctagaatcccagcttgttccttgtagtaa 1236
本发明优选采用定点饱和突变的方法对SEQ ID NO.2所示的植酸酶进行改造，优选地，首先在植酸酶PHd的第10位，第70位，第142位，第159位和第255位进行单点饱和突变。因此，基于SEQ ID NO.2的植酸酶突变体，在第10位，第70位，第142位，第159位和第255位中至少一个位置上具有氨基酸改变。
在优选的实施方案中，相对于SEQ ID NO.2所示的植酸酶，新的植酸酶突变体具有至少一个以下改变：S10F，S10M，S10N，S10Q；G70V，G70E，G70R；D142K，D142R，D412E；R159P，R159W，R159Y；Y255N，Y255Q，Y255D，Y255H，Y255S。在该列中，原位点为各位置编号之前的氨基酸，突变后氨基酸为在位置编号之后提及的氨基酸。并且，任何所提及的某位置的可能的氨基酸取代均可以与任何剩余提及位置的可能氨基酸改变进行组合。因此，本发明的植酸酶突变体可以具有至少一个提及的单改变或所述改变集合之一。
根据所取代的位置和氨基酸，各单独的或组合的突变可以使植酸酶突变体的酶活提高5％到30％，或在75℃处理5分钟时的热稳定性增加2％到25％，因此，可以通过选择相应的突变数目和突变类型，来选择对应于不同目的植酸酶突变体。
本发明还包含分离的核酸序列，其编码上述的在单个位置或多个位置上具有所述可能改变的本发明植酸酶之一，特别是基于SEQ ID NO.2在以下氨基酸位置上具有以下改变的植酸酶：
(PHm-01)10F/70G/142D/159R/255Y；(PHm-02)10F/70E/142D/159R/255Y；
(PHm-03)10M/70R/142D/159R/255Y；(PHm-04)10M/70E/142D/159R/255Y；
(PHm-05)10N/70E/142D/159R/255Y；(PHm-06)10N/70V/142D/159R/255Y；
(PHm-07)10Q/70R/142D/159R/255Y；(PHm-08)10Q/70R/142K/159R/255Y；
(PHm-09)10S/70R/142R/159R/255Y；(PHm-10)10S/70R/142K/159P/255Y；
(PHm-11)10S/70E/142D/159Y/255Y；(PHm-12)10S/70V/142E/159W/255Y；
(PHm-13)10S/70E/142D/159R/255Y；(PHm-14)10S/70V/142E/159R/255Y；
(PHm-15)10F/70G/142K/159R/255Y；(PHm-16)10S/70V/142K/159R/255Y；
(PHm-17)10F/70E/142R/159R/255Y；(PHm-18)10M/70R/142R/159R/255Y；
(PHm-19)10S/70E/142R/159R/255Y；(PHm-20)10M/70G/142K/159R/255Y；
(PHm-21)10N/70E/142R/159R/255Y；(PHm-22)10N/70V/142R/159R/255Y；
(PHm-23)10Q/70R/142R/159R/255Y；(PHm-24)10Q/70R/142K/159R/255Y；
(PHm-25)10S/70E/142R/159Y/255D；(PHm-26)10S/70V/142R/159Y/255N；
(PHm-27)10F/70G/142E/159R/255Y；(PHm-28)10F/70V/142E/159R/255Y；
(PHm-29)10M/70R/142E/159R/255Y；(PHm-30)10M/70E/142E/159R/255Y；
(PHm-31)10N/70R/142E/159R/255Y；(PHm-32)10N/70V/142R/159R/255Y；
(PHm-33)10Q/70R/142R/159R/255Y；(PHm-34)10Q/70R/142K/159R/255Y；
(PHm-35)10S/70E/142R/159P/255N；(PHm36)10S/70V/142R/159Y/255D；
(PHm-37)10F/70G/142K/159P/255Y；(PHm-38)10F/70V/142K/159W/255Y；
(PHm-39)10F/70E/142R/159Y/255Y；(PHm-40)10M/70R/142R/159P/255Y；
(PHm-41)10M/70E/142R/159P/255Y；(PHm-42)10M/70G/142K/159Y/255Y；
(PHm-43)10N/70E/142R/159Y/255Y；(PHm-44)10N/70V/142R/159Y/255Y；
(PHm-45)10Q/70R/142R/159W/255Y；(PHm-46)10Q/70R/142K/159P/255Y；
(PHm-47)10S/70E/142R/159P/255H；(PHm-48)10S/70G/142K/159Y/255H；
(PHm-49)10S/70E/142R/159Y/255S；(PHm-50)10S/70V/142R/159Y/255S；
(PHm-51)10S/70R/142V/159W/255D；(PHm-52)10S/70R/142K/159P/255H；
(PHm-53)10F/70G/142K/159P/255N；(PHm-54)10F/70V/142K/159W/255Q；
(PHm-55)10F/70E/142V/159Y/255N；(PHm-56)10M/70R/142R/159P/255D；
(PHm-57)10M/70E/142R/159P/255H；(PHm-58)10M/70G/142K/159Y/255H；
(PHm-59)10N/70E/142R/159W/255S；(PHm-60)10N/70V/142R/159Y/255S；
(PHm-61)10Q/70R/142R/159W/255D；(PHm-62)10Q/70R/142K/159P/255H；
(PHm-63)10N/70E/142R/159Y/255D；(PHm-64)10N/70V/142R/159Y/255N；
(PHm-65)10Q/70R/142R/159W/255Q；(PHm-66)10Q/70R/142K/159P/255Y；
(PHm-67)10S/70G/142K/159R/255H；(PHm-68)10S/70G/142V/159P/255D；
(PHm-69)10S/70E/142R/159Y/255H；(PHm70)10S/70V/142E/159R/255Q；
(PHm-71)10S/70G/142R/159W/255Y；(PHm-72)10S/70G/142K/159P/255Q；
(PHm-73)10S/70E/142V/159Y/255S；(PHm-74)10S/70V/142E/159R/255N；
本发明也包括编码植酸酶的分离的核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NO.3所示的核酸序列具有至少98.8％的同一性。
本发明还包括重组表达载体，所述载体包含根据本发明的植酸酶突变体的编码核酸序列之一。
本发明也包括重组宿主细胞，所述宿主细胞包含根据本发明的植酸酶突变体的编码核酸序列之一或包含根据本发明的植酸酶突变体的重组表达载体。
本发明还采用定点饱和突变的方法对毕赤酵母表达载体(如pPICZαA)的α信号肽(序列如SEQ ID NO.4进行改造)，pPICZαA载体的α信号肽序列如SEQ ID NO.4：MRFPSIFTAV10 LFAASSALAA 20 PVNTTTEDET 30 AQIPAEAVIG 40 YSDLEGDFDV 50 AVLPFSNSTN 60NGLLFINTTI 70 ASIAAKEEGV 80 SLEKREAEA 89
优选地，基于SEQ ID NO.4，本发明在α信号肽的第85位氨基酸进行饱和突变。
在优选的实施方案中，α信号肽的第85位氨基酸R，被置换为以下氨基酸之一：K，E，V，G。
本发明还涉及上述改良的任一植酸酶突变体与上述改造的任一α信号肽的任意组合。构建形成的这些优化改良的植酸酶重组表达载体，既包含根据本发明的植酸酶突变体的核酸序列之一，又包含根据本发明α信号肽的核酸序列之一。
本发明也包括重组宿主细胞，所述宿主细胞包含根据本发明的植酸酶突变体的核酸序列之一与根据本发明的α信号肽的核酸序列之一的任意组合形成的重组表达载体。
本发明还提供了包含上述植酸酶突变体和表达载体的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母菌株X33。
本发明还提供了表达上述植酸酶突变体的方法，包括以下步骤：
1)用上述的改良的重组表达载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)重组菌株进行发酵，诱导重组植酸酶的表达；
3)发酵结束后，回收并纯化所表达的植酸酶。
具体地，将上述毕赤酵母重组表达质粒，转化到酵母宿主菌株X33中，高通量筛选高拷贝的转化子，热稳定试验检测筛选的转化子的耐温性，将最终筛选到的转化子，在7L的发酵罐中进行发酵，发酵过程中，每隔24h取发酵液测定OD600以及菌体湿重，取上清液进行植酸酶活性检测。
本发明还提供了上述植酸酶突变体在饲料添加剂中的应用。
本发明利用基因工程手段对大肠杆菌来源的植酸酶衍生体和毕赤酵母表达载体进行改良，以得到耐高温、高酶活植酸酶的毕赤酵母生产菌，生产的植酸酶，热稳定性得到很大的提高，在75℃水溶液中保温5分钟，仍有75％的酶活保留，80℃和85℃水溶液中保温5分钟，剩余酶活分别达到30％和40％，而改造前的植酸酶在75℃水溶液中保温5分钟，剩余酶活不到50％，80和85度℃水溶液中保温5分钟，剩余酶活不到10％；将该优化改良的植酸酶突变体添加到饲料中，经90℃高温制粒处理，其酶活仍保留70％以上，而改造前的植酸酶经90℃高温制粒处理，酶活保留不足原来的50％，说明本发明的经过改良的植酸酶在热稳定方面更优势。同时，该菌株生产植酸酶的产量也得到了大幅度的提高，其在180小时的发酵酶活达到25400U/mL，比改造前的植酸酶生产菌提高59.8％。因此，本发明的优化改良的植酸酶可在饲料工业中显示出巨大的应用潜力。
附图说明
图1为PHM植酸酶工程菌在7升发酵罐中的发酵情况。
图2为植酸酶PHM和改造前的植酸酶PHd在不同pH值环境下的相对酶活曲线图。
图3为植酸酶PHM和改造前的植酸酶PHd经不同温度处理后的相对酶活曲线图。
具体实施方式
实验材料和试剂：
1、菌株与载体
大肠杆菌菌株Topl0、大肠杆菌菌株OrigamiB、毕赤酵母X33、载体pPICZαA、pET-22b(+)，Zeocin购自Invitrogen公司。
2、酶与试剂盒
Q5高保真PCR扩增酶、限制性内切酶购自NEB(北京)有限公司；质粒提取、DNA胶回收纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
3、培养基
大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LB-Amp为LB培养基加100ug/mL氨苄青霉素。LB-Zeo为LB培养基加25ug/mL Zeocin。
酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDzeo(YPD+100mg/L zeocin)。
酵母诱导培养基BMGY(I％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。
重组酵母发酵培养基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％、消泡剂0.03％。高压后每升加4.35毫升PTM1。
PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、植酸酶基因的合成及克隆
以大肠杆菌来源的植酸酶衍生体PHd的氨基酸序列作为参考(如SEQ ID NO.2所示)，人工合成该基因(核酸序列如SEQ ID NO.3所示)。
根据基因5'端设计PCR引物含有NdeI内切酶位点，3'端设计PCR引物含EcoRI内切酶位点，引物序列如下：
5'端引物NdeI-PHd-F1：GGATTACCATATGCAGAGTGAGCCTGAGTTG
3'端引物EcoRI-PHd-R1：CGGAATTCTTACTACAAGGAACAAGCTGG
以合成基因PHd为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增得到的片段切胶回收，用NdeI和EcoRI双酶切，连接到pET-22b(+)载体的NdeI和EcoRI位点，转化Top10大肠杆菌，LB-Amp平板培养获得pET-22b-PHd阳性菌落。
实施例2、基因定点饱和突变
确定大肠杆菌植酸酶衍生体PHd的9个待突变位点，分别为：第10位的S，第70位的G，第91位的E，第142位的D，第159位的R，第212的S，第255位的Y，第353的Q，第373位的G，针对性的设计了9对饱和突变引物，目的基因突变位点统一为NNS，NNS左右各取15个碱基构成正向引物；反向引物与正向引物完全互补，其中，N代表A,T,C,G等四种碱基，S代表C,G两种碱基。
以重组载体pET-22b-PHd为模板，加入突变位点的正反向引物，Q5高保真PCR酶进行PCR扩增，产物经DpnI酶切处理后电击转化OrigamiB大肠杆菌感受态细胞，在LB-Amp平板筛选阳性突变重组克隆。每个突变位点挑取186个单克隆接种到96孔深孔板。每个平板挑选3个未突变的克隆为对照。每孔含500uL培养基LB-Amp。37℃摇床200rpm培养5小时，转移50uL菌液到新的96孔平板保种后，平板每孔剩余菌液添加含有IPTG的50uL LB-Amp培养基，并使每孔的IPTG终浓度为0.5mM，37℃摇床200rpm过夜诱导表达植酸酶。含有过夜培养诱导表达植酸酶的菌液平板在75℃水浴锅加热处理5分钟后细胞裂解，检测培养液中存留植酸酶活性。植酸酶初步耐热活性检测根据中华人民共和国国家标准《GB/T 18634-2002》进行。
根据植酸酶活性和耐热活性检测结果，植酸酶活性高于对照克隆组或热处理剩余酶超过对照克隆组的克隆挑选为阳性克隆。从保种板上挑选阳性克隆集中到96孔平板重复上述的培养、诱导表达、酶活测定及热处理筛选试验。确定酶活高或耐温好的为阳性突变克隆，提取阳性克隆质粒DNA进行基因测序。
通过定点突变PCR得到5个阳性位点(第10位，第70位，第142位，第159位和第255位)的18种阳性克隆，分别是:10F，10M，10N，10Q；70V，70E，70R；142K，142R，412E；159P，159W，159Y；255N，255Q，255D，255H，255S。为进一步获得高酶活高耐温的植酸酶突变体，本发明对此5个阳性突变位点间的几种替换进行两点或多点间的随机组合，进行了突变位点间的重组筛选。多点突变按照单点定点突变的方法进行逐步的突变，根据植酸酶活性和耐热活性检测结果来确定阳性克隆。
通过高通量筛选，得到74种植酸酶突变体。这些植酸酶突变体与改造前的植酸酶相比，酶活提高5％到30％，或在75℃处理5分钟时的热稳定性增加2％到25％。这些植酸酶突变体的组合方式分别为：
(PHm-01)10F/70G/142D/159R/255Y；(PHm-02)10F/70E/142D/159R/255Y；
(PHm-03)10M/70R/142D/159R/255Y；(PHm-04)10M/70E/142D/159R/255Y；
(PHm-05)10N/70E/142D/159R/255Y；(PHm-06)10N/70V/142D/159R/255Y；
(PHm-07)10Q/70R/142D/159R/255Y；(PHm-08)10Q/70R/142K/159R/255Y；
(PHm-09)10S/70R/142R/159R/255Y；(PHm-10)10S/70R/142K/159P/255Y；
(PHm-11)10S/70E/142D/159Y/255Y；(PHm-12)10S/70V/142E/159W/255Y；
(PHm-13)10S/70E/142D/159R/255Y；(PHm-14)10S/70V/142E/159R/255Y；
(PHm-15)10F/70G/142K/159R/255Y；(PHm-16)10S/70V/142K/159R/255Y；
(PHm-17)10F/70E/142R/159R/255Y；(PHm-18)10M/70R/142R/159R/255Y；
(PHm-19)10S/70E/142R/159R/255Y；(PHm-20)10M/70G/142K/159R/255Y；
(PHm-21)10N/70E/142R/159R/255Y；(PHm-22)10N/70V/142R/159R/255Y；
(PHm-23)10Q/70R/142R/159R/255Y；(PHm-24)10Q/70R/142K/159R/255Y；
(PHm-25)10S/70E/142R/159Y/255D；(PHm-26)10S/70V/142R/159Y/255N；
(PHm-27)10F/70G/142E/159R/255Y；(PHm-28)10F/70V/142E/159R/255Y；
(PHm-29)10M/70R/142E/159R/255Y；(PHm-30)10M/70E/142E/159R/255Y；
(PHm-31)10N/70R/142E/159R/255Y；(PHm-32)10N/70V/142R/159R/255Y；
(PHm-33)10Q/70R/142R/159R/255Y；(PHm-34)10Q/70R/142K/159R/255Y；
(PHm-35)10S/70E/142R/159P/255N；(PHm36)10S/70V/142R/159Y/255D；
(PHm-37)10F/70G/142K/159P/255Y；(PHm-38)10F/70V/142K/159W/255Y；
(PHm-39)10F/70E/142R/159Y/255Y；(PHm-40)10M/70R/142R/159P/255Y；
(PHm-41)10M/70E/142R/159P/255Y；(PHm-42)10M/70G/142K/159Y/255Y；
(PHm-43)10N/70E/142R/159Y/255Y；(PHm-44)10N/70V/142R/159Y/255Y；
(PHm-45)10Q/70R/142R/159W/255Y；(PHm-46)10Q/70R/142K/159P/255Y；
(PHm-47)10S/70E/142R/159P/255H；(PHm-48)10S/70G/142K/159Y/255H；
(PHm-49)10S/70E/142R/159Y/255S；(PHm-50)10S/70V/142R/159Y/255S；
(PHm-51)10S/70R/142V/159W/255D；(PHm-52)10S/70R/142K/159P/255H；
(PHm-53)10F/70G/142K/159P/255N；(PHm-54)10F/70V/142K/159W/255Q；
(PHm-55)10F/70E/142V/159Y/255N；(PHm-56)10M/70R/142R/159P/255D；
(PHm-57)10M/70E/142R/159P/255H；(PHm-58)10M/70G/142K/159Y/255H；
(PHm-59)10N/70E/142R/159W/255S；(PHm-60)10N/70V/142R/159Y/255S；
(PHm-61)10Q/70R/142R/159W/255D；(PHm-62)10Q/70R/142K/159P/255H；
(PHm-63)10N/70E/142R/159Y/255D；(PHm-64)10N/70V/142R/159Y/255N；
(PHm-65)10Q/70R/142R/159W/255Q；(PHm-66)10Q/70R/142K/159P/255Y；
(PHm-67)10S/70G/142K/159R/255H；(PHm-68)10S/70G/142V/159P/255D；
(PHm-69)10S/70E/142R/159Y/255H；(PHm70)10S/70V/142E/159R/255Q；
(PHm-71)10S/70G/142R/159W/255Y；(PHm-72)10S/70G/142K/159P/255Q；
(PHm-73)10S/70E/142V/159Y/255S；(PHm-74)10S/70V/142E/159R/255N；
实施例3、植酸酶PHd毕赤酵母表达载体的构建
根据植酸酶PHd基因，5'端设计PCR引物含有EcoRI内切酶位点，3'端设计PCR引物含NotI内切酶位点，引物序列如下：
5'端引物EcoRI-PHd-F1：GTAGAATTCCAGAGTGAGCCTGAGTTG
3'端引物NotI-PHd-R1：ATTGCGGCCGCTTACTACAAGGAACAAGCTGG
以合成基因PHd为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增得到的片段，用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切，纯化，连接到pPICZαA载体EcoRI和NotI位点，使植酸酶PHd基因插入到上述表达载体的信号肽序列的下游。连接产物转化Top10大肠杆菌，LB-Zeo平板培养获得pPICZαA-PHd阳性菌落，提取pPICZαA-PHd阳性菌落质粒。
实施例4、重组表达载体pPICzaA-PHd的改造
pPICZαA-PHd质粒的PHd基因与α信号肽之间含有一个EcoRI酶切位点，本发明通过设计引物，删除该质粒EcoRI酶切位点的GAATTC6个核苷酸。删除位点左右各取15个碱基构成正向引物，反向引物与正向引物完全互补，引物序列如下：
5'端引物EcoRI-d-F1：AGAGAGGCTGAAGCTACGTGGCCCAGCCGG
3'端引物EcoRI-d-R1：CCGGCTGGGCCACGTAGCTTCAGCCTCTCT
以重组载体pPICzaA-PHd为模板，加入以上正反向引物，Q5高保真PCR酶进行PCR扩增，产物经DpnI酶切处理后电击转化Top10感受态细胞，LB-Zeo平板培养获得pPICZαAd-PHd载体的阳性菌落。
实施例5、重组载体α信号肽的定点饱和突变
α信号肽影响着毕赤酵母对目的蛋白的分泌，因此，本发明还对毕赤酵母表达载体的α信号肽进行突变改造。本发明选择信号肽的第2位点R和85位点R分别进行定点饱和突变，每个位点按照毕赤酵母最优或较优密码子设计19对突变引物(即突变成一种氨基酸设计一对突变引物)，突变位点左右各取15个碱基构成正向引物；反向引物与正向引物完全互补。
以重组载体pPICzαAd-PHd为模板，加入突变位点的正反向引物，PCR扩增，产物经DpnI酶切处理后电击转化Top10大肠杆菌感受态细胞，LB-Zeo平板培养获得pPICZαAd-PHd载体各突变的阳性菌落，提取各突变阳性菌落质粒DNA。
pPICZαAd-PHd载体信号肽的第2位点和85位点的各突变质粒、pPICzαA-PHd质粒、pPICzαAd-PHd质粒，分别经过PmeI内切酶线性化后，电击转化毕赤酵母X33感受态细胞，涂布含100ug/mL Zeocin的YPDS固体培养平板，30℃培养2-3d。尽量挑取Zeocin YPDS平板上生长速度快及菌落较大的转化子，每个平板挑取22个转化子于24孔深孔板，同时挑取2个改造前的原始转化菌(前期高通量筛选获得)的单菌落为对照，每孔含2mL酵母培养基BMGY，待其生长至饱和状态，离心弃去BMGY培养基，换上酵母诱导培养基BMMY，诱导24小时后，取上清液进行植酸酶酶活性检测。
植酸酶活性检测结果显示：重组载体α信号肽的85位点R突变成K，E，V，G后，可得到植酸酶高酶活的转化子，最高酶活分别比对照高36％，33％，34％，34％。因此，毕赤酵母表达载体的α信号肽的85位突变成K或E或V或G，可能有提高植酸酶产量的作用。
实施例6、高通量筛选酶活高耐温好的植酸酶工程菌株
提取实施例2中得到的植酸酶突变体的质粒DNA，以其为模板，用实施例3中的引物扩增植酸酶突变体基因片段，连接到pPICZαA载体上，构建植酸酶突变体的毕赤酵母表达载体，这些构建好的载体统称为pPICZαA-PHm。这里，“pPICZαA-PHm”中的“PHm”是指在植酸酶PHd的第10位，第70位，第142位，第159位和第255位中至少一个位置上，被相应的置换为以下氨基酸之一：10F，10M，10N，10Q；70V，70E，70R；142K，142R，412E；159P，159W，159Y；255N，255Q，255D，255H，255S的植酸酶突变体。载体构建方法与实施例3中pPICZαA-PHd的构建方法相同。
pPICZαA-PHm重组载体按照实施例4进行改造，删除基因与α信号肽之间的EcoRI酶切位点，改造后的含有植酸酶突变体的重组载体统称为pPICZαAd-PHm。
按照定点突变的方法，在pPICZαAd-PHm重组表达载体α信号肽的85位点引入突变，将R突变成K或E或V或G，使α信号肽的改良与植酸酶的改良结合起来。这里，任一的植酸酶突变体都可以与α信号肽85K，85E，85V，85G任何一个进行组合，由此构建的重组表达载体统称为pPICZαAmd-PHm。这里，“pPICZαAmd”是指pPICZαA与基因间不含酶切位点，且α信号肽的第85位氨基酸被置换为以下氨基酸之一：K，E，V，G；“PHm”是指在植酸酶PHd的第10位，第70位，第142位，第159位和第255位中至少一个位置上，被相应的置换为以下氨基酸之一：10F，10M，10N，10Q；70V，70E，70R；142K，142R，412E；159P，159W，159Y；255N，255Q，255D，255H，255S的植酸酶突变体。
这些优化改良的植酸酶重组表达载体pPICZαAmd-PHm质粒，经过线性化后，电击转化毕赤酵母X33感受态细胞，涂布含100ug/mL Zeocin的YPDS固体培养平板，30℃培养2-3d。尽量挑取Zeocin YPDS平板上生长速度快及菌落较大的转化子，每个平板挑取66个转化子于24孔深孔板，每个深孔板含22个转化子，2个改造前的原始转化菌作为对照。每孔含2mL酵母培养基BMGY，待其生长至饱和状态，离心弃去BMGY培养基，换上酵母诱导培养基BMMY，诱导24小时后，取上清液进行植酸酶酶活性检测和耐热活性检测。
经过高通量筛选，筛选得到186株转化子酶活高于原始转化菌20％以上，其中105株转化子的植酸酶热稳定性显著提高，在75℃水溶液中保温5分钟，酶活保留率提高5％到25％。
将上述筛选得到的105株转化子，于YPDS平板划线培养，每株转化子挑取4个单菌落于24孔板，同时挑4个改造前的原始转化菌作为对照。每孔含2mL酵母培养基BMGY，待其生长至饱和状态，离心弃去BMGY培养基，换上酵母诱导培养基BMMY，诱导24小时后，取上清液进行植酸酶酶活性检测，最优的植酸酶工程菌株表达最高耐热又好，该菌株在24孔板中酶活比对照高50％，75℃处理5分钟，酶活保留率25％，将该工程菌命名为PHM。
实施例7、植酸酶的活性测定
按照中华人民共和国国家标准《GB/T 18634-2002》进行。植酸酶活性定义是指样品在植酸钠浓度为5.0mmol/L、温度37℃、pH值5.5的条件下，每min从植酸钠中释放l pmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
U＝FxC/(Vx30)
式中：U-试样中植酸酶的活性，U/mL；C-根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U；F-试样溶液反应前的总稀释倍数；V-试样体积，mL；30-反应时间，min。
标准曲线的制定如表1：
磷浓度(mmol/L) 0 1.5625 3.125 6.25 12.5 25
OD值 0 0.054 0.109 0.212 0.437 0.942
实施例8、7L发酵罐小试
从YPD-zeo平板上选取工程菌PHM的单菌落，接种于20mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养20hr。以1：50的比例接种到300mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养至OD600＝5，用以接种发酵罐。
发酵过程中，温度控制在30℃，通气量维持在2vvm，转速控制在500-800rpm之间以维持溶氧20％以上。
发酵过程分为三个阶段：1)菌株培养阶段：国产的7L发酵罐，加入3L发酵基础培养基，121℃灭菌20min，调节温度至30℃，用氨水调节pH至4.6，加入PTMl(4.35mL/L)，接入种子菌(1：10)，通气搅拌培养约18-24h，直到将发酵罐中甘油耗尽，表现为溶氧突然上升；2)之后进入甘油促生长期，补加50％甘油(含有PTMl，12mL/L)，补料速度为18mL/L·h，持续4-6h；3)最后进入诱导期，用氨水或磷酸调节pH至所需值，流加100％甲醇(含有PTMl，12mL/L)，流速从1mL/L·h经15hr线性升至4mL/L·h，持续120h。
发酵过程中，每隔24h取发酵液测定OD600以及菌体湿重，取上清液进行植酸酶活性检测。发酵结束最终平均发酵酶活达到25400U/mL，发酵过程曲线如图1所示。
实施例9、对改造前大肠杆菌植酸酶PHd及本发明植酸酶PHM的性质分析
对改造前大肠杆菌植酸酶PHd和本发明植酸酶PHM分别进行最适pH的测定，测定方法按常规方法进行测定，结果如图2所示，从图2可见，改造前的植酸酶PHd和改良后植酸酶PHM的pH反应曲线没有改变，最适pH值均为5.0。
根据国家植酸酶检测方法稀释植酸酶发酵液，在60-90℃区域进行耐温性实验。改造前大肠杆菌植酸酶PHd和改良后植酸酶PHM在不同温度的水浴锅中加热处理5min后迅速放入冰水降温。另设一个未加热对照组。按常规方法进行酶活测定，以未加热处理样品结果为100％，检测各温度热处理5分钟后剩余酶活，如图3所示。从图3可见，本发明的改良后植酸酶PHM在耐热性能上有了很大的提高，75℃处理5分钟，酶活保留率为75％，而突变前的植酸酶PHd经75℃处理5分钟，酶活保留不足原来的50％。经过突变筛选，获得的植酸酶PHM耐温性有了明显的提高，可以应用于工业生产。

Claims (9)

1.优化改良的植酸酶，其特征在于，基于氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的植酸酶，所述植酸酶的第10位、第70位、第142位、第159位和第255位的氨基酸发生以下突变：
第10位：S10F，S10M，S10N，或S10Q；
第70位：G70V，G70E，或G70R；
第142位：D142K，D142R，或D142E；
第159位：R159P，R159W，或R159Y；
第255位：Y255N，Y255Q，Y255D，Y255H，或Y255S。
2.优化改良的植酸酶突变基因，其特征在于，编码权利要求1所述的优化改良的植酸酶。
3.根据权利要求2所述的优化改良的植酸酶突变基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种高效表达优化改良的植酸酶基因的重组表达载体，其特征在于，包含权利要求2所述优化改良的植酸酶突变基因。
5.一种高效表达优化改良的植酸酶基因的重组菌株，其特征在于，包含权利要求2所述优化改良的植酸酶突变基因。
6.根据权利要求4所述的高效表达优化改良的植酸酶基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为毕赤酵母重组表达载体。
7.根据权利要求4所述的高效表达优化改良的植酸酶基因的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为毕赤酵母重组表达载体，其中，毕赤酵母表达载体的序列如SEQ IDNO.4的α信号肽的第85位氨基酸R，被置换为以下氨基酸之一：K，E，V，G。
8.权利要求1所述的优化改良的植酸酶在饲料添加剂中的应用。
9.一种高效表达优化改良的植酸酶的方法，其特征在于，所述方法包括在宿主细胞中表达权利要求4所述高效表达优化改良的植酸酶基因的重组表达载体的步骤。
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